Yöntem makalesi

Kollagenaz enjeksiyonlarını egzersizle indüklenen mekanik aşırı yük ile birleştirmek: Aşırı Yük Stres Yaralanması Diz Osteoartritini Simüle Eden Fare Modeli

DOI:

10.3791/70609

⸱

22 Mayıs 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Yueyang Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 2College of Acupuncture and Massage, Anhui University of Traditional Chinese Medicine, 3School of Exercise and Health, Shanghai University of Sport, 4School of Rehabilitation Science, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 5Department of Rehabilitation Medicine, Shanghai Pudong Hospital

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, intra-artiküler kollagenaz enjeksiyonları egzersiz kaynaklı aşırı eserle birleştirerek aşırı yüklenme kaynaklı diz osteoartritinin fare modelinin oluşturulmasını ve dejeneratif patogenezi araştırmak için minimal bir invaziv platform sağladığını açıklar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diz osteoartriti (KOA), biyolojik doku bozulması ile sürekli mekanik aşırı yüklenmenin karmaşık etkileşimiyle yol açan çok faktörlü dejeneratif eklem hastalığıdır. Geleneksel cerrahi hayvan modelleri genellikle tetikleyici travmatik eklem hasarını tetikler; bu da insan dejeneratif KOA'nın kademeli ve birikimli patogenezini doğru şekilde yansıtamıyor. Bu translasyonel boşluğu kapatmak için, mevcut çalışma, hafif enzimatik kıkırdak bozulmasını sürekli mekanik yükleme ile sinerji ederek aşırı yük stresinden kaynaklanan KOA'yı simüle eden yeni ve tekrarlanabilir bir fare modeli oluşturmaktadır. Özellikle, standart olarak standart tip II kollajenazın eklem içi enjeksiyonları, dört hafta boyunca sıkı kalibre edilmiş rotator tipi yorgunluk cihazı aracılığıyla günlük mekanik aşırı eserle eşleştirildi. Bu çift faktörlü müdahalenin etkinliği kapsamlı davranışsal, histolojik ve moleküler analizlerle doğrulandı. Otomatik yürüyüş analizi, birleşik grupta ciddi lokomotor eksiklikleri ortaya koydu. Bunlar, adım uzunluğu, adım genişliği ve pençe duruşu alanındaki önemli azalmalarla karakterize edildi. Safranin O-fast yeşil boyama kullanılarak yapılan histomorfolojik değerlendirmeler bu fonksiyonel eksiklikleri doğruladı; ilerleyici kıkırdak yapısal hasarı, yüzey kusurları ve erken ve orta evre insan KOA'sının patolojik özelliklerini yansıtan Osteoartrit Araştırma Derneği International (OARSI) puanlarının önemli ölçüde yükselttiğini gösterdi. Ayrıca, immünohistokimyasal değerlendirmeler, mekanosensitli kanal Transient Receptor Potential Vanilloid 4 (TRPV4) üzerinde belirgin bir şekilde yukarı regülasyon ve eklem kondrositlerinde kritik matriks proteini Collagen Type II Alpha 1 (COL2A1)'de eşzamanlı azalma gösterdi. Lokalize eklem instabilitesini kontrollü mekanik stresle birleştirerek, bu minimal invaziv strateji, cerrahi modellerle ilişkili akut travmayı önler. Bu protokol, dinamik moleküler mekanizmaları takip etmek, kronik ağrı fenotiplerini değerlendirmek ve erken evre osteoartrit için uzun vadeli terapötik müdahaleleri test etmek için klinik açıdan önemli bir deneysel platform oluşturur.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Osteoartrit (OA), obezite, mekanik gerginlik ve travma gibi faktörlerden kaynaklanan, ağrı, şişlik, sertlik ve işlev bozulmalarıyla karakterize edilen çok faktörlü bir dejeneratifdurumdur 1. Diz osteoartriti (KOA) yaşlanırken oldukça yaygındır ve giderek yaygınlaşır, ancak klinik çalışmalar genellikle çeşitli klinik belirtiler nedeniyle kapsam olarak sınırlı kalır. Bu nedenle, etkili tedavilerin geliştirilmesi uygun hayvan modellerinin yapılmasınıgerektirir 2. OA'nın içsel heterojenliği göz önüne alındığında, evrensel olarak kabul edilen bir "altın standart" model yoktur ve araştırmacıların bilimsel araştırmalarıyla uyumlu belirli modelleri belirlemelerini gerektirir.

