Lusiferaz Tabanlı Yaşam Testi ile İnsan Kolorektal Organoidlerinde Kadmiyum Toksisitesinin Değerlendirilmesi İçin Standartlaştırılmış Bir Protokol

Özet

Protokol, insan kolorektal organoidlerini ortaya koymayı ve kadmiyum kaynaklı toksisiteyi tespit etmek için lusiferaz tabanlı ATP biyolüminesans testini değerlendirmeyi amaçlamaktadır. Testin uygulanabilirliğini ve hassasiyetini, organoid canlılıktaki doz ve zamana bağlı değişiklikleri niceleyerek değerlendirir.

Özet

Kadmiyum (CD), Grup 1 kanserojen olarak sınıflandırılmakta ve ciddi bir küresel çevre sorunu oluşturur. Bu çalışma, insan kolorektal organoid modeli oluşturmayı ve kolorektal organoidlerin (CO'lar) Cd maruziyetine karşı toksik yanıtlarını tespit etmek için luciferaz tabanlı ATP biyolüminesans testinin fizibilitesini ve hassasiyetini değerlendirmeyi amaçladı. Kök hücreler, insan kolorektal dokusundan izole edilip, üç boyutlu bazal zar matriksinde kültürlenerek CO'lar üretti. Organoidler, farklı maruziyet süreleri için derecelendirilmiş bir CD konsantrasyonları serisiyle işlendi. Eşit hacim oranında bir parıltı canlılık reaktifi eklendi, oda sıcaklığında sallanarak nazikçe karıştırıldı, böylece lizisi ve reaktifan nüfuzunu teşvik etti ve ardından biyolüminesans reaksiyonun ilerlemesi için inkübe edildi. Lüminesans, çok modlu mikroplaka okuyucuda lüminesans modunda kaydedildi. Doz-yanıt eğrisi uyumu, yarı-maksimum inhibitör konsantrasyonun hesaplanması ve yaşamlılık veya göreli canlılık değişikliklerinin değerlendirilmesi için kullanıldı. Birincil kök hücreler insan kolorektal dokusundan başarıyla izole edildi ve CO üretiminde kullanıldı. CD maruziyeti, organoid metabolik aktivitesinde doz ve zamana bağlı azalmalar sağladı; doz–yanıt analizi, organoidler için hayatta kalma eğrileri ve IC50 değerleri sağladı. Bu çalışma, çevresel ağır metal toksikolojisi çalışmalarında insan CO'larının kullanımı için metodolojik rehberlik ve pratik içgörüler sunmaktadır.

Giriş

CD, doğal olarak oluşan ve Grup 1 kanserojen olarak sınıflandırılan ağır bir metaldir ve küresel bir çevre endişesi^{haline gelmiştir 1}. İnsanların Cd'ye maruz kalması öncelikle solunma ve diyet yoluyla gerçekleşir. Kronik düşük dozlu maruziyet çeşitli olumsuz sağlık sonuçlarıyla ilişkili olsa da, kullanımını ve çevresel salınımını önemli ölçüde azaltmak hâlâ^{zordur 2,3}. Geleneksel iki boyutlu kültürler düz substratlar üzerinde büyür ve doku mimarisi, hücre polaritesi ve tümör mikro ortamından yoksundur. Sonuç olarak, kadmiyum maruziyetine karşı in vivo heterojenliği ve otmen toksikolojik yanıtları yeniden ifade etme konusunda sınırlı bir yetenek^{sahiptirler 4}. Bu tür sistemler, hücre-hücre etkileşimlerini, matrise bağlı büyümeyi veya ilaç direncinin gelişimini sağlayan biyolojik süreçleri yeterince^{modelleyemez 5}. Hasta dokularından türetilen üç boyutlu organoid sistemler, geleneksel iki boyutlu hücre hatlarına kıyasla fizyolojik olarak daha ilgili bir platform^{sunar 6}. Organoidler, birincil dokunun genomik özelliklerini, histolojik organizasyonunu ve fonksiyonel durumlarını korur. Bu, tümör büyümesi, evrimi ve kadmiyum toksisitesine duyarlılığının daha doğru modellenmesini sağlar ve hastalık modelleme ile toksikoloji araştırmaları için net avantajlar^{sağlar 7}. CO'lar karmaşık üç boyutlu bir mimariye, hücresel heterojenliğe ve kendini yenileme ile kendini örgütlenme için içsel^{kapasitelere sahiptir 8,9}. CO'ların alıcı farelere nakledilmesi, bağırsak kök hücresinin kendini yenilemesini teşvik edebilir ve konak bağışıklık mikroçevresini modüle ederek koruyucu etkiler^{yaratabilir 4}. 2009 yılında, Sato ve ark. ilk kez tek bir Lgr5⁺ yetişkin bağırsak kök hücresinin kendiliğinden kendini organize edip farklılaşarak tüm bağırsak hücre hatlarını kapsayan kript–villus yapıları^{oluşturabildiğini göstermiştir 10}.

