Yöntem makalesi

Yağlı stromal damar fraksiyonunda yansıtılan ışık kullanılarak yaşlanma tespiti

171 görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/70588

⸱

5 Haziran 2026

 ,  ,  , 
1Department of Cell and Molecular Biology, Karolinska Institutet, 2Nordiska Kliniken Stockholm

Bu makalede

Özet

Bu protokol, insan yağ dokusundan izole edilen stromal damar fraksiyonunda yaşlanma ile ilişkili beta-galaktosidaz (SA-β-gal) aktivitesinin objektif ve tek hücreli tespiti için yansıtılmış ışık konfokal mikroskopisi sunmaktadır. Yöntem, immünositokimya ile uyumludur, nicel değerlendirme için pH kontrollerini içerir ve ayrıca geleneksel SA-β-gal boyamaya daha hassas ve daha az öznel bir alternatif sunar.

Özet

Hücresel yaşlanma, kalıcı hücre döngüsü durması ve doku fonksiyonunu etkileyen, yaşlanmaya ve metabolik hastalıklara katkıda bulunan belirgin bir sekretor profilin gelişimiyle karakterize edilen stres kaynaklı bir durumdur. Yaşlanma ile ilişkili β-galaktosidaz (SA-β-gal) aktivitesi, yaşlanan hücrelerin bir belirteçsi olarak yaygın olarak kullanılır; ancak geleneksel SA-β-gal testleri genellikle öznel görsel değerlendirmeye dayanır ve sınırlı nicel bilgi sağlar. Bu sınırlamalar özellikle preadipositler, bağışıklık hücreleri ve endotel hücrelerinin heterojen karışımını içeren yağ dokusundan türetilen stromal vasküler fraksiyon (SVF) gibi birincil insan hücre popülasyonlarında belirgindir. Burada, insan SVF hücrelerinde SA-β-gal aktivitesinin yüksek çözünürlüklü, nicel tespiti için optimize edilmiş yansıtılan ışık konfokal mikroskopi yaklaşımını sunuyoruz. Bu protokol, SA-β-gal aktivitesinin objektif tek hücre analizini mümkün kılmak, ek yaşlanma veya soy belirteçlerinin çoklu olarak tespit edilmesi için eşzamanlı immünositokimya imkanı sağlar ve pH uyumlu kontrolleri dahil eder. Bu özellikleri birleştirerek, bu yöntem heterojen birincil insan hücre popülasyonlarında hücresel yaşlanmayı incelemek için hassas, tekrarlanabilir ve nicel bir yaklaşım sunar. Geleneksel SA-β-gal boyamaya daha iyi bir alternatif sunar.

Giriş

Hücresel yaşlanma, DNA hasarı, telomer kaybı ve onkogen aktivasyonu dahil olmak üzere birçok stres türünden kaynaklanabilen çok yönlü bir yanıttır. Bu durum, hücre döngüsünün stabil bir durgunluğuna ve kısmen anti-apoptotikproteinlerin 1,2'nin indüksiyonuyla apoptoza karşı direncin artmasına yol açar. Yaşlanma, doku bütünlüğünün korunmasının önemli olduğu durumlarda, örneğin onarım ve bakım gibi durumlarda hücre hayatta kalmasının iyileşmesiyleilişkilendirilmiştir 3,4. Doku homeostazındaki rolünün ötesinde, yaşlanma embriyonik desenlerişekillendirerek normal gelişime katkıda bulunur 5,6 ve hasarlı veya potansiyel olarak kötü huylu hücrelerin temizlenmesini teşvik ederek tümör oluşumuna engelolarak 7,8,9. Yaşlanma faydalı işlevler gösterse de, birçok çalışma, yaşlanan hücrelerin yerel metabolizmayı bozabileceği, çevredeki dokulara zarar verebileceği ve hatta tümör ilerlemesini destekleyebilen pro-inflamatuar salgı profili kazandığı zıt bir yönüortaya koymuştur 10,11,12,13.

Yaşlanma, birden fazla dokuda çeşitli hücre tiplerinde tespit edilmiştir ve genellikle yaşlanma, hastalık, doku işlev bozukluğu veya kanserle ilişkilidir. Karaciğerde, karaciğer yıldız hücrelerinin yaşlanması, metabolik homeostazı salgılananfaktörler 14,15 yoluyla değiştirerek tümör ilerlemesini teşvik ettiği gösterilmiştir. Hepatosit 16 veya tüm karaciğerbiyopsilerini 17 inceleyen çalışmalar, bu hücrelerdeki yaşlanmanın metabolik bozuklukla ilişkili steatotik karaciğer hastalığı ve disfonksiyon ilişkili steatohepatit gibi metabolik eş hastalıklara katkıda bulunabileceğini göstermektedir. Ayrıca, tip 2 diyabet ile yaşlanma arasındaki ilişki son on yılda önemli bir ilgi gördü; yaşlanmanın pankreas β hücreleri,hepatositler 16 ve adipositler 18,19,20,21'de diyabetle ilişkili komplikasyonlarla ilişkilendirildiğini kanıtlamaktadır. Bu bulgular, metabolik dokularda yaşlanan hücrelerin doğru şekilde tanımlanmasının önemini vurgulamaktadır; burada birikim ve heterojenlik, hastalık ilerlemesine ve tedavi amaçlı hedefleme süreçlerinekatkıda bulunur 22.