KOA günümüzde modern tıpta, eklem kıkırdak ve perikondral doku üzerinde mekanik ve biyolojik faktörlerin etkileşimini içeren bir durum olarak tanımlanmaktadır. Bu karmaşık etkileşimin sonucu olarak, öncelikle eklem kıkırdak ve çevresindekimatris 3'ün kademeli olarak bozulmasıdır. Mekanik stres, eklem hücreleri ve dokularındaki çeşitli fizyolojik ve patolojik süreçleri yöneten kritik bir aktarım sinyaliolarak hizmet eder 4. Eklem kıkırdağının sağlıklı bir durumda tutulması, fizyolojik aralıkta uygun mekanik yükü gerektiriyordu. Buna karşılık, aşırı yük aşırı yüklenmesi genellikle kıkırdak dejenerasyonuna ve ardından KOA5'in başlamasına yol açar. Kendiliğinden modeller, önemli zaman ve ekonomik yatırımlarlaengellenirken, cerrahi olarak indüklenen modeller ise esas olarak orta ve geç aşama KOA'yı temsil eden yıkıcı bir yaklaşım kullanır ve doğal dejeneratifilerlemeden sapır 7,8. Buna karşılık, kimyasal olarak indüklenen modeller kolajen matrisini hedefler ancak mekanik stres olmadan kullanıldığında insan dejeneratif OA'nın kapsamlı değişikliklerini yakalayamaz. Enzimatik bozulmayı mekanik aşırı eser ile birleştirmek, aşırı yük stres hasarının kademeli patogenezini daha sadık şekilde özetleyerek bu boşlukları kapatır. Bu çalışmanın amacı, döner tekerlek yorgunluk cihazı kullanılarak eklem içi tip II kollagenaz enjeksiyonlarını aşırı eserle birleştirerek yeni bir KOA fare modeli oluşturmak ve doğrulamaktır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm hayvan deneyleri, Şanghay Geleneksel Çin Tıbbı Üniversitesi Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanan protokollere uygun olarak gerçekleştirildi. Deneyler, Şanghay Geleneksel Çin Tıp Üniversitesi Deneysel Hayvan Merkezi tarafından verilen proje lisansı (NO.: PZSHUTCM201016022) kapsamında, Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Rehberi'nin Güncellenmesi Komitesi ile uyumlu olarak gerçekleştirildi.

1. Hayvan Modeli Üretim Protokolü

  1. 32 adet 10 haftalık C57BL/6 faresini dört gruba rastgele atandırın: kontrol, kollajenaz, aşırı egzersiz ve kollajenaz + aşırı egzersiz.
    1. Tüm fareleri standart beslenme ve barınma koşulları altında bir hafta boyunca alıştırın ve ardından modelleme prosedürlerine başlayın.
  2. Atanan deneysel gruplara göre hayvan modellerini 4 haftalık bir süre boyunca uyarın.
    1. Tip II kollajenazı, kollagenaz grubundaki farelere eklem içi enjeksiyon yoluyla uygulanır.
    2. Aşırı egzersiz grubundaki fareleri döner tekerlek cihazı kullanarak egzersiz eğitimine maruz bırakın.
    3. Hem eklem içi kollagenaz enjeksiyonunu hem de döner tekerlek egzersizi antrenmanını kollagenaz + aşırı egzersiz grubundaki farelere uygulayın.
    4. Tüm ilgili egzersiz gruplarında aynı antrenman sıklığı ve süresini koruyun.

