Yöntem makalesi

Tahıllarda Bitki-Mikrop Etkileşimi Çalışmaları için Bitki-Mikrop Etkileşim Çalışmaları İçin Bitki Gnotobiyotik Büyüme Sisteminin Montajı ve Kullanımı

DOI:

10.3791/70607

⸱

26 Haziran 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Plant and Microbial Biology, North Carolina State University, 2Department of Biological and Agricultural Engineering, North Carolina State University, 3Medialab-Matadero, Matadero Madrid

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, tahılları barındırmak üzere tasarlanmış ve buğday ile mısırda doğrulanmış yeni bir bitki gnotobiyotik büyüme sisteminin montajını ve kullanımını tanımlar. Bu bitki gnotobiyotik sistemi, steril büyüme koşulları, sulama yönetimi ve çeşitli toprak bazlı substratlarla uyumluluk sağlayarak kontrollü bitki-mikrob deneylerini mümkün kılar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sahada tutarlı şekilde çalışan mikrobiyal bazlı tarımsal düzenlemelerin geliştirilmesi, bitki-mikrop etkileşimlerinin moleküler mekanizmalarının anlaşılmasını gerektirir. Bu temel etkileşim mekanizmalarını incelemek, bitkileri çevre kontrollü ve gnotobiyotik koşullarda yetiştirebilme yeteneğini gerektirir (yani, bitkiyle etkileşime giren tüm mikroorganizmalar bilinir; ister mikrobsuz, ister tanımlanmış mikrobiyal topluluklar ister doğal topluluklar olsun). Şu anda mevcut olan bitki gnotobiyotik sistemleri, tarımsal öneme sahip büyük bitkileri, örneğin tahılları incelemek için uygun değildir. Ayrıca, bu sistemlerin çoğu sulama yönetimine sahip değildir. Burada, sulama yönetimine sahip tahıl bitkilerini barındırmak için tasarlanmış yeni bir gnotobiyotik sistem olan GNOVA'yı tanıtıyoruz. Bu yeni sistem, 3D baskılı bir taban ve ticari olarak mevcut materyallerden oluşan erişilebilir bir platformdur. Bu protokol, sistemi ve deney kurulumunu adım adım bir rehber sunar. Ayrıca, GNOVA'nın gnotobiyotik torba sistemi ile performans karşılaştırmasını sunuyoruz. GNOVA, bitki büyümesini torba sisteminde iki haftadan buğday için 17 haftaya, mısır için ise 4 haftaya kadar uzattı. Her iki ürünün çimlenme oranı da GNOVA kapsamında buğday için %66'dan %100'e, mısır için ise %75'ten %100'e yükselmiştir. GNOVA içinde yetiştirilen buğday, torba sisteminde aynı yaştaki bitkilerde bulunmayan ekiciler geliştirdi. GNOVA'da yetiştirilen taze mısır ağırlığı, torba sistemine göre %594 daha fazlaydı. Ayrıca, GNOVA sisteminde mısırın sürgün yüksekliği ve kök uzunluğu torbalara göre sırasıyla %89 ve %57 daha fazlaydı. GNOVA sistemi, tahıllarda fide aşamasının ötesine bitki-mikrobiyota etkileşimlerinin keşfi için bilim insanlarının sahip olduğu araç kutusunu genişleterek artan büyüme alanı ve sulama yönetimi sağlar.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikrop bazlı tarımsal tedaviler, son birkaç on yılda bitki büyümesini ve çevresel strese karşı dayanıklılığı artırarak ürün verimliliğini artırma potansiyeli nedeniyle büyük ilgi gördü. Aynı zamanda, bu biyostimulyanların moleküler etki mekanizmaları hâlâ yeterince anlaşılmamış olup, topraklar, konumlar ve çevresel koşullar genelinde tutarsız sonuçlarına katkıdabulunabilir 1,2. Mevcut mikrop bazlı tedavilerin etkinliğinin artırılmasını ve yeni teknolojilerin geliştirilmesini teşvik etmek, bitki-mikrob etkileşiminin moleküler mekanizmalarının daha derinlemesine anlaşılmasınıgerektirir 3,4. Ancak, bu mekanizmaların incelenmesi, doğal mikrobiyal toplulukların karmaşıklığı nedeniyle hâlâzordur 5,6. Bitki faydalarını yönlendiren mikrobiyal etkileri ve etkileşimleri belirlemek için, çevresel koşulların ve mikrobiyal topluluğun kontrolünü sağlayan büyüme sistemleri içinde sentetik mikrobiyal topluluklar (SynCom) kullanarak doğal sistemlerin karmaşıklığını azaltabiliriz. Gnotobiyoloji, tanımlanmış mikrobiyaltopluluklarla ilişkili konakların incelenmesi 7, araştırmacıların mikrobsuz konakları, bilinen mikrobiyal topluluklarla kolonileştirilmiş konaklarla karşılaştırmasına olanak tanır ve böylece mikrob fonksiyonunu bitki fenotipi8 ile ilişkilendirebilir.

Erken gnotobiyotik sistemler, camtest tüpleri 9,10,11,12 vekavanozlar 13 kullanılarak inşa edilmiştir. O zamandan beri, bitkileri gnotobiyotik olarak incelemek için geliştirilen yeni sistemlerin hızla yayıldığını gördük. Günümüzde en yaygın kullanılan sistemler arasında petrikabları 14, testtüpleri 15, 16, cam kavanozlar17, magentakutular 18, mühürlü poşetler19, hidroponik20, FlowPot ve GnotoPot21, mikrofluidik sistemler22 ve EcoFABs23 yer alır. Bu ilerlemeye rağmen, çoğu sistem ya görüntüleme22 veya sümyut toplama17,20 için optimize edilmiş ya da küçük modeltürler için tasarlanmış 14,18,21. Birçoğu, sulama kontrolünü ve deney süresini sınırlayan kapalı sistemlerdir. Bu kısıtlamalar, tahıl gibi daha büyük tarımsal ürünlerin incelenmesinde zorluklar yaratır; çünkü bu ürünler ek alan, hava akışı ve su yönetimi gerektirir.

Daha büyük bitkileri ve daha uzun çalışmaları karşılayabilecek bir sisteme olan ihtiyacı fark eden EcoFAB 3.0, gnotobiyotik yetiştiriciliği daha büyük bitkilere genişletmek için yakın zamandageliştirilmiştir 24. EcoFAB 3.0, daha fazla kök ve baş boşluğu hacmi sunar; bu da Sorgum bicolor'un 4 haftaya kadar büyümesini destekler ve eksudat toplama ile kök görüntülemeimkanı sağlar 24. Bu yeni sistem, gnotobiyotik sistemleri tarım ürünlerine genişletmenin umut verici bir örneği olsa da, laboratuvarlar arasında kolayca benimsenebilecek ve çok çeşitli deneysel iş akışlarıyla uyumlu erişilebilir ve çok yönlü bir platforma ihtiyaç hâlâ devam etmektedir. Bu nedenle, gnotobiyotik koşullarda tahıl ürünlerini barındırmak için tasarlanmış GNOVA (Çoklu Bitki Uygulamaları için GNotobiyotik sistem) geliştirdik. Burada, GNOVA'nın montajı ve işletilmesi için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz ve laboratuvarımızda rutin olarak kullanılan gnotobiyotik torba sistemine kıyasla performansını gösteriyoruz. Bu yeni sistemin geliştirilmesiyle, önceki kapalı sistemlere kıyasla daha büyük bir büyüme alanı ve yerleşik sulama sağlayarak steril koşullarda buğday ve mısır yetiştirme yeteneğini geliştirdik. GNOVA'nın performansı EcoFAB 3.0 ile karşılaştırılabilir olup, model olmayan tahıl ürünlerinde bitki-mikrobiyom etkileşimlerini disseksiye etmek için araç repertuarını genişletir. Ayrıca, bitki gnotobiyotiklerinin çok yönlülüğü ve uyum sağlama yeteneği, GNOVA'nın basit tasarımı, ticari olarak mevcut materyallerin kullanımı ve mevcut 3D nesne dosyaları sayesinde artar; bu dosyalar, araştırmacıların araştırma ve bütçe ihtiyaçlarını ayarlamak için materyal ve tasarım değiştirmelerine olanak tanır.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NOT: Üs için 3D baskı dosyaları ek materyallerde bulunabilir ve Dryad (https://doi.org/10.5061/dryad.f7m0cfzbc) formatında halka açık olarak erişilebilirdir. Hız ve maliyet verimliliği için, yerel ticari 3D baskı hizmet sağlayıcılarında toplu olarak baskı yapmanızı öneriyoruz.

