24 kuyu rafları kullanarak orta verimlilikli kolon DNA çıkarımı

Özet

Bu protokol, plazmid DNA çıkarımını hızlandırmak için maliyet etkin bir yöntem tanımlar. Standart sallanan kovalı plaka rotorlarıyla uyumlu özel 3D baskılı raflar kullanılarak, araştırmacılar aynı anda 48 döner kolonunu kapaklı veya 116 döner kolonunu kapaksız işleyebilir; bu da manuel mikrosantrifüj yöntemlerine kıyasla kullanım süresini önemli ölçüde azaltmaktadır.

Özet

Silika-membran spin kolon ekstraksiyonu, yüksek kaliteli DNA arıtımı için standarttır ancak emek yoğun ve küçük partilerin ötesinde manuel ölçeklendirmek zordur. Mevcut otomatik sıvı işleme robotları, küçük ve orta ölçekli laboratuvarlar için genellikle hâlâ çok pahalıdır. Bu makale, standart santrifüjleme plaka rotorlarına uyan özel tasarımlı, 3D baskılı raflar kullanılarak sade, yarı otomatik bir yaklaşım sunmaktadır.

Önerilen sistem, 116'ya kadar standart ticari spin sütununun paralel işlemesine izin verir. Rack tasarımı, "iç içe girmiş" bir konfigürasyonu sağlar; böylece aynı anda lizat selginmesi (filtrasyon kolonları aracılığıyla) ve DNA bağlanması (silika sütunları aracılığıyla) tek bir santrifüj aşamasında mümkün olur. Ayrıca, tasarım ortak bir atık rezervuarı içeriyor ve yıkama aşamalarında bireysel tüplerden akıntı atma ihtiyacını ortadan kaldırıyor.

Bu yöntem, standart manuel protokollerle karşılaştırılabilir DNA verimi ve saflığı sağlar, ancak 24'ten büyük örnek partilerinde toplam işlem süresini yaklaşık %50–70 azaltır (120–180 dakika yerine 60–90 dakika). Lizat filtreleme, yıkama ve atık atma gibi adımlar için gereken toplam süre, işlenmiş örnek sayısına bakılmaksızın 5–10 dakika indirilir. Bu açık kaynak donanım yaklaşımı, manuel miniprepler ile pahalı otomasyon arasındaki boşluğu kapatıyor.

Giriş

Silika matritisleri kullanılarak nükleik asitlerin izolasyonu, ilk olarak 1979 yılında Vogelstein ve Gillespie tarafından, yüksek kaotropik tuzlar, özellikle sodyum iyodid¹ konsantrasyonlarında DNA parçalarının cam tozuna adsorbe edilmesinin temel ilkesini ortaya koymuşlardır. Bu atılım, dönemin hakim olduğu toksik fenol-kloroform ekstraksiyonu ve zahmetli sezyum klorür gradyan ultrasantrifüj yöntemlerine karşı daha güvenli ve verimli bir alternatif sundu. Daha sonra, Boom ve ortak yazarlar, guanidinium tiosiyanatı (GuSCN) birincil kaotropik ajan 2 olarak tanıtarak bu metodolojiyi önemli ölçüde optimize^ettiler. Bu yenilik çok önemliydi; çünkü GuSCN hem liz hücrelerine güçlü bir protein denaturantı hem de RNazlar ile DNazların güçlü bir inhibitörü olarak aynı anda işlev görür ve böylece ilk ekstraksiyon aşamalarında nükleik asit bütünlüğünü korur.

Kuruluşundan bu yana, yaygın olarak "Boom yöntemi" olarak bilinen bu katı faz ekstraksiyon teknolojisi, kapsamlı bir geliştirmeden geçti. Bakteriyel plazmid³ ve genomik^{DNA 4'ten} ökaryot mitokondriyal⁵ ve yüksek moleküler ağırlıklı genomik DNA'ya kadar giderek karmaşıklaşan biyolojik matrislerden nükleik asitleri izole etmek için uyarlanmıştır. Ayrıca, teknoloji klinik ve adli uygulamalar için ölçeklendirilmiştir; bunlar arasında hücresiz dolaşımda olan^{DNA'nın plazma 6'dan} izolasyonu, polifenoller açısından zengin inatçı bitki^{DNA'sı ve RNA'sının çıkarılması ve} viral nüklein^{asitlerin saflaştırılması 8} yer almaktadır. Döner sütunlu birçok ticari kit de mevcuttur.

