Method Article

Epitrankriptomun Çözülmesi: Meme Kanserinde M6A Düzenleyici Ağının In Silico İçgörüleri

DOI:

10.3791/70545

⸱

June 9th, 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Life Sciences, College of Science and General Studies, Alfaisal University, 2Department of Biological and Biomedical Sciences, Aga Khan University, 3College of Medicine, Alfaisal University, 4Affiliated Hospital of Hunan University, School of Biomedical Sciences, Hunan University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, mutasyon profillerini, kopya sayısı değişikliklerini, gen ifadesini ve klinik sonuçları Kanser Genomu Atlası (TCGA), Genotip-Doku İfadesi (GTEx) projesi ve mikroarray platformlarından kamuya açık veri setleri kullanılarak integreleyerek m6A modifikasyon düzenleyicilerinin in silico genetik, moleküler ve prognostik analizlerini yürütmek için bir yaklaşım sunmaktadır.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

N6-metiladenozin (m6A), ökaryot transkriptlerde en çok bulunan iç RNA modifikasyonudur ve RNA metabolizmasında, gen ifadesinde ve hücresel homeostazda kritik bir rol oynar. M6A düzenleyicilerinin düzensizliği, "yazarlar", "silgiler" ve "okuyucular" dahil olmak üzere, giderek kanser biyolojisinde rol oynamaktadır; ancak meme kanserindeki kapsamlı rolleri henüz anlaşılmamaktadır. Bu yöntem makalesinin temel amacı, biyoinformatik yeni başlayacaklara mutasyonel analizler yapmak, gen ifadesi değişikliklerini değerlendirmek ve hasta hayatta kalma ilişkilerini incelemek için kamuya açık kanser veri setlerini adım adım bir çerçeve sunmaktır. Bir vaka çalışması olarak, meme kanserinde m6A düzenleyicileri, Kanser Genomu Atlası (TCGA), Genotip-Doku İfadesi (GTEx) projesi ve mikroarray platformlarından veri setleri kullanılarak analiz edilmiştir. Transkriptomik profiller, meme kanserinde m6A düzenleyici bileşenlerinin prognostik önemini değerlendirmek için iş akışlarını göstermek amacıyla sistematik olarak analiz edildi. Bu analitik çerçeve kullanılarak, önemli m6A düzenleyicileri arasında genetik değişiklikler ve farklı ifade kalıpları tanımlandı. METTL14, CBLL1, YTHDC1, HNRNPC, HNRNPA2B1 ve RBMX gibi birkaç düzenleyici daha iyi hasta sağlıkla ilişkilendirilirken, YWHAG genel hayatta kalma zayıflığıyla ilişkilendirildi. Bu çalışma, meme kanserinde m6A düzenleyici genlerinin kapsamlı bir sistem genomik genel bakışını sunarken, pratik ve tekrarlanabilir web tabanlı biyoinformatik iş akışını göstermektedir. Bu bulgular, meme kanserinde epitrankriptomik düzenlemenin anlaşılmasını ilerletmekte ve yeni m6A tabanlı tanı ve tedavi stratejilerinin geliştirilmesi için temel sunmaktadır.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Epitranskriptomik modifikasyonlar, transkripsiyon sonrası gen düzenlemesinde önemli bir katman oluşturur ve çeşitli hücresel süreçlere ve hastalık durumlarına katkıda bulunur. Bugüne kadar tespit edilen 170'ten fazla RNA modifikasyonu arasında, N6-metiladenosin (m6A), ökaryotmRNA'larda en yaygın ve iyi karakterize edilen olanıdır 1. METTL3/METTL14 dahil "yazar" kompleksleri tarafından kurulan, FTO ve ALKBH5 gibi "silgi" ile çıkarılan ve YTH ile IGF2BP aile üyeleri dahil "okuyucu" proteinler tarafından yorumlanan m6A, RNA ekleme, stabilite, taşıma ve çevirmeyi organize eder; böylece gelişim, farklılaşma ve stres yanıtı gibi temel biyolojiksüreçleri etkiler 2,3.