1. Gnotobiyotik sistemin montajı

  1. Pot montajını başlatın (tekrar deneysel kullanımdan önce bir kez yapın).
    1. Pot tabanını kapatın; paslanmaz çelik tel örgülü daireyi polikarbonat tüpün bir ucuna yerleştirin ve çemberi hortum kelepçesiyle sabitleyin (Şekil 1A).
    2. Sulama açıklıklarını, polikarbonat borunun açık ucunun üst kenarından 1,5 cm uzakta 1/4 inç (6,35 mm) bir sulama açıklığı oluşturarak delin. İlk açıklıktan 3 cm uzakta iki 1/8 inç (3,18 mm) yuva delin; bir yuva kenardan 1 cm, diğeri ise üst yuvadan 2 cm uzakta.
      NOT: Gerekirse, aynı adımlarla saksının üst kenarına ek boru hatları eklenebilir.
    3. Sulama borusunu 1/4 inçlik açıklıktan kısa bir silikon boru parçası yerleştirerek takın.
    4. Zip bağını iki 1/8 inçlik yuvadan geçirerek boruyu sabitleyin (Şekil 1B). Pot dışına uzanan silikon boruya 1 bağlantı noktasının erkek luerini yerleştirin (Şekil 1C).
      NOT: Bağlantı 1'in hortum barbağı açıkta olmalıdır.
    5. Boş bir şırınga fıçısını cam yünü ile doldurup ucunu küçük bir alüminyum folyo parçası ile kapatarak şırınga varillerini hazırlayın (Şekil 1C).
    6. Şırınge namlusunun luer kilit ucuna kısa bir silikon boru parçası takın (Şekil 1C).
    7. İki aynı şırınga namlusunu hazırlayın. Hazırlanan şırınga namlularından birini, potadan dışarı uzanan boru üzerindeki 1 numaralı bağlantı noktasına (Şekil 1D) takın.
    8. Duraklama: Monte edilmiş saksılar daha sonra deneysel kullanım için saklanabilir.

figure-protocol-1
Şekil 1: Pot montajı. A) Pot altı tel file ve hortum kelepçesiyle kapatılmış. (B) Saksının üst kenarındaki sulama portu. (C) Sulama hattı, hazırlanmış şırınga namlusu ile Fitting 1'in açık hortum barbıyla uçuruyor. (D) Kapalı sulama hattına sahip montaj edilmiş saksı Bu şekilin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

  1. Deney için tencere hazırlama (her yeni deneyden önce yapılın)
    1. Saksının altını iki fiberglas boru sargısı ile önceden kesilmiş dairelerle kaplayın (Şekil 2A).
    2. İki parça kil ile bir parça kum karıştırarak toprak substratını hazırlayın. Saksıya 840 mL substrat ekleyin.
    3. Saksıları plastik bir kapakla kapatın ve bantla sabitleyin (Şekil 2B).
    4. 121 °C'de kuru döngüde 30 dakika boyunca otoklav dolu tencereler. Saksıların plastik kapaklarıyla gece boyunca soğumasına izin verin. 121 °C'de 30 dakika boyunca kuru döngüde tekrar otoklav yapın. Tamamen soğut. Saksıları plastik kapakla kapalı tutun.
      NOT: Başka toprak substratları da kullanılabilir, ancak saksı başına gereken miktar önceden optimize edilmelidir. GNOVA ayrıca %100 kil ve %100 kum ile 1 L test edilmiştir. Diğer toprak substratları ise tam sterilizasyon için daha fazla otoklav döngüsü veya farklı ayarlar gerektirebilir.
      DIKKAT: Potları otoklavdan çıkarırken dikkatli olunmalıdır, çünkü malzeme sıcak olur ve hortum kelepçeleri gevşebilir. Potları almadan önce soğuduktan sonra hortum kelepçelerinin parmak sıkı olduğundan emin olun.
    5. Soğutulan pot kapları 3D baskılı tabana yerleştirin. Toprak dolu saksı 3D baskılı tabanın içine yerleştirin. Saksı tabanından tutun, açılan sütunlardan değil, çünkü en kırılgan kısım onlar olur.
    6. Sulama borusunu 3D baskılı tabanın alt açıklıklarından birinden geçirin (Şekil 2C).
      NOT: 3D baskılı destek tabanını otoklavlamayın, çünkü bu parçayı eritebilir. 60 °C'nin üzerindeki sıcaklıklar gerektiren deneyler için alternatif bir ısıya dayanıklı filament gerekebilir ( bkz. Malzeme Tablosu).
    7. Otoklavlama sonrası potları oda sıcaklığında tutun ve plastik kapağı veya hazırlanmış şırıngayı son deney kurulumuna kadar çıkarmayın.

figure-protocol-2
Şekil 2: Hazırlanmış saksı illüstrasyonu. (A) Saksıçının altı fiberglas boru sargısıyla kaplı. (B) Saksı üstü plastik kapakla kapalı. (C) Son 3D baskılı baz tasarımının içine yerleştirilmiş boş kap. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

  1. Cam silindir hazırlığı (her yeni deneyden önce yapılabilir)
    1. Cam silindirin bir ucunu önceden kesilmiş bir DW4 filtresiyle kapatın ve vinil bantla sabitleyin (Şekil 3A).
    2. Cam silindiri diğer açık uca bakacak şekilde çevirin ve borunun içine kenardan 14 cm uzakta pamuk bir halka takın. Pamuk halkayı cerrahi bantla sabitleyin (Şekil 3B).
    3. Silindirin alt ucunu iki lastik bant kullanarak sterilizasyon sargısı ile kapatın (Şekil 3B).
    4. Hazırlanan cam silindirleri kullanmadan önce 30 dakika boyunca 121 °C'de kuru döngüde otoklav edin. Otoklavlandıktan sonra, steril cam silindirleri oda sıcaklığında saklamak, ambalajı çıkarmadan ihtiyaç duyulana kadar.

figure-protocol-3
Şekil 3: Cam silindir montajı. (A) Cam silindirin üst ucu DW4 filtre malzemesi ve vinil bant ile kapatılır. (B) Cam silindirin alt ucu, pamuk halkası ile donatılmış ve sterilizasyon sargısı ile lastik bantlarla kapatılmış. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

  1. Sulama filtresi hazırlığı (her sulama etkinliğinden önce yapılır, 1.4.4–1.4.6 adımları hariç, bu adımlar sadece bir kez yapılmalıdır)
    1. Filtre tutucusunu PES filtre membranını (Şekil 4A.4) filtre tutucu (Şekil 4A.5) ile filtre diski (Şekil 4A.3) arasına yerleştirerek monte edin.
    2. Filtre membranının düzgün tarafını çıkış yönüne doğru yönlendirin, böylece filtre tutucusunun üstüne baktığından emin olun (Şekil 4A.1).
    3. O-ringi (Şekil 4A.2) filtre tutucusunun üstüne oturturun (Şekil 4A.1). Filtre üstünü filtre tutucuya takın. Sadece elle sıkıştır.
    4. Konnektörleri takın. Bağlantı 2'nin erkek slipini filtre tutucusunun üst portuna takın.
    5. Filtrenin hortum dikenli ucuna kısa bir silikon boru parçası takın (Şekil 4B). Bir fitin erkek luer'ini diğer hazırlanmış şırınga namlusunun sonuna 1.1.6 adımından (Şekil 4B) yerleştirin.
    6. Filtreyi hazırlanan şırınge namlusundaki hortum dikenli bağlantısına bağlayın.
    7. Monte edilen filtreleri kuru döngüde 121 °C'de 30 dakika boyunca otoklav edin. Filtreler soğuduktan sonra ve kullanmadan önce sıkın.
      NOT: Tüm gerekli filtrelerin hazırlanması ve kapalı polipropilen kutuda otoklav yapılması önerilir. Otoklavlandıktan sonra, sulama filtreleri hazırlanan şırınga çıkarılmadığı sürece kullanılana kadar oda sıcaklığında steril tutulabilir.

figure-protocol-4
Şekil 4: Filtre tutucu montajı. (A) Sökülü filtre tutucu parçası: 1. Filtre tutucu üstü, 2. O-halkası, 3. Filtre disi, 4. Filtre membranı ve 5. Filtre tutucu. (B) Hazırlanmış bir şırınga namlusu ile montaj edilmiş filtre tutucu. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