Bu sürecin temelinde duran fizikokimyasal mekanizma, su yapısının kaotropik iyonlar tarafından bozulmasına dayanır. Yüksek iyon mukavetemi ve düşük pH durumunda, hem nükleik asit fosfat omurgasını hem de silika yüzeyini çevreleyen hidratasyon kabukları çıkarılır (dehidrasyon). Bu, silika yüzeyindeki negatif yüklü silanol grupları ile nükleik asidin fosfat grupları arasında genellikle Na⁺ veya kaotropik katyonlar aracılığıyla katyon köprülerinin oluşmasını kolaylaştırır. Nükleik asit tipi (DNA vs. RNA) ve parça uzunluğu açısından seçicilik, tampon kimyasının hassas modülasyonuyla sağlanır. Örneğin, belirli tuz konsantrasyonları ve pH seviyeleri, uzun genomik ipliklerin kısa oligonukleotidlere göre bağlanmasını teşvik edebilir veya RNA ile DNA arasındaki farkı artırabilir. Ayrıca, bu teknolojinin modern versiyonları genellikle belirli nükleik asit türlerinin diferansiyel adsorbsiyon izotermlerini artırmak için modifiye silika yüzeyleri kullanır.

Silika bazlı nükleik asit arıtması için kanonik iş akışı dört farklı aşamadan geçer: (1) Lizi, biyolojik başlangıç materyalinin homojenleştirildiği ve hücresel yapıların parçalandığı, genellikle alkali koşullar veya deterjanlar (SDS/Triton) kullanılarak; (2) Hücresel döküntüler, çökelmiş proteinler ve polisakkaritlerin kolon tıkanmasını önlemek için çıkarıldığı açıklama; (3) Bağlanma, süpernatantın kaotropik tuzlar ve etanol ile ayarlanarak silika zarına adsorpsiyonu teşvik edildiği bir durum; ve (4) Yıkama, zarla bağlı nükleik asitlerin alkol bazlı tamponlarla durulanması ve kalıntı tuzlar ve inhibitörlerin çıkarılması, ardından düşük iyonik güçlü bir tamponda elülasyon yapılmasıdır.

Bu sürecin kimyası sağlam olsa da, bireysel spin kolonlarının mekanik işlenmesi orta verimli iş akışları (24–100 örnek) için önemli bir darboğaz olmaya devam eder ve manuel işlem ile pahalı otomatik sıvı işleme sistemleri arasında bir boşluk yaratır. Manuel kolon tabanlı nükleik asit çıkarımı basitleştirmek için mevcut yaklaşımlar arasında vakum manifoldlar ve otomatik arıtma^{için robotik iş istasyonları yer alır} 9,10,11,12.

Vakum manifoldlar genellikle ya santrifüj kolonlar için 20–24 Luer fiş adaptörleriyle donatılmış rastgele erişimli konfigürasyonda veya 96 kuyuklu plakalarla kullanılmak üzere tasarlanmış tasarımda bulunabilir. 20–24 örnek için yapılandırılmış vakum manifoldlar, DNA arındırması sırasında kolon yıkama adımını santrifüjle karşılaştırıldığında hızlandırır; çünkü rotordan kolonların çıkarılması ihtiyacını ortadan kaldırır. Bu yöntem kullanışlı olsa da, kolon drenaj ucu vakum manifoldunun Luer açıklığıyla temas ettiği için çapraz kontaminasyon meydana gelebilir. Bir sütundan DNA Luer açıklığına girerse, sonraki manifold kullanımı sırasında başka bir örnek kolonuna aktarılabilir. Kontaminasyonu önlemek için üreticiler ek^{aksesuarlar önerir 10,13}; ancak bunlar ekstraksiyon kurulumunun montajını karmaşıklaştırır ve çoğu zaman atlanır.

96 kuyu formatı için tasarlanmış vakum manifoldlar farklı bir yapıya sahiptir ve mikrosantrifüj sütunları için değil, uyumlu 96 kuyu DNA çıkarma plakaları için tasarlanmıştır; bu plakalarda silika membranı bulunur. Bu durumda, DNA çıkarımı önceden paketlenmiş 96 kuyu formatlı DNA izolasyon^{kitleri 14} kullanılarak gerçekleştirilir. Bu kitler yüksek verimlilik sunar ancak uygulanabilirliği sınırlıdır, çünkü 96'dan az örnek işlemek genellikle pratik değildir.

