Intrakraniyal Meme Kanseri Beyin Metastazları Fare Modeli: Meninges ve Koku Bulb'da Bağışıklık ve Stromal Hücrelerin Karakterizasyonu İçin

Özet

Protokol, meme kanseri beyin metastazlarını intrakraniyal aşılama yoluyla belirler ve akış sitometrisiyle beyin bağışıklığını düzenleyen anahtar lenfatik ve bağışıklık hücresi alt setlerini karakterize eder. Bu analizler, beyin mikro ortamını şekillendiren bağışıklık ve stromal hücre dinamikleri hakkında içgörüler sağlar ve yeni terapötik stratejilerin geliştirilmesini sağlar.

Özet

Merkezi sinir sistemi (MSS), meninges ve koklu soğan dahil olmak üzere özel bağışıklık arayüzleriyle çevrilidir; bu arayüzler hem metastatik kolonizasyon için izin verici yollar hem de anti-tümör bağışıklık yanıtları için giriş noktası olarak hizmet edebilir. Metastatik ilerleme sırasında bağışıklık hücresi dinamiklerinin bu yapılar içinde nasıl evrildiğini anlamak, beyinde tümör büyümesini destekleyen veya kısıtlayan mekanizmaları belirlemek için gereklidir. Bu protokol, C57BL/6 farelerine E0771 meme kanseri hücrelerinin intrakraniyal enjeksiyonu yoluyla meme kanseri beyin metastazları (BCBM) fare modelinin kurulmasını detaylandırır. Tümör gelişiminden sonra, meninges ve koklu bulb dikkatlice parçalanır, enzimatik olarak sindirilir ve tek hücreli süspansiyonlara işlenir. Bu popülasyonlar, daha sonra çok parametrik spektral akış sitometrisi kullanılarak analiz edilerek CNS ile ilişkili bağışıklık nişlerinde limfoid, miyeloid ve stromal hücre alt kümelerini kapsamlı şekilde karakterize eder. Bu iş akışı, tümör taşıyan ve tümör dışı kontroller arasında karşılaştırmalı analizler yapılmasını sağlar; TSS bağışıklık arayüzlerinde tümör immün kaçamasının temelini oluşturabilecek ve potansiyel terapötik hedefleri temsil edebilecek değişiklikleri tespit eder. Genel olarak, protokol BCBM'yi incelemek ve CNS-periferik bağışıklık sistemi arayüzlerinde bağışıklık regülasyonunu sorgulamak için tekrarlanabilir bir yaklaşım sunar. Ek kanser hücre hatları, immünoterapiler veya genetik fare modelleri için uyarlanabilir; böylece beyin mikroçevresinde bağışıklık direnci mekanizmaları ve terapötik yanıt incelenebilir.

Giriş

Beyin metastazları, merkezi sinir sistemini (MSS) etkileyen en yaygın kötü huylu tümörler olup, primer beyin tümörlerinden daha sık görülür. Akciğer kanseri, meme kanseri ve melanom, beyne en sık metastaz yapan birincil^{kanserlerdir 1}. Bunlar arasında, meme kanseri beyin metastazları (BCBM), metastatik hastalıklı hastaların %10–%30'unu etkileyen ve gelişmiş sistemik tedaviler ile nörogörüntülemedeki ilerlemeler nedeniyle artan insidans oranı gösteren büyük bir klinik^zorluktur. BCBM hastalarının prognozu kötü kalır; mevcut tedaviler – cerrahi, radyoterapi ve kemoterapi dahil – büyük ölçüde palyatif ve nörolojik semptomlar yaşam kalitesini ciddi şekilde etkiler³. Hedefli tedaviler ve immünoterapiler tamamlayıcı stratejiler olarak araştırılsa da, beyin metastazlarında immünoterapinin klinik faydası sınırlıdır ^4,5,6.

