Yöntem makalesi

Oksidatif Miyofiber Davranışının Değerlendirilmesi İçin Tek Lifli İzolasyon Testi

515 görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/70637

⸱

31 Mart 2026

 ,  ,  ,  , 
1Department of Health Promotion Sciences, Graduate School of Human Health Sciences, Tokyo Metropolitan University, 2Department of Immunology, Graduate School of Medicine, Juntendo University

Bu makalede

Özet

Bu protokol, oksidatif soleus'tan sağlam tek kas liflerinin izole edilmesini ve bu liflerden türetilen yüksek saf miyoblast kültürlerinin oluşturulmasını açıklar. Optimize edilmiş prosedür, fare başına yaklaşık 300–500 sağlam miyofiber elde ederek sonraki moleküler ve hücresel analizleri mümkün kılar.

Özet

İskelet kası, hareket ve genel sağlık için bütünlüğü ve işlevi için hayati öneme sahip çok çekirdekli miyofiberlerden oluşur. Sinirülsküler bozukluklarda, kas grupları hastalık türleri ve evreleri arasında farklı şekilde etkilenebilir, bu nedenle mekanik çalışmalar için temsil kaslardan canlı tek liflerin izole edilmesi önemlidir. Bu protokolün amacı, lif uzunluğu ve kırılganlığı nedeniyle ayrılması zor olan fare soleus (SOL) kasından sağlam tek miyoliflerin yüksek verimini izole etmek için güvenilir bir yöntem sağlamaktır. Kollajenaz konsantrasyonu ve sindirim süresi optimize edilerek, protokol lif kaybını en aza indirir ve dissosiyasyon sırasında canlılığı korur. Optimize edilmiş iş akışı, izole liflere kalıntı doku tutunmasını belirgin şekilde azaltır, böylece lifsiz hücrelerin taşınmasını sınırlar ve çapraz hücre kontaminasyonunu en aza indirir. Bu teknik, tek lifli analizler ile uydu hücre izolasyonu ve minimum kontaminasyon koşullarında genişleme için uygundur. Bu optimize edilmiş iş akışını kullanarak, rutin olarak ~300–500 sağlam SOL kaynaklı tek miyolif elde ediyoruz; bunlar yüksek verimlilikle immünoetiketlenebilir ve aynı zamanda minimal fibroblast kontaminasyonu ile yüksek kaliteli uydu hücre popülasyonu elde eder. Extensor Digitorum Longus (EDL) kası ile karşılaştırmalı analizler yaparak, nöromüsküler hastalık araştırmalarında tedavileri değerlendirmede kişiye özel, kas özelliğine özgü bir yaklaşımın değerini vurguluyoruz; böylece aday ilaç müdahalelerinin küçük, ayarlanabilir deneysel pencerelerde test edilmesini sağlıyoruz.

Giriş

İskelet kası, insan vücudunda en bol dokudur ve toplam vücut kütlesinin yaklaşık %40–50'sinioluşturur. İskelet kası, glikojen şeklinde bir enerji deposu olarak hizmet eder. Soğuğa maruz kalma sırasında, termogenez yoluyla ısı sağlar ve önemli olarak hareket etmesini sağlar. İskelet kası, çok çekirdekli, post-mitotik miyofiberlerden oluşur. Kas olgunlaşmasını ve onarımını sürdürmek için, iskelet kasımızın yerleşik kök hücresi olan uydu hücresi (SC) tarafından yeni miyonüküller üretilir. SC'ler, doğum sonrası iskelet kasliflerinin 2,3,4'ün çevresinde bulunur. SC'ler, hem hareketsiz hem de aktif 3,5 hallerinde ifade edilen transkripsiyon faktörü Pax7 ile tanımlanır. Yaralanma veya hipertrofik uyarılma durumunda, SC'ler MyoD'yi aktive eder ve yukarı düzenler, miyojenik programa girer, çoğalır ve nihayetinde mevcut veya yeni oluşan miyoliflerle birleşerek kas fonksiyonunu geri kazandırır 6,7,8. SC'ler, kök yetenekleri, embriyolojik kökenleri (somitik vs somitik olmayan), doğum sonrası büyüme evresi (genç vs yaşlı) ve kas bileşimi (hızlı vs yavaş lifler) açısından heterojendirler.9,10,11.