2. Deney kurulumu

  1. Deneyi başlatmadan en az bir gün önce çözelti ve malzemeleri hazırlayın ve sterilize edin.
    1. Üreticinin talimatlarına uygun olarak 0.5X Murashige ve Skoog bitki büyüme ortamı hazırlayın. 121 °C'de sıvı döngüde 30 dakika boyunca otoklav ortamı yapın.
    2. Sökülü şişe kapak dispenserini 121 °C'de kuru döngüde 30 dakika boyunca otoklavla geçirin. 121 °C'de sıvı döngüde 30 dakika boyunca 1 L deiyonize su otoklavı ile incelenin.
    3. Otoklav cam petri kabı, 500 mL beakonlar, çay süzgeçleri ve cımbız kuru döngüde 121 °C'de günde 30 dakika önceden kullanılıyor.
      NOT: Aksi belirtilmedikçe, aşağıdaki adımlar aseptik teknikle laminar akış başlıkta yapılmalıdır.
  2. Tohumları yüzeyden sterilize edin.
    NOT: Yüzey tohum sterilizasyon protokolü, kullanılacak bitki türüne bağlıdır. Gnotobiyotik sistem, aşağıdaki tohum sterilizasyon protokolleriyle hem buğday hem de mısır ile test edilmiştir.
    DIKKAT: Çamaşır suyu ve sodyum hipoklorit ile çalışırken laboratuvar önlüğü, eldiven ve koruyucu gözlük giyin; çünkü bu kimyasallar cilt ve gözleri tahriş edici veya aşındırıcı olabilir. Etanol yanıcıdır; Açık alev yakınında kullanmayın.
    1. Buğday tohumu sterilizasyonu25
      1. İki beakıyı %95 v/v etanol ile 150 mL, bir besheri 150 mL seyreltmemiş ev çamaşır suyu ile ve iki besheri 150 mL su ile doldurun.
      2. Buğday tohumlarını çay süzgecisine yerleştirin. Çay süzgecini tohumlarla bir bedekte %95 v/v etanol ile bir dakika boyunca nazikçe karıştırın.
      3. Tohumları yeni bir çay süzgecisine aktarın. Çay süzgeçlerini tohumlarla çamaşır suyu ile 10 dakika boyunca nazikçe karıştırın.
      4. Tohumları yeni bir çay süzgecisine aktarın. Çay süzgecilerini diğer kabın içindeki tohumlarla nazikçe karıştırın, %95 v/v etanol içeren.
      5. Çay süzgelerini tohumlarla steril deyonizasyon suda 30 saniye boyunca nazikçe karıştırın. Çay süzgecilerini diğer beakerdeki tohumlarla steril deionize suyla 2 dakika boyunca nazikçe karıştırın. Steril tohumları boş steril bir petri kabına yerleştirin.
    2. Mısır tohumu sterilizasyonu26
      1. Mısır tohumlarını 50 mL'lik konik bir tüpte yerleştirin. Konik tüpü %70 v/v etanol ile doldurun. Konik tüpü 3 dakika boyunca nazikçe ters çevirin.
      2. %70 etanol dekantı yapın ve konik tüpü %2 v/v sodyum hipoklorit ile tohumlarla doldurun. Konik tüpü 3 dakika boyunca nazikçe ters çevirin.
      3. %2 sodyum hipoklorit dekantı yapın ve tohumları steril deyonize suyla durulayın. Suyu boşaltın ve tohumları dört kez suyla durulayın. Mısır tohumlarını steril bir petri kabına yerleştirin.
  3. Uygunsa mikrobiyal inokulumu ortama ekleyin.
    NOT: Gnotobiyotik sistemin optimizasyon ve sterillik testi sırasında mikrobiyal inokulum uygulanmadı.
  4. Şişe kapağı dağıtıcılarını monte edin ve medya şişelerine takın.
    NOT: Bu açık bir sistem olduğu için, akış ortamını toplamak için bir konteyner bulundurmanızı öneririz. Fırın tepsisi kullanmanın iyi çalıştığını ve kolay hareket ettirmeye olanak sağladığını gördük, ancak sık sık boşaltmayı gerektiriyor.
  5. Plastik kapağı kapağadan çıkarın ve tencereye 378 mL orta malzeme dökün.
    NOT: Bu, diğer toprak alt tabanları kullanıldığında ayarlanması gereken yaklaşık %70 su dolu gözenek boşluğuna (WFPS) karşılık gelir. Kil için 360 mL, kum için ise 358 mL kullanın.
    1. Sterilize edilmiş tohumu steril cımbızla uygun derinliğe ekin.
    2. Buğday 1/2 inç derinlikte, mısırı ise 1 inç derinlikte ekin. Alternatif olarak, steril önceden çimlenmiş fideleri GNOVA'ya ekin. Mısır büyüme testi için önceden çimlendirilmiş tohumları kullanın.
    3. Saksının üstündeki plastik kapağı değiştirin.

3. Son montaj ve deneysel çalışma

  1. Saksı ve cam silindiri bir büyüme odasına aktarın. Cam silindiri alt kısmı aşağıya bakacak şekilde tencerenin yakınında tutun.
  2. Plastik kapağı tencereden hızla çıkarın ve sterilizasyon sargısını cam silindirden çıkarın. Cam silindiri üstüne indirin, 3D baskılı tabanın kenarına oturtur.
    NOT: Büyüme sisteminin son montajı sırasında tencerenin yanına bir alev (örneğin, taşınabilir Bunsen ocağı) da yerleştirilerek kirlenme riskini daha da azaltabilir.
    DIKKAT: Açık alevle çalışırken çevrede başka yanıcı malzeme olmadığından emin olun. Alevin vücudunuza göre konumuna dikkat ederek yanık yaralanmasını önleyin.
  3. Bitki türüne bağlı olarak, türe özgü büyüme koşulları kullanılarak 4 ila 17 hafta arasında bitkiler yetiştirin.
  4. Gündüz/gece sıcaklıkları 22 °C/16 °C sıcaklığında buğday yetiştirin, mısır ise 27 °C/23 °C sıcaklıklarda yetiştirin. Her iki tesisin foto periyodu sadece floresan ışıklar altında 12 saattir.

4. Sulama

  1. Şişe kapağı dağıtıcısına uzun bir silikon boru takın.
  2. Sulama sırasında taşınabilir bir alevle sterilliği koruyun. Taşınabilir alev seçeneği yoksa, sterilliği korumak için çamaşır suyu ile sulama yapın.
  3. Taşınabilir alevle sulama.
    DIKKAT: Açık alevin etrafında dikkatlice çalışın, böylece beden yaralanması ve tesis hasarını önleyin.
    1. Sulama hattının yakınına alev yerleştirin. Şırınga namlusunu sulama hattından ve filtre tutucudan çıkarın. Tüm tüp uçlarını alev bölgesi içinde tutun.
    2. Filtre tutucusunu sulama hattına takın. İki şırınga namlusunu birbirine bağlayın. Şişe üst dispenserindeki diğer uzun silikon boru parçasını filtre tutucusunun alt portuna bağlayın.
    3. 150 mL 0.5X Murashige ve Skoog ortamı dağıtın. İki şırınga namlusunu ayırın.
    4. Silikon boruyu filtre tutucudan ayırın ve yerine bir şırınga namlusu takın.
  4. %10 çamaşır suyu ile sulama
    NOT: Bu sulama stratejisini büyük deneylerde (n > 50) kullanarak sulama sırasında verimliliği artırmanızı öneriyoruz.
    DIKKAT: Çamaşır suyu ile çalışırken laboratuvar önlüğü, eldiven ve koruyucu gözlük giyin.
    1. %10 v/v çamaşır suyu çözeltisi iki küçük plastik kaba dağıtın ve onları sulama hattının yakınına yerleştirin. Şırınga namlusunu sulama hattından ve filtre tutucudan çıkarın.
    2. Tüm boru uçlarını 10% çamaşır suyu çözeltisine batırın ve ihtiyaç duyulana kadar. Fazla çamaşır suyu çözeltisini silkeleyin. Filtre tutucusunu tencerenin sulama hattına takın.
    3. Şişe üst dispenserinin diğer uzun silikon tüp parçasını filtre tutucusunun alt portuna bağlayın.
    4. 150 mL 0.5X Murashige ve Skoog ortamı dağıtın. Silikon boruyu filtre tutucudan ayırın.
      NOT: Kum için sulama hacmi 120 mL, kil için ise 360 mL'dir.
    5. Fazla çamaşır suyu silkeledikten sonra sulama hattındaki filtreyi şırınga fıçısı ile değiştirin.
      NOT: Sulama hacmi değişirse, sulama hattını astarlamak için yaklaşık 20 mL ortam alın.
  5. Saksıları haftada bir sula. Deneyin amacına ve kullanılan toprak tabanına göre sulama hacmi ve sıklığı ayarlanır. Eğer %100 kum kullanılıyorsa, sulama sıklığını haftada iki kez artırın.