Nüklein asit ekstraksiyonu için otomatik robotik çalışma istasyonları, DNA arındırma için şüphesiz en pratik yöntemdir; çünkü minimum operatör katılımı gerektirirler; bu da araştırmacıların zamanından tasarruf sağlar ve kontaminasyon gibi stokastik faktörleri en aza indirir. Ne yazık ki, çoğu tahliye istasyonu evrensellikten yoksun ve yalnızca özel kitlerle çalışır. Bu çalışma istasyonları öncelikle tanı laboratuvarlarında kullanılır, ancak çoğu küçük ve orta ölçekli akademik laboratuvar için maliyet etkin değildir.

Bu nedenle, 1 saatten kısa sürede 12 ile 96 örnek işleyebilen orta verimli DNA çıkarma yöntemleri için laboratuvar uygulamalarında bir boşluk vardır. Kapalı spin kolonları kullanılarak 48 örnek ve kapalı olmayan spin kolonları ile 116 örnek manuel izole edilmesine olanak tanıyan 24 kuyruklu bir raf sunuyoruz. Ek ekipman olarak sallanan kovalı plaka rotorlu bir santrifüj ve sabit açılı mikrosantrifüj kullanılır. Plazmid DNA arındırma prosedürü, plazmid DNA izolasyonu, lizlenmiş hücre artıklarını çıkarmak için bir açıklama adımı içerdiğinden, 24 delikli rafların kullanılmasına örnek olarak sunulmaktadır; bu da süreci otomatikleştirmeyi zorlaştırır. Buna rağmen, bu raflar neredeyse her kolon tabanlı nüklein asit ekstraksiyon yöntemi için kullanılabilir.

Protokol

1. 3D baskılı ekipmanların hazırlanması

1. Rafı 0.4 mm nozullu bir sigortalı filament 3D yazıcı ile yazdırın. %100 dolgulu genel PLA, PETG veya ABS filamenti kullanın. Katman yüksekliğini 0.1 mm olarak ayarlayın ve yüzey düzgünleştirmesini etkinleştirin. Su geçirmezlik ve mekanik stabilite için baskı ayarlarını ayarlayın.
   NOT: Rack bileşenleri için STL dosyaları Ek Dosya 1'de sağlanmıştır. Temel Rezervuar için belirtilen baskı parametrelerini takip edin. Rezervuarı kullanmadan önce %70 etanol ile doldurup santrifüj yaparak (1, 2, 5, 10 ve 30 dakika) sızıntı veya yapısal hasar olmadığını doğrulamak için test edin.
2. Temel Rezervuar bileşenlerini yapıştırarak kapalı bir ünite oluşturun.

2. Bakteriyel kültür ve liz

1. E. coli transformantlarını, uygun antibiyotikler içeren 3–5 mL LB ortamına aşılayın. Gece boyunca (12–16 saat) 37 °C'de sarsıntı ile kuluçka yapın.
2. Hücreleri 2.000 × gr santrifüjle 10 dakika boyunca hasat edin. Üst yüzeyi at.
   NOT: Hücre pelletleri işlemeden önce −20 °C sıcaklıkta saklanabilir.
3. Pellete 250 μL resüspansiyon tamponu (RNase A ile tampon P1) ekleyin. Tamamen vorteks veya pipetleme ile yeniden askıya alın.
4. 250 μL lizis tamponu (Buffer P2) ekleyin. Tüpü nazikçe 4–6 kez ters çevirerek karıştırın.
   NOT: Genomik DNA'nın kesilmesini önlemek için yoğun karıştırmadan kaçının.
5. 350 μL nötrasyon tamponu (Buffer N3) ekleyin. Hemen intersle iyice karıştırın.
   NOT: Beyaz bir çökelti oluşmalıdır, bu da başarılı nötralizasyonu gösterir.

3. Filtrasyon ünitesinin montajı

1. DNA bağlama sütunlarını rafın kolon tutucu katmanına yerleştirin.
2. Santrifüj sırasında kolon kapaklarını belirlenmiş yuvalara yerleştirin.
3. Açıklama/filtre sütunlarını, bağlayıcı sütunların hemen üzerindeki filtre sütunu katmanına yerleştirin.
   NOT: Filtre sütunları yoksa, lizat mikrotüplerde santrifüj edilip süpernatantı bağlama kolonlarına aktarın.