Bağırsak epiteli, tüketimden sonra Cd toksisitesine karşı ilk savunma hattını oluşturur. Aslında, CD'nin ağızdan biyoyararlanıcılığı genellikle %5'in altındadır. CD kaynaklı bağırsak toksisitesi, hücreler arası bağlantıların bozulması, artan parasellüler geçirgenlik ve inflamatuar yanıtların indüklenmesi ile karakterize edilir. Ayrıca, Cd bağırsak bağışıklık fonksiyonunu bozur ve bağırsak^{mikrobiyotasının bileşimini ve homeostazını değiştirir.} Maruziyet dozu ve süresine bağlı olarak, Cd hücre döngüsü düzensizliğine neden olabilir; bazı bağlamlarda onkojenik fenotipleri desteklerken, diğerlerinde apoptozu tetikler. CD, dolaylı olarak ROS (reaktif oksijen türleri) üretimini uyararak oksidatif stresi ve redoks dengesizliğini tetikleyebilir. Reseptörler, kinazlar, fosfatazlar, proteazlar, yapışma molekülleri ve transkripsiyon faktörlerinin fonksiyonu redoks sinyalizasyonu yoluyla modüle edilebilir. CD ayrıca sinyal zincirlerini bozarak ERK1/2, JNK (c-Jun N-terminal kinaz) ve p38 MAPK (p38 mitogen-aktive protein kinaz) aktivasyon durumunu birden fazla hücre tipinde^{değiştirir.} ERK1/2'yi MAPK zincirinde aktive ederek, Cd hücre çoğalmasını ve hayatta kalmasını teşvik edebilir, programlanmış hücre ölümünü bastırabilir ve anormal hiperproliferasyona^{katkıda bulunabilir 13}. CD, anahtar efektör proteinlerin ifadesini ve aktivitesini doğrudan veya dolaylı olarak düzenleyebilir. Örneğin, tümör baskılayıcı p53'ü aşağı regule eder ve Bcl-2 ile Bcl-xL gibi anti-apoptotik proteinleri yukarı düzenler; bu da nihayetinde apoptozu ve hücre döngüsü^{homeostazını 14} bozur.

CD'nin sitotoksik etkilerini değerlendirmek için kullanılan CO modellerinde, organoid canlılığını değerlendirmek için ATP içeriği ölçümü yaygın olarak kullanılır. Enerji metabolizmasının merkezi molekülü olan ATP, organoidlerin genel metabolik durumunu ve canlılığını doğrudan yansıtır. CO'larda kadmiyum maruziyeti, Cd öncelikle mitokondriyal işlev bozukluğunu indükler, oksidatif stresi artırar ve organoid enerji homeostazını bozar. Bu olaylar birlikte ATP üretimini zayıflatır ve nihayetinde organoid canlılığını azaltır. Bu nedenle, ATP seviyelerindeki değişiklikler, kadmiyum kaynaklı sitotoksisitenin sağlam fonksiyonel bir okuması olarak hizmet eder. Geleneksel sitotoksisite testleri arasında kolorimetrik MTT/CCK-8 testleri, Canlı/Ölü boyama ve akış sitometrisi tabanlı analizler bulunur. Bu yöntemlerle karşılaştırıldığında, ATP tabanlı testler üç boyutlu organoid sistemlerde belirgin avantajlar sunar. Organoidlerin yapısal karmaşıklığı ve belirgin mekansal heterojenliği nedeniyle, geleneksel boyama ve görüntüleme yaklaşımları genellikle yetersiz doku nüfuzu ve azalmış nicel doğruluk nedeniyle sınırlıdır. Buna karşılık, ATP testleri lusiferaz aracılı biyolüminesans reaksiyona dayanır ve organoid yapısını bozmadan doğrudan nicelik ölçemeyi sağlar. ATP ölçümü yüksek hassasiyet ve geniş bir dinamik aralık sergiler. Bu sayede erken metabolik baskılamadan organoid ölümüne kadar uzanan sürekli biyolojik yanıtların tespit edilmesini sağlar ve farklı kadmiyum konsantrasyonlarında doğru doz-yanıt analizlerini kolaylaştırır. ATP seviyeleri, organoidlerin genel fonksiyonel durumunu kapsamlı şekilde yansıtır ve morfolojik değerlendirmeye veya tek moleküler belirteçlere bağlı yaklaşımları geride bırakır. Bu nedenle, bu test özellikle yüksek verimli toksisite taraması için uygundur ve daha iyi kararlılık ve tekrarlanabilirlik sunar.

CO'ların Cd maruziyetine duyarlılığını değerlendirmek için ATP biyolüminesansının kullanımının temel ilkesi, ateşböceği lusiferazının ATP, Mg²⁺ ve O₂ varlığında D-lusiferinin oksidasyonunu katalize ederek oksilüsiferin üretmesi ve foton yaymasıdır. Yayılan ışığın yoğunluğu, örnekteki ölçülebilir ATP içeriğiyle tanımlanmış bir doğrusal aralık içinde orantılıdır. Bu nedenle, lüminesans hücresel metabolik aktivite veya yaşamlılık için dolaylı bir nicel vekil olarak hizmet eder. Organoidler, ekstrasellüler bir matriksin içine gömülür ve çok katmanlı üç boyutlu bir yapıya sahiptir. Bunu karşılamak için, ATP test reaktifleri optimize edilmiş lizis-tampon bileşimleri ve prosedürleri içerir. Bu optimizasyonlar, iç organoid hücrelerin bozulmasını artırır, ATP salınımını destekler ve biyolüminesans sinyal^15'i stabilize eder. Önemli olarak, ATP biyolüminesansı metabolik aktivite bildirir, kesin hücre sayısı değil. Örneğin, mitokondriyal inhibitörler, hücreler canlı kalırken bile kısa aralıklarda hücresel ATP seviyelerini belirgin şekilde azaltabilir. Buna karşılık, bazı erken hücre ölüm türleri nispeten yüksek ATP seviyelerini geçici olarak koruyabilir.