M6A düzenleyici bileşenlerinde değişiklikler, geniş bir malignite yelpazesindebildirilmiştir 4. Birçok kanserde, anormal m6A aktivitesi kötü huylu fenotipleri tetikler; örneğin, METTL3'ün yüksek ekspresyonu, kirpi yolunu modüle ederek prostat kanserinin başlangıcını ve ilerlemesini teşvik eder ve MYC RNAmetilasyonu 5,6. Başlangıçta akut miyeloid lösemide onkojenik etkiler yaratmakla ilgili olduğu tespit edilen FTO'nun karaciğer, akciğer ve kolorektal kanserlerde tümör ilerlemesinitetiklediği gösterildi 7,8,9,10. Ancak, FTO ve ALKBH5'in bağlam bağımlı rolleri, m6A aracılı regülasyonun ikili doğasını gösteren ve hem onkojenik hem de tümör baskılayıcı sinyalleridestekleyebilen 11,12,13,14 olarak tanımlanmıştır. M6A okuyucuları, YTHDF1/2/3, heterojen nükleer ribonükleoproteinler (hnRNP'ler) ve insülin benzeri büyüme faktörü-2 mRNA bağlayan proteinler (IGF2BP1-3) dahil olmak üzere kanserogenez 15,16,17 ile ilişkili olduğu bulunmuştur.

Meme kanserinde, artan kanıtlar m6A düzenleyicilerinin sıkça düzensiz olduğunu ve tümör alt tipleri, bağışıklık ilişkili özellikleri ve klinik sonuçlarla ilişkili olabileceğinigöstermektedir 18,19. Çoklu mekanistik çalışmalar, METTL3'ü meme kanserinde sık sık artırılmış bir pro-onkojenik faktör olarak konumlandırmaktadır. METTL3 aracılı m6A kurulumu, proliferasyonu, epitelyal-mezenkimal geçişi (EMT), metastazı ve kemorezistansı teşvik eden transkriptlerin translasyonunu stabilize edebilirveya artırabilir 20. METTL3'ün ayrıca Bcl-21'i hedefleyerek meme kanseri ilerlemesini teşvik ettiğigösterilmiştir. ALKBH5, NANOG ve diğer kök kaynaklı moleküller aracılığıyla kanser kök programlarının düzenlenmesinde rol oynamıştır, ancak etkisi tümör bağlamına göredeğişebilir 22.

Son yıllarda m6A düzenleyici listesi genişlemeye devam ederken, yeni belirlenen düzenleyicilerin meme kanserinde nasıl düzensiz olabileceğine dair bir güncellemeye ihtiyaç var. Tablo 1, m6A modifikasyonunun yazarları, okuyucuları ve silgilerini içeren m6A düzenleyicilerinin bir listesini sunmaktadır. Ayrıca, LRPPRC ve YWHAG gibi yeni m6A düzenleyicileri de kanser ilerlemesinde etkileri tespitedilmiştir 23,24,25. Bu nedenle, bilinen tüm m6A düzenleyicilerinin kapsamlı genetik ve moleküler karakterizasyonu, sınırlı biyoinformatik geçmişe sahip araştırmacılar tarafından kullanılabilecek araçlarla meme kanserinde gerçekleştirilmiştir.

Bu Yöntemler makalesinin amacı, kamuya açık kanser genomik kaynakları kullanarak meme kanserinde m6A düzenleyicilerini analiz etmek için adım adım platform tabanlı bir biyoinformatik protokol sunmaktır. Kanser Genomu Atlası (TCGA) (www.cancer.gov/tcga), Genotip Doku İfadesi (GTEx)projesi 26 ve cBioPortal ile UCSC Xena gibi web tabanlı analitik platformlar kullanılarak yapılan bu protokol, mutasyon profillerini, gen ifadesindeki değişiklikleri ve hasta hayatta kalma ilişkisini değerlendirmek için tekrarlanabilir iş akışlarını sunar. Bu görselleştirilmiş ve erişilebilir yaklaşım, kanser biyoinformatiğine yeni başlayan araştırmacılar tarafından epitranskriptomik veri analizinin benimsenmesini kolaylaştırmayı amaçlamaktadır.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NOT: M6A metil düzenleyicilerini kodlayan genlerin listesi, yazar, okuyucu ve silgi olarak kategorize edilmiştir ve Tablo 1'de sunulmaktadır. Tüm listelenen genler, sonraki mutasyonlar, ifade kalıpları ve genel hayatta kalma analizlerine dahil edilmiştir. Bu çalışmada kullanılan tüm yazılım ve araçlar Materyaller Tablosu'nda listelenmiştir.

