Method Article

Epitrankriptomun Çözülmesi: Meme Kanserinde M6A Düzenleyici Ağının In Silico İçgörüleri

DOI:

10.3791/70545

⸱

June 9th, 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Life Sciences, College of Science and General Studies, Alfaisal University, 2Department of Biological and Biomedical Sciences, Aga Khan University, 3College of Medicine, Alfaisal University, 4Affiliated Hospital of Hunan University, School of Biomedical Sciences, Hunan University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, mutasyon profillerini, kopya sayısı değişikliklerini, gen ifadesini ve klinik sonuçları Kanser Genomu Atlası (TCGA), Genotip-Doku İfadesi (GTEx) projesi ve mikroarray platformlarından kamuya açık veri setleri kullanılarak integreleyerek m6A modifikasyon düzenleyicilerinin in silico genetik, moleküler ve prognostik analizlerini yürütmek için bir yaklaşım sunmaktadır.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

N6-metiladenozin (m6A), ökaryot transkriptlerde en çok bulunan iç RNA modifikasyonudur ve RNA metabolizmasında, gen ifadesinde ve hücresel homeostazda kritik bir rol oynar. M6A düzenleyicilerinin düzensizliği, "yazarlar", "silgiler" ve "okuyucular" dahil olmak üzere, giderek kanser biyolojisinde rol oynamaktadır; ancak meme kanserindeki kapsamlı rolleri henüz anlaşılmamaktadır. Bu yöntem makalesinin temel amacı, biyoinformatik yeni başlayacaklara mutasyonel analizler yapmak, gen ifadesi değişikliklerini değerlendirmek ve hasta hayatta kalma ilişkilerini incelemek için kamuya açık kanser veri setlerini adım adım bir çerçeve sunmaktır. Bir vaka çalışması olarak, meme kanserinde m6A düzenleyicileri, Kanser Genomu Atlası (TCGA), Genotip-Doku İfadesi (GTEx) projesi ve mikroarray platformlarından veri setleri kullanılarak analiz edilmiştir. Transkriptomik profiller, meme kanserinde m6A düzenleyici bileşenlerinin prognostik önemini değerlendirmek için iş akışlarını göstermek amacıyla sistematik olarak analiz edildi. Bu analitik çerçeve kullanılarak, önemli m6A düzenleyicileri arasında genetik değişiklikler ve farklı ifade kalıpları tanımlandı. METTL14, CBLL1, YTHDC1, HNRNPC, HNRNPA2B1 ve RBMX gibi birkaç düzenleyici daha iyi hasta sağlıkla ilişkilendirilirken, YWHAG genel hayatta kalma zayıflığıyla ilişkilendirildi. Bu çalışma, meme kanserinde m6A düzenleyici genlerinin kapsamlı bir sistem genomik genel bakışını sunarken, pratik ve tekrarlanabilir web tabanlı biyoinformatik iş akışını göstermektedir. Bu bulgular, meme kanserinde epitrankriptomik düzenlemenin anlaşılmasını ilerletmekte ve yeni m6A tabanlı tanı ve tedavi stratejilerinin geliştirilmesi için temel sunmaktadır.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Epitranskriptomik modifikasyonlar, transkripsiyon sonrası gen düzenlemesinde önemli bir katman oluşturur ve çeşitli hücresel süreçlere ve hastalık durumlarına katkıda bulunur. Bugüne kadar tespit edilen 170'ten fazla RNA modifikasyonu arasında, N6-metiladenosin (m6A), ökaryotmRNA'larda en yaygın ve iyi karakterize edilen olanıdır 1. METTL3/METTL14 dahil "yazar" kompleksleri tarafından kurulan, FTO ve ALKBH5 gibi "silgi" ile çıkarılan ve YTH ile IGF2BP aile üyeleri dahil "okuyucu" proteinler tarafından yorumlanan m6A, RNA ekleme, stabilite, taşıma ve çevirmeyi organize eder; böylece gelişim, farklılaşma ve stres yanıtı gibi temel biyolojiksüreçleri etkiler 2,3.