2. Tip II Kolagenaz Eklem İçi Enjeksiyon Protokolü

  1. Anestezi
    1. Kalibre edilmiş gaz anestezi makinesiyle uygulanan izofluran ile anestezi başlatın. %2–%3 isofluran konsantrasyonunda hızlı indüksiyon gerçekleştirin.
    2. Anestezi %1,5–%2 izofluran olarak kalın. Anestezik temizleyici sisteminin doğru çalışmasını sağlayarak mesleki maruziyeti önlemeye yardımcı olun.
    3. İşlem boyunca farenin solunum hızını ve reflekslerini sürekli izleyin.
  2. Deri Hazırlığı
    1. Sol diz eklemini çevreleyen bölgeye tüy alma kremi uygulayın. Saçları tamamen kazıyıcı ile çıkarın.
    2. Açıkta kalan cildi iyice temizleyin. Hazırlık boyunca aseptik koşulları koruyun.
  3. Tip II Kolajenaz Hazırlanması
    1. Tip II kollagenaz tozunu steril bir biyogüvenlik dolapta 30 dakika boyunca oda sıcaklığında dengeleyin. Çözümleme süreci için tek çözücü ve tampon olarak steril fosfat-tamponlu tuzlu (PBS, pH 7.2–7.4) kullanın.
    2. Gerekli kollagenaz tozu kütlesini analitik bir denge kullanarak hassas şekilde tartın. Steril PBS'yi toza yavaşça ekleyin ve nihai çalışma konsantrasyonu 0.04 U/μL elde edin.
    3. Karışımı nazikçe yukarı aşağı pipetle karıştırın; böylece şeffaf ve görünür parçacıklardan arının. Bu adımda enzimatik aktivite kaybını önlemek için şiddetli girdaplardan kaçının.
    4. Hazırlanan 0.04 U/μL çözeltiyi 1.000 rpm'de 5 dakika boyunca 4 °C'de santrifüj yapın. Bu, çözünmemiş mikro partikülleri ortadan kaldırır ve sonraki enjeksiyon sırasında iğne tıkanıklığını önler.
    5. Süpernatantı steril tüplere aspire edin ve hemen kullanılmak üzere 4 °C'lik buz banyosunda saklayın. Her seans için çözeltiyi taze hazırlayarak maksimum enzimatik aktivite sağlanır.
  4. Eklem İçi Enjeksiyon
    1. Farenin sırt derisini, baskın olmayan elin başparmağı ve işaret parmağı ile kavrayın. Alt uzuvları yüzük ve küçük parmaklarla sabitleyerek diz eklemlerini doğal olarak uzatın ve enjeksiyon bölgesini tamamen açığa çıkarın.
    2. 30 G iğneyle donatılmış 10 μL'lik bir mikro şırınga tutun. İğneyi, giriş noktasında yaklaşık 0,2 cm deri tabakasına deri yüzeyine paralel olarak yerleştirin.
    3. Doku direnci azaldığında iğne yönünü cilde dik bir yöne yavaşça ayarlayın.
    4. İğneyi yaklaşık 0,3–0,5 cm boyunca ilerletmeye devam edin, ta ki direnç kaybı eklem boşluğuna girdiğini gösterene kadar. Kan reflüsünün olmadığını doğrulamak için şırınganın pistonunu yavaşça çekin.
    5. Tip II kollagenaz çözeltisi 5 μL (konsantrasyon: 0.04 U/μL) eklem boşluğuna sabitbir hızda 10 enjekte edilir.
    6. İğneden hemen sonra iğne pozisyonunu koruyun. Enjeksiyon bölgesinin çevresindeki deriyi 10–15 saniye boyunca nazikçe bastırın.
    7. İğneyi yavaşça çekin. İlaç sızıntısını önlemek için giriş noktasına steril gazlı bezle hafifçe bastırın.
    8. Fareyi sıcak ve kuru bir ev kafesine yerleştirin. Hayvanın anesteziden doğal olarak iyileşmesine izin verin; bu genellikle 5–10 dakika sürer.
    9. Fare tamamen iyileştikten sonra standart barınma ve beslenme koşullarına devam edin.
    10. Bu eklem içi enjeksiyonları, enjeksiyonlar arasında 3–4 günlük aralık olarak, yalnızca 4 haftalık modelleme döneminde (ilk 1 haftalık alışma sonrası dönemde) haftada iki kez yapılacaktır.
    11. Tüm keskin silahları hemen onaylı biyolojik tehlike kaplarına atın.
      NOT: Tüm enjeksiyonları eğitimli personelin yapmasını sağlayarak eklem yaralanmasını ve deneysel değişkenliği en aza indirin.