1. M6A düzenleyicilerindeki genetik değişikliklerin tanımlanması

  1. Kanser genomikleri için cBioPortal'a erişin. cBioportal web sitesine (www.cbioportal.org)27,28 gidin. Ana sayfadan "Sorgu" sekmesini seçerek yeni bir analiz başlatabilirsiniz.
  2. Uygun kanser çalışması ve grubunu seçin.
  3. "Görselleştirme ve Analiz için Çalışmaları Seç" arama çubuğuna "Meme İnvaziv Karsinoması" yazıp "Meme İnvaziv Karsinoma (TCGA, Pan-Kanser Atlas)" seçeneğini seçin.
  4. Alt kısımda "Gene göre sorgulama" seçeneğini seçin.
    KRITİK: Seçilen kohortun (996 örnek) hem mutasyon hem de kopya numarası değişikliği (CNA) verilerini içerdiğinden emin olun.
  5. Genetik soruyu tanımlayın. "Genleri Gir" bölümünde, araştırılan m6A düzenleyicilerinin tam listesi için HUGO gen sembollerini girin.
    NOT: Genler, boşluklarla ayrılmış bir liste olarak girilebilir. "Genomik Profilleri Seç" bölümünde, aşağıdaki iki veri türünün kontrol edildiğinden emin olun: Mutasyonlar ve Kopya Numarası Değişiklikleri.
  6. "Hasta/Vaka Seti Seç" bölümünde, tüm profil vakaların olduğu kohorta karşılık gelen varsayılan örnek setini seçin.
  7. Mavi "Sorgu Gönder" butonuna tıklayın.
  8. Genetik değişim verilerini geri alın ve yorumlayın. Gönderme sırasında sonuç "özet" sekmesinde yüklenir. Merkezi "OncoPrint" görselleştirmesi, kohorttaki tüm sorgulanan genlerde genetik değişikliklere anında bir genel bakış sunar ve bu durum indirilebilir.
  9. OncoPrint'in yanında, "Kanser Tipi Özeti" sayfasını bulun. Bu, meme kanseri alt tipleri arasındaki değişikliklerin nicel bir dağılımı sağlar.
  10. Pan-kanser analizi yapın. cBioPortal ana sayfasına geri dönün ve "Sorgu" sekmesinden "TCGA PanCancer Atlas Studies" seçeneğini seçin.
  11. Gen giriş kutusuna aynı m6A düzenleyici genler listesini girin.
  12. "Submit Request Submit" seçeneğine tıklayın ve sonuçlar sayfasında "Kanser Türleri Özeti" sekmesine gidin. Bu, pan-kanser görünümü sunar.

2. UCSC Xena kullanılarak m6A regülatörlerinin karşılaştırmalı transkriptomik analizi.

  1. UCSC Xena Platformu'na erişin. UCSC Xena web sitesine (https://xena.ucsc.edu)29 gidin.
  2. Ana sayfadan ana analiz tarayıcısına girmek için "Launch Xena" butonuna tıklayın.
  3. Xena tarayıcısında "VERI SETSİ"ne tıklayın.
  4. Veri setleri arasında "TCGA TARGET GTEx" seçeneğini seçin. Bu, TCGA ve GTEx projelerinin normal dokularından gelen eşit şekilde işlenmiş RNA-Seq verilerini içerir.
  5. Bir sonraki sayfada "GÖRSELLEŞTIRMEK"e tıklayın.
  6. Fenotip (örnek grubu) değişkenini tanımlayın. "İlk Değişkeninizi Seçin" bölümünde, Fenotipik veri tipinde "Ana Kategori"yi seçin.
  7. "TO SECOND VARIABLE" seçeneğine tıklayın. Sonra, Genomik veri türünde, veri setinde "Gen İfadesi" işaretini işaretleyin. "Gen veya Pozisyon Ekle" kutusuna gen listesini ekleyin. "Bitti" seçeneğine tıklayın.
  8. İfade desenlerini bir ısı haritasıyla görselleştirin.
  9. Meme (TCGA+GTEx) örneklerini TCGA TARGET GTEx'ten ayırmak için "Breast" yazın ve örnekleri saklamak için filtre seçeneğini kullanın.
  10. Isı haritası artık görünür ve PDF olarak indirilebilir.
  11. Bireysel genler için karşılaştırmalı kutu grafikleri oluşturun. Belirli bir gen için ifade farklılıklarını nicelikten ölçmek ve görselleştirmek için "Grafik olarak Görüntüle" seçeneğini kullanın. Bu seçenekle, veriler kutu grafiki, nokta grafiği ve keman grafiki olarak görüntülenebilir ve iki örnek grubu arasındaki ifade dağılımını karşılaştırır.
  12. Grafikleri indirmek için "PDF olarak indir" seçeneğini kullanın.
  13. İstatistiksel anlamlılık (p-değeri) "İSTATİSTİK"ye tıklayarak elde edilebilir.

