Düşük Girişli CRISPR Genom Düzenleme ve Süspansiyon T Hücreleri ile 3D Hücre Modellerinde mRNA Transfeksiyonu için Dijital Mikrofluidik Elektroporasyon Platformu

Summary

Bu protokol, birincil insan T hücrelerinde TCRα/β reseptörünün küçültülmüş CRISPR–Cas9 genom düzenlemesini 'DMF-ection' olan dijital mikrofluidik (DMF) elektroporasyon platformu kullanarak tanımlar. Bu yöntem, yüksek canlılıkla paralel, düşük girdili gen düzenlemesini mümkün kılar ve çok hücreli 3D sferoidlere mRNA iletimi için daha da uyarlanabilir.

Abstract

Dijital mikrofluidik (DMF) elektroporasyon, memeli hücrelerinin hassas ve düşük hacimli genetik manipülasyonunu sağlarken, hücresel girdisini 100 katına kadar en aza indirir ve canlılığı korur. Bu çalışma, birincil insan süspansiyon T hücrelerinde TRAC lokusunun CRISPR aracılı nakatlanması ve üç boyutlu HEK293T sferoidlerin mRNA transfeksiyonu için yüksek verimli DMF tabanlı transfeksiyon iş akışını sunmaktadır. Mekansal olarak biriktirilmiş CRISPR rehber RNA'ları ve kartuş üzerindeki ribonükleoprotein (RNP) montajı kullanılarak, CD4⁺ ve CD8⁺ T hücresi popülasyonlarında yalnızca 10.000 hücre kullanılarak verimli TRAC lokus bozulması sağlandı ve düzenleme sonrası yaşamlılık %85'in üzerindeydi. Akış kaynaklı ve Taylor dispersyon analizleriyle yapılan biyofiziksel karakterizasyon, polimer katkı maddelerinin elektroporasyon tampon koşullarında Cas9–sgRNA komplekslerini stabilize ettiğini ve mikrolitre altındaki hacimlerde tekrarlanabilir düzenlemeyi desteklediğini ortaya koymuştur. İş akışı, 3D uygulamalar için de uyarlanarak EGFP mRNA'yı sağlam HEK293T sferoidlere ileterek, sferoid büyüme veya morfolojiyi bozmadan sağlam ve mekansal olarak düzgün floresans elde etti. Bu sonuçlar birlikte, DMF elektroporasyonunun hem süspansiyon bağışıklık hücreleri hem de çok hücreli sferoidler arasında verimli genom düzenleme ve mRNA iletimi sağladığını göstermektedir. Bu platform, CAR-T hücre tedavisi, fonksiyonel genomik ve gelişmiş 3D hücresel modeller uygulamalar için ölçeklenebilir ve düşük girdili bir çözüm sunar.

Introduction

Birincil insan hücrelerinde gen düzenleme, hem terapötik geliştirme hem de temel araştırmalar için giderek daha merkezi hale gelmektedir; bunlar arasında bağışıklık mühendisliği, nadir hastalık modellemesi ve fonksiyonel genomik uygulamaları da bulunmaktadır^. Elektroporasyon yüksek verimli genom düzenlemesini mümkün kılsa da, geleneksel küvet bazlı sistemler genellikle her koşul için milyonlarca hücreye kadar ihtiyaç duyar; bu da hasta kaynaklı örnekler ve nadir bağışıklık popülasyonları için kullanımlarını^sınırlar. Ayrıca, bu sistemler büyük ölçekli tarama için yeterli değildir, çünkü veri verimliliği, otomasyon ve reaktif tüketimi³.

Mikrofluidik elektroporasyon, düşük girdili genom düzenleme için umut vadeden bir yaklaşım olarak ortaya^{çıkmıştır 4}. Ancak, mevcut platformların çoğu, karmaşık sıvı işleme, reaktiv karıştırmada sınırlı esneklik ve nispeten yüksek şart başlı hücre gereksinimleri içeren sürekli akış mimarislerine dayanır. Buna karşılık, dijital mikrofluidikler (DMF), düzlemsel elektrot dizisi üzerinde ayrık nanolitre ölçekli damlaların aktif manipülasyonunu sağlar; böylece reaksiyon bileşimi, zamanlama ve mekansal lokalizasyon üzerinde hassas kontrol sağlanır. Bu tak-çalıştır damlalı format, birincil hücrelerin ve reaktiflerin korunmasının önemli olduğu düşük hacimli, yüksek verimli iş akışları için oldukça uygundur⁵.

Son çalışmalar, verimli RNP ve mRNA teslimatı için yerel, düşük akımlı elektrik alanları üreten ve termal ve elektrokimyasal gerilimi en aza indiren üç damlacıklı elektroporasyon mimarileri kullanılarak DMF tabanlı hücre içi teslimatın ^{uygulanabilirliğini göstermiştir 6,7,8}. Bu temel üzerine inşa edilerek, 48 bağımsız adreslenebilir reaksiyon noktası, tam otomasyon uyumluluğu ve ölçeklenebilir kartuş^{üretimi 9} (Şekil 1) içeren 'DMF-ection' adlı yeni nesil DMF elektroporasyon platformu geliştirildi. DMF kartuşu, alt PCB plakası ve bir conta ile ayrılmış plastik üst plakadan oluşur ve hizalama patlatmalarıyla tek doğru bir konumda monte edilir (Şekil 1A). 48-plex düzeni, sekiz özdeş aileye ayrılmıştır (Şekil 1A–H), her biri altı bağımsız adreslenebilir elektroporasyon noktası içerir ve her kartuş başına 48'e kadar paralel düzenleme koşullarını destekler (Şekil 1B). Kılavuz RNA kütüphaneleri, kartuş montajından önce akustik bir dağıtıcı kullanılarak substrat yüzeyine yerleştirilir. Depolama pozisyon doğruluğu, tüm 48 noktada doğrulandı; bırakma pozisyonları elektrodun orta noktasından milimetre altı sapma içinde kümelenmiş (Şekil 1C), böylece güvenilir kartuş üzerinde RNP montajı sağlandı. Yüklemeden sonra, hücreler ve sıvı elektrot damlacıkları kartuş üzerinde aktiflenerek üç-damlacık elektroporasyon geometrisi oluşturulur (Şekil 1D). Elektroporasyondan sonra, hücreler geri kazanım ve sonraki akış analizi için kültür plakalarına boşaltılır; akış sitometrisi, dizileme ve mikroskopi dahil olmak üzere (Şekil 1E). Bu sistem, standart küvet tabanlı yöntemlere göre 100 kat daha az hücre kullanarak yüksek verimli genom düzenlemesini mümkün kılarak düşük girdili ve yüksek verimli uygulamalarda genom mühendisliğine erişimi önemli ölçüde genişletir.

Bu çalışma, platformun performansını mRNA ve CRISPR–Cas9 ribonükleoprotein (RNP) kompleksleri dahil olmak üzere birden fazla biyomoleküler yük taşıyarak değerlendirerek verimli transfeksiyon ve gen bozulması sağlamaktadır. Birincil T hücrelerine ek olarak, DMF-eksiyon nüklein asitlerin karmaşık çok hücreli yapılara taşınması için genelleştirilebilir bir çerçeve sağlar. Üç boyutlu (3D) sferoidler ve organoid tipi modeller, mimari ve kırılganlıkları nedeniyle reaktifin nüfuzuna önemli engeller oluştururken, geleneksel elektroporasyon yaklaşımları genellikle morfolojiyi bozur veya heterojen teslimat üretir. T-hücre düzenlemesinde kullanılan aynı küçültülmüş elektroporasyon prensiplerinin yapılandırılmış dokulara da uygulanıp uygulanmadığını değerlendirmek için, DMF iş akışı 3D HEK293T sferoidlere uygulandı. Bu deneyler, DMF tabanlı elektroıslatmanın sağlam sferoidleri tri-damla geometrileri içinde nazikçe konumlandırabileceğini ve yapı ile büyümeyi koruyarak uniform mRNA iletimini destekleyebildiğini göstermiştir. Bu sonuçlar burada açıklanan birincil T-hücre protokolünün dışında olsa da, programlanabilir DMF elektroporasyonunun ilaç keşfi ve hastalık modellemesiyle ilgili yeni ortaya çıkan 3D hücresel sistemler için daha geniş uygulanabilirliğini göstermektedir.