Yaşlanmayla ilişkili sinyal ve protein ifade değişiklikleri genellikle hücre ve dokuya özboluşludur; ancak yaşlanan hücrelere özgü birçok özellik genel olarak karakteristik olarak görülür. En yaygın kullanılan belirteçlerden biri, pH 6.0'da β-galaktosidazın artan enzimatik aktivitesidir; buna yaşlanma ile ilişkili β-galaktosidaza (SA-β-gal)23 denir. β-galaktosidaz, tüm hücrelerde bulunan lizozomal hidrolazadır ve normalde asidik pH (~4.5–5.0) seviyesinde aktiftir ve glikozillenmiş substratların bozulmasına katkıda bulunur. SA-β-gal'ın belirleyici özelliği, β-galaktosidaz aktivitesinin optimal olmayan pH koşullarında tutulmasıdır. Klasik testte, hücreler sentetik alt 5-bromo-4-kloro-3-indolil-β-D-galaktopiranozid (X-gal) ile pH 6.0'da kuluçka içindedir; burada enzimatik aktivite çoğu hücrede azalırken, yaşlanan hücrelerde tespit edilebilir kalır. Bu, mikroskobik olarak görselleştirilebilen çözünmeyen mavi birçökeltinin oluşmasına yol açar 24.

Bu test yaygın olarak benimsenmiş olsa da, X-gal çökeltinin tespiti geleneksel olarak parlak alan mikroskobisine dayanmıştır. Parlak alan algılama, mavi çökeltinin görsel olarak tanımlanmasına dayanır ve bu nedenle düşük seviyeli sinyaller ve erken yaşlanma durumları için sınırlı hassasiyete sahiptir. Buna karşılık, yansıtılan ışık görüntüleme, X-gal çökeltinin optik yoğunluğunu yakalar ve daha geniş bir dinamik aralıkta nicel algılama sağlar. Daha yakın zamanda, hassasiyeti artırmak için florojenik substratlargeliştirilmiştir 25. Ancak, bu yaklaşımlar genellikle SA-β-gal'in klasik pH bağımlı tanımını korumayan koşullar altında β-galaktosidaz aktivitesini ölçer. Sonuç olarak, sinyal yoğunluğunu artırabilir ama yaşlanma için özelliği azaltabilirler. Buna karşılık, X-gal çökeltinin doğal opaklığı, konfokal yansıtılan ışık görüntüleme kullanılarak tespit edilmesini sağlar; bu da SA-β-gal26'nın orijinal enzimatik tanımını korurken daha hassas ve nicel bir okuma sağlar.

Yıllar içinde, siklin-bağımlı kinaz inhibitörleri P16 ve P21'in artan ekspresyonu ile hücre döngüsü durmasını ve diğer yaşlanma programlarını düzenleyen transkripsiyon faktörü P53 gibi yaşlanmaya dair ek özellikler tespit edilmiştir 27,28,29,30,31,32,33. Bu gelişmeler, hücrelerin genellikle çoklu belirteçlerin birleşik varlığına göre sınıflandırıldığı daha sağlam bir yaşlanma tanımına yol açmıştır. Ancak pratikte, bu işaretleyiciler genellikle farklı modalitelerle ölçülür: P16 ve P21 gibi nükleer belirteçler genellikle floresan tabanlı tekniklerle tespit edilirken, SA-β-gal aktivitesi geleneksel olarak parlak alan mikroskopisiyle değerlendirilir. Bu ayrım, aynı hücre içinde birden fazla yaşlanma özelliğinin değerlendirilme yeteneğini sınırlamıştır. Yansıtılan ışık görüntüleme, SA-β-gal algılamanın floresan tabanlı belirteçlerle doğrudan entegre edilmesini mümkün kılarak tek bir görüntüleme iş akışı içinde bu sınırlamayı aşarak heterojen hücre popülasyonlarında yaşlanmanın daha sağlam ve biyolojik anlamlı bir değerlendirmesini kolaylaştırır.