Kadmiyum (Cd) toksisite değerlendirmelerinde üstün fizyolojik önem göstermelerine rağmen, kolorektal organoid modeller birkaç pratik sınırlama sunmaktadır. Geleneksel iki boyutlu (2D) hücre hatlarına kıyasla, organoid yetiştirme daha zaman alıcı ve maliyet daçtır. Ayrıca, hayvan kaynaklı matrislere olan bağımlılıkları, büyük ölçekli, yüksek verimli toksisite taramasında faydalarını kısıtlayan partiden partiye değişkenlik yaratır. Bu modeller, ağır metallerin bağırsak epitelleri üzerindeki doğrudan toksikolojik etkilerini değerlendirmek için oldukça uygun olsa da, sistemik toksisite veya karmaşık toksikoinetik süreçleri değerlendirmek için in vivo modellerin yerini tam olarak değiştiremiyorlar.

Bu çalışmada, kolorektal kök hücreleri izole etmek ve in vitro CO'ları oluşturmak için kaynak materyal olarak insan kolorektal dokusu kullanılmıştır. Organoidler çeşitli konsantrasyonlarda ve farklı maruziyet sürelerinde CD'ye maruz kaldı. Daha sonra lüminesans, çok modlu mikroplaka okuyucu kullanılarak lüminesans-algılama modunda ölçüldü. Hücre canlılığı veya IC50 değerleri, belirli bir mikroplaka okuyucu için operasyonel yazılım kullanılarak hesaplandı ve görselleştirildi.

Protokol

Deney, Suzhou Mesleki Sağlık Koleji Etik Komitesi tarafından onaylandı (Onay No. SWYXLL202516) ve tıbbi etik standartlara uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Bu araştırmadaki tüm denekler yazılı bilgilendirilmiş onay vermiştir.

1. İnsan kolorektal dokusunun izolasyonu ve CO'ların oluşması

1. Doku Örneklerinin Taşınması ve Korunması
   1. Deneyden önce, bazal membran matrisini 4 °C'de yavaşça eritin ve gerekli kültür ortamını oda sıcaklığına dengeleyin.
   2. Klinik işlemlerden elde edilen insan kolorektal dokusunu hemen önceden soğutulmuş doku koruma çözeltisine (2–8 °C) yerleştirin.
      NOT: Taşınma sırasında dokunun tamamen su altında kaldığından emin olun. Örnekleri laboratuvara aktarın.
2. Biyogüvenlik dolabının altında, dokuyu değerlendirme için 6 cm boyutunda bir kültür kabına yerleştirin. Görünür yağ dokusu ve kas katmanlarını bistüri ve forseps kullanarak dikkatlice çıkarın, epitel bileşenleri korun.
3. Doku, 3 mL Fosfat-Tamponlu Salin (PBS) içeren 6 cm'lik bir kaba ve 300 μL antibiyotik takviyesi yapıldı. Dokuyu 2 mm × 5 mm parçalara kesin.
4. Doku parçalarını 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın.
5. Tüpe 10 mL önceden soğutmalı PBS ve 200 μL 0.5 M EDTA (nihai konsantrasyon ~10 mM) eklenir.
6. Tüpü oda sıcaklığında bir shaker'a koyup 0.072 g ile 15 dakika boyunca nazikçe karıştırın.
7. Dokuyu kültür kabına aktarmak için forseps kullanın ve mikroskop altında inceleyin. Mezar yapıları görünür hale geldiğinde veya ayrılmaya başlayınca bir sonraki adıma geçin.
   NOT: EDTA tedavisinden sonra mikroskobik gözlem altında kriptler yapıları görünür hale geldiğinde, sindirim genellikle kripta izolasyonu için yeterli seviyeye ulaşmış olur ve kriptler gevşemiş epitel doku parçalarından ayrılmaya başlar. Sağlam kriptler genellikle belirgin bir merkezi lümenle iyi tanımlanmış bez veya tübüler morfolojiye sahiptirken, aşırı sindirim çok sayıda ayrışmış tek hücre ve nekrotik kalıntı üretir.
8. Birçok sağlam kripta göründüğünde ve doku parçaları gevşek ve saydam göründüğünde sindirimi sonlandırın; böylece nazik pipetleme kriptaları kolayca serbest bırakabilir.
   NOT: Uzun süreli EDTA kuluçkası, kript bütünlüğünü bozar, hücresel döküntü birikimini artırır ve bağırsak kök hücre canlılığını azaltır; böylece sonraki organoid oluşum etkinliğini azaltır.
9. EDTA sindirimini durdurmak için 15 mL antibiyotikle takviyeli PBS ekleyin. Nazikçe karıştır.
10. Numuneyi 300 × g sıcaklığında 4 °C'de 3 dakika boyunca santrifüjleyin.
11. Üst yüzeyi çıkarın.
12. 1 mL tam hücre ortamı ekleyin ve süspansiyonu 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
13. Süspansiyonu 300 × g'de 3 dakika santrifüj edin ve süspansiyonu atın.
14. 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne taban membran matrisinden 500 μL ekleyin ve iyi karıştırın.
15. Karıştırma sırasında oda sıcaklığına maruz kalmayı en aza indirin ve taban membran matrisini buzun üzerinde tutarak erken katılaşmayı önleyin.
16. 24 kuyruklu plakanın her kuyusuna damla olarak 25 μL karışım ekleyin ve bir damla oluşturun.
17. 24 kuyu plakasını ters çevirin ve %5 CO₂ ile 37 °C'de 20 dakika kuluçka yapın.
18. Her kuyuya 600 μL CO kültür ortamı ekleyin.
19. Ticari kaynaklardan kolorektal organoid kültür ortamı ve dissosiyasyon reaktifleri alın ve üreticilerin talimatlarına uygun olarak kullanın.
20. Tam hücre kültür ortamı hazırlamak için, 500 mL DMEM bazal ortamına 50 mL fetal sığır serumu (FBS) ve 5 mL penisillin-streptomisin eklenin. Çözeltiyi hafifçe ters çevirerek iyice karıştırın.