3. Dönen Tekerlek Kaynaklı Aşırı Eserleme Protokolü

  1. Cihaz Hazırlığı ve Güvenlik Kontrolü
    1. Rotator tipi yorgunluk cihazının hızını 12 rpm'ye (yaklaşık 0,063 m/s eşdeğeri) ve süreyi seans başına 2 saat olarak ayarlayın.
    2. Elektriksel uyarım modülünü açın. Mevcut çıkışın önceden ayarlanmış güvenli aralık olan 0.1–0.3 mA içinde olduğunu doğrulayın. Mevcut yoğunluğu manuel olarak artırmayın.
      DIKKAT: Elektriksel uyarım modülünü yalnızca fareleri çarkağa yönlendirmek için kullanın, cezalandırıcı bir uyarı olarak değil. Cihazın kablolarını hasar olup olmadığını kontrol edin ve kısa devre ile elektrik şoku yaralanmalarını önlemek için operasyondan önce elektrot teması iyi olduğundan emin olun.
  2. Aklimatizasyon Eğitimi
    1. Yorgunluk cihazının döner tekerlek odalarının temiz, kuru ve kalıntıdan arınmış olduğundan emin olun. Potansiyel uyarımla ilgili stresi ortadan kaldırmak için tekerlek girişindeki elektriksel uyarım elektrotlarını devre dışı bırakın.
    2. Her fareyi kuyruğun tabanından nazikçe tutun veya steril yumuşak doku kullanarak alın. Fareleri dönen çarkın çalışma yüzeyinin merkezi bölgesine tek tek yerleştirin.
    3. Fareyi yatay koşu yüzeyinde doğal bir dört ayaklı ayakta pozisyona getirin. Gövdeyi tekerleğin orta dönme eksenine paralel şekilde konumlandırın; ön patiler ileri, arka patiler biraz geriye doğru olsun.
    4. İlk 2 dakika boyunca farenin dar elektrot bölgesine girmesini önlemek için geçici ve kısıtlayıcı olmayan yumuşak bir bariyer kullanın. Bu süre sonunda bariyeri kaldırarak farenin tüm odayı özgürce keşfetmesine izin verin.
    5. Fareleri ilk 3 gün boyunca günde 10 dakika sabit cihazda bırakın. Bu süre zarfında tekerlek dönmesini başlatmayın veya herhangi bir elektriksel uyarım başlatmayın.
    6. Fareyi sürekli donma veya aşırı kalkma gibi şiddetli stres belirtileri için izleyin. Eğer anormal davranış gösterirse, fareyi nazikçe merkezi tekerlek bölgesine yerleştirerek doğal bir duruşu geri kazandırın.
    7. 4. gün direksiyonu 5 devirde çalıştırın, 30 dakika sürer. Bu adım, fareleri elektrikli ipuçları kullanmadan cihazın hareket ritmine alıştırır.
    8. Ritmik adaptasyon aşamasında fareler düşerse veya durursa onları manuel olarak çarkın merkezine geri yönlendirin. Elektrik uyarımının 4 günlük aklimatizasyon süresi boyunca deaktiv kaldığından emin olun.
      DIKKAT: Korkudan kaynaklanan stres tepkilerini önlemek ve gelecekteki eğitim uyumunu sağlamak için aklimatizasyon aşamasında elektriksel uyarı kullanmaktan kaçının.
  3. Resmi Tatbikat İdamı
    1. Resmi eğitimi her gün sabit bir saatte (örneğin, 09:00–11:00) gerçekleştirin. Fareleri rotator tipi yorgunluk cihazına yerleştirmek için yalıtımlı eldiven takın.
    2. Cihaz kapısını kapat. Önceden ayarlanmış parametreleri 12 rpm'de (~0.063 m/s) başlatın ve seans başına maksimum 2 saat sürecek şekilde ( bkz. Şekil 1).
      DIKKAT: Eğitim sırasında fareleri sürekli izleyin. Fare sürekli düşerse (1 dakika içinde 3 kezden fazla) antrenmanı 5 dakika durdurun; böylece şiddetli yorgunluk ve stres kaynaklı yaralanmaları önleyin.
  4. Yorgunluk Nokta Belirleme ve Uyarım
    1. Fareleri sürekli izleyerek yorgunluk durumlarını değerlendirin. Aşırı stresi önlemek için bir fare dört özel yorgunluk kriterinden en az ikisini karşılıyorsa, antrenman seansını tam 2 saat süresine zorlamadan erken sonlandırın.
    2. Kriter 1'i, düşmeden önce tekerlekte 5 saniyeden fazla kalamamak olarak tanımlayın. Kriter 2'yi, 1 dakika içinde 3 veya daha fazla kez düşme sıklığının önemli ölçüde artması olarak tanımlayın.
    3. Kriter 3'ü, farenin elektriksel uyarıma rağmen hareketsiz kaldığı veya sadece kısa bir süre hareket ettiği tekerlekle dönme niyetinin olmaması olarak tanımlayın.
    4. Kriter 4'ü anormal hareket duruşlarının sunumu olarak tanımlayın. Uzuvların sürüklenmesi veya sersemlemiş yürüyüş gibi bariz işaretlere dikkat edin.
    5. Fare spiner girişine düştüğünde cihazın otomatik olarak hafif bir elektriksel uyarı tetiklemesine izin verin. Fare tekerleğedöndüğünde elektriksel uyarının hemen durduğundan emin olun.
      DIKKAT: Fare kasılma veya nefes sefne gibi anormal durumlar gösterirse eğitimi derhal sonlandırın. Faresi cihazdan çıkarın ve gerekirse semptomatik tedavi verin.
  5. Eğitim Sonrası İşlem ve Sıklık
    1. Eğitim bittikten sonra cihazın gücünü kapatın. Fareleri çıkarıp yuvalarına geri getirmek için yalıtımlı eldiven takın.
    2. Farelere yeterli içme suyu sağla. Hayvanları herhangi bir anormal aktivite, ruhsal durum veya uzuv sorunları (örneğin klodikasyon veya kas titremeleri) açısından gözlemleyin.
    3. Herhangi bir anormalliği kaydedin ve zamanında tedavi verin.
    4. Bu antrenman sıklığını günde bir kez, seansta 2 saat olarak, 4 hafta ardışık olarak koruyun. Eğitim parametrelerini ve güvenlik izlemesini tüm süre boyunca tutarlı tutun.
      NOT: Her günlük eğitim seansından önce yorgunluk cihazı ve elektrik uyarım modülünün düzgün çalıştığından emin olun ve böylece uyarım yoğunluğu tutarlı hale getirilir.