3. Kaplan-Meier Plotter kullanılarak m6A regülatörlerinin prognostik öneminin değerlendirilmesi.

  1. Kaplan-Meier Plotter aracına erişin. Kaplan-Meier Plotter web sitesine (https://kmplot.com/analysis)30 gidin.
  2. Ana sayfadan, meme kanseri veri setlerine özgü bir analiz başlatmak için "meme kanseri" sekmesini seçin.
  3. Tek bir gen için gen sorgusunu yapılandırın.
  4. Ana giriş bölümünde "Gen sembolü" kutusunu bulun.
  5. Analiz edilecek m6A regülatör geninin resmi sembolü (örneğin, METTL3) girin.
    KRITİK: Gen giriş kutusunun hemen altında, "Sadece JetSet en iyi sonda seti" için kontrol kutusunu bulun ve etkinleştirin. Bu, geniniz için en güvenilir ve spesifik mikroarray probun otomatik olarak seçilmesini sağlar, veri kalitesini ve tekrarlanabilirliği optimize eder.
  6. Hayatta kalma analizi parametrelerini tanımlayın. "Hayatta kalma" bölümünde, bu analiz için birincil son nokta olarak "Genel hayatta kalma (OS)" yi seçin. Bu ayar seçildiğinde araç otomatik olarak 1880 meme kanseri hastasından alınan verileri kullanır.
  7. "Hastaları böl" seçeneğinin "median" olarak olduğundan emin olun. Bu, hastaları iki eşit gruba ayıracaktır; yüksek ekspresyon ve düşük ekspresyon, sorgulanan genin tüm örneklerdeki medyan ifade değerine dayanır.
  8. "Takip eşiği" takip süresini seçmek için kullanılabilir. Bu çalışma için 180 ay seçildi.
  9. Kaplan-Meier Plot'u oluşturup yorumlayın.
  10. "Kaplan-Meier Plot'u Çiz" butonuna tıklayın.
  11. Yeni bir pencere yüklenir ve hayatta kalma eğrisi gösterilir.
  12. Ana olay örgüsü unsurlarını yorumlayın; X ekseni aylarla zamanı gösterir, Y ekseni genel hayatta kalma olasılığını gösterir, iki renkli çizgi ise yüksek ekspresyonlu (kırmızı) ve düşük ekspresyonlu (siyah) hasta gruplarının sağ kalma eğrilerini temsil eder. Log-rank P-değeri gösterilir ve iki hayatta kalma eğrisi arasındaki farkın istatistiksel anlamlılığını gösterir.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Meme kanserinde m6a metilasyon düzenleyicilerinin mutasyonel manzarası