2. Cd'ye maruz kalan CO'ların hassasiyet testi

1. 96 kuyu plakalarında CO'ların kaplaması ve kültürlenmesi
   1. Her kuyunun kültür ortamını atıp 500 μL organoid dissosiyasyon çözeltisi ekleyin. Bazal zar matrisini dağıtmak için hafifçe yukarı ve aşağı pipet yapın.
   2. İşlenmiş tabağı sindirim için 37 °C, %5 CO₂ inkübatöre yerleştirin; ilk sindirim süresi 10 dakikadır.
   3. 24 kuyu plakasının her kuyusundan sindirim çözeltisi 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne toplan ve 10 mL tam hücre kültürü ortamı eklenecektir.
   4. 300 × g seviyesinde 3 dakika boyunca santrifüj yapın, organoidi toplayıp süpernatantı atın.
   5. 1 mL tam hücre kültürü ortamı ekleyin, pipetle iyice karıştırın ve süspansiyonu 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
   6. 300 × g seviyesinde 3 dakika santrifüj yapın, sonra süpernatantı atın.
   7. 100 μL bazal membran matrisi ekleyin ve pipetle iyice karıştırın.
   8. Organoidleri ayırın ve mikroskop altında tek hücre sayısını tahmin edin, ardından yaklaşık 3.000–5.000 tek hücre tohumu bir kuyuya tohumlanın.
   9. Tüm deneysel gruplarda nispeten tutarlı bir tohumlama yoğunluğu korumak, tekrarlanabilir organoid büyüme ve deneysel sonuçlar sağlanmak.
   10. Organoid ayrışmasından sonra mikroskobik değerlendirmeye ve organoid kültür çalışmalarında yaygın olarak kullanılan daha önce bildirilen koşullara dayanarak tohumlama aralığını ayarlayın.
   11. 96 kuyruklu bir plakanın her kuyusunun ortasına 6 μL karışım ekleyin. Toplamda 30 kuyu kullanın, üç teknik kopya var.
   12. Plakayı ters çevirin ve %5 CO₂ inkübatörde 37 °C'de 15 dakika kuluçka yapın.
   13. 96 kuyu tabakasının her kuyusuna 100 μL organoid kültür ortamı ekleyin.
   14. Kadmiyum tedavisine tam olarak 7 gün sonra başlayın.
       NOT: Bu 7 günlük kültür dönemi, tek hücrelerin yapısal olarak sağlam CO'lara tam olarak gelişmesini sağlar.
2. CD Konsantrasyon Sulandırması
   1. 3,67 mg kadmiyum klorür tozunu 2 mL steril ultra saf suda çözerek 2 mL nihai hacmi olan 10 mM stok çözeltisi hazırlanır.
   2. 2 mL 10 mM kadmiyum çözeltisini 0.22 μm filtreden geçirerek sterilize edin.
   3. Sterilize edilmiş kadmiyum çözeltiyi 1,5 mL santrifüj tüplerine alıp 4 °C'de, ışıktan korunarak depolayın.
   4. Deney boyunca laboratuvar önlüğü, koruyucu eldivenler ve koruyucu gözlükler dahil olmak üzere uygun kişisel koruyucu ekipman (PPE) giyin.
   5. Tüm ilgili işlemleri kimyasal bir duman davlumbanında gerçekleştirerek maruz kalma risklerini en aza indirin.
   6. Kadmiyum takviyeli kültür ortamı, pipet uçları, santrifüj tüpleri ve kültür kapları dahil olmak üzere tüm Cd içeren atıkları tehlikeli kimyasal atık olarak sınıflandırın ve yönetin.
   7. Bu malzemeleri belirlenmiş ağır metal sıvı veya katı atık toplama konteynerlerine atın.
   8. Tüm atıkları kurumsal yönergeler ve yerel çevre düzenlemelerine uygun olarak sıkı bir şekilde bertaraf etmelidir.
   9. CD atıklarını asla genel laboratuvar çöpü olarak kabul etmeyin veya lavaboya dökmeyin.
   10. 24 kuyruklu bir plakanın kapağını 4, 3, 2, 1 ve 0 olarak etiketleyin.
       NOT: Organoidleri 40 μM, 20 μM, 10 μM, 5 μM ve 0 μM nihai konsantrasyonlarda Cd ile tedavi edin. Kadmiyum stok çözeltisinin seyreltilmesi standart formül kullanılarak hesaplandı:
               C₁ V₁ = C₂ V₂
3. 20 μM çalışma konsantrasyonundan 4 mL hazırlamak için, 3992 μL tam kültür ortamına 10 mM stok çözeltisinden 8 μL eklenin. Çözeltiyi iyice karıştırarak eşit dağılımı sağlar.
   1. İyi etiketlenmiş 4 kuyuya 1,4 mL kültür ortamı ekleyin ve kalan her bir kuyuya 700 μL kültür ortamı ekleyin.
   2. İyi etiketlenmiş 4 bölgeden 5,6 μL kültür ortamı alın ve 5,6 μL kadmiyum çözeltisi ekleyin. İyice karıştırın.
   3. İyi etiketlenmiş '4' noktasından iyi etiketlenmiş '3' noktasına 700 μL çözeltiyi aktarın ve iyice karıştırın.
   4. Her kuyidan bir sonraki daha düşük numaralı kuyuya ('3'ten '2'ye, '2'den '1'e, '1''den '0'a) aktarma ve karıştırma işlemini tekrarlayın, her adımda iyice karıştırın.
      NOT: İyi etiketlenmiş 0'da herhangi bir işlem yapılmamalıdır.
   5. 96 kuyu tabakasını kuluçka makinesinden çıkarın ve mevcut kültür ortamını atın.
   6. 96 kuyululu plakanın kapağını soldan sağa 40 μM, 20 μM, 10 μM, 5 μM ve 0 μM olarak etiketleyin.
   7. Her etiketlenmiş kuyuya 100 μL kadmiyum içeren kültür ortamı ekleyin.
   8. Tabağı kuluçka makinesine yerleştirin.