4. Yürüyüş Analizi

  1. Sistem Genel Bakış
    1. Yürüş algılama ve analizini otomatik bir yürüyüş görüntüleme sistemi kullanarak gerçekleştirin.
    2. 4 haftalık modelleme sürecinden sonra 32 adet 10 haftalık C57BL/6 faresinde tüm yürüyüş prosedürlerini uygular.
    3. Yüksek hızlı kamerayı şeffaf koşu bandı kayışının altına yerleştirerek hareket sırasında ventral görüntüler yakalayın.
  2. Aklimatizasyon ve Kurulum
    1. Tüm fareleri resmi veri toplamadan önce koşu bandı cihazına alıştırarak stresi en aza indirin.
    2. Koşu bandı hızını farelerin fizyolojik yürüyüş temposuna uydurmak için 20 cm/s olarak ayarlayın.
    3. Her fare için üç bağımsız geçerli deneme kaydedilecek ve denemeler arasında 2 dakikalık dinlenme aralı bir süre var.
  3. Deneme Kaydı ve Tempo Seçimi
    1. Her deneme sırasında farenin 60 saniyelik bir tutma süresi boyunca kesintisiz yürümesine izin verin.
    2. Bir kayıt "donma", zıplama veya dönüş nedeniyle geçersizse, bir yedek deneme gerçekleştirin.
    3. Veri toplama süreci yalnızca fare en az 10 saniye boyunca istikrarlı ve tutarlı hareket etmeye ulaştıktan sonra başlatın.
    4. Analiz için her 60 saniyelik denemeden en az 4 ardışık tam adımı seçin.
    5. Öznel önyargıyı ortadan kaldırmak için adımı iki bağımsız kör gözlemcinin gerçekleştirdiğinden emin olun.
    6. Farenin doğal dört ayak duruşunu atlamadan veya ani hız dalgalanmaları olmadan koruduğunu doğrulayın.
    7. Adımın hem ağırlık taşıyan duruş aşaması hem de ileri itme hareketi aşaması içerdiğinden emin olun.
    8. Takip kaybı, bulanıklık veya kirlenme olmadan net pati-kemer temas görüntüleri için kontrol edin.
  4. Görüntü İşleme ve Parametre Çıkarma
    1. Sistem yazılımının yerleşik algoritmalarını kullanarak yakalanan görüntüleri dijitalleştirin ve pati-kemer temas noktalarını tespit edin.
    2. Salınım/duruş oranını, salınım fazı süresi ile duruş fazı süresi arasındaki oran olarak hesaplayın.
    3. Adım uzunluğunu (cm) tek bir tam adımda kat edilen doğrusal mesafe olarak ölçin.
    4. Adım genişliğini (cm) karşılıklı arka patilerin medial kenarları arasındaki yatay mesafe olarak ölçün.
    5. Maksimum ağırlık taşımada toplam temas alanını temsil eden en yüksek duruşta (cm2) Paw alanını belirleyin.
    6. Paw alan değişkenliğini (cm2) temas alanının ardışık adımlar boyunca varyasyon katsayısı olarak hesaplayın.
    7. Her fare için geçerli 3 geçerli denemenin ortalama değerini hesaplayın ve nihai veri setlerini dışa aktarın.
      NOT: Düzensiz durma, zıplama veya dönme davranışları içeren denemeleri analizden hariç tutun.