Vücudun bölgesine bağlı olarak, iskelet kasları o bölgenin enerjik ve fonksiyonel taleplerine göre uyarlanır. Kas liflerindeki bu heterojenlik, kaskı ve oksidatif kapasiteleri sayesinde mümkündür. Gerçekten de, kas lifleri yavaş seğiren oksidatif liflerden (tip I ve IIa olarak adlandırılır) ve hızlı kasılmış glikolitik liflerden (kemirgenlerde IIb olarak IIx olarak adlandırılır)12,13. Bu güzel, işlevsel lif mozaiği, günlük yaşamımızda özgürce hareket etmemizi sağlar. Örneğin, soleus (SOL) ve erector spinae gibi duruş kasları kronik, düşük seviyeli aktivasyon durumundadır ve bu nedenle yüksek oranda yavaş oksidatif tip I ve tip-IIa kas lifleri içerir. Buna karşılık, extensor digitorum longus (EDL) gibi kısa ama hızlı etkili kaslar esas olarak glikolitik tip-IIx ve tip-IIb liflerinden oluşur. Ancak lif bileşimi sabit değildir; aksine, kas lifleri, üzerlerine konan fonksiyonel gereksinimlere bağlı olarak hızlıdan yavaşa ve tersine geçiş yapabilen dinamik yapılardır. Lif tipi kasılmadaki fark, miyozin proteini içeriği nedeniyle mümkündür. Bu, iskelet kasındaki ana proteindir ve miyozin hafif ve ağırzincirlerin izoformlarından oluşur 12,14.

Bir sarkomer (kasın kuvvet üreten en küçük fonksiyonel birimi) içinde, miyozin başları ve aktin etkileşime girerek çapraz köprü olarak bilinen bir yapıyı oluşturur. ATP'nin hidrolizi sayesinde, miyozin ve aktin etkileşimlerinin döngüsüyle enerjiserbest bırakılır 15,16. Miyozin ağır zinciri (MyHC), fiber tipi tanımlamaiçin en uygun işaretleyicidir 12,13. İfade edilen MyHC'nin izoformuna bağlı olarak, kas kasılma oranı değişir. Daha önce belirtildiği gibi, tip I lifler, tip-II liflerin aksine, yavaş oksitasyonel liflerdir. Tip I baskın kas grupları oksidatif enzimlerin daha yüksek bolluğuna sahiptir, mitokondri açısından daha zengindir ve kasıperfüze etmek için yoğun bir kapiller ağına sahiptir 17,18 (maraton koşucusunu düşünün). Tip-I lifler, MYH7 geni13,19 tarafından kodlanır. Tip-II lifler yorulmaya hızlıdır, yüksek oranda glikolitik enzim içerir ve kısalma hızı daha yüksektir, bu da onları kısa süreli güç patlamaları veya hareket patlamaları için ideal kılar (güç kaldırıcıyı düşünün). Tip-IIa, IIx ve IIb (kemirgenlerde) tip-II lifleri, sırasıyla MYH2, MYH1 ve MYH4 genleri tarafındankodlanır (20,21). Şaşırtıcı olmayan bir şekilde, kas bütünlüğünü etkileyen herhangi bir patofizyolojik hakaret, lif tipi bileşimini değiştirir ve kas fonksiyonuna zarar verebilir, bu da yaşam kalitesini potansiyel olarak düşürebilir. Aslında, birçok kas distrofisi ya uydu hücresinde (uydu hücre opatileri) ya da kas lifinde (motor nöron veya kas dokusundan türemiştir) başlar ve lif tipi bileşiminde bir değişimeneden olabilir 22,23,24,25. Örneğin, omurilik yaralanması, yatak dinlenme çalışmaları ve uzay uçuşu (mikrogravitasyon), uzun süreli hareketsizliğin postural kasların yavaş bir liffenotipinden hızlı lif fenotipine (26,27,28,29,30) geçmesine neden olabileceğini göstermektedir. Buna karşılık, Duchenne kas distrofisinde, hem insan hem de fare modellerinde (mdx), hızlı glikolitik lifler daha yavaş muadillerine göre daha büyük ölçüde ve şiddetleetkilenir 31,32,33,34. Benzer şekilde, facioscapulohumeral kas distrofisinde (FSHD) hızlı ve yavaş bir seğirme geçişi gözlemlenir; tip-I liflerde daha yüksek oranda ve tip-II liflerinde daha düşük kuvvet üretimivardır 24,35,36.