Dedic ve meslektaşları, geleneksel SA-β-gal görüntülemenin geliştirilmiş hassasiyeti, objektif eşik için pH uyumlu kontrollerin kullanımı ve immünositokimya ile uyumluluk gibi birkaç sınırlamasını ele alırken, yansıtılmış ışık konfokal yöntemi özel olarak izole olgun adipositleriçin optimize edilmiştir 26. Ancak, yağ dokusunda yaşlanma sadeceadipositlerle sınırlı değildir 34,35 ve stromal vasküler fraksiyonun (SVF) incelenmesiyle ek bilgi edinilebilir. SVF, preadipositler, endotel ve fibroblast popülasyonları ile çeşitli bağışıklık hücrelerini içerir; bunların hepsi yaşlanma geçirebilir ve yağ yeniden modellenmesi, iltihaplanma ve metabolik sinyalin değişimine katkıda bulunabilir. Bu heterojen bölme içinde yaşlanmanın karakterize edilmesi, hücre tipine özgü süreçleri doku düzeyindeki ve sistemik sonuçlarla ilişkilendirmek açısından önemlidir.

Burada, yansıtılan ışık SA-β-gal tespitini SVF hücrelerine genişletiyoruz ve böylece birden fazla yağ dokusu hücre tipine uygulanmasını sağlıyoruz. Bu yaklaşımı immünositokimya ile birleştirerek, yöntem birincil insan örneklerinde SA-β-gal aktivitesinin entegre tek hücre analizini, ana ve fonksiyonel belirteçlerle birlikte mümkün kılar.

Protokol

Tüm deneyler Helsinki Bildirgesi'nin tüzüğüne uygun olarak gerçekleştirildi. Çalışma, Stockholm'deki bölgesel etik komitesi tarafından DNR 2012/50-31 onaylandı.

1. Hücre hazırlığı

  1. İnsan yağ dokusundan kollagenaz sindirimiyle izole edilen stromal vasküler fraksiyon (SVF) hücreleri kullanılır.
    NOT: Hücre verimi biyopsi boyutu ve doku bileşimine bağlı olarak değişir; ancak genellikle 10 g yağ dokusu başına yaklaşık 1,0 × 10,6 SVF hücresi elde edilir.

2. X-gal boyama ve kaydırma hazırlıkları

  1. Hücreleri 1 mL %2 paraformaldehit (PFA) içinde 1,5 mL mikrosantrifüj tüpünde oda sıcaklığında (RT) 20 dakika boyunca bir rocker üzerinde sabitleyin.
  2. 600 × g ile 10 dakika boyunca santrifüj yapın ve süpernatantı çıkarın.
  3. Üreticinin talimatlarına göre yaşlanma β-Galaktosidaz boyama kiti ile X-gal boyama çözeltisini hazırlayın.
  4. Boyama çözeltisini 3 tüpe (her biri 1 mL) ayırın ve pH değerini 1 M HCl ve 1 M NaOH ile 5, 6 ve 8'e ayarlayın. Kalibre edilmiş bir pH ölçer kullanarak pH ölçün.
  5. 0.5 × 106 hücreye X-gal çözeltisi ekleyin veCO2 olmadan 37 °C'de 24 saat kuluçka yapın.
  6. 600 × g 10 dakika boyunca santrifüj yapın ve süpernatantı çıkarın.
  7. Hücreleri PBS (pH 7) ile yıkayın, 600 × g'de 10 dakika boyunca santrifüj yapın ve süpernatantı çıkarın.
  8. %5 normal eşek serumunda (NDS) primer antikor çözeltisi (CD31 [1:200] veya IgG kontrolü [1:333]) hazırlanın. Hücreleri gece boyunca 4 °C'de kuluçka altına alın.
  9. Hücreleri 3 kez PBST (%0,1) ile 10 dakika boyunca sallanan cihazda RT rejiminde yıkayın.
  10. %5 NDS içinde ikincil antikor çözeltisi (fare karşıtı Alexa Fluor 555 [1:500]) ve buğday tohumu agglutinin (WGA [1:200]) hazırlayın. RT'de 1 saat boyunca sallanan bir yerde kuluçka yapın.
  11. 600 × g üzerinde 10 dakika boyunca santrifüj yapın ve ikincil antikor boyama çözeltisini çıkarın.
  12. Hücreleri RT'de 10 dakika boyunca PBST'de (%0,1) 3 kez yıkayın.
  13. 600 × g ile 10 dakika boyunca santrifüj yapın ve süpernatantı çıkarın.
  14. Antiifade montajında hücreleri yeniden süskü edin.
  15. Hücre süspansiyonunu mikroskop slaytlarına pipetleyin.
  16. Montaj ortamının RT'de gece boyunca kürlenmesine izin vererek hücreleri immobilize et.
  17. 100 μL %100 gliserol ekleyin, üstüne bir örtü koyun ve oje ile kapatın.

3. Mikroskopi

NOT: Görüntü hücreleri, yansıtılan ışık algılaması için konfigürlenmiş konfokal mikroskop kullanmaktadır. Yansıtılan ışık sinyali, üretici tarafından sağlanan ışın ayırıcısı veya dikroik ayna konfigürasyonu kullanılarak uyarılma dalga boyunda veya yakınında toplanmalıdır. Tüm deneyler için silikon yağı (sayısal açıklık 1.05) olan 30× objektif kullanın.