Son çalışmalar, beyin bağışıklığı anlayışımızı geliştirdi ve^{meninges 7} ve burun mukozasındaki lenfa damarları dahil olmak üzere MSS ile ilişkili fonksiyonel lenfatik^yollara yeniden ilgi duydu. Bu yapılar, beyni çevreleyen ve koku bulb ile kribriform plakaya bitişik uzanan sürekli bir lenfatik ağ oluşturur ve nihayetinde servikal lenf düğümlerine bağlanır. Bu sistem, sıvı homeostazında, bağışıklık gözetiminde ve MSS ile periferik lenfoid organlar arasında bağışıklık hücresi ticaretinde kilit roller^{oynar 9}. Beyin tümörleri ve metastazlar için immünoterapi yaklaşımlarına ilgi arttıkça, bu lenfatik-immün arayüzler, sistemik bağışıklığın intrakraniyal lezyonlarla iletişim kurabileceği umut verici ancak hâlâ az incelenmiş yollar olarak ortaya çıkmaktadır. Ayrıca, bağışıklık hücrelerinin beyin tümörü mikro ortamına katılımını yöneten mekanizmalar ve bu hücrelerin bu benzersiz ortamda nasıl etkileşime girdiği de hâlâ yeterince anlaşılmamaktadır. Bu boşluklar, tümör-immün etkileşimlerinin kapsamlı analizini mümkün kılan ve beyin metastazlarına karşı anti-tümör bağışıklığını iyileştirmek için stratejilerin geliştirilmesini destekleyen preklinik modeller ve prosedürlere olan ihtiyacı vurgular.

Burada, E0771 hücrelerinin stereotaksik intrakraniyal aşılanması yoluyla tekrarlanabilir, immünokompetif BCBM fare modelinin oluşturulmasını, meninges ve koku bulbuğunun izolasyonu ve ayrıştırılması ile spektral akış sitometrisiyle immünofenotipleme için birleştiren bir protokolü tanımlıyoruz. Bu yaklaşım, terapötik müdahalelerin güvenliği ve etkinliğini değerlendirmek için BCBM'nin kontrollü modellemesini sağlar ve beyin lenfatik-immün arayüzündeki bağışıklık ve stromal popülasyonların derinlemesine karakterizasyonunu sağlar; beyin tümörü mikroçevresini şekillendiren ve tedavi yanıtlarını etkileyen hücresel oyuncular hakkında içgörü sağlar.

Hayvan modelleri, metastazların incelenmesinde vazgeçilmez olmaya devam etmektedir; çünkü metastatik ilerlemenin birçok kritik yönü in vitro çoğaltılamamaktadır. Beyin metastazları üretmek için çeşitli in vivo fare modelleri geliştirilmiştir ve her birinin kendine özgü avantajları ve sınırlamaları^{vardır 10}. Ortotopik implantasyon veya genetik olarak tasarlanmış fare modelleri dahil olmak üzere spontan metastaz modelleri, klinik hastalık ilerlemesini daha yakından taklit eder ancak nadiren intrakraniyal lezyonlar oluşturur, uzun deneysel zaman çizelgeleri gerektirir ve yaygın ekstrakraniyal hastalık nedeniyle genellikle yüksek değişkenlik sağlar. İntrakardiyak, intrakarotis veya kuyruk damar enjeksiyonları gibi sistemik yaklaşımlar, tümör hücrelerini dolaşıma dahil eder ve hematojen yayımı, kan-beyin bariyeri ekstravazasyonunu ve kolonizasyonu daha iyi taklit eder. Ancak, bu modeller primer tümör invaziyasının erken aşamalarını yakalamaz ve özellikle akciğerlerde sık sık geniş ve değişken ekstrakraniyal metastazlar üretir. Sistemik modeller arasında intrakarotis enjeksiyonu en düşük değişkenliğe sahiptir, ancak ileri cerrahi uzmanlık gerektirir. Alternatif olarak, intrakraniyal enjeksiyon tümör konumunun hassas kontrolü, hızlı ve tekrarlanabilir tümör gelişimi ve deneyler arasındaki değişkenliği azaltmak gibi çeşitli avantajlar sunar. Bu yaklaşım, metastatik süreci daha doğru taklit etmek için ortotopik primer tümör implantasyonu ve ardından cerrahi rezeksiyonla da desteklenebilir. Kafayası içi enjeksiyon, tam metastatik kaskadı özetlemese ve erken istila ile yayılma çalışmaları için uygun olmasa da, yerleşik lezyonlara karşı terapötik etkinliği değerlendirmek ve beyin mikroçevresindeki etkileşimleri araştırmak için sağlam bir model sunar. Bilinen bir sınırlama, enjeksiyonun kendisinin yerel nöroinflamasyonu tetikleyebilmesi, bu da enjekte edilen ve enjekte edilmemiş farelerde bağışıklık profillerinin karşılaştırılmasıyla değerlendirilebilen bağışıklık gösterimlerini etkileyebilir.