Protocol

Bu protokolde kullanılan birincil insan T hücreleri, ticari tedarikçilerden bağışçı onayı ile ve ilgili kurumsal, etik ve düzenleyici yönergeler doğrultusunda temin edilmiştir. İnsan kaynaklı biyolojik materyallerin tüm işlenmesi kurumsal biyogüvenlik protokollerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Bu protokolü uygulayan araştırmacılar, birincil insan hücrelerinin kullanımının yerel kurumsal inceleme kurulu (IRB) veya etik komite gerekliliklerine, geçerli biyogüvenlik düzenlemelerine ve insan biyolojik materyalinin kullanımını düzenleyen ilgili ulusal veya bölgesel mevzuatlara uygun olmasını sağlamakla yükümlüdür. Bu çalışmada kullanılan hücre materyaliyle hasta tarafından tanımlanabilir bir bilgi ilişkilendirilmemiştir.

1. Birincil insan T hücrelerinin hazırlanması ve aktivasyonu

1. Kriyokonseriflenen birincil insan CD3⁺ T hücrelerini 37 °C su banyosunda hızla erit. Hücreleri önceden ısıtılmış bazal T-hücre ortamına aktarın ve 180 × g sıcaklığında 10 dakika boyunca santrifüj yapın. Süpernatantı atın ve pelleti taze ortamda tekrar askıya alın.
2. Hücre konsantrasyonunu ve yaşamlılığını otomatik hücre sayacı kullanarak belirleyin.
3. Hücreleri, çözünür tetramerik antikor CD3/CD28 T-hücre aktivatör uyarıcısı (satıcı talimatlarına göre) ve 200 IU/mL IL-2 ile takviye edilmiş T-hücre kültür ortamında 1 ×^{10 6} hücre/mL ortamında yeniden süzülür. Hücreleri 72 saat boyunca 37 °C, %5 CO₂ sıcaklıkta kuluçka edin.
   NOT: Aktivasyon sırasında hücre yoğunluğunu 0.5–2 × 10⁶ hücre/mL arasında tutun. U-bottom 96-kuyu plakalarında aktivasyon gerçekleştirerek hücreden aktivatörün temasını ve aktivasyon verimliliğini optimize etmeye çalışın.

2. DMF substratı üzerinde rehber RNA noktalarının hazırlanması (akustik dağıtıcı lekelendirme)

1. Nükleazsız suda liyofilize sgRNA'yı 100 μM stok konsantrasyonuna yeniden yapılandırın. Ayrı bir tüpte, nukleazsız suda 100 mg/mL poli-L-glutamik asit (PGA, sodyum tuzu, MW 15.000–50.000 Da) stok hazırlanır. SgRNA ve PGA stokunu 5:4 hacim oranında (sgRNA: PGA) birleştirin; böylece nihai sgRNA konsantrasyonu 55,6 pmol/μL ve nihai PGA konsantrasyonu 44,4 mg/mL olarak nükleazsız suda elde edilir. Girdap kısa süreliğine 1.000 × g'de 30 saniye boyunca santrifüj yapar ve tek kullanımlık hacimlere aliquot yapar, kullanılmayan aliquotları −80 °C'de 6 aya kadar depolar.
   NOT: Tekrarlayan donma-çözülme döngülerinden kaçının.
2. Rehber-PGA karışımını, istenen reaksiyon alanı düzenine uygun olan kuyularda düşük ölü hacimli akustik kaynak plakasına ekleyin.
3. Kılavuz-PGA karışımının 40 nL (2.2 pmol sgRNA'ya eşdeğer) her hedef tespit bölgesine kalibre edilmiş akustik dağıtıcı kullanılarak aktarıl.
   NOT: 55.6 pmol/μL olduğunda, 40 nL her bir bölge başına 2.2 pmol sgRNA sağlar (55.6 × 0.040 = 2.22 pmol). Kurutulmuş kılavuzlar, kartuş üzerinde damla birleşmesi sırasında yeniden oluşturulur; Tam yeniden askıya alınması, siteler arasında tutarlı düzenleme verimliliğiyle doğrulanır.
4. Biyolojik bir güvenlik kabinde, benekli damlaların oda sıcaklığında tamamen hava kurumasına izin verin, ta ki görünür bir sıvı kalmayana kadar (yaklaşık 5 dakika).
   NOT: Zorunlu hava akışı veya ısı kullanmayın, çünkü bu kılavuz RNA'yı yerinden çıkarabilir veya bozabilir.
5. DMF kartuşunu birleştirin.
   1. Biyolojik bir güvenlik kabinde, üst plakanın asimetrik plastik kırılma özelliklerini alt plakadaki çentiklerle eşleştirerek üst plakayı benekli alt taban üzerinde hizala. Kısa kenarlar boyunca eşit, eşzamanlı baskı uygulayın, böylece kilitleme özelliklerinin tam olarak bağlandığını kesin mekanik bir çıtırtı hissedilene kadar.
      NOT: Kartuş tek doğru yönde tasarlanmıştır; yanlış montaj snap yapmaz. Substratları her zaman kenarlarından tutun, böylece kontaminasyon veya fonksiyonel yüzeylere zarar vermeyin ve yüzey kaplamalarını birbirine kaydırmaktan kaçının; çünkü bu yüzey kaplamalarını çizebilir.
   2. Kontrol noktası: Mekanik çıtla doğru montajı onaylayın.
      NOT: Kaplama bütünlüğüne dair ön elektrik göstergesi yoktur; yanlış montajdan kaynaklanan fonksiyonel arızalar otomatik olarak tespit edilir ve çalışma sonrası kalite kontrol raporunda bildirilir.
      Duraklama noktası: Kullanılmayan montaj edilmiş kartuşları, oda sıcaklığında 48 saate kadar saklayacak şekilde kapatılmış bir pakette kurutucu (silika jel paketleri) ile saklayın.

3. Hücre hazırlığı

1. Her kullanımdan önce 1 mL Tam Transfeksiyon Tamponu taze hazırlanır; DMF uyumlu elektroporasyon tamponu, sağlanan biyouyumlu iyonik olmayan yüzeyaktif madde ile 20:1 (v/v) oranında (elektroporasyon tamponu: yüzey aktif madde) birleştirilir ve nihai %0,05 (v/v) yüzey aktif madde konsantrasyonu elde edilir. Nazik karıştırın ve buz üzerinde kalın.
   NOT: Burada kullanılan DMF uyumlu transfeksiyon tamponu düşük iletkenlikli, izotonik bir tampondur (iletkenlik: 3,5 mS/cm, osmolalite: 305 mOsm/L). Alternatif tamponlar kullanan araştırmacılar, DMF aktuasyonu ve hücre canlılığı ile uyumluluğu doğrulamalıdır. Biyouyumlu iyonik olmayan yüzeyaktif madde, damlacık sabitlenmesini azaltır; Eğer sağlanan yüzey aktif madde kullanılmazsa, uygun bir ikame vardır.
2. Aktive edilmiş T hücrelerini Transfeksiyon Tamponu ile bir kez yıkayın (yüzey aktif madde içermeden). 180 × g 5 dakika boyunca santrifüj yapın, süpernatantı aspire edin ve hücre pelletini Tam Transfeksiyon Tamponunda (yüzeyaktif madde içeren) 1.0 × 10⁷ hücre/mL ile 10 7 hücre ile kartuş başına toplam 100 μL hacimde yeniden süsküyünüz. Buzda kal.
3. Kartuşu yüklemeden hemen önce, Cas9 nükleazını doğrudan 100 μL T-hücre süspansiyonuna ekleyin ve nazik pipetleme ile karıştırın; Buzda kal.
   NOT: Birincil T hücreleri için, Cas9 100 μL kartuş hacmi başına 42 pmol (0.42 pmol/μL) ile yüklenir. Her elektroporasyon sitesi yaklaşık 1 μL hücre süspansiyonu işliyor ve her düzenlemede 0.42 pmol Cas9 sağlıyor. Bu dozu diğer bağışıklık hücre tiplerine uyum sağlarken optimize edin ( bkz. Tablo 1).