4. Lizat klirensi ve DNA bağlanması

1. Nötralize edilmiş lizat 2.5. Adımdan filtreleme kolonlarına aktarılır.
2. Monte edilen rafı sallanan kovalı plaka rotoruna yerleştirin.
   DIKKAT: Dengeyi dengelemek için eşit kütleli ve aynı konfigürasyona sahip bir karşı ağırlık rafı kullanın.
3. Oda sıcaklığında 2.000 × g boyunca 1 dakika boyunca santrifüj yapın.
4. Rafı santrifüjden çıkarın.
5. Filtre sütunu katmanını çıkarıp at.

5. Yıkama

1. Rezervuardan gelen akıntıyı atık konteynerine at. Rafı bağlayıcı sütunlarla yeniden birleştirin.
2. Her bağlama kolonuna çok kanallı pipet kullanarak 500–700 μL yıkama tamponu ekleyin.
3. Santrifüj 2.000 × g'de 1 dakika boyunca kullanın.
4. Rezervuardan akıntıyı atın.
5. Her kolona yıkama tamponu ekleyip 2.000 × g'de 1 dakika santrifüj yaparak yıkamayı tekrarlayın.
   NOT: Kolonlar oda sıcaklığında veya yıkamadan sonra 4 °C sıcaklıkta saklanabilir.

6. Kurutma ve elüsyon

1. Bağlama kolonlarını raftan çıkarın ve 2 mL'lik toplama tüplerine aktarın.
2. Membranı kurutmak için >10.000 × g santrifüj yapın.
3. Kolonları temiz 1.5 mL tüplere aktarın.
4. Membrana doğrudan 50 μL elusyon tamponu veya su ekleyin. Oda sıcaklığında 1 dakika kuluçka yapın.
5. DNA elüasyonu için 1 dakika boyunca >10.000 × g sıcaklığında santrifüj yapın.

7. Isteğe bağlı: Titanyum dioksit ile birlikte çökeltme

1. Liz tamponunu titanyum dioksit tozu ile 2:1 hacim-kütle oranında karıştırın.
2. Lizata 250 μL titanyum dioksit süspansiyonu ekleyin. Ters çevirilere göre karıştırın.
3. 350 μL nötralizasyon tamponu ekleyin ve iyice karıştırın.
4. Santrifüj 2.000 × g'de 1 dakika boyunca koyun.
5. Üst katmanı çökeltiyi bozmadan toplayın.
6. Üst yüzeyi bağlama kolonuna aktarın.

Sonuçlar

Rack varyasyonları
Farklı laboratuvar ortamlarında mevcut kaynakların kullanılmasını ve kullanıcı tercihlerini karşılamayı sağlayan çok çeşitli santrifüj modelleri için uygun dört raf versiyonu geliştirdik. Tüm raflar 24 yuvalı bir formata sahiptir ancak versiyona bağlı olarak sütunlar için ek oturma pozisyonları içerir. Detaylı boyutlar ve uyumluluk Ek Dosya 2'de sağlanmıştır. Monte edilen rafın yüksek çözünürlüklü bir görüntüsü Ek Şekil S1'de sunulmaktadır.

Temel rack versiyonu (Şekil 1) en verimli konfigürasyondur. Dört parçadan oluşur ve boyutları 88 × 130 × 77 mm arasındadır. Bu yöntem, kaplı sütunlar kullanıldığında eşzamanlı olarak 48 sütuna kadar, kapssız sütunlar kullanıldığında ise 116 sütuna kadar kullanılabilmesini sağlar. Rack bileşenleri, kullanım kolaylığı ve santrifüj sırasında istenmeyen etkileri en aza indirmek için tasarlanmıştır. Döner sütunlar, kapsüllerin yerleştirilmesi için oluklara sahip kolon katmanına yerleştirilir; Bu aynı oluklar, başlıksız sütunları da barındırabilir. Kolon tabakası rezervuarın üzerinde yer alır. Kolonların drenaj açıklığı, rezervuarın kesik noktasının üzerinde konumlandırılmıştır; bu da bitişik sütunlar arasındaki sıçramayı azaltmaya yardımcı olur. Sıvı, kesik deliğinin altındaki bir açıklıktan rezervuara akar. Rezervuar kapasitesi yaklaşık 100 mL olup, yüksek kolon yüküne sahip iki yıkama basamasını barındırır. Filtre sütun katmanı, gerektiğinde sütun katmanının üzerine yerleştirilebilir; filtre sütunları bağlayıcı sütunların üzerinde ve temas halinde konumlandırılır. Kapapa, filtre veya bağlama kolonlarını içeren katmanı kapatır ve santrifüg dönüşünde hava akışını sınırlar. Temel rack versiyonu, A-2-DWP kova rotorları (örneğin, Eppendorf 5804), rotor 1770 (ör. HETTICH Rotina 380) veya eşdeğer sistemlerle uyumludur.