TCGA veri setlerinin genomik analizine yönelik daha önceki bir çalışmada, DNA metilasyonunun düzenleyicilerini kodlayan birkaç gende tekrarlayan mutasyonlarbildirilmiştir 31. Mevcut çalışmada, cBioPortal "Meme İnvaziv Karsinomu (TCGA, PanCancer Atlas)" veri setini analiz etmek için kullanıldı; böylece m6A RNA metilasyonunun yazarlarını, okuyucularını ve silgilerini kodlayan genlerin mutasyonel profillerini inceledi. Bu analiz, meme kanseri hastaları arasında çeşitli genetik değişiklikleri ortaya koydu; genler arasında değişim sıklıkları önemli ölçüde değişiyordu - CNBP ve RBM15B'de %0,4'ten VIRMA'da %12'ye kadar (Şekil 1A). Gen amplifikasyonu en yaygın değişimi temsil ederken, ek olaylar arasında derin delesiyonlar, baz ikameleri ve birden fazla eşzamanlı değişim vardı. Özellikle, m6A ile ilgili fonksiyonları düzenleyen genlerdeki değişiklikler 476 hastada (kohortun %48'i) tespit edildi (Şekil 1B), bu da meme kanserinde m6A modifikasyon dinamiklerinin önemini vurgulamaktadır. Farklı değişim türlerinin sıklığı değişse de, bu mutasyonlar meme kanserinin tüm moleküler alt tiplerinde gözlemlenmiştir (Şekil 1C). Doğrulama için PIK3CA, TP53, CDH1 ve GATA3 referans kontrol genleri olarak dahil edilmiştir (Şekil 1A). Dikkat çekici bir şekilde, m6A düzenleyici mekanizmasındaki değişiklikler sadece meme kanseriyle sınırlı değildi. TCGA Pan-Kanser Atlas'taki 32 çalışmadan 10.953 hastadan alınan 10.967 örnek analizi, çok çeşitli kanser tiplerinde korunmuş mutasyon desenlerini ortaya koydu. Son zamanlarda, m6A yolunun prostat kanserinde (PCa) sıkça değiştiği ve genel olarak pro-onkojenik bir rol oynadığıgösterilmiştir32. Bu bulgular, m6A RNA modifikasyonunun yazarlarını, okuyucularını ve silgilerini kodlayan genleri etkileyen mutasyonların birden fazla kanserde yaygın bir özellik olduğunu göstermektedir (Şekil 2).

Meme kanserinde anormal gen ifade profilleri

Ortaya çıkan kanıtlar, transkriptomik bozulmaların tümörjenezin temel katkıları olduğunu ve anormal gen ifadesinin meme kanserinde biyobelirteç potansiyeli sunduğunu öne çıkarmaktadır. Bunu araştırmak için, m6A modifikasyonunu düzenleyen genlerin transkript seviyeleri, TCGA ve normal meme dokusunu temsil eden Genotip Doku İfadesi (GTEx) projesinden alınan verilerle analiz edildi. Şekil 3A'da gösterildiği gibi, çeşitli m6A ile ilişkili genler meme kanseri örneklerinde anlamlı düzensizlik göstermiştir. Tümör dokularında normal kontrollere kıyasla hem yukarı regülasyon hem de aşağı regülasyon gözlemlenmiştir. Yazar kompleksinin bileşenleri olan METTL3 ve WTAP, diğer genlerle birlikte aşağı regülasyona uğrarken, VIRMA, YTHDF1 ve YTHDF3 gibi birkaç gen ise yukarı düzenlendi. Şekil 3B , TCGA ve GTEx kohortları arasında bireysel genlerin farklı ifade profillerini daha ayrıntılı olarak açıklar. Bu bulgular toplamda, m6A metilasyon yazarları, okuyucuları ve silgicilerini kodlayan genlerin meme kanserinde kapsamlı transkripsiyonel deregülasyondan geçtiğini ve hastalık ilerlemesinde potansiyel önemlerini vurguladığını göstermektedir.

m6A makine genleri ve hasta prognozlarındaki rolü

Genetik değişiklikler ve gen ifade değişikliklerinin kanser hastaları arasında oldukça yaygın olduğu gözleminin ardından, bu ifade değişikliklerinin meme kanserinde prognostik önemi araştırıldı. Mikroarray veri setlerini entegre eden Kaplan-Meier (KM) Plotter aracı30 kullanılarak, genel sağlık, m6A düzenleyici genlerin ifadesine göre 1880 meme kanseri hastasının kohortunda değerlendirildi. Bu analiz, METTL14, CBLL1, YTHDC1, HNRNPC, HNRNPA2B1 ve RBMX ekspresyonunun artmasının genel hayatta kalma artışıyla anlamlı ilişkili olduğunu ortaya koydu. Buna karşılık, YWHAG aşırı ekspresyonu kötü hayatta kalma sonuçlarıyla korelasyonlıydı (Şekil 4). Kontrol grupları olarak, sırasıyla daha iyi ve kötü prognozun bilinen belirteçleri olan CCND2 ve TOP2A dahil edildi. M6A düzenleyicilerini kodlayan diğer genler, hasta sağkımı ile istatistiksel olarak anlamlı korelasyon göstermedi (Ek şekil). Bu bulgular, meme kanseri tahmininde potansiyel faydası olan m6A metilasyon düzenleyici genlerinin bir alt kümesini ortaya koymaktadır.