Bileşen	Düzenleme başına nihai yoğunlaştırma
Cas9	0.42 pmol ~1 μL damlada
sgRNA	2.1 pmol (40 nL spot'tan)
PGA	44,4 mg/mL stok lekeleme karışımında
Yüzeyaktif madde	%0,05 (v/v)
Hücre girişi	~10.000 hücre

Tablo 1: Her transfeksiyon damlasında nihai konsantrasyonların özet tablosu.

4. DMF-ection platformunda transfeksiyon

1. Çok kanallı pipet kullanarak, 8 hücre yükleme portunun her birine 10 μL T-hücre/Cas9 karışımı ve 16 sıvı elektrot yükleme portuna 10 μL tam Transfeksiyon Tamponu dağıtın ( Şekil 1'de gösterildiği gibi).
2. Voltajı 500 V'a, darbe süresini 3 ms'ye ve darbe sayısını 2'ye ayarlayın. Elektroporasyon dizisini platform talimatlarına göre başlatın.
   1. Kontrol noktası: Koşudan hemen sonra koşu sonrası QC raporunu inceleyin. Sporadik arızalar (

5. Düzenlenmiş T hücrelerinin boşaltılması ve geri kazanılması

1. Sıvı işleyici kullanarak, her reaksiyon noktasından elektroporlu hücreleri, 150 μL önceden ısıtılmış bazal T-hücre ortamı içeren 96 kuyuyla U-taban plakasına aktarın ve 200 IU/mL IL-2 ile desteklenir.
2. Hücreleri 72 saat boyunca 37 °C, %5 CO₂ sıcaklıkta inkübe ederek protein dönüşümü ve yüzey reseptör ekspresyonu değişikliklerine izin verilebilir.

6. TRAC etkisinin akış sitometrisi analizi

1. Hücreleri, yıkamalar arasında hücre kaybını azaltmak için steril 96 kuyruklu konik alt plakaya aktarın. Hücreleri Akış Sitometri Tamponu (1× PBS, %2 FBS, 2 mM EDTA) ile iki kez yıkayın; 400 × g sıcaklıkta 5 dakika santrifüj yapın ve üst tabakayı nazikçe ters çevirerek üst tabakayı çıkarın. Hücreler plakada pellet halinde kalır.
2. Üretici önerdiği konsantrasyonlarda Flow Cytometry Buffer'da anti-CD4, anti-CD8 ve anti-TCRα/β antikorları içeren yüzey boyama master karışımı hazırlayın. Her kuyuya 25 μL ana karışım ekleyin ve ışıktan korunan 4 °C'de 20 dakika kuluçka yapın. 1× PBS ile (FBS olmadan) iki kez yıkayıp 400 × g 5 dakika boyunca santrifüj yapın. Hücreleri 100 μL 1× PBS içinde 1:1.000 (v/v) oranında canlılık boyası içeren bir şekilde yeniden süzülün ve ışıktan korunan oda sıcaklığında 10 dakika kuluçka yapın.
   NOT: Konik alt plakalar pelet hücrelerini etkilidir; Hücrelerin tüm adımlarda iyi bir şekilde yeniden süspansiyonda olduğundan emin olun.
3. Hücreleri Akış Sitometri Tamponu ile iki kez yıkayın ve her örnek için 150–200 μL içinde tekrar süzülerek alın.
4. Sitometreyi, kullanılan florokromlar için uygun lazer çizgileri ve filtre setleriyle yapılandırın (örneğin, canlılık boyası için 488 nm uyarılma; uygun yüzey işaretleyicileri için 405 nm veya 488 nm). Tek boyalı telafi kontrolleri ve lekesiz bir örnek kullanarak voltajları ayarlayın. Her örnek için en az 5.000 canlı singlet etkinliği toplayın. Kapı ardışık olarak açılır: Saçılma tekleteleri → canlı hücreler (canlılık boyası negatif) → CD4⁺ veya CD8⁺ → TCRα/β ekspresyonu.
   NOT: Standart koşullarda, hücrelerin çoğalma süresi olduğu süreyle, yıkama ve boyama sırasında kaybedilen her örnek için toplam canlı olay 5.000'den 10.000'in üzerine kadar değişebilir.
5. CD4⁺ ve CD8⁺ popülasyonlarındaki TCRα/β-negatif hücrelerin sıklığını ölçerek TRAC gen bozulmasını belirleyin. Her alt küme için canlı singlet kapısına göre TCRα/β-negatif hücrelerin yüzdesi olarak knockout verimliliğini bildirin.

Results

Beklenen sonuçlar
Her koşul başına 10.000 aktif T hücresinin elektroporasyonu genellikle >transfeksiyondan 72 saat sonra >95% 95 kullanılabilirlik ile %85 TRAC etkisi sağlar. Akış sitometrisi, TRAC hedefleme durumunda hedeflenmemiş sgRNA kontrolleri (NTC) ve herhangi bir elektrik alanına maruz kalmayan kontrollere kıyasla TCRα/β boyama kaybının net olduğunu gösterir. Aksi belirtilmedikçe, n bağımsız DMF koşularını ayrı günlerde gerçekleştirir. Aynı kartuş serisinden alınan teknik kopyalar, istatistiksel analizden önce ortalaması alınmış ve bağımsız olarak n'ye katkı sağlamaz. Burada bildirilen tüm T hücresi deneyleri, tek bir sağlıklı bağışçıdan alınan kriyokonserve hücreler kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Aynı platformu kullanarak bağışçıdan bağışçıya varvartlık daha da^{karakterize edilir 9}.

Anyonik polimer katkıları sayesinde elektroporasyon koşullarında Cas9–sgRNA ribonükleoprotein stabilitesi iyileştirildi
Dijital mikrofluidiklerin temel tasarım gereksinimlerinden biri, elektroıslama sırasında damlaların serbestçe kaymasına olanak tanıyan yüksek hidrofobik bir yüzeydir. Bu özellik damla hareketi ve hassas hareket için vazgeçilmez olsa da, reaktif yüklemesi için zorluklar yaratır. Diziyle tarama uygulamaları için, kullanıcı tanımlı yük kütüphanelerinin doğrudan kartuş yüzeyine aktarılabilmesi kritik öneme sahiptir. Bu, reaktif düzenlerinin kullanıcının kütüphane tasarımını yansıtmasını sağlar ve dijital mikrofluidik iş akışının dizili deneyleri ek transfer veya manuel müdahale olmadan sorunsuz şekilde yürütmesini sağlar. Akustik dağıtıcıdan nano kullanma bu görev için çok uygundur; çünkü nanolitre hacimlerini büyük diziler boyunca çeşitli yüzeylere yüksek konumsal hassasiyetle iletebilir. Ancak, damlacıklar hidrofobik kartuş yüzeyine çarptığında, genellikle zıpır, boncuk birikir veya eşit şekilde yayılamaz; bu da tutarsız birikme ve geri kazanmaya yol açar. Bu değişkenlik, 40 nL ile 120 nL arasında değişen ara damla hacimlerinde en belirgindir (Şekil 2A, koşul başına n = 3, *** p değeri < 0.01), burada damlanın kinetik enerjisinin geri tepme yaratacak kadar yüksek olduğu, ancak yüzey yapışmasının sıvıyı sabitlemek için yeterli olmadığı varsayılmaktadır. Sonuç olarak, daha yüksek yük dozajlarında doğrudan kartuş üzerine biriktirme, daha fazla değişiklik yapılmadan güvenilmez olabilir. Bu etkiyi azaltmak için reaktiflere biyogüvenli polimer poli-L-glutamik asit (PGA) takviye edildi. PGA, biyoparçalanabilen, negatif yüklü bir polipeptittir ve ilaç formülasyonlarında stabilizator olarak yaygın olarak kullanılır ve canlı hücre iş akışları için mükemmel uyumludur. Yüklü omurga, damla temas açısını düşüreceği ve daha eşit yayılmayı teşvik edeceği, geri tepmeyi azalttığı ve yüzey yapışmasını iyileştirdiği varsayılmaktadır. PGA varken, depolanan floressein hacimleri emilimle doğrusal ölçeklendi ve kartuşlar arasında varyans belirgin şekilde azaldı. İstatistiksel analiz, PGA'nın 40, 90 ve 120 nL lekeleme hacimlerinde (***p < 0.001, ****p < 0.0001) tekrarlanabilirliği anlamlı şekilde artırdığını, çok küçük damlacıkların (10–20 nL) ise düşük kinetik enerjilerde geri sıçramanın daha az belirgin olduğunu doğruladı.