Mini rack versiyonu (Şekil 2), çok çeşitli santrifüj kovalı rotorlar için uygundur. Üç parçadan oluşur ve filtre kolon katmanıyla birlikte minimum boyutları 82,5 × 128 × 58 mm'dir. Bu yöntem, kapalı 48 sütuna kadar veya başlıksız 90 sütuna kadar kullanılabilmektedir. Bu versiyonun geometrisi temel rafa benzer, ancak kolon pozisyonlarının dış sıraları çıkarılıp yerine kolon kapakları için oluklar getirilmiştir. Rezervuar kapasitesi, basılı versiyona göre değişir. En küçük rezervuar (20 mL) yaklaşık 30 sütun için bir yıkama basamağı barındırır; Daha büyük rezervuarlar daha yüksek veri taşıma sağlar. Filtre kolon katmanı, rotor kovasının daha küçük santrifüjlerde hareket etmesine olanak tanıyan yuvarlak kenarlara sahiptir. Mini rack versiyonu, UC-124 kovalı rotorlarla (örneğin, Accumax iFuge UC02) veya eşdeğer sistemlerle uyumludur. Filtre sütun katmanı olmadan kullanıldığında, raf A-2-MTP kova rotorları (örneğin, Eppendorf 5430) veya onların eşdeğerleriyle uyumludur.

Rezervuarsız (açık) versiyon (Şekil 3), sınırlı 3D baskı deneyimi olan kullanıcılar için uygundur; çünkü rezervuar, pipet uç kutusu gibi harici bir kapla değiştirilmiştir. Bu versiyon üç parçadan oluşur ve ölçüleri 79 × 115 × 61,5 mm'dir. Bu yöntem, kapalı 48 sütuna veya başlıksız 78 sütuna kadar kullanılmasına izin verir. Geometrisi önceki sürümlere benzer ancak entegre bir rezervuar yok. Bunun yerine, atık toplamak için uygun bir konteyner kullanılır. Kolon ve filtre katmanlarında daha az oturma pozisyonu bulunur ve filtre katmanında rotor hareketine müdahale önlemek için konik koltuklar bulunur. Taban, standart kaplara sığacak şekilde tasarlanmıştır ve yan aralıklarla stabilize edilebilir. Uyumluluk seçilen konteynere bağlıdır ancak A-2-DWP kova rotorlarını (örneğin, Eppendorf 5804), rotor 1770'i (örneğin HETTICH Rotina 380) ve UC-124 kovalı rotorları (örneğin, Accumax iFuge UC02) içerir.

Kapalı raf versiyonu (Şekil 4) en basit konfigürasyondur ve 5 mL veya 10 mL 24 kuyu derin kuyu plakalarıyla birlikte kullanılır. 73 × 109 × 4 mm boyutlarında tek bir bileşenden oluşur ve 48 sütuna kadar kullanılabiliyor. Bu versiyon, ilgili plaka formatını destekleyen herhangi bir santrifüj rotoruyla uyumludur.

Verim ve saflık
DNA çıkarımı E. coli kültürlerinde hem standart manuel mikrosantrifüj protokolü hem de rack tabanlı yöntemle gerçekleştirildi. Spektrofotometrik analiz, raflar kullanılarak çıkarılan DNA kalitesinin standart yöntemle elde edilenle karşılaştırılabilir olduğunu gösterdi. Tipik A260/A280 oranları her iki yaklaşımda da 1.8 ile 1.9 arasında değişiyordu. Toplam plazmid verimi (μg), geleneksel yöntem ile rack konfigürasyonları kullanılarak ekstraksiyon arasında anlamlı bir fark göstermedi (Şekil 5); ham veriler Ek Dosya 2'de sağlanmıştır. Plazmid konformasyonu da korunmuş, gevşek, lineerleşmiş ve süper sarmal formların benzer dağılımları ile (Şekil 6).