3. Luminescent Canlı Hareket Reaktifinin Eklenmesi

1. −20 °C dondurucudan parlayan canlılık reaktifini çıkarın ve oda sıcaklığında çözülmesine izin verin. Luminesan canlılık reaktifini 1:1 hacim oranında ekleyin.
2. Tek kullanımlık bir reaktif rezervuarına 2,5 ml parıldayan canlılık reaktifi ekleyin.
3. 2,5 mL kolorektal organoid kültür ortamı ekleyin ve pipetle iyice karıştırın.
4. 96 kuyu plakasının her kuyusundan organoid kültür ortamını çıkarmak için atık aspirasyon sistemi kullanın. Bazaz membran matrisini kuyulardan aspirasyon yapmaktan kaçının.
5. Tek kullanımlık reaktif rezervuaristen 200 μL çözeltiyi CO'ların bulunduğu 96 kuyu plakasının her kuyusuna aktarın ve güçlü pipetle iyice karıştırın. Pipet yaparken hava kabarcıkları oluşturmaktan kaçının.
6. Tabağı oda sıcaklığında 25 dakika kuluçka yapın. Oda sıcaklığında ışıktan korunarak kuluçka yapın.

4. Luminesan canlılık reaktif ölçümü

1. Belirli mikroplaka okuyucunun işletim yazılımını açın (Ek Şekil 1A).
2. Şimdi Oku (Ek Şekil 1B) üzerine tıklayın.
3. Yeni Sayfaya tıklayın (Ek Şekil 1B).
4. Okuma (Ek Şekil 1C) tuşuna tıklayın.
5. Seçilmiş Lüminesans (Ek Şekil 1D).
6. Lüminesans lifini seçin (Ek Şekil 1D).
7. Tamam'a tıklayın (Ek Şekil 1D).
8. Tam plakayı seçin (Ek Şekil 1E).
9. Hepsini Temizle (Ek Şekil 1F) tuşuna tıklayın.
10. Hedef 96 kuyu plakasında karşılık gelen konumları seçin, toplamda 15 kuyu (Ek Şekil 1G).
11. Tamam'a tıklayın (Ek Şekil 1G).
12. 96 kuyu plakasını enstrümata yerleştirin (Ek Şekil 1H).
13. Use Gap'ı seçin (Ek Şekil 1I).
14. Ölçümü başlatmak için Ok'ya tıklayın (Ek Şekil 1I).
15. Ölçüm tamamlandıktan sonra, veriyi Excel'e aktarmak için Dışa Aktar tuşuna tıklayın (Ek Şekil 1J).