Daha sonra, DMF iş akışında kullanılan polimer katkı maddelerinin eklenmesi, elektroporasyon için kullanılan düşük hacimli tampon koşullarında Cas9–sgRNA ribonükleoprotein (RNP) davranışı üzerindeki etkileri açısından değerlendirildi. Bu amaçla, Akış kaynaklı dağılım analizi (FIDA) teknolojisi kullanıldı. FIDA, hidrodinamik yarıçapın ve bağlanma afinitesinin doğru, çözelti fazında ölçümü sağladığı için seçilmiştir; bu da protein-nükleik asit etkileşimlerinin deneysel ortamda kullanılan aynı tampon koşullarında nicelendirilmesine olanak tanır. FIDA, serbest sgRNA'nın hidrodinamik yarıçapı (Rh) 3,45 ± 0,26 nm olduğunu ve bunun küçük, tek zincirli RNA türüyle uyumlu olduğunu göstermiştir. Cas9 ile titrasyon, 15.32 Rh ± 0.46 nm ve sub-nanomolar bağlanma afinitesi (KD = 0.70 ± 0.14 nM) ile kararlı bir RNP kompleksi üretmiştir (Şekil 2).

Polimer stabilizasyonunun etkisini değerlendirmek için, RNP oluşumundan önce rehber-RNA'ya poli-L-glutamik asit (PGA) eklenmiştir. PGA'nın varlığı, Cas9 ile sgRNA arasındaki görünüş affinitesini azalttı (K_D = 67,7 ± 9,5 nM) ve kompleks boyutunu yaklaşık 10 nm'ye düşürdü (Şekil 2A sağ panel). Azalmış eğilim daha az sıkı ilişkili kompleksleri gösterse de, daha küçük ve daha uniform R_h PGA'nın büyük boyutlu RNP montajlarının oluşmasını engellediğini göstermiştir (Şekil 2B).

Sonra, RNP stabilitesi elektroporasyon koşullarında Taylor dağılım analizi kullanılarak değerlendirildi (Şekil 2C). Polimer olmadan, Cas9–sgRNA karışımları agregasyonu gösteren geniş, kötü uydurulmuş Taylorgramlar üretmiştir (Şekil 2B). Buna karşılık, 0.0025 mg/mL PGA eklendiğinde, iyi tanımlanmış, monodispers dispers dağılım profilleri (R² = 0.999) ve R_h ~ 9.6 nm elde edilmiştir. Bu sonuçlar, PGA'nın toplanmayı önlediğini ve RNP uniformitesini artırdığını, böylece tekrarlanabilir nanolitre ölçekli elektroporasyonu desteklediğini göstermektedir. Bu stabilizasyon, aşağı akış T hücresi deneylerinde gözlemlenen yüksek düzenleme verimlilikleri için mekanik bir gerekçe sağlar.

Birincil T hücrelerinde doza bağlı düzenleme verimliliği

FIDA deneyleri PGA'nın RNP montajının verimliliğini azalttığını gösterse de, fonksiyonel düzenleme sonuçlarının daha az etkilendiği varsayımlanmıştır; çünkü elektroporasyon genellikle Cas9'a göre fazla kılavuz RNA ile yapılır. Bu nedenle, PGA–RNP giriş hacmi, TRAC lokusunda birincil insan T hücrelerinde nakatlanma verimliliği üzerindeki etkisi açısından değerlendirildi (Şekil 2D). Dört kartuşta, düzenleme verimliliği 40 nL (2.1 pmol), 20 nL (1.05 pmol) ve 10 nL (0.53 pmol) RNP girişlerinde tutarlı olarak yüksek (>75–80%) oldu ve CD4⁺ ile CD8⁺ alt kümeleri arasında minimum değişkenlik vardı. 5 nL (0,26 pmol) olmasına rağmen, düzenleme sağlam kaldı, ancak yüksek dozlara kıyasla ılımlı bir azalma gözlemlendi. Test edilen en düşük dozda (2.5 nL, 0.13 pmol), düzenleme verimliliği önemli ölçüde azaldı ve yaklaşık %60 TRAC KO seviyesinde durağaldı. Kontroller düzenlemenin özgüllüğünü doğruladı: elektroporasyon olmayan kuyular (0V) ve kartuş dışı kontroller (OCC) sadece arka plan etkisini gösterdi. Kartuş dışı kontrol (OCC) CD8⁺ popülasyonunda gözlemlenen yükselmiş TCR-negatif frekans, muhtemelen aktivasyondan sonra donöre özgü başlangıç TCR downmodulasyonunu yansıtır; bu hücreler elektroporasyon veya gen düzenlemesinden bağımsız olarak bu hücrelere kartuşa maruz kalmamıştır. Bu sonuçlar birlikte, DMF-ection'ın nanolitre ölçekli RNP girdilerinde CRISPR aracılı verimli düzenlemeyi mümkün kıldığını göstermektedir. Önemli olarak, düzenleme CD4⁺ ve CD8⁺ T hücreleri arasında karşılaştırılabilirdi; bu da platformun T hücresi alt kümeleri arasında uygulanabilirliğini vurguladı ve RNP kullanımının bir kat daha fazla azaltılabileceğini ve etkisini kaybetmeden azaltabileceğini öne sürdü.

Minyatürize DMF-eksiyonu kullanılarak primer CD4⁺ ve CD8⁺ T hücrelerinde verimli gen bozulması
DMF-eksiyon iş akışının performansını daha derinlemesine doğrulamak için, CRISPR–Cas9 aracılı TRAC lokusu yok edilmesi, birincil insan CD4⁺ ve CD8⁺ T hücrelerinde yalnızca 10.000 aktive hücre kullanılarak değerlendirildi. Üç deneysel grup dahil edildi: TRAC hedefleme rehber durumu (TRAC KO), RNP teslimatının spesifik olmayan etkilerini hesaba katan hedefsiz kontrol (NTC) ve tedavi edilmemiş, manipüle edilmemiş hücrelerde temel TCRα/β ekspresyonunu oluşturmak için kartuş dışı kontrol (OCC). Canlı singlet'ları tanımlamak için standart bir kapı stratejisi uygulandı, ardından CD4⁺ ve CD8⁺ alt kümeleri ile TCRα/β ifadesi geldi (Şekil 3A). TRAC lokusunun yüksek verimli gen bozulması, her iki T-hücre alt kümesinde 40 bağımsız elektroporasyon koşusu boyunca sağlanmıştır. CD4⁺ T hücrelerinde TRAC nakavt verimliliği %4,9 ± 88,4'e ulaşırken, NTC'de %3,2 ± %4,7, OCC koşullarında ise %9,8 ± %5,1 olmuştur. Benzer bir sonuç CD8⁺ T hücrelerinde gözlemlendi; TRAC KO %4,2 ± 89,8'e ulaşırken, %4,2 ± %7,4 (NTC) ve %4,9 (OCC) %2,2 ± %4,9 (OCC) oldu (Şekil 3B, sol). Önemli olarak, elektroporasyon koşullar arasında önemli bir sitotoksisite yaratmadı. Tüm gruplarda canlılık %96'yı aştı ve TRAC KO (97,1 ± 1%), NTC (%96,8 ± %1) ile OCC (%97 ± %1) koşulları arasında anlamlı bir fark yoktu (Şekil 3B, sağ). Bu veriler birlikte, DMF elektroporasyonunun güçlü ve yüksek verimli TRAC bozulmasını mümkün kıldığını ve hücresel sürdürülebilirliği birden fazla bağımsız koşu boyunca korduğunu göstermektedir. Birincil insan T hücreleri, bağışçı onayı ile kurumsal ve satıcı etik yönergelerine uygun olarak ticari kaynaklardan alınmıştır.