5. Hasat

NOT: Bu hasat protokolü, gnotobiyotik sisteminin test ve optimizasyonu sırasında uygulanmıştır. Hasat protokolü, belirli araştırma hedeflerine ve işlenen örnek hacmine uygun şekilde değiştirilmelidir.

  1. Hasattan en az bir gün önce tüm çözelti ve malzemeleri hazırlayın ve sterilize edin.
    1. Otoklav 4 L deiyonize su ve 500 mL 0.145 M NaCl, 121 °C'de sıvı döngüsünde, günde 30 dakika önce.
    2. Otoklav makas ve cımbız kuru döngüsünde 121 °C'de günde 30 dakika önceden uygulanıyor.
      NOT: Aksi belirtilmedikçe, aşağıdaki adımlar aseptik teknikle laminar akış başlıkta yapılmalıdır. Numune toplama için sterillik gerekli değilse, tüm bu adımlar laminar akış başlığı dışında yapılabilir.
  2. Gnotobiyotik sistemleri büyüme odasından laboratuvara aktarın ve laminar akış başlığına yakın yerleştirin.
  3. Cam silindiri potadan çıkarın ve potayı hızla laminar akış başlığına yerleştirin. Potayı 3D baskılı tabandan çıkarın.
  4. Bitkiyi tabanda tutun ve toprak alt tabakasını bir kaba dökün. Köklerden büyük toprak toplayıcılarını nazikçe silkeleyin.
    NOT: Toprak alt örtü örnekleri, hasadın bu aşamasında özel araştırma hedefine göre toplanabilir ve işlenebilir. Burada kısaca anlatılan protokol, toprakların sterilliğini test etmek için kullanılmıştır.
  5. Toprak bakteri için toprak hasadı27 tek plakalı seri seyreltme lekelemeile 28.
    1. 96 kuyuluğa sahip bir plakanın kuyruklarını 270 μL 0,145 M NaCl ile doldurun. İlk sırayı boş bırak. 15 mL konik bir tüpe 1 g toprak substratı ekleyin ve 9 mL 0.145 M NaCl içerir.
    2. Vortex'i maksimum hızda 5 dakika boyunca kullanın. Numunenin 30 μL'sini 96 kuyu plakasının boş bir kuyusuna aktarın.
    3. Her örnekten yedi seri seyreltme hazırlamak için her örnekten 30 μL pipetle, alt kuyuya 270 μL NaCl çözeltisi içeriyor.
    4. Her transfer arasında pipetle yukarı aşağı iyice karıştırın.
    5. Her örnek için tek plakalı seri seyreltme noktasını 10 μL tek bir R2A plakasına yerleştirerek hazırlayın.
    6. Damlaları yaymak için plakaları eğin. Plakaları oda sıcaklığında kuluçka altına alın.
    7. Koloni oluşturan birimleri (CFU) sayın ve toprak CFU/g hesaplayın.
  6. Sürgünleri köklerden steril makasla ayırın. Taze filim ağırlığını kaydet.
  7. Kökleri deionize suyla bir beakerde nazikçe sallayarak temizleyin. Kökleri kurutup taze ağırlık kaydet.
    NOT: Bu noktada yer üstü ve altındaki materyaller toplanabilir ve ilgilenilen aşağı akış analizine en uygun metodolojiye göre işlenebilir.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bitki-mikrop etkileşimlerini incelemek için gerekli steril ve kontrollü ortamı sağlayan yeni bir bitki gnotobiyotik sistemi olan GNOVA'yı geliştirdik. Bu yeni sistem, 24,4 inç (62 cm) dikey sürgün alanı ve çeşitli toprak alt tabakalarıyla uyumlu 1,3 L'lik bir saksı sunuyor. Tam monte edilmiş sistem yaklaşık 3 ft (92,4 cm) yüksekliğinde ve 4,57 inç (11,6 cm) genişliğindedir (Şekil 5A–C). Diğer sistemlere kıyasla, sürgün büyümesi için en yüksek dikey kapasiteye ve ikinci en büyük kök odasına sahiptir (Ek Tablo 1). GNOVA, büyüme odasında sadece 0,0135m2 yüzey alanı gerektirir, bu da sistemi kompakt ve manevra edilebilir kılar. Bu sistem, dikey boşluk 1,22 m olan erişimli büyüme odalarında kullanılabilir. Bu sistemin tüm bileşenleri, 3D basılı taban hariç, otoklavlanabilir olup 24 inç × 24 inç × 36 inç (genişlik, ×uzunluk × yükseklik; 61 cm × 61 cm × 91 cm boyutlarındaki otoklavlarla uyumludur. Bu, bireysel parçaların manuel sterilizasyonunu aşarak deneysel kurulumu kolaylaştırır. Ayrıca, bu sistemin çoğu bileşeni yeniden kullanılabilir olup, deney başına kullanım maliyeti yaklaşık 6 USD olarak belirlenmiş ilk kurulum maliyeti olan 54 USD'den sonra tutmaktadır (Ek Tablo 2). GNOVA'daki çevresel koşullar, sistemin sıcaklığı ve göreceli nemi bir haftalık mısır bitkisi ile üç gün boyunca takip edilerek belirlendi. GNOVA içindeki sıcaklık, büyüme odasından ortalama +1,3 °C daha yüksekti (Ek Şekil 1). Sistem ve odadaki sıcaklık farkları, ışık döngüsünde (ortalama +2,5 °C) karanlık döngüdeki (ortalama +0,4 °C) sıcaklık farklarından daha fazlaydı. GNOVA içindeki göreli nem ortalama %63 idi, büyüme odasındaki bu oran %34'tü.

figure-results-1
Şekil 5: GNOVA sisteminin renderleri. (A) Destek tabanının nihai tasarımının 3D modeli (B) Destek tabanının 3D modelinin kesit alanı (C) Tam montajlı GNOVA'nın 3D modelinin kesit bölümü Bu şekilin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Sistemde sterilliği sağlamak için, bitkiler olmadan sulanmayan ve sulama sistemleri üzerinde dört haftalık bir deneme yaptık. Cam silindirdeki kirlenme, pamuk halkası üzerinde ve altında doğrudan tamponla alınarak belirlendi. Hem sulanmamış (n=4) hem de sulanan örneklerde (n=6) pamuk halkası üzerinde üç koloninin üzerinde (örneğin alınan yüzey alanının üçte birinde bir koloni) tespit edilebilir mikrobiyal büyüme gözlemlenmemiştir (Ek Şekil 2A). Pamuk halkanın altında, bir sulanmamış replikada büyüme gözlemlenmiş, sulanan sistemlerde ise büyüme gözlemlenmemiştir (Ek Şekil 2B). Bu, cam silindirden düşük kirlenme potansiyelini gösterir; çünkü mikrobiyal büyüme sadece pamuk halkası altındaki sınırlı kopyalarda bulunuyordu ve bu halka bitkiye temas etmiyordu. Toprak kirliliği, R2A plakalarında seri seyreltmeler tespit edilerek değerlendirildi (Ek Şekil 2C). Her iki durumda da önemli bir mikrobiyal büyüme tespit edilmedi; seri sulandırmalardan (yani 30 koloni < skorlanamayan koloni oluşturan birim sayısına sahip tek bir sulama replikası dışında. Sterillik testlerine ek olarak, GNOVA içinde yetiştirilen buğday ve mısırın standart gnotobiyotik büyüme protokolümüz olan iki haftalık poşette sistem19 performans karşılaştırmasını yaptık. Küçük boyut ve sulama eksikliğinin bitki performansı üzerindeki etkisini anlamak için, torbadaki büyüme sürelerini GNOVA içindeki büyüme sürelerine uygun şekilde uzattık. Her iki sistemin kurulumunda kullanılan ilk toprak su içeriği eşleşmiş olsa da, GNOVA haftalık gürreleme alırken, torbalar bu şekilde gerçekleşmedi. Tüm karşılaştırmalar için, laboratuvarımızın ilk gnotobiyotik kurulumu olduğu için poşet sistemini referans olarak kullanıyoruz. Hem buğday hem de mısır GNOVA içinde %100 çimlenmeye ulaşırken, torba sisteminde buğday sadece %67 (n = 3) ve mısır %75 (n = 8) (Şekil 6) elde etmiştir.