Bazı kas lifi tiplerinin neden farklı hastalıklarda seçici olarak etkilendiği veya saklandığı hâlâ belirsiz. Bu desenlerin rastgele olmaması, tek lifli izolasyonun güçlü ve yaygın kullanılan bir teknik olarak ortaya çıktığı altta yatan mekanizmaların incelenmesinin önemini vurgular. Gerçekten de, Bischoff37 tarafından 80'lerin ortalarında ilk kez tanıtıldığından beri, bu vazgeçilmez araç sürekli olarak geliştirilip uyarlanarak kas biyolojisi 38,39,40'ın giderek daha hassas incelenmesini mümkün kılmıştır. Önemli olarak, tek lifli izolasyon SC'leri fizyolojik nişlerine mümkün olduğunca yakın tutar ve moleküler aktivitelerinin yeterli incelenmesini sağlar. Flexor digitorum brevis (FDB) ve EDL gibi kas grupları nispeten kolayca çıkarılabilsede 41,42,43, SOL kası sağlam liflerin zengin popülasyonunu elde etmesi en zor kaslardan biri olmaya devam etmektedir. Bunun nedeni sertliği, uzun lif uzunluğu ve hasara karşı yatkınlığıdır. Bunu çözmek için, mevcut çalışmada yüksek kaliteli, uygulanabilir bir lif popülasyonu elde eden ve izole edilmesi zor olan SOL kasından sağlam bir şekilde bir lif popülasyonu elde eden bir teknik optimize edilmiştir. EDL lif izolasyonu ile birleştirildiğinde, bu yaklaşım farklı kas gruplarından liflerin ve türev hücrelerin (uydu hücreleri, miyoblastlar ve miyotüpler) kültürünü mümkün kılar. Önemli olarak, bu platform çeşitli kas patolojilerine farklı katkı sağlayabilecek moleküler faktörlerin sistematik olarak incelenmesine olanak tanır ve kas tipine özgü yanıtları ortaya çıkarabilecek ve nihayetinde iskelet kas hastalıkları için etkili tedavilerin geliştirilmesini destekleyebilecek şekilde ilaç müdahalelerini test etmek için güçlü bir yöntem sunar.

Protokol

Tüm hayvanlar Tokyo Metropolitan Üniversitesi'nin hayvan tesisinde barındırıldı (İzin Numaraları: A4-4, A5-9, A6-7, A7-018). Tüm hayvanlar belirli patojensiz (SPF) koşullar altında tutuldu. Bu çalışmada kullanılan hayvan yönetimi ve deneysel prosedürler, Tokyo Metropolitan Üniversitesi Güvenlik ve Etik Komitesi'nin yönergelerine sıkı sıkıya uydu.

1. Reaktif Hazırlığı

  1. Tüm süre boyunca eldiven takın. 25 mL'lik bir santrifüj tüpünde, yüksek glikozlu Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM) + GlutaMAX ile %0,5 Kollagenaz tip I çözeltisi ile %1 penisilin-streptomisin-amfoterisin B süspansiyonu (AB) ile hazırlanın. Kollagenaz iyi çözündükten sonra (gerekirse tüpü hafifçe vurur), solüsyonu 0.22 μm düşük protein bağlayıcı filtreden filtreleyerek sterilize edin.
    NOT: 2.5 mL kollagenaz çözeltisi iki soleus (bir fare) için yeterlidir.
  2. 10 mL %5 sığır serum albümini (BSA) fosfatla tamponlanmış tuzlu bir salin (PBS) içinde hazırlayın. 60 °C'de 30 dakika boyunca ısıyla inaktive edin, ardından çözeltiyi 0,22 μm düşük protein bağlanan filtreden geçirin.
    NOT: PBS çözeltisindeki %5 BSA, 4 °C'de 10 güne kadar saklanabilir.