5. Histoloji

  1. Doku Toplama ve Fiksasyon
    1. Tüm fareleri 4 haftalık indüksiyon döneminden sonra servikal dislokasyon yoluyla insancıl bir şekilde ötenazi yapın. Sol diz eklemini dikkatlice disseksiye edin ve çevresindeki fazla yumuşak dokuyu çıkarın.
    2. Numuneyi hemen önceden soğutulmuş %4 paraformaldehit (PFA) fiksatif (w/v) içine batırın. Dokuyu tamamen batırmak için fiksatif hacminin örnek hacmasının 10–15 katı olduğundan emin olun.
    3. Mendiliyi oda sıcaklığında 48 saat sabitleyin. Fiksasyon kabını her 8 saatte bir hafifçe karıştırarak yeterli sabitleyici penetrasyonu sağlayın.
  2. Doku Kalsifikasyonu
    1. Sabit numuneyi yavaşça akan suyla 10 dakika boyunca durulayın. Bu durulama işlemini üç kez tekrarlayarak kalan PFA'yı çıkarabilirsiniz.
    2. Örneği 0.5 mol/L etilenidiamintetraasetik asit (EDTA) kalsifikasyon çözeltisine (pH 7.2–7.4) aktarın. Dekalsifikasyon çözeltisi hacmini örnek hacminin 20 katında tutun ve 4 °C'de depolayın.
    3. Dokuyu 14–21 gün boyunca kalsifiye eder. Eski sıvıyı her 3 günde bir taze EDTA kireçlenme çözeltisi ile değiştirin.
    4. Dekalsifikasyon noktasını steril bir iğneyle subkondral kemiği nazikçe delerek test edin. İğne dirençsiz pürüzsüz bir şekilde deldiğinde kalsifikasyon sürecini sonlandırın.
    5. Tamamen kalsifiye edilmiş örneği 2 saat boyunca akan suyun altında yıkayarak kalan EDTA'yı çıkarabilirsiniz. Numuneyi fosfatla tamponlanmış tuzlu su (PBS) ile üç kez, her biri 5 dakika boyunca yıkayın.
  3. Gömme ve Kesimleme
    1. Kireçsizleştirilmiş örneği sıralı olarak derecelendirilmiş etanol serisi ile kurutun (%70, %80 ve %90, her biri 2 saat; %95 1 saat; mutlak etanol iki kez 1 saat süre).
    2. Ksilen içindeki kurutulmuş dokuyu iki kez, her biri 10 dakika boyunca temizleyin. Temizlenmiş dokuyu parafine gömürün.
    3. Parafinle gömülü dokuyu mikrotom kullanarak 5 μm kalınlığında sagital sürekli kesitlere kesin. Bölümleri poli-L-lizin kaplamalı cam slaytlara monte edin ve 60 °C'de 2 saat boyunca sürgü kurutma sıcak plakasında pişirin.
  4. Histomorfolojik Değerlendirme
    1. Kesitleri safranin O-fast yeşile boyanarak eklem kıkırdak histomorfolojisini değerlendirin.
    2. Çift kör koşullarda Osteoartrit Araştırma Derneği (OARSI) puanlama sistemi kullanılarak kıkırdak dejenerasyonunudeğerlendirmek 12.
  5. İmmünohistokimya (IHC) Çekirdek İş Akışı
    1. Ksilen içindeki bölümleri iki kez, her biri 10 dakika boyunca deparaffize edin. Bölümleri sıralı olarak derecelendirilmiş etanol serisi ile deiyonize suya yeniden nemlendirin.
    2. Mikrodalga kaynaklı ısı epitopu geri almak için bölümleri 0.01 mol/L sitrat tamponuna (pH 6.0) daldırın. Tamponu yüksek güçte kaynatın, ardından orta güçte 15 dakika boyunca nazikçe kaynatın.
    3. Bölümleri doğal olarak oda sıcaklığına soğutun. Slaytları PBS ile üç kez, her biri 5 dakika boyunca yıkayın
    4. Kesitleri, endogen peroksidaz aktivitesini engellemek için oda sıcaklığında %3 hidrojen peroksit (H2O2) metanol çözeltisinde 20 dakika kuluçka yapın. Slaytları PBS ile üç kez, her biri 5 dakika boyunca yıka.
    5. Bölümlere %5 keçi serumu bloklayıcı çözelti uygulayın. Oda sıcaklığında 60 dakika kuluçka yapın, spesifik olmayan bağlanma noktalarını engellemek için.
    6. Tıkama çözeltisini yıkamadan ayıklayın. Spesifik birincil antikor çalışma çözeltisini (Geçici Reseptör Potansiyeli Vanilloid 4 (TRPV4) 1:100, Caspase-3 1:200 veya 1:150 seyreltme ile Collagen Type II Alpha 1 (COL2A1) uygulanır).
    7. Birincil antikorla birlikte bölümleri 4 °C'de nemlendirilmiş bir odada gece boyunca 12–16 saat boyunca kuluçka edin.
    8. Ertesi gün bölümleri oda sıcaklığında 30 dakika dengeleyin, ardından PBS ile üç kez, her biri 5 dakika boyunca yıkayın. Bir yaban turpu peroksidaz (HRP) ile konjuge edilmiş keçi anti-tavşan anti-veya anti-fare IgG ikincil antikoru (1:500 seyreltme) uygulayın.
    9. Bölümleri ikincil antikorla oda sıcaklığında 60 dakika kuluçka yapın. Slaytları PBS ile üç kez, her biri 5 dakika boyunca yıka.
    10. 3,3'-diaminobenzidin (DAB) kromojen çözeltisi uygulayın ve oda sıcaklığında 3–5 dakika karanlıkta kuluçka yapın. Mikroskobik gözlem altında berrak kahverengi sinyal belirdiğinde reaksiyonu hemen deiyonize su ile durdurun.
    11. Bölümleri hematoksilin çözeltisiyle 5 dakika boyunca karşı boya yapın. Lekenin mavi olması için akan suyun altında 10 dakika durulayın.
    12. Bölümleri 30 saniye boyunca %1 asit alkol çözeltisi kullanarak ayırt edin. Kaymaları akan suyun altında 5 dakika durulayın.
    13. Kesitleri derecelendirilmiş etanol serisiyle hızlıca kurutun ve dokuyu ksilen içinde iki kez, her biri 10 dakika boyunca temizleyin.
    14. Slaytları nötr balsam ile monte edin ve optik reçine kapak kapaklarıyla örtün. Monte edilmiş kaydırakların oda sıcaklığında kurumasına izin verin.
  6. IHC Kontrolleri ve Görüntü Analizi
    1. Boyama işlemi sırasında birincil antikoru PBS ile değiştirerek negatif kontrol kurun. Antikor etkinliğini doğrulamak için pozitif kontrol olarak bilinen bir kıkırdak dokusu kesitini ekleyin.
    2. Boyalı kesit görüntülerini 40× ve 100× büyütmelerde tam bir slayt tarayıcı ile alın.
      NOT: Tüm histolojik değerlendirmeleri en az iki kör gözlemci tarafından bağımsız olarak yapılarak öznel yanlılığı azaltmak.