figure-results-2
Şekil 6: GNOVA (mor) ve torba sistemi (yeşil) içinde buğday (n = 3) ve mısırın (n = 8) çimlenmesi. Her bir replikasyonun çimlenme sonucu, her gnotobiyotik sistem için y ekseninde ya çimlenme yok ya da Çimlenmemiş olarak gösterilir. Barlar, farklı sistemlerdeki her bitki türünün çimlenme oranını (%) temsil eder. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

GNOVA içindeki maksimum sürdürülebilir büyüme süresi ve bitki performansını belirlemek için buğday ve mısır için bir büyüme testi de yapıldı. Standart poşet protokolümüz sadece iki haftalık büyüme gerektirse de, iki sistem arasında daha iyi bir karşılaştırma yapmak için poşetler içindeki büyüme süresini iki haftadan fazla uzattık. İki hafta sonra, GNOVA (n=3) içinde yetiştirilen buğday zaten Zadock'un büyüme aşamasına (GS) 13 (Şekil 7A) ulaşmıştı, oysa torbada GS11'de kalmıştır. Beşinci haftada, bitkiler GNOVA sistemlerinde GS21'e ulaşmıştı; bu da ekmekçilerin ortaya çıkışı ile gösterilmiştir (Şekil 7B). Buna karşılık, torbe sistemlerinde tillerler yoktu ve bitkiler GS13'te kaldı. Bu büyüme durgunluğu ve torba sisteminde fenolojik değişikliklerin olmaması, bu sistemdeki bitkilerin altıncı haftada sona ermesine yol açtı. GNOVA içinde buğday bitkileri beş hafta daha büyümeye devam etti; burada yaprak sayısı ve biyokütleste artış gözlemlendi (Şekil 7C). GNOVA'da 12 haftalık büyümeden sonra buğday biyokütlesi görsel olarak artmış olsa da, bitkiler daha fazla klorotik yaprak göstermeye başlamış ve cam silindir hacmi bitki biyokütlesi ile doldurulmuş (Şekil 7D). Bundan sonra iki hafta daha buğday yetiştirildi (Şekil 7E,F). Ancak biyokütütlede görsel artış olmadığı için büyüme testi 17 haftalık büyüme sırasında sonlandırıldı. Mısırın büyümesi de dört hafta boyunca GNOVA içinde değerlendirilmiş ve torbalarda yetiştirilen mısırla karşılaştırılmıştır (Şekil 8A,B). Bu deneyde, mısır tohumları GNOVA veya torba sisteminde ekilmeden önce sterilize edilip önceden çimlendirilmiştir. Mısırın taze sürgün ve kök ağırlığı iki sistem arasında anlamlı derecede farklıydı (İki örnek t-testi, p< 0.05, Ek Tablo 3). GNOVA'da yetiştirilen mısırın taze sürgünleri ve kökleri ortalama olarak sırasıyla 11,2 g ve 5,7 g ağırlığındaydı (Şekil 8C,D). Buna karşılık, torbada yetiştirilen mısır sürgünleri ve kökleri sırasıyla 1,29 g ve 1,15 g taze ağırlıktaydı. Genel olarak, GNOVA içinde yetiştirilen taze mısır biyokütlesi, torba sisteminde yetiştirilen mısıra kıyasla %593 artmıştır. Ayrıca, sürgün ve kök uzunluğu GNOVA içinde torbalara göre sırasıyla %89 ve %57 oranında önemli ölçüde daha fazlaydı (Şekil 8E,F).

figure-results-3
Şekil 7: GNOVA prototipinde buğday büyümesi. (A) Zadock'un büyüme aşamasında iki haftada buğday (GS) 13. (B) Bir torbada beş haftalık büyüme sonrası buğday ve GNOVA karşılaştırılması. Tillerler GNOVA (GS21) içinde bulunur ve torbada yoktur (GS13). (C) 10 haftalık büyümede buğday biyokütlesinin artması. (D) Klorotik yaprakların ortaya çıkmasıyla birlikte büyümenin 13 haftasında buğday biyokütlesinin artması. (E) 15 haftalık büyüme sırasında buğday biyokütlesinin daha fazla artışı. F) Buğday biyokütlesi, 17 haftalık büyüme süresinde mevcut büyüme hacminin çoğunu kaplar. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-4
Şekil 8: GNOVA (mor) prototipinde mısırın torba sistemi (yeşil) ile karşılaştırılması. Çubuklar, ortalama değerleri ± standart hata (n=4) (A) GNOVA ve torba sisteminde dört hafta yetiştirilen mısırı gösterir. (B) GNOVA ve torba sisteminde yetiştirilen hasat edilen bitkilerin boyut karşılaştırması. (C) Taze filim ağırlığı (Orta±SE). (D) Taze kök ağırlığı (Orta±SE). (E) Atış uzunluğu (Orta±SE). F) Kök uzunluğu (Ortalama±SE). Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 1: GNOVA (mor) ve büyüme odasında (turuncu) ölçülen göreli nem ve sıcaklığın zamansal dinamiği. Veriler üç gün boyunca beş dakikalık aralıklarla kaydedildi. GNOVA içindeki veriler, yedi haftalık bir mısır bitkisi ile kaydedildi. Açık mavi renkte olan alanlar gece saatlerine karşılık gelir. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 2: Bitkilerin sulama (Kontrol) ve sulama (Sulanma) ile yapılan GNOVA'nın sterillik testinden kaynaklanan mikrobiyal büyüme. (A) Pamuk halkanın üzerindeki cam silindir örnekleri. (B) Pamuk halkası altındaki cam silindir örnekleri. (C) Toprak örneklerinin tek plakalı seri seyreltme kaplaması. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Tablo 1: GNOVA'nın mevcut diğer bitki gnotobiyotikleriyle (EcoFAB, magenta kutuları, torbalar, FlowPot ve GnotoPot, EcoFAB 3.0) özellik karşılaştırması. Sistemler, bitki yükseklik kapasitesi, kök hacmi kapasitesi ve sulama kontrolü gibi deneysel tasarımla ilgili temel parametreler üzerinden karşılaştırılır. Bilgiler, yayımlanmış literatür ve mevcut sistem açıklamalarından derlenmiştir; veriler açıkça bildirilmediğinde, tahminler belirtilir. † Literatürde belirtilmediğinde en iyi yaklaştırma; ‡ Sistemin görevi yerine getirmek için sökülmesine veya laminar akış başlığına taşınmasına gerek yoktur; * Sistemde yapılan değişikliklerle mümkün olabilir; Maliyet kategorileri şu şekilde tanımlanmıştır: düşük (birim başına USD 100) Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Tablo 2: Malzeme listesi (BOM) ve tek bir GNOVA ünitesinin montajı ve işletmesi için tahmini maliyetler. Malzemeler, karşılık gelen birim maliyeti, sistem başına gereken miktarlar ve sistem başına toplam maliyetle birlikte yeniden kullanılabilir veya tek kullanımlık bileşenler olarak kategorize edilir. Yeniden kullanılabilir bileşenler ilk kurulum maliyetine katkıda bulunurken, tek kullanımlık malzemeler deney başına tüketilebilir maliyeti temsil eder. * maliyet etkin fiyatlar için pazarlık edilen toplu fiyatlardan hesaplanmıştır; ** Gereken miktar, deneyin süresine, kullanılan toprak tabanına ve araştırma hedefine göre değişir. Kil ve kum karışımı kullanılarak haftalık sulama programıyla dört haftalık bir deneyin değeri; † Sistem başına gereken malzeme miktarının yaklaşık maliyeti; ‡ Besin çözeltisi veya toprak substratı için fiyat dahil değildir, çünkü bu deneysel hedefe göre değişecektirLütfen bu dosyayı indirmek için buraya tıklayın.

Ek Tablo 3: Mısır büyümesi için iki örneklemli t-testin elde edilen p-değerleri, GNOVA ve torba sisteminde yetiştirilen değişkenleri ölçtü. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada sunulan bitki gnotobiyotik sistemi olan GNOVA, tahıl ürünlerinde bitki-mikrop etkileşimlerini incelemek için erişilebilir ve çok yönlü bir araç sağlar. Temel özellikleri arasında, artan büyüme kapasitesi ve yerleşik sulama yer alır; böylece steril koşullarda tahılların fide aşamasının ötesine kadar büyümesini sağlar. Bu sistemin performansı EcoFAB 3.0 ile karşılaştırılabilir olup erişilebilir alternatif bitki gnotobiyotik sistemi sunar. Sistem, maliyet, sadelik ve orta boy otoklavlarla uyumluluk açısından ticari olarak seçilen bileşenlerden inşa edilmiş, laboratuvarlar arasında benimsenmeyi kolaylaştırmaktadır. Montaj ve işletme basittir ve özel ekipman gerektirmez, bu da uygulama engellerini azaltır. GNOVA, geniş toprak substratları, tohum sterilizasyon protokolleri, mikrobiyal inokulantlar (mikrobsuz, SynCom veya doğal topluluk) ve çeşitli sonraki analizlerle uyumluluğu sayesinde farklı araştırma hedeflerine uyarlanabilir.