Dijital mikrofluidiklerle HEK293T sferoidlerin işlenmesi
Sonrasında, dijital mikrofluidik elektroporasyon iş akışı çok hücreli üç boyutlu yapılara sahip uygulamalar için değerlendirildi. Boş HEK293T sferoidler, düşük yapışma mikroplakalarında her kuyu başına yaklaşık 100 hücre tohumlanarak ve 24 saat kültürlenerek sferoid oluşumuna izin verilerek oluşturuldu (Şekil 4A). Oluşturulan küreler daha sonra toplanmış, yeniden askıya alınmış ve elektroporasyon için dijital mikrofluidik kartuşa yüklenmiştir. Tedavinin ardından, sferoidler 96 kuyuyla bir plakaya aktarıldı ve ardından görüntüleme ve büyüme analizi yapıldı.

Elektroporasyondan sonra her kuyu başına ortalama bir sferoid geri kazanımı sağlamak için, taşıma ve transfer sırasında malzeme kaybını telafi etmek amacıyla kartuşa kasıtlı olarak fazla sayıda sferoid yüklendi. Yaklaşık 192 sferoid 100 μL elektroporasyon tamponunda yeniden süspansiye getirildi ve kartuşa yüklendi. Her reaksiyon ailesi ~9,3 μL süspansiyon aldı, bu ~18 sferoid eşdeğer ve bireysel damlacıklar ~1 μL (damlada başına 1–2 sferoid) içeriyordu. Kartuş çalışması sırasında yaklaşık yarısı sferoidlerin yükleme portunda kaldığı için, bu yükleme stratejisi her üç damlacık elektroporasyon noktasında ortalama ~1 sferoid oluşuyordu.

Sferoid geri kazanım analizi, elektroporasyondan sonra genellikle her kuyu başına 0–1 sferoidin boşaldığını, bu da reaksiyon ailesi başına yaklaşık 4–6 sferoid geri alındığını göstermiştir (Şekil 4B sol panel). Bu geri kazanım teorik maksimumun altındadır ve yıkama, süpernatantın aspirasyonu ve yükleme portunda kürelerin tutulması sırasında meydana gelen kayıpları yansıtır. Bu kayıplar, küçük sferoid çapı (~100 μm) ve süspansiyon içinde tek hücreli olmayan yapıların eşit dağılımını korumanın doğuştan gelen zorluğuna bağlanır. Sonuç olarak, bazı sferoidler eşit olmayan dağınıklıkta kalır veya üç-damlacık bölgesine giremez. Fazla sayıda sferoid yüklenmesi, çoğu elektroporasyon alanında en az bir sferoidin bulunmasını sağladı ve mikrofluidik kartuştaki DAPI boyalı sferoidin mikroskop üzerinde görüntülenmesiyle gösterildiği gibi, tutarlı aşağı akış analizini mümkün kıldı (Şekil 4B, sağ panel). Daha fazla süreç optimizasyonu, eşdeğer iyileşme için gereken sferoid sayısını azaltabilir. Bu kullanım kayıplarına rağmen, iş akışı sağlam sferoidlerin tri-damlacık elektroporasyon geometrisi içinde nazikçe konumlandırılmasını sağladı.

EGFP mRNA iletimi ve HEK293T sferoidlerde canlılık
Elektroporasyon sonrası (her sferoid başına 50 ng GFP mRNA) HEK293T sferoidlere EGFP mRNA'nın etkin bir şekilde ulaşımı gözlemlenmiştir. Elektroporasyondan 24 saat sonra yapılan floresan mikroskopi, elektroporlu sferoidlerde sağlam ve mekansal olarak düzgün GFP ekspresyonunu ortaya koydu, oysa 0 V veya kartuş dışı kontrol koşullarında tespit edilebilir floresans gözlemlenmedi (Şekil 4C, sol panel). Normalize edilmiş ortalama floresans yoğunluğunun (MFI) sferoid alanı başına nicel analizi, test edilen her iki elektroporasyon parametre seti altında başarılı transfeksiyon olduğunu doğruladı (Şekil 4C, orta panel). Özellikle, 500 V, 2 ms, 2 darbede elektroporlanmış sferoidler 6.96 MFI × ^10-5 ± 3.50 × ^10-5 gösterirken, 375 V, 6 ms, 1 darbede elektropor edilenler MFI 5.05 × ^10-5 ± 3.29 × ^10-5 gösterdi. Kontrol koşullarında ölçülebilir floresans tespit edilmedi (0 ± 0). Her iki elektroporasyon durumu da kontrollere kıyasla (p < 0.05) anlamlı şekilde daha yüksek floresans üretmiştir ve darbe parametreleri arasında istatistiksel olarak anlamlı bir fark yoktur. Elektroporasyonun sferoid büyümesini veya yapısal bütünlüğü olumsuz etkileyip etkilemediğini değerlendirmek için, tedaviden sonraki 5 gün boyunca sferoid çapları günlük olarak ölçüldü. Elektroporlu sferoidler, tedavi edilmemiş kontrollerle karşılaştırılabilir büyüme kinetikleri sergilemiştir; bu da mRNA transfeksiyonunun sferoid canlılığını veya proliferatif kapasiteyi bozmadığını gösterir (Şekil 4C, sağ panel). Bu sonuçlar birlikte, dijital mikrofluidik elektroporasyonun sağlam çok hücreli sferoidlere verimli mRNA iletimi sağladığını ve yapısal bütünlüğünü ve büyümeyi korurken, bu platformun üç boyutlu hücresel modellere genişletilmesinin mümkün olduğunu göstermektedir.

Veriler ortalama ± standart sapma olarak sunulur. İstatistiksel anlamlılık, tek yönlü ANOVA ile Tukey'nin çoklu karşılaştırmalar için sonradan düzeltmesi kullanılarak belirlendi ve p < 0.05 anlamlılık eşiği oldu. N değer, şekilde belirtildiği gibi bağımsız biyolojik kopyaları (ayrı bağışçılar veya bağımsız kartuş koşuları) temsil eder.