Meninges ve koku soğanının bağışıklık karakterizasyonu, nispeten yeni ve az araştırılmış bir araştırma alanı olarak kalmaktadır. Çoğu çalışma, tüm beyin veya servikal lenf düğümü^{örneklerine dayanır ve} bu örnekler, bu lenfatik dokuların belirgin hücresel bileşimini ve özel bağışıklık fonksiyonlarını yakalayamaz. Her iki yapının da geri kazanılması, beyin bağışıklığı hakkında daha geniş ve bilgilendirici bir bakış sunar. Çok parametrik spektral akış sitometrisiyle birleştiğinde, bu iş akışı CNS-periferik bağışıklık iletişiminde yer alan bol ve nadir bağışıklık hücresi popülasyonlarının yüksek verimli profilini destekler. Bu, hücre alt kümelerini tanımlamak, aktivasyon durumlarını değerlendirmek ve tedavi kaynaklı değişiklikleri değerlendirmek için yüzey ve hücre içi belirteçlerin nicelendirilmesini içerir. Bu protokol kapsama almayan diğer CNS bağışıklık analizi metodolojileri arasında, bağışıklık hücrelerinin mekansal dağılımını koruyan ancak düşük belirteç çoklaması, öznel niceliklendirme ve nadir hücre^{tiplerinin 12} az temsil edilmesi nedeniyle sınırlanan immünohistokimya (IHC) ve immünoflüoresans (IF) bulunur. Daha yakın zamanda, tek hücreli RNA dizileme (scRNA-seq), hücresel durumların ve transkripsiyon programlarının yüksek çözünürlükte keşfedilmesini mümkün kılarak CNS bağışıklık popülasyonlarının profilini genişletmiştir. Güçlü transkriptomik içgörü sunmasına rağmen, scRNA-seq maliyet, dissosiyasyon artefaktları, transkript kesintisi ve protein seviyesinde çözünürlük^{kaybı 13,14} nedeniyle sınırlıdır. Akış sitometrisi, mekansal analizden yoksun ve dissosiyasyonla ilgili etkilere duyarlı olsa da, gelişmiş çok parametrik panel sayesinde üstün fenotipik çözünürlük sunar ve sağlam nicel bağışıklık profili sağlar.

Burada açıklanan metodolojiler birlikte, BCBM'nin modellenmesi ve CNS lenfatik arayüzlerindeki bağışıklık dinamiklerinin sorgulanması için esnek ve güçlü bir platform sağlar; hem beyin tümörü mikroçevresini hem de ilgili bağışıklık düzenleyici yollarını hedefleyen tedavilerin preklinik geliştirilmesini destekler.

Protokol

Tüm hayvan işlemleri, Lizbon Üniversitesi Eczacılık Fakültesi yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Protokoller, Portekiz hayvan koruma yetkili kurumu Direção-Geral de Alimentação e Veterinária tarafından incelenip onaylandı (Referans 0421/000/000/2021).