Bitki gnotobiyotik deneylerinde, gözlemlenen etkilerin kontaminantlara değil, ilgi çeken mikroplara atfedilebilmesini sağlamak için minimum kirlenme gereklidir. GNOVA'nın basit işleyişi kirlenme riskini azaltıyor. Aseptik tekniğe sıkı sıkı bağlılık ve aşağıdaki temel öneriler, sterilliğin korunmasını sağlayacaktır. Deney kurulumu sırasında, tedavilerin çapraz kontaminasyonunu en aza indirmek için mikrobiyal aşılananlar arasındaki laminar akış başlığının dezenfekte edilmesini öneriyoruz. Uygulamaların sırası da çapraz kontaminasyonu azaltabilir. Herhangi bir canlı mikrobiyal tedaviden önce mikropsuz tedaviler uygulamak idealdir. Yabancı mikroplar da tohumlar yoluyla getirilebilir. Bu nedenle, yüzey tohum sterilizasyon protokolleri, sterillik ve çimlenme dengesi sağlamak amacıyla her bitki türü veya tohum kaynağı için optimizeedilmelidir 26. Model olmayan tahıllar için sterilizasyon protokolleri, örneğin sorgum24,arpa 29, switchgrass ve yulaf23 gibi GNOVA'da kolayca uygulanabilir. Sterilizasyon çimlenmeyi olumsuz etkilerse, önceden çimlenmiş tohumlar kullanılabilir. Sulama, gnotobiyotik sistemlerde önemli bir kirlenme kaynağıdır. Bu süreçte en kritik nokta, filtrelerin sulama hatlarına bağlanmasıdır. Sulama hatlarının ve filtrelerin boru uçları bu süreçte steril kalmalıdır. Alevle sterilizasyon beceri gerektirir ve özellikle büyük deneylerde (n >50) emek yoğun olabilir. Bu nedenle, alternatif ağartıcı bazlı yöntem büyük deneyler veya alevle sterilizasyon pratik olmadığı durumlarda önerilir. Sistem malzemelerinin işlenmesi sırasında kontaminasyon durumunda ek steril filtrelerin korunması ve sulama sırasında çamaşır suyu veya etanol bulundurulması da önerilir. Ayrıca, sterilliği izlemek ve kirleticileri tespit etmek için kontaminasyon kontrol birimlerinin (yani bitki içermemesi, mikrop tedavisi olmaması ve sulama almaması) dahil edilmesi şiddetle tavsiye edilir.

Sulama kirliliği riskini aşmak için, en erken bitki gnotobiyotik sistemleri tamamen kapalıydı ve sulama yeteneğinden yoksun oldu; bu da deneylerin süresini sınırladı. Mısır, iki ila dört hafta arasında19,30 torbalarda, cam tüplerde ve15 petri kaplarında gnotobiyotik olarak yetiştirildi. Bitki büyümesi sırasında su ve besinleri yenilemek için, EcoFAB23, FlowPot ve GnotoPot21 gibi alternatif sistemler, laminar akış kapaklarında kısmi sökümle sulama yapılmasını mümkün kıldı. Bu durum, boyutlarını ve daha büyük bitkilerle uyumluluklarını sınırladı. Sulama hatları GNOVA dışında kolayca erişilebilir olduğundan, sökme zorunlu değildir ve sistem laminar akış başlıkları boyutlarına bağlı değildir. Bu sadece sürekli besin ve su tedarikini sağlamakla kalmaz, aynı zamanda mevcut büyüme alanını da artırır. Sürgünün azalması fotosentetik kapasitesini azaltabilir ve durgunlaşmaya katkıdabulunabilir 24, kök hacmi kısıtlanması ise kök bağlanmasına yol açabilir ve su ile besin alımınıazaltabilir 31. Küçük büyüme alanı ve torba sistemindeki sulama eksikliği, GNOVA sistemine kıyasla mısır ve buğdayın biyokütlesinin azalmasını ve fenolojik ilerlemesinin eksikliğini açıklayabilir. Bu yeni sistem, EcoFAB 3.024'teki sorgum süresine benzer bir süre boyunca mısırın gnotobiyotik büyümesini sağladı. Ayrıca, daha temsilli bir toprak sisteminde hidroponik sistemde buğdayın gnotobiyotik büyümesini dört hafta boyunca (20) aşar. Fiziksel kısıtlamaların yanı sıra, gnotobiyotik sistemler genellikle kısırlığı korumak için kısıtlı hava akışına dayanır. Sınırlı hava akışı sıcaklık ve nemin artmasına ve gaz değişim oranlarının düşmesine yol açabilir ve bu da bitki fizyolojisinietkileyebilir 32. Gelişmiş hava akışına sahip sistemlerde, örneğin GNOVA'da kullanılan DW4 filtresine benzer çalışan HEPAfiltreleri 33 ile donatılmış magenta kutularda iyileşme bildirilmiştir. Benzer şekilde, EcoFAB 3.0 artan sıcaklık ve göreceli nem gösterdi ancak sorgum24'ün gnotobiyotik büyümesi için sağlam bir platform olarak kabul edildi. Bu, gnotobiyotik sistemlerde fiziksel ve çevresel kısıtlamaların devam ettiğini, ancak burada sunulan sistem tasarımındaki ilerlemelerin tahılların gnotobiyotik büyümesini daha etkili destekleyen daha iyi koşullar sağladığını göstermektedir.

Kolayca değiştirilebililmesi GNOVA'nın bir diğer önemli özelliğidir. Tasarımının modülerliği, kullanıcıların araştırma ihtiyaçları ve bütçelerine daha uygun şekilde bireysel parçalarda değişiklik yapmasına olanak tanır. Bu sistem, doğal topraklar da dahil olmak üzere herhangi bir toprak alt tabakası ile uyumludur. Kurulum hacmi, besin çözeltisi konsantrasyonu ve sulama hacmi ile sıklığındaki değişiklikler, toprağın fiziksel-kimyasal özelliklerine dayanmalıdır; çünkü bunlar doğrudan besin ve su bulunabilirliğini ve dağılımınıetkiler 34. Kuraklık, tüm GNOVA sisteminin ağırlığının izlenmesi ve toprak su içeriğinin gravimetrikolarak 35 olarak belirlenmesiyle oluşturulabilir. Kök ekzudatları, hasat edilen bitkileri ultra safsuda kuluçka olarak inceleyerek veya sistemi yıkamak yoluyla steril olmayansülükler elde ederek yıkıcı bir şekilde toplanabilir 37. Steril ekzudatlar gerekirse, GNOVA'nın pot ve 3D baskılı destek tabanı, EcoFAB 3.024 tasarımındaki gibi yerleşik bir ekzuda toplama özelliği içerecek şekilde değiştirilebilir. Mikrobiyal topluluk birleşimindeki önceliklietkileri anlamak isteyen bilim insanları, saksı etrafına ek sulama hatları kurabilirler. Bu, ana sulama hattının sterilliğini korurken mikrobiyal aşılantıların sonraki uygulamalarına olanak tanır. Çevresel koşullar, GNOVA içinde dezenfekte edilmiş kablosuz sıcaklık ve göreli nem sensörleri yerleştirilerek izlenebilir. Alternatif olarak, cam silindiri polikarbonat bir odayla değiştirip örneklemeportları 24 sondajı yapılabilir, çevrenin ölçülmesi ve gaz örneklemesi mümkün olur. Bu, CO2, O2 ve etilen gibi gazların ve uçucu bileşiklerin nicelendirilmesine olanak tanıyabilir ve tesis performansınıetkileme potansiyeline sahip olabilir 33. Sisteme hava akışı ayrıca cam silindirdeki pamuk halkası çıkarılarak da artırılabilir. Ancak, bu değişikliklerden herhangi biri kontaminasyon riskini artırabilir ve henüz GNOVA içinde doğrulanmamış veya optimize edilmemiştir.