M6A düzenleyici bileşenlerinde değişiklikler, geniş bir malignite yelpazesindebildirilmiştir 4. Birçok kanserde, anormal m6A aktivitesi kötü huylu fenotipleri tetikler; örneğin, METTL3'ün yüksek ekspresyonu, kirpi yolunu modüle ederek prostat kanserinin başlangıcını ve ilerlemesini teşvik eder ve MYC RNAmetilasyonu 5,6. Başlangıçta akut miyeloid lösemide onkojenik etkiler yaratmakla ilgili olduğu tespit edilen FTO'nun karaciğer, akciğer ve kolorektal kanserlerde tümör ilerlemesinitetiklediği gösterildi 7,8,9,10. Ancak, FTO ve ALKBH5'in bağlam bağımlı rolleri, m6A aracılı regülasyonun ikili doğasını gösteren ve hem onkojenik hem de tümör baskılayıcı sinyalleridestekleyebilen 11,12,13,14 olarak tanımlanmıştır. M6A okuyucuları, YTHDF1/2/3, heterojen nükleer ribonükleoproteinler (hnRNP'ler) ve insülin benzeri büyüme faktörü-2 mRNA bağlayan proteinler (IGF2BP1-3) dahil olmak üzere kanserogenez 15,16,17 ile ilişkili olduğu bulunmuştur.

Meme kanserinde, artan kanıtlar m6A düzenleyicilerinin sıkça düzensiz olduğunu ve tümör alt tipleri, bağışıklık ilişkili özellikleri ve klinik sonuçlarla ilişkili olabileceğinigöstermektedir 18,19. Çoklu mekanistik çalışmalar, METTL3'ü meme kanserinde sık sık artırılmış bir pro-onkojenik faktör olarak konumlandırmaktadır. METTL3 aracılı m6A kurulumu, proliferasyonu, epitelyal-mezenkimal geçişi (EMT), metastazı ve kemorezistansı teşvik eden transkriptlerin translasyonunu stabilize edebilirveya artırabilir 20. METTL3'ün ayrıca Bcl-21'i hedefleyerek meme kanseri ilerlemesini teşvik ettiğigösterilmiştir. ALKBH5, NANOG ve diğer kök kaynaklı moleküller aracılığıyla kanser kök programlarının düzenlenmesinde rol oynamıştır, ancak etkisi tümör bağlamına göredeğişebilir 22.

Son yıllarda m6A düzenleyici listesi genişlemeye devam ederken, yeni belirlenen düzenleyicilerin meme kanserinde nasıl düzensiz olabileceğine dair bir güncellemeye ihtiyaç var. Tablo 1, m6A modifikasyonunun yazarları, okuyucuları ve silgilerini içeren m6A düzenleyicilerinin bir listesini sunmaktadır. Ayrıca, LRPPRC ve YWHAG gibi yeni m6A düzenleyicileri de kanser ilerlemesinde etkileri tespitedilmiştir 23,24,25. Bu nedenle, bilinen tüm m6A düzenleyicilerinin kapsamlı genetik ve moleküler karakterizasyonu, sınırlı biyoinformatik geçmişe sahip araştırmacılar tarafından kullanılabilecek araçlarla meme kanserinde gerçekleştirilmiştir.

Bu Yöntemler makalesinin amacı, kamuya açık kanser genomik kaynakları kullanarak meme kanserinde m6A düzenleyicilerini analiz etmek için adım adım platform tabanlı bir biyoinformatik protokol sunmaktır. Kanser Genomu Atlası (TCGA) (www.cancer.gov/tcga), Genotip Doku İfadesi (GTEx)projesi 26 ve cBioPortal ile UCSC Xena gibi web tabanlı analitik platformlar kullanılarak yapılan bu protokol, mutasyon profillerini, gen ifadesindeki değişiklikleri ve hasta hayatta kalma ilişkisini değerlendirmek için tekrarlanabilir iş akışlarını sunar. Bu görselleştirilmiş ve erişilebilir yaklaşım, kanser biyoinformatiğine yeni başlayan araştırmacılar tarafından epitranskriptomik veri analizinin benimsenmesini kolaylaştırmayı amaçlamaktadır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NOT: M6A metil düzenleyicilerini kodlayan genlerin listesi, yazar, okuyucu ve silgi olarak kategorize edilmiştir ve Tablo 1'de sunulmaktadır. Tüm listelenen genler, sonraki mutasyonlar, ifade kalıpları ve genel hayatta kalma analizlerine dahil edilmiştir. Bu çalışmada kullanılan tüm yazılım ve araçlar Materyaller Tablosu'nda listelenmiştir.