Şekil 1. DMF elektroporasyon platformu mimarisi ve iş akışı. (A) DMF kartuşunun fotoğrafı. (B) Monte edilmiş 48 plex kartuş düzeninin (orta fotoğraf) açıklamalı şeması, her biri altı bağımsız adreslenebilir elektroporasyon noktası içeren sekiz özdeş ailenin (A–H) organizasyonunu gösterir; sıvı elektrot yükleme portları, hücre yükleme portları, anot, katot ve nano spot bölgeleri etiketlenmiş (sol iç görsel). Yükleme portları, boşaltma portları ve montaj snapleri gibi temel özellikler etiketlenmiştir. Kartuş, iki plakanın tek doğru konumda snap ile monte edilmesiyle monte edilir ve belirgin mekanik bir bağlantı hissedilene kadar. Sağdaki görsel: sıvı işleyici dağıtım haritası, yükleme portları (kırmızı), boşaltma portları (pembe) ve tespit hedef bölgeleri (mavi) için renk kodlu konumları gösteriyor. (C) Sol: tüm 48 noktada akustik dağıtımın konumsal doğruluğunu gösteren görüntü (n = 48), bırakma pozisyonları elektrodun orta noktasına (mm) göre çizilmiştir. Sıkı kümelenme, sub-milimetre biriktirme doğruluğunu doğrular. Sağda: hücre damlasının rehidrasyonundan önce doğru ortalanmış bir noktayı (üstte) ve rehidrasyon sırasında, damlanın kılavuzun olduğu yere ileri geri taşındığı ve yeniden süzülmesi için (alt, kırmızı ok) gösteren temsil edici fotoğraflar. (D) Ayrı elektroporasyon bölgelerinin üstten görünümü, damlaların (i) damlayı depolanmış kılavuz RNA üzerinde ileri geri taşıyarak yükün yeniden hidratlanması, (ii) anod ile katot arasında elektroporasyon bölgesine hareket etmesini gösteriyor; burada hücre damlası yan iki sıvı elektrot damlalarıyla köprü oluşturup darbe almaktadır, ve (iii) tam üçlü drop, sıvı taşıyıcı tarafından alınmadan önce boşaltma portuna taşınır. (E) Uçtan uca iş akışı şeması. Kılavuz RNA, akustik bir dağıtıcı kullanılarak kartuş alt tabakasına yatırılır. Hücreler ve yük, otomatik sıvı işleyici kullanılarak kartuşa hazırlanır ve yüklenir. Elektroporasyon DMF platformunda gerçekleştirilir. Hücreler 96 kuyuyla bir plakaya boşaltılar ve kurtarış için bir kuluçka makinesine aktarılır. Aşağı akış analizi, akış sitometrisi, mikroskopi, yeni nesil dizileme veya diğer uygun okumalar kullanılarak yapılır. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2. Polimer takviyesinin biriktirme ve RNP montajı üzerindeki etkisi. (A) Polimer takviyesi akustik biriktirme salıtı artırır. Dört bağımsız kartuşta biriktirme ve yeniden yapılandırıldıktan sonra, poli-L-glutamik asit olsun ya da olmasın, floresin emilimi yapılır. PGA'nın varlığında varyans ara hacimlerde (40–120 nL) azalmıştır. 
(B) PGA'nın Cas9–sgRNA montajı üzerindeki etkisi. PGA'nın yokluğunda (sol panel) veya varlığında (sağ panel) hidrodinamik yarıçapı (Rh) ölçün FIDA afinite bağlanma eğrileri. Serbest sgRNA 0,26 nm ± 3,45 Rh gösterirken, Cas9 titrasyonu 15,32 ± 0,46 nm RNP kompleks boyutu elde etti (Kd = 0,70 ± 0,14 nM). PGA eklemesi, konsantrasyona bağlı olarak kompleks boyutu azaltmış ve bağlanma afinitesini zayıflatmıştır. 0.005 mg/mL PGA eklendiğinde, serbest sgRNA 4.31 ± 0.07 nm Rh gösterirken, Cas9 titrasyonu RNP kompleks boyutunu 10.21 ± 0.38 nm (K) verdi_d = 67.7 ± 9.5 nM). Deneyler, %0,05 Pluronik F-68 ile düşük iletkenlikli elektroporasyon testi tamponu içinde gerçekleştirildi. Floresans entegre LED modülü kullanılarak 480 nm'de tespit edildi. Tüm deneyler için kalıcı kaplamalı bir kapiler (Ø 75 μm, L = 100 cm) kullanıldı. Poliyanyonik polimerlerin RNP montajı üzerindeki etkisini test etmek için, PGA, 0.0025 mg/mL ve 0.005 mg/mL konsantrasyonlarında analiz karışımlarına eklendi. Bu koşullar, dijital mikrofluidiklerde, elektrosvetleme ve elektroporasyon tamponlarında kullanılan aralığı modellemek için seçildi. Doğrudan bağlanma analizi için, floresan gösterge olarak TRAC lokusunu hedefleyen 10 nM FAM etiketli sgRNA kullanıldı. Cas9 nükleazının artan konsantrasyonları (500 nM'e kadar) CapMix testinde göstergeye karşı titre edilerek karmaşık oluşum için dispersiye profilleri oluşturuldu. Tüm deneyler 25 °C'de yapıldı; her veri noktası 40 nL Gösterge ve ~12 μL analit (Cas9) tüketti. Deneyler şu dizilikle yapıldı: (1) %0,1 Fosforik Asit ile 3.500 mbar'da 30 saniye boyunca yıkama; (2) 3.500 mbar'da test tamponu ile 30 saniye boyunca yıkama; (3) kapilleri 3.500 mbar'da 20 saniye boyunca analitle doldurmak; (4) göstergeyi 50 mbar'da 10 saniye boyunca enjekte etmek; (5) 400 mbar ile 180 saniye boyunca analit ile harekete geçirme ve ölçüm. Hidrodinamik yarıçaplar, çıkarılmış zirve genişliğinin maksimum zirve yüksekliğinin yarısında ve ayrışma sabitleri (K_D) 1:1 bağlama modeline doğrusal olmayan regresyon uyumuyla belirlendi. (C) PGA'nın RNP stabilitesi üzerindeki etkisi. PGA ile ve olmadan Cas9–sgRNA komplekslerinin Taylor dispersyon profilleri, 500 nM Cas9 nükleazı ve 50 nM FAM etiketli sgRNA ile gerçekleştirilmiştir. PGA yokluğunda, zamanla (solda) kompleksten gelen büyük agregaların oluşumu ve azalan bir sinyal ile birlikte kararlı bir kompleks gözlemlenmemiştir. 0.0025 mg/mL PGA eklendiğinde, minimal agregasyona sahip iyi tanımlanmış, monodispers bir Taylorgram elde edildi_h ~ 9.6 nm (R² = 0.999, sağ). Karmaşık stabilite, standart elektroporasyon koşulları altında (500 nM Cas9 + 50 nM sgRNA) 0.0025 mg/mL PGA ile veya olmadan değerlendirildi. Örnekler önceden karıştırıldı ve giriş numune tepsisinde 4 °C sıcaklıkta tutuldu; enjeksiyonlar ise birkaç saat boyunca 10 dakikalık aralıklarla yapıldı. Deneyler şu dizilikle yapıldı: (1) %0,1 Fosforik Asit ile 3.500 mbar'da 30 saniye boyunca yıkama; (2) 3.500 mbar'da test tamponu ile 30 saniye boyunca yıkama; (3) kapiler kahilleri 3.500 mbar'da 20 saniye boyunca analitle (test tamponu) doldurmak; (4) göstergeyi 50 mbar'da 10 saniye boyunca enjekte etmek; (5) 400 mbar ile 180 saniye boyunca analit ile harekete geçirme ve ölçüm. Kararsız kompleks oluşumu, büyük agregaların (Taylorgram'daki sivri) oluşumu ve azalan sinyal yoluyla gösterilmiştir. Kararlı kompleksler, iyi uyumlu, monodispers Taylorgramlar (R² > 0.99), ve R_h Değerler uyumlu profillerden çıkarıldı. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3. TCR alfa/beta nakavt etkinliği ve birincil insan T hücrelerinde canlılık. (A) Canlı tekliler, CD4⁺ ve CD8⁺ T-hücre alt kümeleri ve kontrol (hedeflenmeyiş sgRNA) ve deneysel (TRAC sgRNA) koşullarında TCRα/β ekspresyonu için temsil akış sitometrisi kapı geçiş stratejisi. Hücreler, TCRα/β yüzey ekspresyonunun değerlendirilmesinden önce FSC/SSC, singletler, canlılık ve CD4⁺ veya CD8⁺ popülasyonlarında ardışık olarak kapatılmıştır. (B) Sol: TCRα/β etkisi CD4⁺ ve CD8⁺ T hücresi alt kümelerinde üç koşulda (TRAC KO), hedeflenmeden kontrol (NTC) ve kartuş dışı kontrol (OCC). CD4⁺: TRAC KO = 88.4 ± %4.9 (n = 40), NTC = 3.2 ± %4.7 (n = 24), OCC = 9.8 ± %5.1 (n = 18). CD8⁺: TRAC KO = 89.8 ± %4.2 (n = 40), NTC = 4.2 ± %7.4 (n = 24), OCC = 20.2 ± %4.9 (n = 18). Sağ: Tüm koşullarda elektroporasyon sonrası canlılık, singlet'larda kapalı. Yaşamlılık: TRAC KO = 97.1 ± %1 (n = 40), NTC = 96.8 ± %1 (n = 24), OCC = 97 ± %1 (n = 18). Bireysel veri noktaları ortalama ve SD ile gösterilir. n, birden fazla kartuş ve gün boyunca bağımsız elektroporasyon koşularını temsil eder. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4. DMF-eksiyon kullanarak HEK293T sferoidlere verimli mRNA iletimi . (A) Kürelerin oluşumu ve küre transfeksiyonu gerçekleştirme sürecini tanımlayan iş akışı diyagramı. Her kuyu başına yüz HEK293T hücre, özel sferoid mikroplakaya yüklenir ve 24 saat boyunca kültürlenerek 100 μm çapında sferoidler oluşturulur. Sferoidler (192) boşaldılır ve 100 μL transfeksiyon tampponuna yeniden süspansiyon edilir. Bu süspansiyon, uygun yükle, kılavuz noktalı DMF-ection kartuşuna aile başına 9.3 μL olarak yüklenir. Elektroporasyon gerçekleştiğinde, örnekler aşağı akış analizi için 96 kuyuyla bir plakaya boşaltılır. (B) Sol: DMF-ection kartuşunda aile başına boşaltılan sferoid sayısı, elle pipetlenen kartuş dışı kontrollere kıyasla karşılaştırıldığında. Orta: Üçlü damlanın floresan görüntüsü, büyük kırmızı kare üçlü damlayı çevreler, kırmızı oval ise küresi çevreler. Sağ: Yükleme portunun yüklü küresel (mavi daireler) olduğu floresan görüntü. (C) Sol panel: Elektroporasyondan önce sağlam HEK293T sferoidlerin parlak alan görüntüleri ve EGFP mRNA elektroporasyonundan 24 saat sonra sferoidlerin floresans görüntüleri, 0 V ve kartuş dışı kontrollerle karşılaştırıldığında. (D) Üst panel: İki elektroporasyon koşulları için (500 V, 2 ms, 2 darbe; 375 V, 6 ms, 1 darbe) ortalama floresan yoğunluğunun küre alanına normalize edilmiş nicelenmesi. Elektroporlu koşullar arasında önemli bir fark yoktur, ancak tüm elektroporlu koşullar 0 V ve kartuş dışı kontrollerden (500 V 2 ms 2 darbe: 6.955 × ^10-5 ± 3.502 × ^10-5, 375 V 6 ms 1 darbe: 5.045 × ^10-5 ± 3.294 × ^10-5, 0 V: 0 ± 0, kartuş dışı kontrol: 0 ± 0 (*p < 0.05). Görüntüler, FIJI görüntü işleme^{paketi 10} kullanılarak işlendi. (500 V, 2 ms, 2 darbe: n = 6; 375 V, 6 ms, 1 darbe: n = 4; Kartuş dışı kontrol: n = 3; 0 V kontrolü: n = 3). (D) Alt panel: 5 gün boyunca koşullar arasında elektroporasyon sonrası sferoid çap. Çap, ters mikroskopla 20x büyütme ile alınan faz sözleşmesi görüntülerinden FIJI kullanılarak ölçüldü. (500 V, 2 ms, 2 darbe: n = 6; 375 V, 6 ms, 1 darbe: n = 4; Kartuş kontrolü kapalı: n = 3; 0 V kontrolü: n = 3). Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Discussion