figure-results-1
Şekil 1: Meme kanserinde m6A yazarları, okuyucuları ve silgicileri genlerinde genetik değişiklikler. (A) 996 meme kanseri hastası arasındaki değişikliklerin dağılımı gösterilmekte olup, her gri çizgi bireysel bir vakayı temsil eder. Renk kodlu çubuklar, yanlış anlamlı mutasyonlar, derin silinmeler, amplifikasyonlar, çerçeve içi mutasyonlar ve kesinti mutasyonları gibi farklı değişim türlerini gösterir. İyi karakterize edilmiş genler olan PIK3CA, TP53, CDH1 ve GATA3, yerleşik mutasyon sıklıkları nedeniyle pozitif kontrol olarak dahil edilmiştir. (B) Hasta kohortu boyunca m6A düzenleyici genlerin genel değişim sıklığı. (C) Meme kanseri alt tipleri tarafından m6A düzenleyici genlerde genetik değişim desenleri. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın. 

figure-results-2
Şekil 2: M6A yazarları, okuyucuları ve silgilerini kodlayan genlerdeki genetik değişikliklerin sıklığı, çeşitli kanser türlerinde. Analiz, TCGA pan-kanser atlasından alınan verilere dayanmaktadır ve 32 kanser çalışmasında 10.953 hastadan 10.967 örnek içermektedir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın. 

figure-results-3
Şekil 3: M6A yazarları, okuyucuları ve silgilerini kodlayan genlerdeki ifade anomalileri. (A) Tüm genlerin aşırı ifadesi (kırmızı çubuklar) ve eksiekspresyonları (mavi çubuklar) gösterilir. GTEx ve TCGA verileri, normal ve meme kanseri örneklerini karşılaştırmak için kullanıldı. (B) Bu şekil, normal ve meme kanseri hastalarında bireysel gen ifadesinin karşılaştırmasını sunmaktadır. Xena, her gen için p-değerlerini belirlemek amacıyla Welch'in t-testini kullanır. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-4
Şekil 4: M6A yazarları, okuyucuları ve silgicilerinin ifade profilleri ve meme kanserinde prognozla ilişkisi. Kaplan-Meier sağ kalma eğrileri genel hasta sağkalma eğrilerini gösterir; X ekseni zamanı (ayları) gösterirken, Y ekseni genel sağkalma olasılığını gösterir. Kırmızı çizgiler yüksek ifadeli grubu, siyah çizgiler ise düşük ifadeli grubu temsil eder. Hastalar, medyan gen ifade seviyelerine göre sınıflandırıldı. p-değerleri Log-Rank testi kullanılarak belirlendi. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil: M6A düzenleyici üyeleri, Kaplan-Meier sağkalma eğrileriyle gösterildiği gibi hasta genel sağkalma ile anlamlı bir korelasyon göstermemektedir. Kırmızı çizgiler yüksek ifadeli grubu, siyah çizgiler ise düşük ifadeli grubu temsil eder. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

TipGen Sembolü
YazarlarMETTL3
METTL14
ZC3H13
WTAP
RBM15
RBM15B
METTL16
CBLL1
KIAA1429/VIRMA
OkuyucularYTHDF1
YTHDF2
YTHDF3
YTHDC1
YTHDC2
HNRNPA2B1
HNRNPC
HNRNPG/RBMX
IGF2BP1
IGF2BP2
IGF2BP3
CNBP
ELAVL1
SND1
PRRC2A
PRRC2B
PRRC2C
EIF3A
FMR1
FXR1
FXR2
LRPPRC
MSI2
SilgilerALKBH5
FTO

Tablo 1: M6A'nın yazarlarını, okuyucularını ve silgilerini kodlayan genler. Tablo 1, ökaryot RNA'ya m6A modifikasyonunun kurulması, tanıması ve kaldırılmasından sorumlu başlıca gen ailelerine genel bir bakış sunmaktadır.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu Yöntemin makalesi, kanser araştırmalarında herhangi bir gen imzasının sistematik çoklu omik profillenmesi ve klinik çevirisi için kapsamlı, erişilebilir ve entegre bir iş akışı sunar; burada meme kanserinde m6A RNA metil düzenleyicilerinin analiziyle gösterilmiştir. Bu büyük kamu biyobilişim platformlarını birleştirerek, bu yaklaşım araştırmacıların genomik keşiften klinik olarak ilgili hipotezlere ileri düzey hesaplama uzmanlığına ihtiyaç duymadan verimli bir şekilde ilerlemesini sağlar.