1. E0771 hücrelerinin in vivo implantasyon için hazırlanması

1. Steril bir başlıkta, E0771 hücrelerini Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM) ile %10 (v/v) fetal sığır serumu (FBS) ve %1 (v/v) penisilin ve streptomisin (PEST) ile takviye edilen T75 şişesinde kültürlendirin.
   1. Hücrelerin tedarikçiden alındığında STR profilleme ile doğrulandığından ve rutin testlerle mikoplazmadan arınmış olduklarının doğrulandığından emin olun. Beyin implantasyonundan önce en az 2–8 geçiş boyunca tümör hücrelerini kültürleyin.
2. İmplantasyon gününde, hücrelerin sağlıklı ve %80-90 birleştiğinden emin olun. Ortamı çıkarın ve hücreleri fosfatla tamponlanmış tuzlu (PBS) yıkayın.
3. Mataraya tripsin ekleyin ve 37 °C'de 5 dakika kuluçka yapın. Sonra, tripsini nötralize etmek ve hücreleri ayırmak için takviye ortamın (%10 v/v FBS ve %1 v/v PEST içeren DMEM) üç katı hacmi ekleyin.
4. Hücreleri bir tüpe aktarın ve oda sıcaklığında (RT) 300 x g sıcaklığında 5 dakika boyunca santrifüj yapın. Süpernatantı çıkarın ve hücre sayımı için pelleti PBS'ye tekrar askıya alın.
5. Tekrar santrifüj yapın (5 dakika boyunca 300 x g ), süpernatantı atın ve hücreleri PBS'de hayvan başına 2 μL içinde 1 x 10^{5 E0771} hücresi konsantrasyonunda yeniden süzülün. Hücre askısını tümör aşılanana kadar buzda tutun. Enjeksiyondan hemen önce hücre süspansiyonunu hazırlayın.

2. Stereotaksik bir cihazla intrakraniyal tümör aşılanması

1. Dişi C57BL/6 fareleri (6-8 haftalık) alın ve ameliyattan önce en az 7 gün boyunca hayvan tesisine alıştırın. Ev farelerini kontrollü koşullarda, 12 saatlik ışık/karanlık döngüyle tutun ve yiyecek ile su sağla.
   NOT: Tümör taşıyan ve kontrol koşulları arasında anlamlı karşılaştırmalı bağışıklık profili için yeterli istatistiksel güç sağlamak amacıyla deneysel grup başına en az beş hayvan önerilmektedir.
2. İşleme başlamadan önce cerrahi alanı ve gerekli tüm malzemeleri hazırlayın:
   1. Cerrahi aletler: bistür, makas, forseps, iğne tutucuları, dikiş teli.
   2. Ekipman ve diğerleri: stereotaksik alet, cam şırınga, matkap, tıraş makinesi, pamuk çubukları, ısıtma pedi.
   3. Anestezi: 15 mL'lik bir tüpte PBS içinde ketamin-ksilazin (K-X) (sırasıyla 25 mg/mL ve 2 mg/mL) hazırlanın.
   4. Analjezi: Buprenorfini 15 mL içinde PBS içinde 15 mL bir tüpte hazırlayın.
   5. Diğer çözeltiler: povidon-iyot, hidrojen peroksit %3 v/v (H₂O₂), oftalmik merhem.
      DIKKAT: H₂O₂ yutulduğunda zararlıdır ve cilt tahrişine neden olabilir.
3. Fareyi intraperitoneal (i.p.) K-X (10 g vücut ağırlığı başına 100 μL) enjeksiyonuyla anestezi edin. Ayak sıkıştırmasına yanıt vermeyerek yeterli anestezi doğrulayın.
4. Her iki göze de susuzluğu önlemek için oftalmik merhem sürürün ve işlem boyunca fareyi bir ısıtma pedinin üzerine koyun.
5. Saç derisini tıraş edin ve cerrahi alanı povidon-iyot ile dezenfekte edin. Orta hat boyunca 1 cm boyuna kesi yapın ve kafatasını ortaya çıkarın.
6. Açıkta kalan kafatasını pamuk çubuk ile dairesel hareketlerle H₂O₂ ile temizleyin; böylece bregma görselleştirin. Aşırı köpük oluşursa, kuru bir sürüntüyle çıkarın.
7. Fareyi stereotaksik çerçeveye yerleştirin. Bregmayı referans noktası olarak ayarlayın (0,0) ve bregmanın yanından 2,5 mm ve önünden 0,5 mm ölçün. Enjeksiyon yerini işaretleyin.
8. Fareyi çıkarın ve işaretlenen koordinatlarda küçük bir delik açın. Beyin hasarını önlemek için çok derin delmelerden kaçının.
9. Şırıngayı enjektöre takın. Hücreleri yeniden askıya alın ve cam şırıngaya iki enjeksiyon için yeterli hacim (4–5 μL) yükleyin. Hücre yerleşmesini önlemek için aynı anda ikiden fazla enjeksiyon hazırlamayın.
10. Faresi stereotaksik cihazda yeniden konumlandırın, iğneyi delikle hizalayın ve yavaşça 3,0 mm derinliğe indirin beyin parenximinde. Hücreleri (veya sahte kontrol için steril PBS) 1 μL/dakika ile enjekte edin.
11. Enjeksiyondan sonra iğneyi en az 1 dakika yerinde tutun, 1,5 mm geri çekin, bir dakika daha tutun, sonra tamamen çekin. Bu, geri akışı en aza indirir ve hücrenin doğru biriktirilmesini sağlar.
12. Kesiyi dikişlerle kapatın ve povidon-iyot uygulayın. Buprenorfin (100 μL) deri altı ile verilmelidir.
13. Anestezi sonrası tam iyileşmeye kadar fareyi bir ısıtma pedinde tutun. Fareyi temiz bir kafese geri götürün ve her gün sıkıntısı, nörolojik belirtiler veya enfeksiyon için izleyin.