Bu protokol, nanolitre ölçekli damlalar kullanarak birincil insan T hücrelerine verimli hücre içi teslimatı sağlayan küçültülmüş dijital mikrofluidik elektroporasyon iş akışını tanımlar. Bu yöntemin temel avantajlarından biri, her reaksiyonda sadece 10.000 hücre kullanılarak CRISPR–Cas9 genom düzenlemesi yapılabilme yeteneğidir ve bu da geleneksel elektroporasyona kıyasla malzeme gereksinimlerini önemli ölçüde azaltmaktadır. Damla tabanlı mimari, otomasyonu destekler; çoklu paralel sitelerde tekrarlanabilir reaktif işleme ve tepki montajını sağlar.

Önceki çalışmalarda, DMF-eksiyon platformunun yaygın kullanılan bir sistemle doğrudan karşılaştırılması, geleneksel nükleofeksiyonun her düzenlemede 10.000 hücrede %2'den az GFP-pozitif T hücresi ürettiğini, DMF-ection platformunun ise aynı düşük girdi koşullarında >%90 transfeksiyon verimliliği elde ettiğini göstermiştir. 192 koşullu dizilmiş bir ekran için, DMF platformu geleneksel^{yöntemlere göre} 25 kat daha az hücre ve yaklaşık 50 kat daha az Cas9 gerektiriyordu. Bu karşılaştırmalar, düşük girdili ve tarama uygulamaları için minyatürize DMF elektroporasyonunun malzeme avantajlarını vurgulamaktadır

Kritik adımlar ve sorun giderme
Başarı için birkaç adım kritik öneme sahiptir. Akustik sıvı işleyicinin doğru kalibrasyonu, kılavuz RNA'nın kartuş alt tabakasına hassas şekilde yerleştirilmesini sağlar ve bu, tutarlı RNP montajı için gereklidir. Eğer lekelenme tutarsızsa veya damlacıklar alt tabakaya yapışmıyorsa, PGA'nın rehber-RNA karışımına doğru konsantrasyonda (5 mg/mL final) dahil edildiğini ve akustik dağıtıcının belirli kaynak plaka geometrisine göre kalibre edildiğini kontrol edin. Ara hacimlerde (40–120 nL) tutarsız lekelenme, en yaygın olarak hidrofobik yüzeyde damlaların geri sıçramasından kaynaklanır; PGA konsantrasyonunu biraz artırmak veya dağıtım yüksekliğini azaltmak bu sorunu çözebilir.

Yüklemeden önce doğru hücre konsantrasyonunu korumak önemlidir, çünkü yoğunluktaki sapmalar damla oluşumunu bozabilir ve düzenleme verimliliğini düşürebilir. Düzenleme verimliliği %75'in altına düşerse, önce T-hücre aktivasyonunun yeterli olduğunu doğrulayın (elektroporasyondan önce akış sitometrisiyle CD25 ve CD69 regülasyonu doğrulayın) ve Cas9 ile sgRNA'nın yüklemeden hemen önce birleştirildiğini doğrulayın.

Polimer katkı maddeleri, elektroporasyon tampon koşullarında Cas9–sgRNA komplekslerinin stabilizasyonunda önemli bir rol^{oynar 11}. PGA nominal bağlanma eğilimini azaltsa da, stabilizasyon etkisi tekrarlanabilirliği artırır ve nanolitre hacimlerde toplanmayı önler. Bu, araştırmacıların iş akışını diğer protein-RNA komplekslerine uyarlaması için ayarlanabilir bir parametredir.

Sorun Giderme
Başarısız damla köprüleme
Her deneyden sonra enstrümantal koşum sonrası kalite kontrol raporunu gözden geçirin. Tespit edilen akımın olmaması, yetersiz damlacık veya sigorta başarısızlığı nedeniyle köprülemenin başarısız olduğunu gösterir ve sistem tarafından otomatik olarak işaretlenir. Etkilenen alanlar aynı koşu içinde kurtarılamaz. Başarısızlıklar aralıklı (%<%10) ise herhangi bir işlem gerekmez; Çarpmayı en aza indirmek için birden fazla kartuş arasında replikaları dağıtın. Eğer arızalar sistematikse, QC kartını ve Sistem Sağlığı Kontrolü'nü çalıştırın ve sorunlar devam ederse teknik destek ile iletişime geçin.

Tutarsız sgRNA lekesi
Dağıtımdan sonra, beklenen tüm damlaların elektrot sınırları içinde merkezlenmiş ve uydu damlacıklarından arınmış olduğunu görsel olarak doğrulayın. Polidispersasyonu önlemek için kılavuz RNA karışımına PGA ekleyin. Eksik damlalar için dağıtıcı çalışma raporunu kontrol edin ve gerekirse tekrar dağıtın. Zayıf menisküs oluşumu için, her kuyu başına minimum 5 μL bulundurun, plakayı kısa bir süre döndürün ve düz bir yüzeye hafifçe dokunun. Buharlaşmayı önlemek için buz üzerinde çalışın ve kullanılmadığında plakaları kapatın.

Azalan düzenleme verimliliği
Düşük düzenleme verimliliği gözlemlenirse, aşağıdaki sırayla sorun giderilme yapılabilir: (1) RNP'ye geçmeden önce teslimat koşullarını EGFP mRNA kullanarak doğrulamak; (2) ölçülen kalite akımı beklentilerle eşleşmesini doğrular; (3) titrasyon hücre yoğunluğu, rehber RNA ve Cas9 konsantrasyonu; (4) yüklemeden hemen önce yüksek hücre canlılığını doğrulamak; (5) reaktif bütünlüğünü ve depolama koşullarını doğrulamak; (6) okuma yönteminin ilgi duyulan hücre yoğunluğu ve hedefe uygun olduğunu doğrulamak.