Çapraz kontaminasyon analizi
Olası çapraz bulaşmayı değerlendirmek için bir dama tahtası deneyi yapıldı. Kolonlar, dönüşümlü olarak yüksek konsantrasyonlu etidiyum bromid çözeltisi (yüksek titrli DNA simüle ederek) ve su ile yüklendi. 2.000 × g santrifüjlemeden sonra, boya dağılımı doğrudan yüklenen kolonların altındaki atık alanıyla sınırlandırıldı ve bitişik kuyular veya komşu sütun uçlarında görünür bir sinyal tespit edilmedi (Şekil 7). Bu gözlemler, rack tasarımının test edilen koşullarda su sıçratma ve çapraz kolon transferi olasılığını azalttığını göstermektedir.

Kontaminasyonun daha fazla değerlendirilmesi için, kontamine edici madde olarak amplikon kullanılarak gerçek zamanlı PCR yapıldı ( bkz. Ek Dosya 2). Amplikon yalnızca amplikonun eklendiği sütunlardan gelen eluatlarda amplifikasyon tespit edilmiştir (Şekil 8). Test edilen koşullarda çapraz kontaminasyon tespit edilmedi; ancak performans, iş akışı ve örnek türüne bağlı olarak değişebilir.

Şekil 1: Rack montaj şemasının temel versiyonu. (A) Başlığı, (B) Filtre Kolon Katmanı, (C) Kolon Tutucu Katmanı ve (D) Temel Rezervuarı gösteren patlatılmış CAD görünümü. Raf, 88 × 130 × 77 mm boyutlarında dört parçadan oluşur ve aynı anda 48 sütunun kapsası ile veya 116 sütunun başlığı olmadan kullanılmasına olanak tanır. Bu şekilin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Rack montaj şemasının mini versiyonu. Patlatılmış CAD görünümü, (A) Filtre Sütun Katmanı, (B) Sütun Tutucu Katmanı ve (C) Temel Rezervuar. Bu versiyon geometrik olarak temel versiyona benzer, ancak iki yan sıra kolon koltukları çıkarılıp yerine kolon kapakları için oluklar getirilmiştir. Üç bölümden oluşur, minimum boyutları 82,5 × 128 × 58 mm (filtre sütun katmanı ile) ve en fazla 48 sütunun başlı veya 90 sütunun başsız kullanımına izin verir. Bu şekilin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Deposuz (açık) rack montaj şeması versiyonu. Patlatılmış CAD görünümü, (A) Filtre Sütun Katmanı, (B) Sütun Tutucu Katmanı, (C) Taban ve (D) Piet Uç Kutusu. Bu versiyon, entegre rezervuarı pipet uç kutusu gibi harici bir kap ile değiştirir. Üç bölümden oluşur, boyutları 79 × 115 × 61,5 mm arasındadır ve 48 sütuna kadar başlıklı veya 78 sütun başlıksız kullanılabilir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: 24 kuyu raflarının kap versiyonu. Üstten görünüm (solda) ve alttan görünümde (sağda). Bu, 5 mL veya 10 mL 24 kuyu derin kuyu plakalarıyla birlikte kullanılan en basit rack versiyonudur. 73 × 109 × 4 mm boyutlarında tek bir parçadan oluşur ve başlıklı veya kapalı olmadan 48 sütuna kadar kullanılabilir. Bu şekilin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: DNA verimi ve saflığının karşılaştırılması. Plazmid veriminin spektrofotometrik analizi (μg/mL). Geleneksel yöntem ile rack konfigürasyonları kullanılarak ekstraksiyon arasında toplam plazmid veriminde istatistiksel olarak anlamlı bir fark gözlemlenmedi. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 6: DNA kalitesinin karşılaştırılması. DNA formları, agaroz jel elektroforezi ile görselleştirildi. Gevşek, linearize ve süper sarmal DNA formları, standart manuel çıkarma ile rack tabanlı ekstraksiyon arasında benzerdir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 7: Çapraz kontaminasyon değerlendirmesi. Santrifüjleme sonrası atık rezervuarının görünümü, örtüşmeden ayrı atık havuzları gösteriliyor. Kolonlar, yüksek konsantrasyonlu etidyum bromid çözeltisi (yüksek titrli DNA simüle ederek) ve su ile yüklendi. Santrifüjleme sonrası bitişik "su" kuyularında veya komşu sütunların uçlarında boya gözlemlenmedi; bu da test edilen koşullarda sıçrama ve çapraz kolon transferinin azaldığını gösteriyor. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 8: Çapraz kontaminasyonun nicel PCR kullanılarak analizi. Kirletici maddeyi içeren örnekler için amplifikasyon eğrileri kırmızı renkte, sadece su içeren örnekler ise yeşil ile gösterilir. Amplifikasyon yalnızca kirletici maddeyi içeren örneklerde tespit edilmiştir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 1: Rack tasarımları için 3D model dosyaları. Bu dosya seti, temel rack versiyonu, mini rack versiyonu (birden fazla rezervuar yüksekliği varyantları ile), rezervuarsız versiyon ve kapalı rack versiyonu dahil olmak üzere tüm rack konfigürasyonları için STL dosyalarını içerir. 3D baskı için bireysel bileşenler (örneğin, taban rezervuarı, sütun tutucu katmanı, filtre sütun katmanı ve kapak) sağlanır. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 2: Destekleyici veriler ve yöntemler. Bu dosya seti, santrifüj uyumluluk tablosunu içeriyor, ayrıntılı çapraz kontaminasyon test prosedürü, ham DNA verimi veri setleri ve kontaminasyon analiziyle ilgili PCR cihaz çıktı dosyalarını içeriyor. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil S1: Temel rack versiyonu (tam montaj halinde). Tam montaj edilmiş temel raf konfigürasyonunun yüksek çözünürlüklü görüntüsü, genel yapı ve bileşen düzenini gösteriyor. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Bu protokol, birçok moleküler biyoloji laboratuvarındaki "aktarım boşluğunu" ele alır. 96 kuyu filtre plakaları daha hızlı olsa da, bireysel döner sütunlarına kıyasla daha düşük bağlama kapasitesi veya daha düşük nihai konsantrasyon^{gösterebilirler 14}. Standart spin sütunlarını plaka-rotor formatına uyarlayarak bu yöntem, kolonların yüksek verimini plaka tabanlı iş akışlarının hızıyla birleştirir.