Bu metodolojinin temel gücü, modüler, hipotez üreten boru hattıdır. Protokol, kullanıcıyı mantıksal bir dizide yönlendirir; önce hangi genlerin genetik olarak değiştirildiğini belirlemek (cBioPortal kullanılarak), ardından toplu düzeltmeli ortamda ifade düzensizliği değerlendirmek (UCSC Xena kullanılarak) ve son olarak bu düzensizlikin hasta hayatta kalma üzerindeki klinik etkisini (Kaplan-Meier Plotter kullanılarak) değerlendirmek. Bu adımlı analiz, DNA'dan RNA'ya, klinik sonuçlara ve daha ileri çalışmalar için aday genleri etkili bir şekilde önceliklendirir. Örneğin, bu iş akışını m6A düzenleyicilerine uygulamak, YWHAG gibi genleri (sık değişme, kötü hayatta kalma prognostik) fonksiyonel doğrulama için yüksek öncelikli hedefler olarak etkili şekilde belirledi.

Protokolün pan-kanser analizi tasarımı, araştırmacıların moleküler imzanın bir kansere özgü olup olmadığını veya tümörjenezin ortak bir özelliği olup olmadığını hızlıca belirlemelerini sağlar; bu çalışmada m6A mekanizmalarında yaygın değişikliklerde gözlemlendiği gibi. Pan-kanser analizi, m6A yazarlarını, okuyucularını ve silgicilerini etkileyen mutasyonların sadece meme kanseriyle sınırlı olmadığını, birden fazla malignite arasında paylaşıldığını ortaya koydu. Bu, anormal m6A düzenlemesinin onkogenezin farklı tümör tiplerinde ayırt edici bir özellik olduğuna dair toplanan kanıtlarla örtüşmektedir; çünkü kanserin ve fizyolojik süreçlerin birçok belirgâhtisini, örneğin RNA splicing, stabilite, translasyon ve kodlamayan RNAaktivitesi 33 gibi birçok belirgin özelliğini etkiler.

Bu metodolojik yaklaşım son derece uyarlanabilir. M6A düzenleyicileriyle gösterilmiş olsa da, aynı iş akışı hemen uygulanarak bu veritabanlarında bulunan herhangi bir kanser tipinde bağışıklık kontrol noktası genlerini, metabolik enzimleri veya RNA-seq deneylerinden yeni gen imzalarını karakterize etmek için kullanılabilir. Bu adım adım format, ıslak laboratuvar bilim insanlarının gelişmiş in silico analizleri yapma engelini azaltarak genomik veriden biyolojik içgörüleye geçişi hızlandırıyor.