3. Fare intrakardiyak perfüzyonu

1. Fareleri i.p. K-X enjeksiyonu ile anestezi edin (10 g vücut ağırlığı başına 100 μl). Ayak sıkıştırmasına yanıt vermeyerek yeterli anestezi doğrulayın.
2. Makasla karın duvarından 5–6 cm uzunluğunda bir kesi ve kaburga kafesinden köprücük kemiğine kadar iki kesi yapın. Büyük kan damarlarını kesmemeye dikkat edin.
3. Kalp açıkken, kan akışını sağlamak için sağ atriumu kesin. 25G × 1 inç iğneyle donatılmış 20 mL bir şırınga ile sol ventriküle buz gibi soğuk PBS enjekte edin.
4. Akış akışı kandan temiz olduğunda perfüzyonu durdurun. Yetişkin farelerde ise yaklaşık 20 mL PBS gerekir.

4. Fare meningelerinin ve koku soğanının izolasyonu

1. Intrakardiyak perfüzyonun ardından, fare cerrahi makasla kafasını kesin. Kafatasını açığa çıkarmak için saç derisini tamamen çıkarın.
2. Makasla, kafatasını arka bölgeden göze doğru enine düzlemde kesin, alttaki beyin dokusuna zarar vermemeye özen gösterin. İnce forseps kullanarak beyni nazikçe çıkarın, iç kafatası yüzeyine temas etmekten veya kazımaktan kaçının.
3. Beyin çıkardıktan sonra, dural meningeler iç kafatası yüzeyine bağlı kalır. Meningeslerin sağlam ayrılmasını sağlamak için kafatasını buz gibi PBS'ye en az 5 dakika batırın.
4. Koklu bulb'u beynin ön bölgesinden ayırın ve işlemeye kadar geçici depolamak üzere buz gibi soğuk PBS'ye aktarın.
5. İnce uçlu forseps kullanarak, ince doku tabakasını dikkatlice kaldırıp soyarak meningeleri iç kafatası yüzeyinden nazikçe ayırın. Meningeleri daha fazla işlem yapılana kadar buz gibi PBS'ye aktarın. Dokuyu yırtmaktan kaçının, böylece optimal aşağı akış hücre toparlanması sağlanır.