6. İstatistiksel Analiz

  1. Veri İşleme ve Genel Test
    1. Tüm veri toplama ve analizleri kör koşullarda yapılarak deneysel yanlılığı en aza indirin.
    2. Dört deneysel grup arasındaki sürekli değişkenleri, tek yönlü varyans analizi (ANOVA) kullanarak genel farkları test etmek için analiz edin.
    3. Kruskal-Wallis H testini, gerekli parametrik varsayımları karşılamayan herhangi bir değişkene uygulanır.
  2. Sonradan Testler ve Anlamlılık Eşikleri
    1. Başlangıçtaki ANOVA istatistiksel anlamlılığı gösteriyorsa spesifik grup farklılıklarını belirlemek için Tukey testini kullanarak sonradan çift karşılaştırmalar yapın.
    2. Aile bazında hata oranını kontrol etmek için sadece Tukey testine güvenin. Bunu ek çoklu karşılaştırma düzeltme yöntemleriyle birleştirmeyin.
    3. İstatistiksel anlamlılığı p < 0.05 olarak tekiz şekilde tanımlayın

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yürüyüş Analizi
Yürüyüş döngüsü parametreleri: Ağırlık taşımayan sallanma fazının süresi ile tek adımın ağırlık taşıyan duruş fazının oranı olarak tanımlanan salınım/duruş oranı—ağırlık taşıma ve itiş dengesini yansıtacak şekilde değerlendirildi. Kontrol grubuna (2,10 ± 0,06) kıyasla, eklem içi kollagenaz enjeksiyonu alan (1,45 ± 0,05) veya aşırı egzersiz yapan (1,68 ± 0,05) farelerde sallanma/duruş oranları anlamlı şekilde daha düşüktür. Bu azalmanın en belirgin şeki...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışmada, eklem üzerindeki aşırı stresin etkilerini, eklem içi kollagenaz enjeksiyonunu tekerlek tabanlı yorgunluk tetikleyen egzersiz eğitimiyle birleştirerek taklit eden yeni bir KOA fare modeli geliştirdik. Bu bulgular, KOA'nın biyolojik ve mekanik faktörlerin etkileşiminden kaynaklandığı fikrini bir kez daha doğrulamaktadır. Bu faktörlerin anlaşılması ve tanımlanması, diz osteoartritli bireylerin semptomlarını hafifletmek ve yaşam kalitesini artırmak için bireysel tedavi planları...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların beyan edecek çıkar çatışmaları yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, katılımcılara zaman ve çabaları için hem-de çalışmadaki tüm hayvanlara teşekkür etmek ister. Bu çalışma, hanghai Yueyang Hastanesi Ruian Şubesi Ana Disiplin İnşaat Teşvik Fonu - Tuina Bölümü [QY71.42.06] ve Tuina Ulusal Geleneksel Çin Tıbbı Yüksek Düzey Ana Disiplin - Bilim [zyyzdxk -2023061] tarafından desteklendi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
%4 Paraformaldehit fiksativeBeyotimeP0099
Asetik asitSinopharm631-61-8
Fareler için DigiGait görüntüleme sistemiRWD Yaşam BilimleriMSI-DIG-MS
EDTA çözümüProcellPB180320
Kaset gömülüLeicaIP C
EtanolSinopharm64-17-5
Hızlı yeşil lekeLeyan1085995
Tüy alma kremiVeetG20161330
HematoksilinAdamas61753A
Yüksek hızlı soğutmalı santrifüjHermleZ366K
Kuluçka makinesiTAITECM-210FN
Shalasyon anestezi makinesiKorucuRZ-Viking
İzofluranWebiow100
MikrotomTed Pella10180-220
Fare rotator tipi yorgunluk cihazıPekin Zhishu Duobao Biyolojik TeknolojisiYLS-10B
Nötr balsamSinopharm96949-21-2
Safranin O lekesiBiyografiS0062
Yarı otomatik doku göme merkeziThermo FisherHistoStar
Sürgü kurutma sıcak plakasıElektron Mikroskopi BilimleriXH-2002
Doku yüzdürme su banyosuBIYOBAZBT-I
Tip II kollagenazSigma-AldrichC4-22-1G
Tüm kaydırma tarayıcıLeicaAperio VERSA
KsilenSinopharm1330-20-7