  1. Mikroskop yazılımında T90/R10 ışın ayırıcısı ayarını seçin.
  2. 633 nm uyarılma kullanın ve 635–645 nm arasında yansıtılan ışığı toplayın.
  3. 405 nm uyarıma ile Hoechst sinyalini alın.
  4. 488 nm uyarıma ile WGA sinyali alın.
  5. CD31 sinyalini 555 nm uyarımla alın.
  6. Z adım boyutunu sistem optimumuna (0,74 μm) ayarlayın ve tam hücre hacmini yakalamak için membran sinyaline dayalı bir Z yığını tanımlayın.
  7. Tüm örnekler için aynı toplama ayarlarıyla görüntüler alın. Dosyaları sıkıştırmadan yerel mikroskop formatında (örneğin, .oir) kaydedin.

4. Görüntü analizi

NOT: ImageJ ve CellProfiler kullanarak görüntüleri analiz edin.

  1. Her kanal için Z-yığınları oluşturmak amacıyla ImageJ'de kanalları bölün (405, 488, 555, 633).
  2. Z Projesi fonksiyonunu kullanarak toplamlanmış yoğunluk projeksiyonları oluşturun ve 16-bit TIFF dosyaları olarak dışa aktarın.
  3. Hücreler için otomatik hücre segmentasyonu ve yansıtılan ışık yoğunluğunun nicelendirilmesi için görüntüleri CellProfiler'a (sürüm 4.2.8) aktarın (Ek Şekil 1 ve Ek Şekil 2).
  4. Yoğunluk ölçümlerini aşağı akış analizi için bir elektronik tabloya aktarın.

5. SA-β-gal skor

  1. SA-β-gal pozitiflik eşiğini, pH 8 koşulunun ortalama yansıtılan ışık yoğunluğu artı üç standart sapma olarak tanımlayın.
  2. pH 6 durumunda bu eşiğin üzerinde yoğunluk değerleri olan hücreleri SA-β-gal pozitif olarak sınıflandırın.

Sonuçlar

İnsan SVF hücrelerinin yansıtılan ışık SA-β-gal boyaması, üç pH kontrollü koşullar boyunca net ve tekrarlanabilir desenler oluşturdu. SVF içindeki endotel hücrelerini tanımlamak için CD31 boyaması dahil edildi ve bu hücrelerin diğer popülasyonlardan ayırt edilmesini sağladı. Sadece az sayıda CD31-pozitif hücre bulunmasına rağmen, belirteç endotel hücrelerin varlığını doğruladı ve yöntemin heterojen birincil örneklerle uyumluluğunu gösterdi.

pH 5 durumu, çoğu hücrede güçlü bir sinyal üretir; bu, asidik pH'da yüksek endojen beta galaktosidaz aktivitesiyle tutarlıdır (Şekil 1Aa–Ac). SA-β-gal aktivitesini değerlendirmek için kullanılan pH 6'da, boyalanma yoğunluğu pH 5'e göre azalmış ve sadece hücre alt kümesi arka plan üzerinde sinyal göstermiştir (Şekil 1Ba–Bc). Sinyal yoğunluğu ve frekansındaki bu değişim, testin beklenen pH bağımlılığıyla tutarlıdır ve SA-β-galaktosidaz aktivitesi kalan hücrelerin optimal olmayan koşullarda tanımlanmasını sağlar. pH 8 durumu, çoğu hücrenin arka plan seviyesinde veya yakınında olduğu için minimum yansıtılan ışık sinyali üretirdi (Şekil 1Ca–CC). Bu koşul, Şekil 1A c,Bc,Cc'deki kırmızı noktalı çizgiyle belirtilen SA-β-gal pozitiflik eşiğini tanımlamak için kullanılmıştır.

Nicel analiz için, SA-β-gal aktivite eşiği, pH 8 koşulunun ortalama yansıtılan ışık yoğunluğu artı üç standart sapma olarak tanımlanmıştır. pH 6 durumunda yoğunluk değerleri bu eşiği aşan hücreler SA-β-gal pozitif olarak sınıflandırıldı. Bu yaklaşım, arka plan sinyalini hesaba katan ve yanlış pozitif sınıflandırmayı en aza indiren nesnel, veri odaklı bir kesim noktası sağlar.