2. Soleus kaslarının diseksiyonu

  1. Kas diseksiyon için düzen ekipmanı (Şekil 1A).
  2. C57BL/6 farelerini, 1 mg/mL medetomidin hidroklorürür, 5 mg/mL midazolam ve 5 mg/mL butorfanol tartrat içeren üçlü anestezik karışımının (0,5 mL/g vücut ağırlığı) intraperitoneal enjeksiyonu ile anestezi edilir, ardından servikal dislokasyon ile fareleri ötenazi edilir.
  3. Arka uzuvda sıralı deri kesileri yapın ve cildi soyun. Yüzey fasyasını çıkarın.
  4. Plantaris (PLA) tendonunu gastroknemius (GAS) ve soleus (SOL) tendon demetlerinden ayırın. PLA'yı tendonundan nazikçe çekerek çıkarın (Şekil 1B).
  5. GAS ve SOL tendon demetlerini kesin ve kasları açığa çıkarın. GAS'ın proksimal tendonu ile SOL arasındaki boşluğa bir pim yerleştirin (Şekil 1C).
  6. İğneyi dikkatlice distal uca doğru kaydırarak SOL ve GAS kaslarını ayırın (Şekil 1D).
  7. GAS tarafından tendon demetlerini kesin (Şekil 1E).
  8. SOL'u GAZ'a dinlendirin. SOL'un pozisyonunu dikkatlice ayarlayın, proksimal tendonu açığa çıkarın ve mikro makasla kesin (Şekil 1F).
  9. SOL'u diseksiyon masasına yerleştirin ve kalan tendonu çıkarın (Şekil 1G).
    NOT: Bu adım isteğe bağlıdır; kalan tendon sonucu etkilemez.

3. Soleus kaslarının sindirimi

  1. Sağlam soleus, hazırlanan %0,5 kollajenaz çözeltisi içeren 25 mL'lik santrifüj tüpüne aktarın. 37 °C'de 130 dakika kuluçka yapın.
    NOT: Her 15–20 dakikada bir, numuneyi elle karıştırarak lifleri hafifçe ayırabilir ve kollagenaz aktivitesini destekleyebilir.

4. Tek liflerin stereomikroskop altında izolasyonu

  1. İki Pasteur pipetini keserek biri geniş delikli, diğeri dar açıklıklı (Şekil 2A). Alevde, triturasyon sırasında kas hasarını önlemek için delikleri sterilize edin ve düzeltin.
  2. İzolasyon sırasında lif yapışmasını önlemek için, Pasteur pipetleri ve üç adet 50 mm Petri kabını %5 BSA/PBS ile kaplayın.
    NOT: İzolasyon aşamaları boyunca bir stereomikroskop (Şekil 2B) kullanılmıştır.
  3. Kas sindiriminden sonra, fazla kollagenaz çözeltisi atılır ve soleus'u %1 AB içeren DMEM içeren ilk kaba aktarın (Şekil 2C).
  4. Geniş çaplı Pasteur pipetini kullanarak lifleri nazikçe yukarı aşağı durulayın (Şekil 2D).
  5. Dar delikli Pasteur pipeti ile, kas lifi uzunluğu boyunca sağlam tek lifleri ikinci tabağa aktarın. Burada bu fırsatı değerlendirerek kalıntıları ve/veya küçülmüş lifleri temizleyin (Şekil 2E,F).
  6. Yüksek kaliteli (tam uzun/sağlam) tek lifleri üçüncü bir tabakaya aktararak dar delikli Pasteur pipetiyle saflık sağlanır (Şekil 2G,H).
  7. Lifleri BSA kaplı 25 mL'lik santrifüj tüpüne toplayın. Süspansiyonu nazikçe karıştırın, sonra oda sıcaklığında 5 dakika bekletin ki lifler tüpün dibine çöksün.
  8. Dar delikli Pasteur pipetini kullanarak üst yüzeyi dikkatlice atarak kalan kalıntıları temizleyin. Yaklaşık 500 μL DMEM ile %1 AB çözeltisi bırakın. Bu çökelti yüksek arındırılmış tek kas lifleri popülasyonunu içerir (Şekil 2G,H).
    NOT: Bu teknik, protein ve mRNA ekstraksiyonu ve ardından analiz için kullanılabilecek > 300 tek lif elde edebilir.