5. Veri işleme ve analiz

1. Doğrusal olmayan regresyon yapabilen açık istatistiksel veri analiz yazılımı. (Ek Şekil 2A).
2. Bir XY veri tablosu seçin (Ek Şekil 2A).
3. X'i sayılara ayarlayın (Ek Şekil 2A).
4. Y'yi yan yana alt sütunlara replikasyon değerlerini girecek şekilde ayarlayın ve 3 replikasyon girin (Ek Şekil 2A).
5. Verileri girin (Ek Şekil 2B).
6. Tıklama analizleri (Ek Şekil 2C).
7. XY analizlerine tıklayın (Ek Şekil 2D).
8. Doğrusal olmayan regresyona (eğri uyumu) tıklayın (Ek Şekil 2D).
9. Tamam'a tıklayın. (Ek Şekil 2D).
10. Doz–yanıt – İnhibisyon seçin (Ek Şekil 2E).
11. Log(inhibitör) vs. normalize yanıt – Değişken eğim seçin (Ek Şekil 2E).
12. Analizi çalıştırmak için Ok'a tıklayın (Ek Şekil 2E).
13. Dosyaya tıklayın (Ek Şekil 2F).
14. Dışa Aktarma (Ek Şekil 2F) tuşuna tıklayın.
15. Tamam'a tıklayın (Ek Şekil 2G).

Sonuçlar

İnsan CO'ların Kurulması
Kolorektal kriptleri doku örneklerinden başarıyla izole ettik ve tipik kriptoloji hem düşük hem de yüksek büyütme mikroskopisiyle net şekilde gözlemlendi. In vitro kültür sırasında, izole kriptler yavaş yavaş genişlemiş ve düzenli bir morfolojik olgunlaşma süreci sergilemiştir (Şekil 1A,B). Kültürün 3. ve 6. günlerinde, yapısal olarak sağlam kolorektal organoidler oluşmuştu ve ağırlıklı olarak küresel veya erken tomurcuklanma benzeri yapılar sergiliyordu (Şekil 1C,D).

CO'ların Cd maruziyetine duyarlılığı
CO'lar 96 kuyu tabakalarına tohumlanarak ek 5 gün kültürlendi, ardından 0, 5, 10, 20 ve 40 μM konsantrasyonlarda kadmiyum ile işlem yapıldı. 72 saat maruz kaldıktan sonra, göreli lüminesans birimlerini (RLU) ölçmek için ATP tabanlı bir lüminesans testi yapıldı ve veriler analiz edilip görselleştirildi. Sonuçlar, kadmiyum konsantrasyonlarının artmasıyla organoid canlılığında doz bağımlı anlamlı bir düşüş gösterdi (Şekil 2A). 10 μM, 20 μM ve 40 μM kadmiyuma maruz kalan CO'lar belirgin şekilde azalmış RLU değerleri göstermiştir (Şekil 2B). 5 μM Cd'ye maruz kalan kolorektal organoidlerde belirgin toksisite gözlemlemedik. Canlı kullanım verileriyle uyumlu olarak, morfolojik analiz, kadmiyum ile işlenmiş kolorektal organoidlerde belirgin yapısal değişiklikler ortaya koydu; bunlar arasında organoid boyutun azalması, epitel mimarisinde ciddi bozulma ve ilerleyici yapısal parçalanma bulundu (Şekil 2C). Bu bulgular, kolorektal organoidlerin kadmiyum kaynaklı sitotoksisiteye karşı son derece hassas olduğunu göstermektedir.

Şekil 1: İnsan kolorektal kriptlerinin izolasyonu ve kolorektal organoid kültürlerinin oluşması. (A) İzole insan kolorektal kriptlerinin temsil görüntüsü. (10×). (B) Tek bir kriptin yüksek büyütme görünümü (20×). (C) Kültürde 3 gün sonra CO'ların temsil eden görüntüsü (4×). Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: CO'larda CD kaynaklı sitotoksik ve morfolojik değişiklikler. (A) Farklı Cd konsantrasyonlarına maruz kalan CO'ların göreli doz-yanıt eğrisi. x ekseni Cd konsantrasyonlarını, y ekseni ise göreli organoid yaşamlılığı gösterir. (B) Farklı CD konsantrasyonlarıyla yapılan işlemlerden sonra CO'ların göreli RLU değerleri. X ekseni Cd konsantrasyonlarını, Y ekseni ise göreli RLU değerlerini gösterir. Tek yönlü ANOVA *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001. (C) 5 μM, 10 μM, 20μM, 40μM'de işlenmemiş (0 μM) ve Cd ile işlenmiş CO'ların temsil eden parlak alan görüntüleri. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 1: Belirli bir mikroplaka okuyucu için işletim yazılımı kullanılarak RLU algılanması için ayrıntılı 16 adımlı iş akışı. (A) Yazılım simgesi. (B) Yazılım fırlatma arayüzü. (C) Ayarlar menüsü. (D) Test seçimi arayüzü. (E) Plaka düzeni yapılandırma menüsü. (F) Varsayılan plaka düzeni. (G) Kuyu pozisyonlarını deneysel plaka düzenine göre yapılandırın. (H) Mikroplaka yükleniyor. (I) Alet RLU ölçümü başlatır. (J) Veri ihracatı. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 2: Aşağıdaki veri ihracatı, veri işleme ve istatistiksel analiz istatistiksel veri analiz yazılımında gerçekleştirilir. (A) Ana ekran. (B) Veri giriş tablosu. (C) Analiz diyalogu. (D) Analiz parametreleri menüsü. (E) Doğrusal olmayan regresyon için yapılandırma menüsü. (F) Dosya seçenekleri menüsü. (G) Veri dışa aktarma diyalogu. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Bu çalışma, kadmiyumun organoid canlılığı üzerindeki etkisini değerlendirmek için COs kullanılarak kadmiyum maruziyeti ve ATP kullanılabilirliği testleri için standartlaştırılmış bir protokol oluşturmaktadır. Bu protokol, deneysel tekrarlanabilirliği ve sonraki ATP test okumalarının stabilitesini artırmak için organoid dissosiyasyon ve 96 kuyu kaplama adımlarını özellikle optimize eder. Mevcut deneysel protokol öncelikle Cd toksisitesi değerlendirmesi için 3D kolorektal kanser organoid modeli oluşturmaya odaklansa da, kapsamlı araştırmalar geleneksel 2B hücre kültürleri ve 3D organoid modellerinin ilaç yanıtları, hücre-hücre etkileşimleri, doku mimarisi ve toksikolojik profillerde önemli ölçüde farklılık gösterdiğini göstermiştir. 2B monokatmanlara kıyasla, organoidler tümörlerin mekansal mimarisini, hücresel heterojenliğini ve in vivo gibi mikro ortamını daha sadık şekilde yansıtır ve üstün fizyolojik önem sunar. Karmaşık hücre-hücre ve hücre-ekstrasellüler matris (ECM) etkileşimlerinin olmaması nedeniyle, 2D kültürlerin ağır metallere maruz kalma tepkisi, gerçek in vivo toksikolojik süreçleri doğru şekilde yakalayamayabilir¹⁶. Buna karşılık, bu çalışmada oluşturulan CO modeli, tümör dokularının üç boyutlu büyüme dinamiklerini etkili bir şekilde simüle eder ve Cd kaynaklı toksisiteyi değerlendirmek için fizyolojik olarak oldukça önemli bir platform sağlar.