Tespit hassasiyeti ve immünositokimya ile uyumluluğu değerlendirmek için, yansıtılan ışık ve parlak alan görüntüleme tüm pH koşullarında karşılaştırıldı. pH 5'te (Şekil 2AA–AD) yansıyan ışık güçlü X-gal çökelti gösterirken, parlak alan sadece en belirgin birikintileri tespit etti. pH 6'da (Şekil 2Ba–Bd), yansıtılan ışık, parlak alanla güvenilir şekilde tespit edilemeyen SA-β-gal pozitif hücreleri tespit etti; sinyal zayıf veya dağınık görünüyordu. pH 8'de (Şekil 2Ca–Cd), yansıtılan ışık düşük enzimatik aktiviteyle uyumlu minimal sinyal algılarken, parlak alan tespit edilebilir çökelti göstermezdi. Bu gözlemler, yansıtılan ışık görüntülemenin, özellikle orta ve düşük aktivite seviyelerinde X-gal çökeltinin daha iyi tespit edilmesini sağladığını göstermektedir.

Yansıtılan ışık SA-β-gal testi de 96 kuyuyla bir plakada gerçekleştirildi (Ek Şekil 3). Bu kurulum, plastik yüzeyden yansıma nedeniyle arka plan sinyalinin artmasına yol açarak pozitif ve negatif hücreler arasındaki kontrastı azalttı. Çizikler gibi yüzey kusurları, arka plan yansımasını daha da artırır (Ek Şekil 3, siyah oklar). Sonuç olarak, nicel analiz, cam kapak kapaklarındaki görüntülemeye kıyasla daha az güvenilirdi. Plaka formatı gerekiyorsa, optimal sinyal algılama için cam tabanlı plakalar önerilir.

Bu sonuçlar birlikte, güçlü pozitif pH 5 koşulu, pH 6'daki ara sinyal ile pH 8'deki minimal arka plan arasında net bir ayrım olduğunu gösterir. Bu desen, testin beklenen davranışıyla tutarlıdır ve heterojen birincil hücre popülasyonlarında SA-β-gal aktivitesinin tespiti için yansıtılan ışık görüntülemenin kullanımını destekler.

figure-results-1
Şekil 1: SVF hücrelerinde pH-bağımlı yansıtılan ışık SA-β-gal algılama.
WGA (Aa, Ba, Ca) ve yansıtılan ışık görüntüleme (Ab, Bb, Cb), pH 5, 6 ve 8 koşullarında X-gal çökeltiyi tespit eder. Sinyal en güçlü pH 5'te, pH 6'da azalır ve pH 8'de minimaldir. Yansıtılan ışık yoğunluğunun (Ac, Bc, Cc) nicelendirilmesi, her koşulda β-galaktosidaz aktivitesinin dağılımını gösterir. Her nokta tek bir hücreyi temsil eder ve kırmızı noktalı çizgi SA-β-gal-pozitif hücrelerin sınıflandırılması için kullanılan eşik değerini gösterir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: SVF hücrelerinde yansıtılan ışık ve parlak alan SA-β-gal algısının karşılaştırılması. pH 5, 6 ve 8'de X-gal boyalı SVF hücrelerinin yakınlaştırılmış görüntüleri, WGA boyama (Aa, Ba, Ca), endotel hücrelerini belirlemek için CD31 boyama (Ab, Bb, Cb), X-gal çökeltini tespit etmek için yansıtılan ışık görüntülemesi (Ac, Bc, Cc) ve buna karşılık gelen parlak alan görüntülerini (Ad, Bd, Cd) gösterir. Yansıtılan ışık görüntüleme, X-gal çökeltiyi koşullar arasında algılarken, parlak alan öncelikle daha yüksek yoğunluklu birikintileri ortaya çıkarır ve düşük sinyal seviyelerinde sınırlı algılama sağlar. CD31 boyama hem pH 5 hem de pH 6 koşullarında gözlemlenir ve endotel hücrelerinin tanımlanmasını sağlar. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 1: CellProfiler boru hattının genel bakışı. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 2: Çekirdekler ve hücre segmentasyonu için iş akışı. (A) Hoechst boyalı çekirdeklerin ve (B) buna karşılık gelen çekirdeklerin segmentasyonunun temsilci görüntüleri. (C) Membran boyasına dayalı hücre segmentasyonu. (D) Çekirdeklerin ve hücre sınırlarının üst üste binmesi. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 3: Plastik tabanlı 96 kuyu plakasında yansıtılan ışık SA-β-gal görüntüleme. (A) WGA boyama ve (B) standart plastik tabanlı 96 kuyu plakada X-gal boyalı SVF hücrelerinin yansıtılmış ışık görüntülemesi. Cam üzerindeki görüntülemeye kıyasla artan arka plan sinyali gözlemlenir; plastik yüzeyden gelen ışık yansımasıyla tutarlı olarak SA-β-gal algılamada kontrastı azaltır. Yüzey çizikleri (siyah oklar) arka plan sinyalini (B) daha da artırır. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Yaşlanma ile ilişkili β-galaktosidaz, yaşlanan hücreleri tanımlamak için en yaygın kullanılan belirteçlerden biridir; ancak geleneksel parlak alan algılama yöntemleri düşük hassasiyet ve yüksek öznellik derecesi nedeniyle sınırlıdır. X-gal boyalı SVF hücrelerinin yansıtılmış ışık görüntülemesi, tek hücre seviyesinde SA-β-gal aktivitesini ölçmek için daha hassas ve tekrarlanabilir bir yaklaşım sağlarken, floresan antikor boyama ile uyumlu kalır. Bu yöntemi SVF için optimize ederek, SA-β-gal aktivitesi, CD31 gibi hücre spesifik belirteçlerle birlikte tespit edilebilir ve hücre sıralamasına gerek kalmadan heterojen birincil hücre popülasyonlarının analizini mümkün kılar.