GNOVA'nın avantajlarına ve çok yönlülüğüne rağmen, bazı sınırlamalar göz önünde bulundurulmalıdır. Bu sistemin kontrollü büyüme odalarında kullanımı için en uygun olduğu belirtilmelidir; çünkü sera veya tarladaki kontrolsüz koşullar performansını etkileyebilir. Buğday sistemde 17 hafta boyunca büyüyebilse de, büyümenin yaklaşık 12 haftasında stres belirtileri gözlemlendi. Bu nedenle, buğday 12 haftadan fazla yetiştirilmemelidir. Ayrıca, sterilliğin korunması yalnızca dört haftalık büyüme dönemi boyunca dört haftalık sulama etkinliğiyle doğrulandı; Daha uzun deneyler ise daha fazla kontaminasyon riski taşır. GNOVA'nın kök hacim kapasitesini artırmasına rağmen, kök kısıtlanması hâlâ mümkündür ve kök morfolojisinin zamansal değerlendirmesi, kök bağlanmasını en aza indiren optimal büyüme sürelerini belirlemeye yardımcı olabilir. Ayrıca, cam silindirin polikarbonat silindirle değiştirilmesi gibi sistemde yapılan bazı değişiklikler, kurulum maliyetini ünite başına 100 USD'nin üzerine çıkarabilir. Şu anda GNOVA yalnızca uç nokta yıkıcı örnekleme izin vermektedir; bu da mikrobiyal dinamikler, dışkı desenleri veya sterillik izleme için zamansal çalışmalar için emek ve çoğaltma gereksinimlerini artırır. Son olarak, kurulum, sulama ve hasat sırasında sterilliği korumak zaman alıcıdır ve GNOVA gibi basitleştirilmiş sistemler bile özel çaba gerektirir, bu da genel işletme maliyetlerini artırır. Bu sistem benimsenirken bu sınırlamalar topluca dikkate alınmalıdır. Ayrıca, deneylerin planlanıp sonuçların yorumlandığı çevresel kısıtlamalar göz önünde bulundurulmalıdır; çünkü bunlar bitki fizyolojisini ve dolayısıyla ilişkili mikrobiyomunu etkileyebilir.

GNOVA, tahıl ürünleriyle uyumlu çok yönlü bir gnotobiyotik platform sağlar. Sistem, RhizoVision explorer39 ve ARIA40 gibi kök mimarisi analiz araçlarına uygun neredeyse sağlam kök sistemlerinin geri kazanılmasını sağlar ve çeşitli mikrobiyal aşılantılar ve çevresel koşullara yanıt olarak kök morfolojisinin karakterizasyonunu sağlar. SynComs ve çoklu omik analizlerle birleştirildiğinde, GNOVA mikrobiyal efektörler ile bitki yanıtları arasındaki mekanistik bağlantıların belirlenmesini kolaylaştırır. Daha büyük SynComlar (>100 üye) ve metagenomik 41,42,43 analizleriyle birlikte birlikte oluş desenlerini incelemek ve farklı koşullar altında ekolojik öneme sahip mikropları belirlemek için kullanılabilir 5,44. Buna karşılık, daha küçük SynCom'lar (<50 suş) metatranskriptomik45,46, metaproteomik 19,47,48 ve metabolomik 49,50,51 ile birleşince, hem bitkilerde hem de mikroplarda fonksiyonel yanıtın ayrıntılı karakterizasyonunusağlar 44. Bu yetenekler birlikte, GNOVA'yı tarımsal sistemlerin sürdürülebilirliğini artıran yeni biyoinokulyantların geliştirilmesini hızlandırabilecek temel mikrobiyal özelliklerin tanımlanmasında değerli bir araç olarak konumlandırmaktadır.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm yazarlar çıkar çatışması belirtmemektedir.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu araştırma, Novo Nordisk Vakfı (INTERACT, hibe numarası: NNF19SA0059360) ve ABD Tarım Bakanlığı Ulusal Gıda ve Tarım Enstitüsü tarafından 2022-67013-36672 numaralı ödülle finanse edilmiştir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Powerconnect cordless drill & 100-Piece KitBlack+DeckerBDC120VA1001/4" and 1/8" drill bits needed. 
Vinyl tape, yellow, 1" wide x 36 yards 3M471Tüketim malzemesi
Sterling Rubber bands size #32  (2 rubber bands per system)AmazonB001I1QO00Tüketim malzemesi. 
Wheat seedBu deneyde kullanılan çeşit: Catawba
Fiberglass pipe wrap insulation, 3 " widex 1/2 " thick  (2 pre-cut circles per system)Lowe's289302 7/8 " (7.3 cm) çapında daireler halinde kesildi. Tüketim malzemesi. Yüksek verimli üretim için daireleri kesmek için yalıtım örtüsünü yuvarlayın ve çömlek ağzının açık kenarını kullanarak örtü yalıtımının üzerine çömleği yerleştirin, baskı uygulayın ve çevirin. 
DW4 Filter media, Pre-cut to 15" x 75 yards  (1 cut circle per system)Class Biological Clean, LtdNA6.3 " (16.02 cm) çapında daireler halinde kesildi. CBC'nin satın alınabilir alternatif olarak diğer önceden kesilmiş veya standart rulo boyutları vardır.  Tüketim malzemesi. Daire şablonunu kartondan kesin ve DW4 malzemesinin alanı boyunca daireler çizmek için bunu kullanın ve makasla kesin.
Silicon tubing, Versilon SPX-50 High-strength, 1/8" ID x 1/4" OD x 1/16" wall thicknessSaint-GobainABX00007İki uzun parçaya ( 16" // 40.64 cm) ve üç kısa parçaya (2.5" // 6.35 cm) kesildi 
Sodium hypoclorite 5% available chlorine in aqueous solutionVWRJT9416-1Mısır sterilizasyon protokolü için %2 v/v'ye seyreltin
Murashige & Skoog medium, micro and macro elements. 25 LResearch Products InternationalM10200-25.00,5x'e seyreltilmiş
Ethanol, 100%, Deacon LabsFisher scientific04-355-45195% v/v'ye seyreltin
Syringe 3 mL, luer lock unsterile  (2 per system)Fisher scientific14-817-117Pistonu atın ve sadece varilleri saklayın, cam yünü ile doldurun ve folyo ile kapatın.
Glass beakers, 250 mL VWR470191-150Buğday tohumunun sterilizasyonu için beş gerekir
Maize seedBu deneyde kullanılan genotip: Mexico 21–22 B73XMo17
Aluminum baking tray 18" x 26" AmazonB01FIK54LQAkış başlığınızın boyutlarına uygun olduğundan emin olun
Sodium ChlorideFisher scientificBP358-10,145 M çözelti hazırlayın.
3D printed base, polylactic acid (PLA) filament used (1 per system)ProtolabsNABaskı ve düzenlenebilir dosyalar ek materyallerde bulunabilir. Dryad.org DOI https://doi.org/10.5061/dryad.f7m0cfzbc adresinde dosyalar mevcuttur. Eğer taban için PLA filament kullanılmışsa, OTOMKLAVLAMAMA YAPMAYIN. PLA, 150 °C'nin üzerinde erişecek ve 60 °C'nin üzerinde deforme olabilir. Tabanın 40 °C'nin üzerindeki sıcaklıklarda kullanılması gerekiyorsa PLA 3D baskı tabanının bütünlüğünün test edilmesi önerilir. PETG (Polietilen Tereftalat Glikol) veya PC (polikarbonat) gibi daha yüksek ısı dayanımına sahip malzemeler kullanılabilir; bu, parçanın maliyetini artıracaktır ve hala otomklavlanan olmayabilir. Prototiplerin 3D baskısı, 256 × 256 × 256 mm (uzunluk × genişlik × yükseklik) yapı hacmine sahip bir kişisel yazıcıda gerçekleştirildi. Hız ve maliyet verimliliği için yerel ticari 3D baskı servis sağlayıcılarında toplu baskı yapılmasını öneririz. 
Male luer to hose barb fitting 1/8 " ID, animal derivative-free polypropelene  (2 per system)Cole-ParmerEW-50114-69Protokolde 1 numaralı bağlantı olarak geçer
Male slip luer to hose barb fitting 1/8 " ID, animal derivative-free polyproylene  (1 per system)Cole-ParmerEW-50114-63Protokolde 2 numaralı bağlantı olarak geçer
201 Stainless steel worm gear hose clamps, 1 1/2" -3 1/2" clamping diameter (1 per system)Grainger5CZF2Protokolde hortum kelepçeleri olarak geçer
Airstream Gen 3 Laminar flow cabinet with simple switch, dimensions 24 1/4" x 47 " x 28 1/4 " ESCO Lifesciences2120707Protokolde laminar akış başlığı olarak geçer. Benzer boyutlara sahip herhangi bir laminar akış başlığı çalışır. Daha küçük akış başlıklarında modifikasyonlar gerekebilir. 
Play sand, Quikrete Premium. 50 lbThe Home Depot1001709466Protokolde kum olarak geçer
304 Stainless steel woven wire, 120 mesh (1 per system)AmazonB09KRS5F7TMakalede paslanmaz çelik tel örgü olarak geçer. 4.7" (11.9 cm) çapında daireler halinde kesildi. Yüksek verimli üretim veya daire üretimi için kartondan daire şablonu kesildi ve bu şablon kull