Organoid geçiş sırasında dissosiyasyon süresi yaklaşık 10 dakika olarak sıkı bir şekilde tutuldu. Bu optimizasyon, aşırı büyük hücre agregalarına yol açan eksik ayrışmayı önlerken, aşırı ayrışmayı da önler; bu da aşırı sayıda tek hücre ortaya çıkarır. Dissosiyasyonun boyutunu hassas şekilde kontrol ederek, nispeten uniform organoid yapılar elde ettik, böylece sonraki farmakolojik tedavilerin ve ATP canlılık testlerinin tutarlılığını artırdık.

Yüksek verimli 96 kuyu kültür sistemi kullandık ve bazaz membran matris kaplama hacmini kuyu başına 6 μL olarak standartlaştırdık. Bu standartlaşma, tüm kuyular boyunca tutarlı organoid yoğunluğu ve büyüme özellikleri sağlayarak kuyu arası değişkenliği en aza indirir ve nihayetinde deneysel tekrarlanabilirliği ve veri karşılaştırılabilirliğini artırır. ATP lüminesans testlerini istatistiksel veri analiz yazılımı kullanılarak doz-yanıt eğrisi analizleriyle birleştirerek, Cd maruziyeti sonrası organoid yaşamalılıkta güçlü bir nicel değerlendirme elde ettik. Bu çalışma, çevresel toksikoloji ve ağır metal maruziyetinde organoid modellerinin uygulanması için yüksek tekrarlanabilir bir deneysel protokol oluşturmaktadır.

COS kültürü sırasında, kript pelletinin bazal zar matrisi ile kapsamlı şekilde karıştırılması, doğru CO oluşumunu ve stabil büyümeyi sağlamak için kritik bir adımdır. Bazaz membran matrisinin oranı %70'in üzerinde tutulmalıdır (bazaz zarı matrisi hacmi %70 >). Önerilen bazal membran matris hacimleri, 96 kuyu plakaları için kuyu başına 6 μL, 48 kuyuklu plakalar için 20 μL ve 24 kuyuluk plakalar için 25 μL'dir. Matris polimerizasyonundan sonra, kuyular için şu hacimleri ekleyin: 96 kuyululu plakalar için kuyu başına 100 μL, 48 kuyululu plakalar için kuyu başına 300 μL ve 24 kuyuyla plakalar için kuyu başına 500 μL. Ortamın doğrudan taban membran matris kubbelerine pipetlenmesine dikkat edilmelidir; çünkü bu üç boyutlu mimariyi bozabilir. Fenotipik ve genetik stabiliteyi korumak için bu çalışma kolorektal organoid kullanımını maksimum 4 pasajla sınırlamıştır.

Kriptler veya CO'lar yaklaşık 600 μm çapa ulaştığında veya kararma ve büyüme durması gösterdiğinde, sonraki hassasiyet analizlerinin yapılmasını sağlamak için geçiş işlemi hemen yapılmalıdır. CO'ların enzimatik ayrışması sırasında, sindirim mikroskop altında izlenmelidir. Eğer CO'lar küçük hücre kümelerine veya tek hücrelere yeterince ayrılmazsa, organoid boyutu ve ayrışma durumuna göre sindirim süresi kademeli olarak uzatılabilir. Aşırı sindirim ve hücre canlılığının kaybı riskini en aza indirmek için tek adımda uzun süreli sindirimden kaçınılmalıdır.