Güvenilir uygulama için birkaç teknik parametre kritik öneme sahiptir. X-gal boyama çözeltisinin doğru pH kalibrasyonu gereklidir, çünkü küçük sapmalar enzimatik aktiviteyi değiştirebilir ve sinyal algısını etkileyebilir. pH ölçer, standart tamponlarla (örneğin pH 4.0 ve pH 7.0) kullanımdan hemen önce kalibre edilmeli ve boyama çözeltisinin pH değeri hazırlandıktan sonra doğrulanmalıdır. Ayrıca, Z-yığını alımı tam hücre hacmini yakalamalıdır, çünkü eksik kapsama yansıtılan ışık yoğunluğunun eksik algılanmasına yol açar. Lazer gücü ve dedektör kazancı dahil görüntüleme parametreleri, sinyalin doygunluk olmadan en üst düzeye çıkarılması ve örnekler arasında tutarlı tutulması için optimize edilmelidir.

Alternatif yaşlanma testlerine kıyasla, yansıtılan ışık görüntülemesi birçok avantaj sunar. Brightfield SA-β-gal algılama, çökeltinin görsel tanımlamasına dayanır ve bu nedenle sınırlı hassasiyete sahiptir ve çoklu analizle kolayca uyumlu değildir. Buna karşılık, yansıtılan ışık görüntüleme, X-gal çökeltinin optik yoğunluğunu tespit ederken SA-β-gal'ın pH-bağımlı enzimatik tanımını korur. Bu, floresans tabanlı belirteçlerle birlikte SA-β-gal aktivitesinin eşzamanlı olarak tespit edilmesini sağlar ve bireysel hücrelerde birden fazla özellik kullanılarak yaşlanmanın değerlendirilmesini sağlar.

Bu avantajlara rağmen, yöntemin sınırlamaları vardır. Yansıtılan ışık görüntüleme, X-gal çökeltinin optik yoğunluğunu algılar, ancak bu sinyali diğer yoğun hücre içi yapılardan kesin olarak ayırt edemez, bu da pH kontrollü koşulları gerekli hale getirir. pH 8 koşulu, arka planda yansıtılan ışık için bir temel sağlar ve belirli ile özgün olmayan sinyaller arasındaki ayrımı destekler. Yaklaşım ayrıca, tüm sistemlerde mevcut olmayabilecek uygun yansıtılan ışık algılama yeteneklerine sahip konfokal bir mikroskop gerektirir. Ayrıca, görüntüleme yüzeyi özellikleri sinyal kalitesini etkileyebilir: plastik taban plakaları yansıma nedeniyle arka planı artırır ve kontrastı azaltırken, cam yüzeyler daha güvenilir bir algılama sağlar.

Bu yöntem, olgun adipositlerde SA-β-gal algısı için yansıtılan ışık görüntülemesini kuran Dedic ve ark.'ın çalışmalarına dayanır ve yaklaşımı daha geniş bir hücre tipiyelpazesine genişletir. Taze izole edilmiş SVF'ye uygulanan uygulama, X-gal çökeltinin yansıtılan ışık algısının çeşitli birincil insan hücre popülasyonlarıyla uyumlu olduğunu göstermektedir. SA-β-gal tespit ediş CD31 gibi soy belirteçleriyle birleştirme yeteneği, heterojen dokular içindeki tanımlanmış alt popülasyonların analizini daha da mümkün kılar.

Birincil insan örneklerinde bağışçılar arasında değişkenlik beklense de, bu çalışmanın amacı biyolojik değişkenliği karakterize etmek yerine yöntemin teknik uygulamasını belirlemektir. Gelecekte birden fazla biyolojik örnek veya deneysel koşullar üzerinde uygulamalar, uygun istatistiksel analizleri içermelidir. Ayrıca, yerleşik yaşlanma indüksiyon modellerinde doğrulama ve ortogonal yaşlanma belirteçleriyle entegrasyon, karmaşık hücre popülasyonlarında SA-β-gal aktivitesinin yorumlanmasını daha da geliştirecektir.

Açıklamalar

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını belirtmektedir.