Sonuç olarak, bu protokol kanserle ilgili genlerin bağlamlandırılması için sağlam bir çerçeve sağlar. Mutasyon ortamını tanımlamanın yanı sıra, bulgular m6A'nın regülatörlerinde çift yönlü ifade değişikliklerini ortaya koydu. Bu bulgu, epitrankriptomun karmaşıklığını vurgular ve farklı kanserlerde METTL3 ve YTHDF aile proteinleri için bildirilen çift rollerde ortaya koyduğu bağlam-bağımlı fonksiyon paradigmasınıpekiştirmektedir (34,35). m6A ekseninin ayrıca, üçlü negatif meme kanserinde proliferasyon, metastaz ve bağışıklık kaçınışını düzenlemede rol oynadığıgösterilmiştir 36,37. İlginç bir şekilde, hayatta kalma analizi prognostik öneme sahip bir m6A düzenleyici alt kümesini tespit etti. METTL14, CBLL1, YTHDC1, HNRNPC, HNRNPA2B1 ve RBMX yüksek ekspresyonu olumlu sonuçlarla ilişkilendirilirken, YWHAG ekspresyonu kötü genel hayatta kalma ile korelasyonluydu. Bu bulgular, m6A regülatörlerinin prognostik biyobelirteç olarak potansiyel klinik faydasını desteklemektedir. CBLL1, daha önceki bir çalışmada olumlu prognoza sahip faktörlerden biri olaraktanımlanmıştır 38. Ancak, güncellenmiş m6A düzenleyici üyelerini içeren mevcut analiz, RBMX ve YWHAG gibi ek üyelerin sırasıyla daha iyi ve daha kötü genel hayatta kalmaya sahip olduğunu tespit etti. Farklı düzenleyicilerin olumsuz veya olumlu prognozu tahmin edebildiği gözlemi, kanser biyolojisinde m6A modifikasyonlarının çift ve bağlama özgü işlevlerini vurgular. YTHDF1 ve YTHDF3 tümörlerde önemli ölçüde yukarı regülasyona sahip olsalar da, genel sağlıkla korelasyon eksikliği okuyucular arasında fonksiyonel yedekliliği, kanser alt tipleri arasındaki bağlama bağlı rolleri veya bireysel ifade seviyeleri yerine oranlarını veya net m6A düzenleyici ağını dikkate alma ihtiyacını gösterebilir. Ayrıca, VIRMA en yüksek değişim sıklığını (%12, esas olarak amplifikasyon) gösterse de, ekspresyonu meme kanserinde genel hayatta kalma oranıyla anlamlı bir şekilde korelasyon göstermedi. Olası bir açıklama, hIgh VIRMA ifadesinin yalnızca m6A biriktirme potansiyelinin arttığını gösterdiğidir; bu durumu agresif tümör davranışına çevirecek gerekli aşağı akış okuyucuları veya hedef mRNA'ların olup olmadığını göstermez. Özellikle, YTHDF1 ve YTHDF3 kohortta aşırı ekspresyona girerken, YTHDC1 ve YTHDC2 önemli ölçüde aşağı regülasyonluydu. Bu uyumsuz ifade modeli, onkojenik çıktı için gereken belirli yazar ve okuyucuların fonksiyonel kombinasyonunun meme kanserinde etkili olmayabileceğini göstermektedir. Dolayısıyla, yüksek ifadesine rağmen, VIRMA bu bağlamda baskın bir sürücü olarak hizmet etmeyebilir (Ek şekil).

Yazarlar, bu in silico boru hattının temel sınırlamasını kabul etmektedir. Analizler doğası gereği korelasyonludur; güçlü ilişkiler tanımlar, ancak mekanik nedensellik kurmazlar. Bu nedensellik fonksiyonel genomiklerle veya m6Ayolunun 39 bileşenlerini hedef alan küçük moleküllü inhibitörler kullanılarak belirlenebilir. Özellikle, ilk METTL3 hedefleyen peptid inhibitörü olan RSM3 yakın zamanda geliştirilmiş ve in vivo40 prostat kanseri modellerinde antikanser potansiyeli göstermiştir. Bu yöntemsel iş akışı, bu terapötik müdahalelerden fayda sağlama olasılığı en yüksek olan hasta popülasyonlarını belirlemek ve aday hedefleri belirlemek için değerli bir araç niteliğindedir.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu makalenin bazı bölümleri, netlik ve okunabilirliği artırmak için yapay zeka tabanlı dil araçlarının yardımıyla revize edilmiştir. Tüm özetli içerik, yorum, analiz ve sonuçlar yazarlara aittir. Çıkar çatışması olmadığını bildiriyoruz.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alfaisal Üniversitesi'nden (IRG 25450) RM'ye verilen bir hibe neyse ki kabul edilmektedir.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
cBioPortalMemorial Sloan-Kettering Kanser Merkezihttps://www.cbioportal.org
Genotip-Doku İfadesi (GTEx)GTEx Konsorsiyumuhttps://gtexportal.org
Kaplan-Meier PlotterGyorffy laboratuvarı/A5 Genetics Ltdhttps://kmplot.com
Kanser Genomu Atlası (TCGA)Ulusal Kanser Enstitüsü (NCI)https://www.cancer.gov/tcga
UCSC Xena TarayıcıKaliforniya Üniversitesi Santa Cruzhttps://xenabrowser.net

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

m6A ModificationEpitranscriptomic RegulationBreast CancerRNA Methylationm6A RegulatorsBioinformatics WorkflowGene Expression AnalysisCancer GenomicsPrognostic BiomarkersTCGA Datasets

Related Articles