Platformun alternatif hücre tipleri ve modellerine uyarlanması
NK hücreleri veya düzenleyici T hücreleri gibi diğer birincil bağışıklık hücre tipleri için elektroporasyon parametreleri optimizasyon gerektirecektir. Hücre büyüklüğü, membran geçirgenliği için gereken elektrik alan eşiğinin önemli bir belirleyicisidir: küçük hücreler daha yüksek alan şiddetine ihtiyaç duyarken, daha büyük hücreler daha düşük voltajlarda geçirimlenir—elektroporasyon biyofiziğinde iyi belgelenmiş bir ilişki. Aktif CD3⁺ T hücrelerinden küçük hücre tipleri için başlangıç noktası olarak, aşırı termal stresi önlemek için darbe süresini kısa (2–3 ms) tutarken voltajı (500–550 V) korumak veya hafifçe artırmak gerekir. Daha büyük hücreler için voltajı 350–400 V'a düşürün ve darbe süresini 10 ms'yi aşmadan modüle edin. Ayrıca, donör seviyesinde mikro-optimizasyon elektroporasyonda yaygın bir uygulamadır ve sağlıklı donör hücrelerde doğrulanan parametreler doğrudan hasta veya hasta kaynaklı materyale çevrilmeyebilir. Hematolojik mişleri, kronik enfeksiyon veya bağışıklık eksikliği olan donörlerden alınan hücreler sıklıkla değişmiş biyofiziksel özellikler sergiler ve düzenleme verimliliği ile canlılığı, özellikle sağlıklı olmayan veya klinik örneklerle çalışırken her yeni donör için yeniden değerlendirilmelidir. Hücre canlılığı elektroporasyon sonrası 24 saat ve 72 saat içinde değerlendirilmeli ve parametreler yinelemeli olarak ayarlanmalıdır. RNP teslimat verimliliği düşürülürse, Cas9 dozu T-hücre protokolüne göre 1,5–2× oranında artırılması gerekebilir.

200 μm çapı aşan organoidler gibi daha büyük veya daha yoğun 3D modeller için, kartuştaki conta, artan yapı boyutu ve difüzyon bariyerlerine uyum sağlamak için modifikasyon gerektirebilir. Bu tür uygulamaları deneyen kullanıcılar, reaktif penetrasyonunu artırmak için dış hücre katmanlarını önceden dissosiyasyon yapmayı veya ardışık olarak birden fazla darbe koşulları uygulamayı düşünmelidir. Burada doğrulanan 100 μm sferoid çapın ötesinde yapılar için damla geometrisi ve darbe parametrelerinin uyarlanması konusunda rehberlik almak için ilgili yazarla iletişime geçin.

Çeviri önemi
Bu iş akışının çeviri potansiyeli basit bir nakavtın ötesine geçiyor. Platform, birincil T hücrelerinde TRAC lokusunda 4 kb GFP yapısının homoloji yönlendirmeli onarım girişi ve fonksiyonel bir anti-HER2 CAR ile CD4⁺ T hücresi tükeniminin yeni düzenleyicilerini belirleyen 45 hedefli dizilmiş CRISPR^{ekranına uygulanmıştır 9}. Bu uygulamalar, klinik olarak ilgili birincil hücre modellerinde protokol düzeyinde optimizasyondan fonksiyonel keşfe giden bir yolu göstermektedir. Buna rağmen, önemli sınırlamalar devam etmektedir: dizileme ile allel bozulma oranları, sitokin salgılanması ve in vivo enstrtment gibi fonksiyonel sonuçlar mevcut protokolde değerlendirilmemiş ve terapötik çeviri için gerekli sonraki adımları temsil etmektedir. Ayrıca, platform kartuş başına 48 paralel reaksiyonu desteklerken, daha büyük ekranlar için çoklu kartuş paralelleştirmesi gerekecektir.

Sınırlamalar
Her minyatürize platformda olduğu gibi, bazı pratik kısıtlamalar kabul edilmelidir. Aşağı akış fenotipleme, küçük reaksiyon ölçeğine uyarlanmalıdır; Akış sitometrisi edinimi, yeterli olay sayısını elde etmek için ek konsantrasyon adımları veya replikat kuyuların havuzlanmasını gerektirebilir. Platformun elektroporasyon ayarları, elektrik alanlarına yüksek duyarlılığa sahip hücre tipleri için de optimizasyon gerektirebilir ve kullanıcılar yayımlanmış parametreleri evrensel olarak sabit değerler yerine başlangıç noktası olarak kabul etmelidir. Son olarak, burada sunulan küreoid iş akışı için genişletilmiş elektroporasyon sonrası zaman noktalarında resmi canlılık boyama yapılmadı; Çapa dayalı büyüme takibi, yapısal bütünlüğün vekil ölçütü olarak kullanıldı ve gelecekteki karakterizasyon için önemli bir yönü temsil ediyordu.

Genel olarak, viral olmayan bir transfeksiyon yöntemi olan DMF-ection, düşük girdili ve yüksek verimlilikli ortamlarda genom düzenleme ve mRNA teslimatı için güçlü ve esnek bir yaklaşım sunar. Birincil T hücreleri, yapılandırılmış 3D modeller ve otomatik sıvı işleme ile uyumluluğu, hücre terapisi mühendisliği, çok koşullu CRISPR taraması ve küçültülmüş fonksiyonel genomikte fırsatları genişletmektedir.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
12 Channel VOYAGER Adjustable Tip Spacing Pipette	Integra	4732	Instrumentasyon
1x PBS	Gibco		Akış Tamponu
96 Well Plate, Sphera Low-Attachment Surface	Thermo Fisher	174927	Sferoid protokolü
96-well conical-bottom plate	Sarstedt	82.1583.001	Sferoid protokolü
Alexa Fluor 647 anti-human CD4 Antibody	Biolegend	357421	1 in 200, Clone A161A1
Attune Flow Cytometer	ThermoFisher		Instrumentasyon
DMEM Media	Gibco	10564011	Medya Takviyesi- Sferoid kültürü
DMF compatible buffer	DropGenie		Transfeksiyon
DropGenie Transfection System	DropGenie		Instrumentasyon
Echo Acoustic Dispenser 650 Series	Beckman Coulter Life Scienes
Echo Qualified 384-well Low Dead Volume	Beckman Coulter Life Scienes
EDTA	Invitrogen		Akış Tamponu
EGFP mRNA	Trilink	L-7201
EVOS Floresan Mikroskobu	ThermoFisher		Instrumentasyon
Fetal Bovine Serum	Gibco	16000044	Medya Takviyesi- Sferoid kültürü
Fida 1 instrument and Fida Neo 480 nm detector	Fida Biosystems ApS		Instrumentasyon
Ghost Dye Violet 510	Cytek Biosciences	13-0870
HEK293T Cells	ATCC		Sferoid protokolü
Human IL-2 Recombinant Protein,	Peprotech	200-02 50ug	T hücresi medya takviyesi
Human Primary Pan CD3+ T Cells	All Cells		Periferik Kan, Kriyokorumalı, pan CD3+ Yardımcı T Hücreleri, Negatif Seçili
Immunocult CD3/CD28 Activator	StemCell Technologies	10970	T Hücresi Aktivasyon medya
Immunocult Expansion Media	StemCell Technologies	10981	T Hücresi Aktivasyon medya
Incucyte Live Cell Analysis System	Sartorius		Instrumentasyon
INTEGRA ASSIST PLUS pipetting robot	Integra	4505, 4-Position Portrait Deck (PN 4521),	Instrumentasyon
non targeting synthetic guide RNA	Synthego		5’ GCACTACCAGAGCTAACTCA 3'
NucleoCounter NC-202	Chemometec
PE anti-human TCR α/β Recombinant Antibody	Biolegend	380805	1 in 200, Clone QA20B12
PE-Cy 7 Anti-Human CD8	BD Pharmingen	557750	1 in 200, Clone RPA-T8
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140122	Medya Takviyesi- Sferoid kültürü
Poly-L-glutamic Acid (PGA)	Sigma Aldrich	P4761-100MG	100mg/ml olarak kullanın
Prism version 8.0.0	GraphPad Software, Inc.		Yazılım
sNLS-SpCas9-sNLS Nükleaz	IDT	10017687
Spheroid Microplate	Corning	3830	Sferoid protokolü
Surfactant F	DropGenie		Transfeksiyon- DMF uyumlu tamponda 1:20 oranında kullanarak tamamlayıcı Transfeksiyon tamponu hazırlayın
TRAC synthetic guide RNA	Synthego		5’ AGAGTCTCTCAGCTGGTACA 3'
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Gibco	25-300-062	Sferoid protokolü