Raflar en avantajlı olarak 12'den fazla örnek işlendiğinde kullanılır. Protokolün başlıca yeniliği, süpernatant ve yıkama çözeltilerinin bertarafı için ortak bir rezervuar kullanarak kolon tabanlı nükleik asit çıkarımını basitleştiren ve hızlandıran 24 kuyu raflarının kullanılmasıdır. Raflar kullanılırken, 14–116 örnek için bu adımların gerçekleştirilmesi gereken süre, 2–12 örnek için gereken süreyle karşılaştırılabilir. Ayrıca, bireysel tüplerin çıkarılması, kolonların taşınması, yıkama çözeltilerinin atılması ve kapakların açılması gibi tekrarlayan adımlar en aza indirildikçe, operatörün çabası azalır. Orijinal kit bileşenleri (çözeltiler ve spin sütunları) değişmediği için, karşılaştırılabilir DNA kalitesi beklenmekte ve sunulan sonuçlarla desteklenmektedir.

24 kuyruklu rafların 3D baskısı standart ekipmanla mümkündür, ancak temel ve mini versiyonlar için deneyim gerektirebilir. Rezervuarsız ve kapaklı raflı versiyonlar daha basittir ve minimum baskı deneyimiyle üretilebilir. Birleşmiş biriktirme modellemesinde önemli bir konu, katmanlar arasında mikro boşlukların oluşmasıdır; bu boşluklar santrifüj sırasında su geçirmezliği azaltabilir. Testler, %100 dolgunluğun, 7 mm rezervuar duvar kalınlığının ve 0,1 mm katman yüksekliğinin yeterli su geçirmezlik sağladığını göstermiştir. Baskı yatağının ısıtılması ve yüzey düzgünleştirmesi uygulanması sızdırmazlık performansını daha da artırdı. Buna karşılık, epoksi reçineler veya organik çözücüler kullanılarak yapılan baskı sonrası sızdırmazlık yöntemleri etkili olmadı; çünkü santrifüj sırasında deformasyon çatlamaya ve sızıntıya yol açtı. Yetersiz duvar kalınlığı ayrıca yapısal arızaya ve su geçirmezlik kaybına yol açabilir, bu da santrifüj dengesizliğine yol açabilir. Bu nedenle, basılı bileşenlerin kullanım öncesi testi önerilir.