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Batista, B. D., Singh, B. K. Realities and hopes in the application of microbial tools in agriculture. Microbial Biotechnology. , (2021).
  2. Parnell, J. J., et al. From the Lab to the Farm: An Industrial Perspective of Plant Beneficial Microorganisms. Frontiers in Plant Science. , (2016).
  3. Busby, P. E., et al. Research priorities for harnessing plant microbiomes in sustainable agriculture. PLOS Biology. , (2017).
  4. Compant, S., et al. Harnessing the plant microbiome for sustainable crop production. Nature Reviews Microbiology. , (2025).
  5. Vorholt, J. A., Vogel, C., Carlström, C. I., Müller, D. B. Establishing Causality: Opportunities of Synthetic Communities for Plant Microbiome Research. Cell Host and Microbe. , (2017).
  6. Liu, Y. X., Qin, Y., Bai, Y. Reductionist synthetic community approaches in root microbiome research. Current Opinion in Microbiology. , (2019).
  7. Basic, M., Bleich, A. Gnotobiotics: Past, present and future. Laboratory Animals. , (2019).
  8. Williams, S. C. P. Gnotobiotics. Proceedings of the National Academy of Sciences, , (2014).
  9. Bennett, R. A., Lynch, J. M. Bacterial Growth and Development in the Rhizosphere of Gnotobiotic Cereal Plants. Microbiology. , (1981).
  10. Lindberg, T., Granhall, U. Acetylene reduction in gnotobiotic cultures with rhizosphere bacteria and wheat. Plant and Soil. , (1986).
  11. Maplestone, P. A., Campbell, R. Colonization of roots of wheat seedlings by bacilli proposed as biocontrol agents against take-all. Soil Biology and Biochemistry. , (1989).
  12. Simons, M. Gnotobiotic System for Studying Rhizosphere Colonization by Plant Growth-Promoting Pseudomonas Bacteria. MPMI. , (1996).
  13. Walley, F. L., Germida, J. J. Response of spring wheat to interactions between Pseudomonas species and Glomus clarum NT4. Biology and Fertility of Soils. , (1997).
  14. Ma, K. W., Ordon, J., Schulze-Lefert, P. Gnotobiotic Plant Systems for Reconstitution and Functional Studies of the Root Microbiota. Current Protocols. , (2022).
  15. Niu, B., Paulson, J. N., Zheng, X., Kolter, R. Simplified and representative bacterial community of maize roots. Proceedings of the National Academy of Sciences, , (2017).
  16. Hsu, P. C. L., O’Callaghan, M., Condron, L., Hurst, M. R. H. Use of a gnotobiotic plant assay for assessing root colonization and mineral phosphate solubilization. Plant and Soil. , (2018).
  17. McLaughlin, S., et al. A Versatile Glass Jar System for Semihydroponic Root Exudate Profiling. Journal of Visualized Experiments. , (2023).
  18. Miebach, M., et al. Litterbox—A gnotobiotic Zeolite-Clay System to Investigate Arabidopsis–Microbe Interactions. Microorganisms. , (2020).
  19. Salvato, F., et al. Evaluation of Protein Extraction Methods for Metaproteomic Analyses of Root-Associated Microbes. Molecular Plant-Microbe Interactions. , (2022).
  20. Kawasaki, A., et al. A sterile hydroponic system for characterising root exudates. Plant Methods. , (2018).
  21. Kremer, J. M., et al. Peat-based gnotobiotic plant growth systems for Arabidopsis microbiome research. Nature Protocols. , (2021).
  22. Nezhad, A. S. Microfluidic platforms for plant cells studies. Lab on a Chip. , (2014).
  23. Gao, J., et al. Ecosystem Fabrication protocols for plant-microbe interactions. Journal of Visualized Experiments. , (2018).
  24. Gupta, K., et al. EcoFAB 3.0: a sterile system for studying sorghum. Frontiers in Plant Science. , (2024).
  25. Verma, S. K., et al. Exploring Endophytic Communities of Plants. Seed Endophytes: Biology and Biotechnology. , Springer. Cham. (2019).
  26. Parnell, J. J., et al. Effective Seed Sterilization Methods Require Optimization Across Maize Genotypes. Phytobiomes Journal. , (2024).
  27. Lee, J., Kim, H. S., Jo, H. Y., Kwon, M. J. Revisiting soil bacterial counting methods. PLOS One. , (2021).
  28. Thomas, P., et al. Optimization of single plate-serial dilution spotting method. Biotechnology Reports. , (2015).
  29. Munkager, V., et al. AgNO3 Sterilizes Grains of Barley without Inhibiting Germination. Plants. , (2020).
  30. Wagner, M. R., et al. Microbe-dependent heterosis in maize. Proceedings of the National Academy of Sciences, , (2021).
  31. Poorter, H., et al. Pot size matters: effects of rooting volume on plant growth. Functional Plant Biology. , (2012).
  32. Ferrante, A., Mariani, L. Agronomic management for enhancing plant tolerance to abiotic stresses. Horticulturae. , (2018).
  33. Vollmer, R., et al. Effect of Gas Exchange Rate and Vessel Type on plant growth. Plants. , (2024).
  34. Cardoso, E. J. B. N., et al. Soil health: suitable indicators for assessment. Scientia Agricola. , (2013).
  35. Sinclair, T. R., Ludlow, M. M. Influence of soil water supply on plant water balance. Australian Journal of Plant Physiology. , (1986).
  36. Döll, S., Koller, H., van Dam, N. M. Protocol for collecting root exudates from soil grown plants. Rhizosphere. , (2024).
  37. Williams, A., et al. Comparing root exudate collection techniques. Soil Biology and Biochemistry. , (2021).
  38. Carlström, C. I., et al. Synthetic microbiota reveal priority effects and keystone strains. Nature Ecology and Evolution. , (2019).
  39. Seethepalli, A., et al. RhizoVision Explorer: software for root image analysis. AoB Plants. , (2021).
  40. Pace, J., et al. Analysis of maize seedling roots using ARIA. PLOS One. , (2014).
  41. Jensen, T. B. N., et al. High-throughput DNA extraction and metagenome preparation. PLOS One. , (2024).
  42. Romero-Salas, E. A., Ibarra-Sánchez, C. L. Isolation of Metagenomic DNA from Plant Roots. Plant Microbiome Engineering. , Springer. New York. (2025).
  43. Su, P., et al. Recovery of metagenome-assembled genomes from rice phyllosphere. Scientific Data. , (2022).
  44. Northen, T. R., et al. Community standards for synthetic communities in plant–microbiota research. Nature Microbiology. , (2024).
  45. Poursalavati, A., Javaran, V. J., Laforest-Lapointe, I., Fall, M. L. Soil Metatranscriptomics: improved RNA extraction method. Phytobiomes Journal. , (2023).
  46. Vannier, N., et al. Genome-resolved metatranscriptomics reveals conserved root colonization determinants. Nature Communications. , (2023).
  47. Zheng, L., et al. Extraction of Proteins from Soil. Metaproteomics: Methods and Protocols. , Springer. New York. (2024).
  48. Zheng, L., et al. Comparative physiological and proteomic response to phosphate deficiency. Journal of Proteomics. , (2023).
  49. Rieusset, L., et al. Cross-metabolomic approach in wheat–Pseudomonas interaction. Metabolites. , (2021).
  50. Zhang, Y., et al. Metabolite-mediated responses of phyllosphere microbiota. Microbiology Spectrum. , (2023).
  51. Swenson, T. L., Northen, T. R. Untargeted Soil Metabolomics. Microbial Metabolomics: Methods and Protocols. , Springer. New York. (2019).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

BiyolojiSay 232Say 232Bo De erSayBitki gnotobiyoti iBitki mikrop etkile imlerisentetik mikrobiyal topluluklarSynCom larbu daym s rm s rmikrobiyommikrobiyota
Video yakında

İlgili makaleler