5. Tek hücrelere doku ayrışması

1. Meninges
   1. Meningsleri %0,05 kollagenaz II ve DNaz I içeren 3 mL RPMI 1640'a aktarın. 37 °C'de 20 dakika boyunca kuluçka yapın, her 10 dakikada bir nazikçe karıştırın. Aşırı sindirim hücre canlılığını azaltır ve kaçınılmalıdır.
   2. Sindirilmiş dokuyu 40 μm hücre süzgecinden 50 mL'lik bir tüpe geçirin. Kalan dokuyu mekanik olarak ayırın, şırıngalı pistonu süzgeceye nazikçe bastırarak ve 5 mL PBS ile yıkayın.
   3. Santrifüj 300 x g ile 5 dakika boyunca 4 °C'de kullanın. Süpernatantı atın ve 3 mL PBS'deki yeniden süzülen pelleti kullanın.
   4. Santrifüjasyonu tekrarlayın. Üst patronu at, kalan hacimdeki son pelleti tekrar askıya alın ve U-bottom 96 kuyu tabakasına aktarın.
2. Koku soğanı
   1. PBS'yi çıkarın ve bir şırınga pistonu kullanarak dokuyu mekanik olarak ayırın. Hanks'in dengeli tuz çözeltisine (HBSS) %0,02 kollagenaz II içeren 3 mL sindirim çözeltisi ekleyin. 37 °C'de 20 dakika kuluçka için, her 10 dakikada bir nazikçe karıştırın.
   2. Hücre süspansiyonunu 70 μm süzgeçten 50 mL'lik bir tüpten geçirin ve 10 mL PBS ile yıkayın.
   3. Santrifüj 300 x g ile 5 dakika boyunca 4 °C'de kullanın. Üst yüzeyi atın ve kalan hacimdeki son peleti tekrar askıya alın. U-bottom 96-kuyu plakasına aktarın.
3. Plakaları boyalanana kadar 4 °C'de sakla.
   NOT: Hücrenin en iyi canlılığını sağlamak için aynı gün boyama işlemi yapın.

6. Hücre boyama ve akış sitometrisi edinimi

1. Panel tasarımı
   1. Lütfen Tablo 1'e bakınız.
      NOT: Bu protokoldeki panel, 4 lazer (menekşe, mavi, sarı-yeşil ve kırmızı) ile donatılmış bir spektral akış sitometresi ve toplamda 51 dedektörle (48 floresans + 3 saçılma kanalı) tasarlanmıştır. Panel, akış sitometresinin konfigürasyonuna ve ilgilenilen proteinler/belirteçlere göre tasarlanmalıdır.
2. Hücre Boyama
   1. U-bottom 96 kuyu plakalarını 300 x g ile 5 dakika boyunca 4 °C'de santrifüjlen. Dikkatlice üst yüzeyi at. Bu adımdan itibaren, plakaları ışıktan koruyun.
   2. Uygun kuyulara 50 μL canlılık boyası (FVD, 1:5000 PBS içinde seyreltme) ekleyin ve RT'de 20 dakika kuluçka yapın. 150 μL PBS ile yıkayın, 300 x g ile 5 dakika 4 °C'de santrifüj yapın ve üst yüzeyi atın. Sadece canlılık kontrolleri ve örneklere uygulanabilirlik boyası ekleyin.
   3. Fc reseptörlerini, hücreleri 30 μL anti-CD16/CD32 antikoru (FACS tamponunda 0,01 μg/mL: PBS ile 2 mM EDTA ve %0,5 BSA) 10 dakika boyunca buzda inkubasyon ederek bloklayın. 170 μL FACS tamponu ile yıkayın, 300 x g sıcaklıkta 4 °C'de 5 dakika boyunca santrifüj yapın ve üst yüzeyi atın.