Dört raflı versiyon, kova rotorlu çok çeşitli santrifüjler için uygundur ve kullanıcıların ekipman ve veri kapasitesi gereksinimlerine en uygun konfigürasyonu seçebilmesini sağlar. Temel rack versiyonu en yüksek verimliliği sağlar ancak daha büyük santrifüjler ve daha yüksek baskı kalitesi gerektirir. Mini versiyon santrifüj boyutu gereksinimlerini azaltır ama aynı zamanda verimliliği de düşürür. Rezervuarsız versiyon üretimi basitleştirir ve pipet uç kutuları gibi yaygın olarak bulunan kaplarla uyumludur, ancak uyumluluk kap geometrisine bağlıdır. Cap-rack versiyonu en basit konfigürasyondur ancak filtre sütunlarıyla kullanılamaz.

Nüklein asitleri bağlamayan filtre kolonları, standart bağlama kolonlarına göre daha az kolay bulunabilir^{olabilir 9}. Yok zamanlarda, ek açıklama adımları gerekebilir ve bu da genel işlem süresini artırır. Alternatif olarak, filtre pipet uçları (1000 μL) veya titanyum dioksit protokolü kullanılabilir.

Ekstraksiyon rafları, standart DNA çıkarma iş^{akışlarına mekanik bir ek olarak işlev görür ve} tampon bileşimini veya kolon kimyasını değiştirmez (titanyum dioksit varyantı hariç). Buna göre, DNA kalitesi üzerinde önemli bir etki beklenmez; bu, agaroz jel elektroforezi ve verim karşılaştırmalarıyla tutarlıdır; standart yönteme göre benzer plazmid formları ve miktarları göstermektedir.

Ortak atık rezervuarının kullanımı çapraz bulaşma riski yaratsa da, test edilen koşullarda bu gözlemlenmemiştir. Önemli bir tasarım özelliği, kolon çıkışlarının "baca" geometrisidir; bu da kolon uçları ile atık sıvı yüzeyi arasındaki ayrımı sağlar. Bu ayrımı korumak için rezervuar aşırı doldurulmamalı ve her tam akıştan sonra boşaltılması önerilir.

Yöntemin bir sınırlaması, sallanan kovalı rotorların maksimum hızıdır (genellikle 2.000 × g). Bağlama ve yıkama adımları için yeterli olsa da, bu hız tam zar kurutması için yeterli değildir. Bu nedenle, sabit açılı mikrosantrifüjde son yüksek hızlı santrifüj adımı gereklidir. Bu ek adıma rağmen, 24 örnekten fazla parti için genel zaman tasarrufu önemli olmaya devam etmektedir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
3D Printer Filament	NIT, Rusya	-	PETG veya PLA önerilir
Buffer N3	Qiagen, Hollanda	19064
Buffer P1	Qiagen, Hollanda	19051
Buffer P2	Qiagen, Hollanda	19052
Creality Ender-3 S1 Pro	Creality, Çin
Elution Buffer	Qiagen, Hollanda	19086
Eppendorf Santrifüj 5702	Eppendorf, Almanya	22626001	Sabit açılı rotor
Eppendorf Santrifüj 5804 R	Eppendorf, Almanya	22625080	Salınımlı kova plaka rotoru
Etidyum Bromür	Biolabmix, Rusya	EtBr-10
Frit of 1000 μL Filtre Pipet Ucu	GenFollower, Çin	E-FTB1000	Filtre Kolonlarının parçası
Filtre Engeli Olmayan Miniprep	JVLAB, Çin	-	Filtre Kolonlarının parçası
Phenol Red	Lenreactiv, Rusya	200125
PrusaSlicer	Prusa Research, Çek Cumhuriyeti
QIAprep 2.0 Spin Miniprep Kolonları	Qiagen, Hollanda	27115
RNase A	Qiagen, Hollanda	19101
Yıkama Tamponu	Qiagen, Hollanda	19065