Aşağıdaki denklemi kullanarak her kuyu için göreli canlılığı hesaplayın ve her yoğunlaşma için yanıt değeri olarak replika kuyularından alınan ortalama yüzdeyi kullanın

 

ATP biyolüminesans testi, ateşböceği lusiferaz-katalizlenmiş D-luciferin oksidasyonuna dayanır ve bu da foton emisyonuna yol açar. Yüksek hassasiyeti, plaka tabanlı yüksek verimli formatlarla uyumluluğu ve standart ticari kitlerin bulunabilirliği nedeniyle, bu yöntem organoid modellerde ön toksisite taraması için yaygın olarak^{uygulanmıştır 17}.

Birkaç kafa karıştırıcı faktör göz önünde bulundurulmalıdır. Bazı kimyasallar, kimyasal girişim veya enzimatik baskılama yoluyla lusiferaz enzimatik reaksiyonunu doğrudan inhibe edebilir ve sinyal söndürülmesine yol açabilir. Üç boyutlu ekstraselüler matriksinden kaynaklanan arka plan lüminesensi, organoid boyut ve yoğunluktaki heterojenlik ve eksik lizi, önemli kuyular arası ve partiler arası değişkenlik yaratabilir. ATP tabanlı lüminesans tek başına hücre ölüm modalitelerini doğru şekilde ayırt etmez veya altta yatan toksikolojik mekanizmaları^{aydınlatamaz 18}.

Metodolojik güvenilirliği artırmak için sistematik kalite kontrol önlemleri önerilir. Üretici tarafından önerilen veya önceden doğrulanmış lizis tamponları ve gerekirse hücre lizisi verimliliğini artırmak için genişletilmiş liz süresi, mekanik ayrışma veya donma-erime döngüleri kullanılarak matris içinde hücre lizis verimliliğini artırmak. İkinci olarak, test optimizasyonu sırasında test bileşikleri veya liz ortamı tarafından parlak reaksiyonun doğrudan inhibisyonunu değerlendirmek için ATP spike-in geri kazanım deneyleri yapılabilir. Üçüncü olarak, doğrusal tespit aralığını ATP standart eğrisi kullanarak doğrulayın ve teknik değişkenliği en aza indirmek için reaktif ekleme, kuluçka ve plaka okuma arasındaki zamanlamayı sıkı bir şekilde kontrol edin. Son olarak, her testte boşluk, araç ve negatif kontroller ekleyin ve kenar etkileri ile parti ile ilgili varyasyonları değerlendirmek ve düzeltmek için yeterli teknik kopyalar ekleyin. Son zamanlarda, geliştirilmiş liz kimyası ve gelişmiş sinyal kararlılığı ile organoid optimize edilmiş canlılık testleri geliştirildi ve bu formülasyonlar genellikle üç boyutlu toksisite testlerinde üstün performans^{göstermiştir 19}. Özetle, bu çalışma insan CO'larını çevresel ağır metal toksikolojisinin in vitro modeli olarak kullandı ve organoid maruziyetine karşı organoid hassasiyetini değerlendirmek için yüksek verimliliğe duyarlı, hassas ATP biyolüminesans tabanlı bir test oluşturdu. Bu çalışma, organoid tabanlı araştırma sistemlerinde toksisite değerlendirmesi için pratik deneysel referans ve metodolojik rehberlik sağlar.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
100 μm cell strainer	BIOLOGIX	15-1100
15 mL centrifuge tubes	BIOFIL	CFT011150
1mL pipette tips	Zhejiang Baidi Biotechnology Co., LTD	H808633
200 μL pipette tips	Zhejiang Baidi Biotechnology Co., LTD	H808214
24-well plates	Corning Incorporated	3524
50 mL centrifuge tubes	CLUXCELL	321050
96-well plates	Corning Incorporated	220400
BioTek Cytation 5	BioTek Co., LTD	16280004	Belirli bir mikroplate okuyucusu için çalışma yazılımı.
Cadmium chloride,10g	Sigma	202908-10G
Cell Counting-Lite 3D Luminescent Cell Viability Assay	Vazyme	DD1102-01/02/03	1:1 hacim oranında ışık saçan canlılık reaktifi.
Human Colonic organoid Kit Plus(Expansion)	Mogenel Biotechnology	MA-0817HOO1HLP
Dulbecco’s Modified Eagle Medium	thermo fisher	6125552
Forceps	Beyotime	FS019
Ice box	Beyotime	FBX078
Low-temperature high-speed centrifuge	Anhui Zhongke Zhongjia Scientific Instrument Co., LTD	KDC-40
Matrigel	Mogenel Biotechnology	82755	Taban zarf matrisi
Organoid Dissociation Solution	Mogenel Biotechnology	MB-0818L01L	Organoid Dissociation Solution
Penicillin-Streptomycin	Beyotime	C0222
Phosphate-buffered saline (1XPBS)	Fdbio Science Biotech Co.,Ltd	FD7032
Pipettes	RUINING	Pipet-Lite XLS
GraphPad Prism 8.0	GraphPad Software		Belirli bir mikroplate okuyucusu için çalışma yazılımı.
Scissors	Beyotime	FS001
Tissue Digestion Solution	Mogenel Biotechnology	MB-0818L06L/MB-0818L06S