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Friedman, B., et al. Adenosine A2A receptor signaling promotes FoxO associated autophagy in chondrocytes. Scientific Reports. 11, 968-968 (2021).
  2. O'Brien, P., et al. What are the patient factors that impact on decisions to progress to total knee replacement? BMJ Open. 9, e031310-e031310 (2019).
  3. Amirkhizi, F., et al. Higher dietary phytochemical index is associated with lower odds of knee osteoarthritis. Scientific Reports. 12, 9059-9059 (2022).
  4. Liu, Q., et al. Effects of mechanical stress on chondrocyte phenotype and chondrocyte extracellular matrix expression. Scientific Reports. 6, 37268-37268 (2016).
  5. Halonen, K. S., et al. Workflow assessing the effect of gait alterations on stresses in the medial tibial cartilage. Scientific Reports. 7, 17396-17396 (2017).
  6. Xu, L., Kazezian, Z., Pitsillides, A. A., Bull, A. M. J. A synoptic literature review of animal models for investigating the biomechanics of knee osteoarthritis. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 12, 1408015-1408015 (2024).
  7. Kim, J. E., et al. Development and characterization of various osteoarthritis models for tissue engineering. PLoS One. 13, e0194288-e0194288 (2018).
  8. Lampropoulou-Adamidou, K., et al. Useful animal models for the research of osteoarthritis. European Journal of Orthopaedic Surgery & Traumatology. 24, 263-271 (2014).
  9. Park, J., et al. A pathophysiological validation of collagenase II-induced biochemical osteoarthritis animal model in rabbit. Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 15, 437-444 (2018).
  10. van der Kraan, P. M., et al. Degenerative knee joint lesions in mice after a single intra-articular collagenase injection. Journal of Experimental Pathology. 71, 19-31 (1990).
  11. Li, J. A mouse model of osteoarthritis originating from lateral instability of the ankle joint. , Suzhou University. (2017).
  12. Glasson, S. S., et al. The OARSI histopathology initiative - recommendations for histological assessments of osteoarthritis in the mouse. Osteoarthritis and Cartilage. 18, Suppl 3. S17-S23 (2010).
  13. Perera, J. R., Gikas, P. D., Bentley, G. The present state of treatments for articular cartilage defects in the knee. Annals of the Royal College of Surgeons of England. 94, 381-387 (2012).
  14. Zhang, J., et al. Tetrahydrohyperforin prevents articular cartilage degeneration and affects autophagy in rats with osteoarthritis. Experimental and Therapeutic Medicine. 15, 5261-5268 (2018).
  15. Sun, Y., Wang, C., Gong, C. Repairing effects of glucosamine sulfate in combination with etoricoxib on articular cartilages of knee osteoarthritis. Journal of Orthopaedic Surgery and Research. 15, 150-150 (2020).
  16. Spender, J. K. On some hitherto undescribed symptoms in the early history of osteoarthritis: the so-called rheumatoid arthritis. British Medical Journal. 1, 781-783 (1888).
  17. Bannuru, R. R., et al. OARSI guidelines for the non-surgical management of knee, hip, and polyarticular osteoarthritis. Osteoarthritis and Cartilage. 27, 1578-1589 (2019).
  18. Felson, D. T. Osteoarthritis as a disease of mechanics. Osteoarthritis and Cartilage. 21, 10-15 (2013).
  19. van Tunen, J. A. C., et al. Association of malalignment, muscular dysfunction, and abnormal joint loading with tibiofemoral knee osteoarthritis. BMC Musculoskeletal Disorders. 19, 273-273 (2018).
  20. Zhang, L., et al. Knee joint biomechanics in physiological conditions and how pathologies can affect it: a systematic review. Applied Bionics and Biomechanics. 2020, 7451683-7451683 (2020).
  21. Amin, S., et al. Knee adduction moment and development of chronic knee pain in elders. Arthritis and Rheumatism. 51, 371-376 (2004).
  22. Foroughi, N., Smith, R., Vanwanseele, B. The association of external knee adduction moment with biomechanical variables in osteoarthritis. The Knee. 16, 303-309 (2009).
  23. Henak, C. R., Anderson, A. E., Weiss, J. A. Subject-specific analysis of joint contact mechanics: application to the study of osteoarthritis. Journal of Biomechanical Engineering. 135, 021003-021003 (2013).
  24. Menge, T. J., et al. Anterior horn meniscal repair using an outside-in suture technique. Arthroscopy Techniques. 5, e1111-e1116 (2016).
  25. Zhang, J., et al. Feasibility study of early prediction of postoperative MRI findings for knee stability after ACL reconstruction. BMC Musculoskeletal Disorders. 22, 649-649 (2021).
  26. Kawada, M., et al. Contribution of hip and knee muscles to lateral knee stability during gait. Journal of Physical Therapy Science. 32, 729-734 (2020).
  27. Shim, J. K., Choi, H. S., Shin, J. H. Effects of neuromuscular training on knee joint stability after anterior cruciate ligament reconstruction. Journal of Physical Therapy Science. 27, 3613-3617 (2015).
  28. Hirschmüller, A., et al. Rehabilitation before regenerative cartilage knee surgery: a new prehabilitation guideline. Archives of Orthopaedic and Trauma Surgery. 139, 217-230 (2019).
  29. Hartmann, H., Wirth, K., Klusemann, M. Analysis of the load on the knee joint and vertebral column with changes in squatting depth. Sports Medicine. 43, 993-1008 (2013).
  30. Fong, I. C. D., et al. Effect of foot progression angle adjustment on the knee adduction moment in runners with knee osteoarthritis. Gait & Posture. 61, 34-39 (2018).
  31. Du, J., et al. Effect of high fat diet and excessive compressive mechanical force on pathologic changes of temporomandibular joint. Scientific Reports. 10, 17457-17457 (2020).
  32. Hunt, M. A., et al. Varus thrust in medial knee osteoarthritis: quantification and effects of different gait-related interventions. Arthritis Care & Research. 63, 293-297 (2011).
  33. Christiansen, B. A., et al. Non-invasive mouse models of post-traumatic osteoarthritis. Osteoarthritis and Cartilage. 23, 1627-1638 (2015).
  34. Adães, S., et al. Intra-articular injection of collagenase in the knee of rats as an alternative model to study nociception. Arthritis Research & Therapy. 16, R10-R10 (2014).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Kollagenaz EnjeksiyonuK k rdak DegenerasyonuY r y AnaliziHistolojik De erlendirmeTRPV4 EkspresyonuCOL2A1 AzalmasOsteoartrit Modeli

İlgili makaleler