   4. 30 μL antikor karışımı veya tek renkli kontroller (Malzemeler Tablosu'nda listelenen antikor seyreltmelerine göre hazırlanır, FACS tamponunda hazırlanır) ekleyin ve buz üzerinde 20 dakika kuluçka yapın. 170 μL FACS tamponu ile yıkayın, 300 x g sıcaklıkta 4 °C'de 5 dakika boyunca santrifüj yapın ve üst yüzeyi atın.
   5. Hücreleri 100 μL 2% paraformaldehit (PFA) ile PBS'de 20 dakika RT ile sabitleyin. 100 μL PBS ile yıkayın, 300 x g ile 5 dakika boyunca 4 °C'de santrifüj yapın ve üst yüzeyi atın.
      NOT: Hücre içi belirteçler için bu adımı ticari bir tampon seti kullanılarak fiksasyon ve permeabilizasyon ile değiştirin, ardından nihai yeniden süspansiyondan önce hücre içi boyama işlemi yapılın.
   6. Son hücre pelletlerini 200 μL FACS tamponunda yeniden askıya alın. Plakaları akış sitometresinde alınana kadar 4 °C'de depolayın.
3. Tek renkli boyalı ve Floresans Minus One (FMO) kontrolleri
   1. Karıştırma optimizasyonu için tek renkli boyalı örnekler gereklidir. Hücreler, pozitif ve negatif zirveler gösteren belirteçler için tek renkli boyalı örnekler için kullanılır. Bunun dışında, optimal karışık çözme için telafi boncuklarının kullanımı tercih edilir ve önerilir. Üreticinin protokolüne göre floresan konjuge edilmiş antikorlar için telafi boncukları hazırlayın.
      NOT: FMO kontrollerinin hazırlanması, özellikle net pozitif ve negatif tepeler göstermeyen işaretleyiciler için doğru gating'i sağlamak için önemli bir adımdır. Farklı florokromlar için birden fazla FMO örneği hazırlayın.
   2. Hücre yüzeyi antijenleri için FMO örneklerini hazırlayın; Bölüm 6.2.2'deki adımları takip edin, ancak 6.2.4'te ilgi gören antikoru antikor karışımından çıkarın.
4. Akış sitometrisi edinimi ve analizi
   1. Sitometreyi AÇIN, akış sitometresi toplama yazılımını başlatın ve makine ısınırken (en az 30 dakika) kalite kontrol (QC) boncuklarını (1 damla 300 μL PBS) 12 x 75 mm numune tüpünde hazırlayın.
   2. Aleti şu şekilde temizleyin: 3 dakika %10 v/v ağartıcı, 30 dakika saat₂O yüksek akış hızında. Sonraki adımlar için akış hızını tekrar düşük seviyeye getirin.
   3. QC sekmesini seçin, tüpü yükleyin ve başlat tuşuna basarak boncukları çalıştırın. Kalite kontrol işlemi tamamlandığında, "Geçti" mesajı çıkıyor.
   4. Satın alma sekmesine gidin, deneyi seçin veya oluşturun ve FSC ve SSC başına hücreleri kapı ile başlatın. Lekesiz ve tek renkli kontroller edinin, karıştırma sihirbazını çalıştırın ve ayarları kaydedin. Boyalı örnekler almaya devam edin.