5. Soleus liflerinden yüksek arındırılmış miyoblast kültürlerinin oluşturulması

  1. Matrigel Matrix'i 0.1 mg/mL'ye seyreldin ve 100 mm kültür kabını kaplamak için kullanın. Kabı 37 °C'de 30–60 dakika boyunca inkübe edin, ta ki kaplama eşit şekilde polimerleşene kadar.
  2. Kas liflerinin süspansiyonuna eşit miktarda Accutase ekleyin ve oda sıcaklığında 10 dakika kuluçka yapın. Daha sonra, %30 fetal sığır serumu içeren glikozsuz DMEM, %1 GlutaMAX, %1 tavuk embriyosu öztü, CEE, %1 AB ve 0,01 μg/mL temel fibroblast büyüme faktörü (bFGF) içeren 10 mL büyüme ortamı eklenin)44.
    NOT: Bu durumda eşit miktarda Accutase, Bölüm 4.8'de tanımlanan 500 μL'dir. Accutase, kas liflerinin nazik ayrışmasını kolaylaştırır ve uydu hücrelerinin salınmasına yardımcı olur; böylece miyoblast kültürünün genlemesini destekler.
  3. 10 mL Accutase ile işlenmiş kas lifi süspansiyonunu Matrigel kaplı bir tabağa aktarın. 100 mm kültür kabına yaklaşık 4 tek lif/cm 2 eklenir. Liflerin kültür kabında eşit şekilde yayıldığından emin olun.
  4. Kültür ortamında 3 gün geçirdikten sonra myoblast kolonileri gözlemlenebilir. Miyoblastlar gerekli popülasyona ulaşana kadar büyüme ortamını günlük olarak değiştirin. Normalde, 6. güne gelindiğinde, mioblast kültürleri deneysel aşama için yeterince birleşir (Şekil 3A).
  5. Miyoblastları orijinal kültür kabından Tripsin ile ayırın ve örneği 37 °C'de 2 dakika kuluçka edin. Hemositometre kullanarak, hücreleri ve tohumları miyojenik ilerleme için gereken kuyu büyüklüğüne ve hücre birleşme oranına göre sayın.
    NOT: 100 mm tabak için 1 mL tripsin ekleyin.

Sonuçlar

Tekniğimiz, soleus (SOL) ve extensor digitorum longus (EDL) kaslarının izole liflerinin Pax7'ye karşı etkili bir şekilde immünoetiketlenebileceğini göstermektedir (Şekil 3B). Bu izole lifler, 3 gün boyunca yüzen bir kültür ortamında (%10 at serumu, %10 at serumu, %1 AB, %0,5 CEE içeren DMEM + GlutaMAX'tan oluşan) tutulabilir ve ardından immünoetiketleme işlemi yapılabilir (Şekil 3B). Liflerin 4 günden fazla süre yüzmesi tavsiye edilmez. Tarif edilen yüzen lif koşullarında, miyofiberler bu süreden sonra toplanma eğiliminde olur ve sonraki immünoetiketleme analizini tehlikeye atar.

Sunulan teknik, miyojenik program boyunca bağışıklık oblotasyonu için de kullanılabilir (Şekil 3C). Gerçekten de, SOL ve EDL kaynaklı miyoblastlar yaklaşık %70 birleşimde 24 kuyu plakalarına yerleştirilmiştir. Hücreler ya büyüme ortamında 1 gün (miyoblastlar) tutuldu ya da iki veya dört gün boyunca farklılaşmaya teşvik edildi (sırasıyla erken oluşan ve farklılaşan miyotüpler). Beş μg protein immünoblotasyon analizi için yüklendi.

MyHC I ekspresyonu, SOL'dan türetilen kas liflerinde neredeyse özgün olarak ekspresyona sahip, miyotüplerde minimum ve miyoblastlarda önemsiz şekilde ifade edilmiştir (Şekil 3C). MyHC II hem SOL hem de EDL kas liflerinde eksprese edildi. Bu ifade, ağırlıklı olarak tip-I ve IIa'dan oluşan SOL'u yansıtırken, EDL esas olarak IIx ve IIb liflerinden oluşur. Miyoblastlar MyHC II'yi ifade etmez, ancak farklılaşma sırasında ekspresyonu giderek artmıştır. Oksidatifle ilişkili proteinler PGC-1α ve COXIV, SOL kaynaklı liflerde beklenen daha yüksek ekspresyonu gösterdi. Ayrıca, izole SOL liflerinde EDL liflerine kıyasla daha yüksek bir GLUT4 ekspresyonu tespit edildi. İskelet kası biyologlarının karşılaşabileceği bir sorun, yaygın olarak kullanılan temizlik proteinleri ve yükleme kontrollerinin, örneğin α-tubulin, β-aktin, GAPDH ve Ponceau S dahil toplam protein boyamaların, miyoblastlar, miyotüpler ve izole kas lifleri arasında stabil kalmamasıdır; her biri belirgin değişkenlik gösterir. α-tubulin ve β-aktinin sinyal yoğunluğu miyotüplerde en yüksekken, Ponceau S boyama miyoblastlarda nispeten zayıftı. Buna karşılık, GAPDH EDL kas liflerinde daha güçlü bir ekspresyon göstermiştir. Bununla birlikte, deneysel amaca bağlı olarak, bu temizlik proteinlerinden biri hâlâ uygulanabilir olabilir, alternatif olarak ısı şoku proteini 70 (HSP70) gibi normalizasyon faktörleri de incelenebilir.