1. M6A düzenleyicilerindeki genetik değişikliklerin tanımlanması

  1. Kanser genomikleri için cBioPortal'a erişin. cBioportal web sitesine (www.cbioportal.org)27,28 gidin. Ana sayfadan "Sorgu" sekmesini seçerek yeni bir analiz başlatabilirsiniz.
  2. Uygun kanser çalışması ve grubunu seçin.
  3. "Görselleştirme ve Analiz için Çalışmaları Seç" arama çubuğuna "Meme İnvaziv Karsinoması" yazıp "Meme İnvaziv Karsinoma (TCGA, Pan-Kanser Atlas)" seçeneğini seçin.
  4. Alt kısımda "Gene göre sorgulama" seçeneğini seçin.
    KRITİK: Seçilen kohortun (996 örnek) hem mutasyon hem de kopya numarası değişikliği (CNA) verilerini içerdiğinden emin olun.
  5. Genetik soruyu tanımlayın. "Genleri Gir" bölümünde, araştırılan m6A düzenleyicilerinin tam listesi için HUGO gen sembollerini girin.
    NOT: Genler, boşluklarla ayrılmış bir liste olarak girilebilir. "Genomik Profilleri Seç" bölümünde, aşağıdaki iki veri türünün kontrol edildiğinden emin olun: Mutasyonlar ve Kopya Numarası Değişiklikleri.
  6. "Hasta/Vaka Seti Seç" bölümünde, tüm profil vakaların olduğu kohorta karşılık gelen varsayılan örnek setini seçin.
  7. Mavi "Sorgu Gönder" butonuna tıklayın.
  8. Genetik değişim verilerini geri alın ve yorumlayın. Gönderme sırasında sonuç "özet" sekmesinde yüklenir. Merkezi "OncoPrint" görselleştirmesi, kohorttaki tüm sorgulanan genlerde genetik değişikliklere anında bir genel bakış sunar ve bu durum indirilebilir.
  9. OncoPrint'in yanında, "Kanser Tipi Özeti" sayfasını bulun. Bu, meme kanseri alt tipleri arasındaki değişikliklerin nicel bir dağılımı sağlar.
  10. Pan-kanser analizi yapın. cBioPortal ana sayfasına geri dönün ve "Sorgu" sekmesinden "TCGA PanCancer Atlas Studies" seçeneğini seçin.
  11. Gen giriş kutusuna aynı m6A düzenleyici genler listesini girin.
  12. "Submit Request Submit" seçeneğine tıklayın ve sonuçlar sayfasında "Kanser Türleri Özeti" sekmesine gidin. Bu, pan-kanser görünümü sunar.

2. UCSC Xena kullanılarak m6A regülatörlerinin karşılaştırmalı transkriptomik analizi.

  1. UCSC Xena Platformu'na erişin. UCSC Xena web sitesine (https://xena.ucsc.edu)29 gidin.
  2. Ana sayfadan ana analiz tarayıcısına girmek için "Launch Xena" butonuna tıklayın.
  3. Xena tarayıcısında "VERI SETSİ"ne tıklayın.
  4. Veri setleri arasında "TCGA TARGET GTEx" seçeneğini seçin. Bu, TCGA ve GTEx projelerinin normal dokularından gelen eşit şekilde işlenmiş RNA-Seq verilerini içerir.
  5. Bir sonraki sayfada "GÖRSELLEŞTIRMEK"e tıklayın.
  6. Fenotip (örnek grubu) değişkenini tanımlayın. "İlk Değişkeninizi Seçin" bölümünde, Fenotipik veri tipinde "Ana Kategori"yi seçin.
  7. "TO SECOND VARIABLE" seçeneğine tıklayın. Sonra, Genomik veri türünde, veri setinde "Gen İfadesi" işaretini işaretleyin. "Gen veya Pozisyon Ekle" kutusuna gen listesini ekleyin. "Bitti" seçeneğine tıklayın.
  8. İfade desenlerini bir ısı haritasıyla görselleştirin.
  9. Meme (TCGA+GTEx) örneklerini TCGA TARGET GTEx'ten ayırmak için "Breast" yazın ve örnekleri saklamak için filtre seçeneğini kullanın.
  10. Isı haritası artık görünür ve PDF olarak indirilebilir.
  11. Bireysel genler için karşılaştırmalı kutu grafikleri oluşturun. Belirli bir gen için ifade farklılıklarını nicelikten ölçmek ve görselleştirmek için "Grafik olarak Görüntüle" seçeneğini kullanın. Bu seçenekle, veriler kutu grafiki, nokta grafiği ve keman grafiki olarak görüntülenebilir ve iki örnek grubu arasındaki ifade dağılımını karşılaştırır.
  12. Grafikleri indirmek için "PDF olarak indir" seçeneğini kullanın.
  13. İstatistiksel anlamlılık (p-değeri) "İSTATİSTİK"ye tıklayarak elde edilebilir.