Teşekkürler

İnsan dokusu biyopsilerine erişim sağladıkları için Liv Eidsmo ve Keira Melican'a, örnek işleme konusunda yardımı için Lena Appelsved'e teşekkür ederiz. Bu çalışma, İsveç Araştırma Konseyi (2022-01236), Karolinska Institutet'teki Diyabet Stratejik Araştırma Programı (C5471162), Novo Nordisk Vakfı (C5475033), Vallee Vakfı Akademisyon Ödülü (C5471234), Mark Vakfı Aspire Grant (C5477023), İsveç Kanser Derneği (22 2420), Karolinska Enstitüsü'nde Kök Hücreler ve Yenilenme Stratejik Araştırma Programı (C5472022) ve Knut ve Alice Wallenberg Vakfı (2020.0118; 2023.0536) tarafından desteklenmiştir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
1.5 mL tubesBioSphere72.706.200Biosphere safeseal tube 1.5 mL, 250 ADET
5 mL tubesEppendorf30119401Eppendorf tubes 5.0 mL microtube
96-well plateCorning4680Corning 96-well high content ccreening microplates with film bottom
CD31 primary antibodyAbcamAb9498Anti-CD31 antibody clone JC/70A
Confocal microscope with reflected light capabilitiesEvidentFV-4000
CoverslipsEprediaBB02400500A113MNZOCoverslips 24 mm x 50 mm, #1.5 thickness (0.13-0.16 mm) 
DPBSGibco14190-136DPBS, no calcium, no magnesium
Fixation bufferSigma Aldrich1.00496.5000Formaldehyde solution 4%, buffered, pH 6.9 
HClSigma-Aldrich320331-500mLHydrochloric acid (37%)
IncubatorStuartS130HHybridization oven/shaker
Microscopy slidesAvantor VWR631-1560Single-frosted slides, coloured ends
Mounting mediaInvitrogenP36984ProLong glass antifade mountant excitation/emission max 361/497 nm
Mouse IgG1 isotype controlR&D SystemsMAB002
NaOHSigma-AldrichS8045-500GSodium hydroxide ≥ 98%
Normal donkey serumJackson ImmunoResearch Labs017-000-121
pH meterMeterLabR21M002 PHM210 standard pH meter 
Pipette tips (1000 µL)Biosphere70.1186.2101250µL filtered pipette tips
Pipette tips (200 µL)Corning4823200µL filtered pipette tips
SABG KitCell signaling9860SSenescence beta-galactosidase staining kit
Secondary antibody, Alexa Fluor 555InvitrogenA31570Donkey anti-mouse IgG (H+L) highly cross-adsorbed excitation/emission max
553/568 nm
Tween-20Fisher Scientific10419000Pure, Fisher chemical
Water bathRowe ScientificSWB20DStandard water bath
WGAInvitrogenW11261Wheat Germ Agglutinin (WGA) Alexa Fluor 488 conjugate: Excitation/emission max 495/519 nm