Sonuçlar

E0771 hücrelerinin intrakraniyal aşılanmasının ardından, farelerde hedeflenen stereotaksik koordinatlarda lokal bir meme kanseri lezyonu gelişti. Striatal parenkimiyi hedefleyen stereotaksik koordinatlar (2,5 mm lateral, 0,5 mm bregma önünde, bregmadan 3,0 mm ventral) standart fare beyin atlaslarına ve daha önce tanımlanmış intrakraniyal implantasyon^{yaklaşımlarına göre seçilmiştir 15,16}. Bu bölge, tümör nakletini destekleme yeteneği ve ventriküllere veya enjeksiy...

Tartışma

Kafatası içi tümör implantasyonunu, meninges ve koku soğanının izolasyonu, ayrımı ve bağışıklık karakterizasyonu ile birleştirerek, bu protokol beyin tümörü mikroçevresi ile MSS ile ilişkili bağışıklık arayüzleri arasındaki dinamik etkileşimin ayrıntılı incelenmesini sağlar. Bu yöntem, tekrarlanabilir intrakranial tümör oluşumu, yüksek kaliteli hücre süspansiyonları ve sağlam bağışıklık alt kümesi çözünürlüğü sağlar. Ancak, intrakraniyal implantasyon metastatik kaskadın erken evrelerini ...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Alexa Fluor 594 anti-mouse CD45R/B220 antibody (clone RA3-6B2)	BioLegend	103254	1:300 seyreltikte kullanılır
Alexa Fluor 700 anti-mouse CD8 antibody (clone 53-6.7)	BioLegend	100730	1:50 seyreltikte kullanılır
APC anti-mouse P2RY12 antibody (clone S16007D)	BioLegend	848006	1:80 seyreltikte kullanılır
Betadine	Selleck Biotechnology GmbH	S4678-100mg	Povidon-iyot
Bovine Serum Albumin (BSA), liofilize toz, ≥96% (agaroz jel elektroforezi)	Sigma-Aldrich	A2153	FACS Tamponu hazırlamak için
Brilliant Violet 421 anti-mouse Podoplanin antibody (clone 8.1.1)	BioLegend	127423	1:80 seyreltikte kullanılır
Brilliant Violet 510 anti-mouse CD11b antibody (clone M1/70)	BioLegend	101263	1:30 seyreltikte kullanılır
Brilliant Violet 570 anti-mouse NK1.1 antibody (clone PK136)	BioLegend	108733	1:40 seyreltikte kullanılır
Brilliant Violet 650 anti-mouse CD19 antibody (clone 6D5)	BioLegend	115541	1:50 seyreltikte kullanılır
Brilliant Violet 711 anti-mouse CD44 antibody (clone IM7)	BioLegend	103057	1:80 seyreltikte kullanılır
Brilliant Violet 785 anti-mouse F4/80 antibody (clone BM8)	BioLegend	123141	1:40 seyreltikte kullanılır
Bupaq 3 mg/mL	Bio5	1002241	Buprenorfin
Cell strainer 40-μm	Avantor	732-2757
Cell strainer 70-μm	Avantor	732-2758
Centrifuge 5910 Ri	Eppendorf	5943000011
Collagenase type II	Worthington Biochemical Corporation	LS004176
Corning Matrigel Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix	Corning	356231
Cytek Aurora Spectral Flow Cytometer	Cytek Biosciences
Dnase I	Worthington Biochemical Corporation	LS002006
Drill	Stoelting Europe	51630
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high-guclose, pyruvate	Gibco	41966029
E0771 cell line	ATCC	CRL-3436
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA)	Merck	E4884	FACS Tamponu hazırlamak için
FCS Express Flow Cytometry Software	De Novo Software
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	A5256801
FITC anti-mouse CD3 (clone 17A2)	BioLegend	100204	1:50 seyreltikte kullanılır
Ghost Dye Red 780	Cytek Biosciences	13-0865-T500	Viabilite boyası (1:5000 seyreltikte kullanılır)
HBSS, calcium, magnesium, no phenol red	Gibco	14025092
Heating Pad	MOBICLINIC
Hydrogen Peroxide 34.5 to 37% (H2O2)	ACROS	10002780
Ketamax 100 mg/mL	Bio3	1009495	Ketamine
Lubrithal Eye Gel	Bio4	1731329
N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid (HEPES) 1M	Gibco	15630080
Paraformaldehyde (PFA) 16 %	Avantor	43368	Fiksasyon Tamponu hazırlamak için
Pacific Blue anti-mouse Ly-6G antibody (clone 1A8)	BioLegend	127612	1:50 seyreltikte kullanılır
PE anti-mouse Ly-6C antibody (clone HK1.4)	BioLegend	128008	1:300 seyreltikte kullanılır
PE anti-mouse P2RY12 antibody (clone S16007D)	BioLegend	848004	1:80 seyreltikte kullanılır
PE/Cyanine5 anti-mouse CD11c antibody (clone N418)	BioLegend	117316	1:80 seyreltikte kullanılır
PE/Cyanine7 anti-mouse CD80 antibody (clone 16-10A1)	BioLegend	104734	1:100 seyreltikte kullanılır
PE-eFluor 610 anti-mouse CD31 antibody (clone 390)	eBioscience	61-0311-82	1:160 seyreltikte kullanılır
PE/Fire 810 anti-mouse I-A/I-E (clone M5/114.15.2)	BioLegend	107667	1:300 seyreltikte kullanılır
Penicillin-Streptomycin (PEST), 10 000 U/mL	Gibco	15140-122
PerCP/Cyanine5.5 anti-mouse CD45 antibody (clone 30-F11)	BioLegend	103132	1:80 seyreltikte kullanılır
Phosphate-buffered saline (PBS) 10X, pH 7.4	Gibco	70011044
Prism (version 10)	GraphPad
RN Needle (27/51/3)S	Hamilton Company	7762-01
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement	Gibco	61870044
Scalpel Blades, carbon steel	B Braun	BB510
Sedaxylan 20 mg/