3. Kaplan-Meier Plotter kullanılarak m6A regülatörlerinin prognostik öneminin değerlendirilmesi.

  1. Kaplan-Meier Plotter aracına erişin. Kaplan-Meier Plotter web sitesine (https://kmplot.com/analysis)30 gidin.
  2. Ana sayfadan, meme kanseri veri setlerine özgü bir analiz başlatmak için "meme kanseri" sekmesini seçin.
  3. Tek bir gen için gen sorgusunu yapılandırın.
  4. Ana giriş bölümünde "Gen sembolü" kutusunu bulun.
  5. Analiz edilecek m6A regülatör geninin resmi sembolü (örneğin, METTL3) girin.
    KRITİK: Gen giriş kutusunun hemen altında, "Sadece JetSet en iyi sonda seti" için kontrol kutusunu bulun ve etkinleştirin. Bu, geniniz için en güvenilir ve spesifik mikroarray probun otomatik olarak seçilmesini sağlar, veri kalitesini ve tekrarlanabilirliği optimize eder.
  6. Hayatta kalma analizi parametrelerini tanımlayın. "Hayatta kalma" bölümünde, bu analiz için birincil son nokta olarak "Genel hayatta kalma (OS)" yi seçin. Bu ayar seçildiğinde araç otomatik olarak 1880 meme kanseri hastasından alınan verileri kullanır.
  7. "Hastaları böl" seçeneğinin "median" olarak olduğundan emin olun. Bu, hastaları iki eşit gruba ayıracaktır; yüksek ekspresyon ve düşük ekspresyon, sorgulanan genin tüm örneklerdeki medyan ifade değerine dayanır.
  8. "Takip eşiği" takip süresini seçmek için kullanılabilir. Bu çalışma için 180 ay seçildi.
  9. Kaplan-Meier Plot'u oluşturup yorumlayın.
  10. "Kaplan-Meier Plot'u Çiz" butonuna tıklayın.
  11. Yeni bir pencere yüklenir ve hayatta kalma eğrisi gösterilir.
  12. Ana olay örgüsü unsurlarını yorumlayın; X ekseni aylarla zamanı gösterir, Y ekseni genel hayatta kalma olasılığını gösterir, iki renkli çizgi ise yüksek ekspresyonlu (kırmızı) ve düşük ekspresyonlu (siyah) hasta gruplarının sağ kalma eğrilerini temsil eder. Log-rank P-değeri gösterilir ve iki hayatta kalma eğrisi arasındaki farkın istatistiksel anlamlılığını gösterir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Meme kanserinde m6a metilasyon düzenleyicilerinin mutasyonel manzarası

TCGA veri setlerinin genomik analizine yönelik daha önceki bir çalışmada, DNA metilasyonunun düzenleyicilerini kodlayan birkaç gende tekrarlayan mutasyonlarbildirilmiştir 31. Mevcut çalışmada, cBioPortal "Meme İnvaziv Karsinomu (TCGA, PanCancer Atlas)" veri setini analiz etmek için kullanıldı; böylece m6A RNA metilasyonunun yazarlarını, okuyucularını ve silgilerini kodlayan genlerin ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu Yöntemin makalesi, kanser araştırmalarında herhangi bir gen imzasının sistematik çoklu omik profillenmesi ve klinik çevirisi için kapsamlı, erişilebilir ve entegre bir iş akışı sunar; burada meme kanserinde m6A RNA metil düzenleyicilerinin analiziyle gösterilmiştir. Bu büyük kamu biyobilişim platformlarını birleştirerek, bu yaklaşım araştırmacıların genomik keşiften klinik olarak ilgili hipotezlere ileri düzey hesaplama uzmanlığına ihtiyaç duymadan verimli bir şekilde ilerlemesini sağ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu makalenin bazı bölümleri, netlik ve okunabilirliği artırmak için yapay zeka tabanlı dil araçlarının yardımıyla revize edilmiştir. Tüm özetli içerik, yorum, analiz ve sonuçlar yazarlara aittir. Çıkar çatışması olmadığını bildiriyoruz.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alfaisal Üniversitesi'nden (IRG 25450) RM'ye verilen bir hibe neyse ki kabul edilmektedir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
cBioPortalMemorial Sloan-Kettering Kanser Merkezihttps://www.cbioportal.org
Genotip-Dokunun Ekspresyonu (GTEx)GTEx Konsorsiyumuhttps://gtexportal.org
Kaplan-Meier PlotterGyorffy laboratuvarı/A5 Genetics Ltdhttps://kmplot.com
Kanser Genom Atlası (TCGA)Ulusal Kanser Enstitüsü (NCI)https://www.cancer.gov/tcga
UCSC Xena TarayıcısıCalifornia Santa Cruz Üniversitesihttps://xenabrowser.net

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

m6A ModificationEpitranscriptomic RegulationBreast CancerRNA Methylationm6A RegulatorsBioinformatics WorkflowGene Expression AnalysisCancer GenomicsPrognostic BiomarkersTCGA Datasets

Related Articles