Kaynaklar

  1. Wang, E. Senescent human fibroblasts resist programmed cell death, and failure to suppress bcl2 is involved. Cancer Res. 55 (10), 2284-2292 (1995).
  2. Yosef, R., et al. Directed elimination of senescent cells by inhibition of BCL-W and BCL-XL. Nat Commun. 7 (1), 11190(2016).
  3. Jun, J. -I., Lau, L. F. The matricellular protein CCN1 induces fibroblast senescence and restricts fibrosis in cutaneous wound healing. Nat Cell Biol. 12 (7), 676-685 (2010).
  4. Krizhanovsky, V., et al. Senescence of activated stellate cells limits liver fibrosis. Cell. 134 (4), 657-667 (2008).
  5. Storer, M., et al. Senescence is a developmental mechanism that contributes to embryonic growth and patterning. Cell. 155 (5), 1119-1130 (2013).
  6. Muñoz-Espín, D., et al. Programmed cell senescence during mammalian embryonic development. Cell. 155 (5), 1104-1118 (2013).
  7. Eggert, T., et al. Distinct functions of senescence-associated immune responses in liver tumor surveillance and tumor progression. Cancer Cell. 30 (4), 533-547 (2016).
  8. Feldser, D. M., Greider, C. W. Short telomeres limit tumor progression in vivo by inducing senescence. Cancer Cell. 11 (5), 461-469 (2007).
  9. Xue, W., et al. Senescence and tumour clearance is triggered by p53 restoration in murine liver carcinomas. Nature. 445 (7128), 656-660 (2007).
  10. Acosta, J. C., et al. A complex secretory program orchestrated by the inflammasome controls paracrine senescence. Nat Cell Biol. 15 (8), 978-990 (2013).
  11. Coppé, J. -P., Desprez, P. -Y., Krtolica, A., Campisi, J. The senescence-associated secretory phenotype: the dark side of tumor suppression. Annu Rev Pathol Mech Dis. 5 (1), 99-118 (2010).
  12. Xu, M., et al. Targeting senescent cells enhances adipogenesis and metabolic function in old age. eLife. 4 (1), e12997(2015).
  13. Xu, M., et al. Senolytics improve physical function and increase lifespan in old age. Nat Med. 24 (8), 1246-1256 (2018).
  14. Li, F., et al. FBP1 loss disrupts liver metabolism and promotes tumorigenesis through a hepatic stellate cell senescence secretome. Nat Cell Biol. 22 (6), 728-739 (2020).
  15. Yoshimoto, S., et al. Obesity-induced gut microbial metabolite promotes liver cancer through senescence secretome. Nature. 499 (7456), 97-101 (2013).
  16. Aravinthan, A., et al. Hepatocyte senescence predicts progression in non-alcohol-related fatty liver disease. J Hepatol. 58 (3), 549-556 (2013).
  17. Baboota, R. K., et al. BMP4 and Gremlin 1 regulate hepatic cell senescence during clinical progression of NAFLD/NASH. Nat Metab. 4 (8), 1007-1021 (2022).
  18. Chen, Y. -W., Harris, R. A., Hatahet, Z., Chou, K. Ablation of XP-V gene causes adipose tissue senescence and metabolic abnormalities. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (45), E4556-E4564 (2015).
  19. Gustafson, B., Nerstedt, A., Spinelli, R., Beguinot, F., Smith, U. Type 2 diabetes, independent of obesity and age, is characterized by senescent and dysfunctional mature human adipose cells. Diabetes. 71 (11), 2372-2383 (2022).
  20. Li, Q., et al. Obesity and hyperinsulinemia drive adipocytes to activate a cell cycle program and senesce. Nat Med. 27 (11), 1941-1953 (2021).
  21. Minamino, T., et al. A crucial role for adipose tissue p53 in the regulation of insulin resistance. Nat Med. 15 (9), 1082-1087 (2009).
  22. Shi, D., et al. Photoactivatable senolysis with single-cell resolution delays aging. Nat Aging. 3 (3), 297-312 (2023).
  23. Dimri, G. P., et al. A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (20), 9363-9367 (1995).
  24. Horwitz, J. P., et al. Substrates for cytochemical demonstration of enzyme activity:I. some substituted 3-indolyl-β-D-glycopyranosides1a. J Med Chem. 7 (5), 574-575 (1964).
  25. Lv, X., et al. Molecular engineering development of β-galactosidase-activatable fluorogenic probes for precise senescence tracking in cells, tissues and a mouse model of psoriasis. Sens Actuators B Chem. 444 (1), 138406(2025).
  26. Dedic, B., et al. Senescence detection using reflected light. Aging Cell. 23 (1), e14295(2024).
  27. Alcorta, D. A., et al. Involvement of the cyclin-dependent kinase inhibitor p16 (INK4a) in replicative senescence of normal human fibroblasts. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (24), 13742-13747 (1996).
  28. Hara, E., et al. Regulation of p16CDKN2 expression and its implications for cell immortalization and senescence. Mol Cell Biol. 16 (3), 859-867 (1996).
  29. Lin, A. W., et al. Premature senescence involving p53 and p16 is activated in response to constitutive MEK/MAPK mitogenic signaling. Genes Dev. 12 (19), 3008-3019 (1998).
  30. Okamoto, A., et al. Mutations and altered expression of p16INK4 in human cancer. Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (23), 11045-11049 (1994).
  31. Serrano, M., Hannon, G. J., Beach, D. A new regulatory motif in cell-cycle control causing specific inhibition of cyclin D/CDK4. Nature. 366 (6456), 704-707 (1993).
  32. Serrano, M., Lin, A. W., McCurrach, M. E., Beach, D., Lowe, S. W. Oncogenic ras provokes premature cell senescence associated with accumulation of p53 and p16INK4a. Cell. 88 (5), 593-602 (1997).
  33. Wong, H., Riabowol, K. Differential CDK-inhibitor gene expression in aging human diploid fibroblasts. Exp Gerontol. 31 (3), 311-325 (1996).
  34. Gustafson, B., Nerstedt, A., Smith, U. Reduced subcutaneous adipogenesis in human hypertrophic obesity is linked to senescent precursor cells. Nat Commun. 10 (1), 2757(2019).
  35. Barinda, A. J., et al. Endothelial progeria induces adipose tissue senescence and impairs insulin sensitivity through senescence associated secretory phenotype. Nat Commun. 11 (1), 481(2020).

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Hücresel YaşlanmaAdipoz DokuSA-Beta-Gal AktivitesiYansımalı Işık MikroskobuKonfokal MikroskopiTek Hücre AnaliziİmmünositokimyaSoy Hattı Belirteçleri
Yağlı stromal damar fraksiyonunda yansıtılan ışık kullanılarak yaşlanma tespiti
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.