Şekil 1
Şekil 1. Soleus kasının diseksiyonu. (A) Diseksiyon için gerekli ekipman. 1: mikro makas, 2: ince forseps, 3: diseksiyon makası ve 4: diseksiyon pinleri. (B) PLA tendonu, GAS ve SOL tendon demetlerinden (sarı ok) kesilmiştir. Distal PLA (beyaz ok) tendonu forseps ile kaldırıldı. (C) SOL (kırmızı ok) ile GAS (yeşil ok) arasındaki proksimal tendon arasındaki boşluğa bir diseksiyon pimi yerleştirildi. (D) SOL, bir diseksiyon pimi kullanılarak GAS'tan ayrıldı. (E) GAS ve SOL tendon demetleri GAS tarafında kesildi. (F) SOL proksimal tendon daha sonra mikro makasla kesildi. (G) Ek distal tendon demetleri çıkarıldı. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2
Şekil 2. Soleus liflerinin izolasyonu. (A) İzolasyon için gerekli ekipman. 1: dar delikli ve 2: geniş delikli Pasteur pipetleri. (B) İzolasyon için kullanılan stereomikroskop. (C) Kollajenazla sindirilen soleus, %1 AB ile DMEM'e aktarıldı. (D) Soleus lifleri ilk 10 yıkama seansından sonra kastan ayrıldı. (E) Tek lifler ikinci tabağa aktarılır. (F) Temiz liflerin döküntülerden ve küçülmüş liflerden çıkarıldığını gösteren görüntü. (G) Enkaz içermeyen tek lifler üçüncü çanakta aktarıldı. (H) Sağlam tek lifler net görünür. Ölçek çubuğu = 10 mm. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3
Şekil 3. Hücre kültürünün genişletilmesi ve EDL ile SOL kaynaklı örneklerin analizi. (A) İzolasyondan 6 gün sonra, proliferasyon ortamı kültüründeki örneklerde, izole soleus liflerinden alınan saf bir miyoblast kültürü gösterilir. Ölçek çubuğu = 100 μm. (B) SOL ve EDL kaynaklı tek lifler, izolasyondan hemen veya 3 gün sonra, Pax7 (yeşil) için immüno-işaretlenmiş uydu hücrelerini gösterir. MyoD (kırmızı) eksikliği, uydu hücrelerinin henüz miyojenik aktivasyona bağlı kalmadığını doğrular. Lifler DAPI (mavi) ile karşı boyandı. Hücreler daha sonra floresans mikroskobu ile gözlemlendi. Ölçek çubuğu = 20 μm. (C) 5 μg protein miyoblastlar, miyotüpler ve miyofiber türevli örneklerin immünoblotasyonu için kullanıldı. İmmünoblotting paneller, MyHC I, MyHC II, PGC-1α, COX IV, GLUT4, α-tubulin, β-aktin ve GAPDH ekspresyonunu gösterdi. Ponceau S boyaması, toplam protein yükleme kontrolü olarak kullanıldı. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Soleus'tan (SOL) çok sayıda kas lifini izole etmenin ilk anahtarı, diseksiyon sırasında kasın yapısal bütünlüğünü korumaktır. Eğer SOL'un epimiyyumu yırtılırsa veya kas özellikle boylamasına ekseni boyunca kuvvetle çekilirse, diseksiyon sırasında izolasyon verimi ciddi şekilde bozulur. Bu diseksiyon hataları genellikle sonrasında kolayca tespit edilir. Gerçekten de, kollagenaz sindiriminden sonra kas eşit şekilde küçülür ve beyaz, kompakt bir kütle oluşturur. Bu koşullarda, sadece çok az sayıda canlı lif ayrışabilir.

Başarılı soleus izolasyonu için ikinci belirleyici faktör, tip I kollagenaz sindiriminin verimliliğidir. Kollagenaz en iyi şekilde çalıştığında, ilk 10 durulama seansında yaklaşık 100–200 soleus lifi elde edilebilir. Buna karşılık, sindirim optimal değilse, ilk 20 durulamadan sonra bile 50'den az lif salgılanabilir. Daha yüksek lif verimi elde etmek için daha yoğun durulama ve ek durulama döngüleri gereklidir. Ancak, SOL lifleri son derece hassas olduğundan, bu genellikle durulama sırasında liflerin küçülmesine yol açar.

Saf SOL kaynaklı primer mioblast kültürü oluşturmak için kollagenaz sindirimi yine kritik rol oynar. Sindirim verimli olduğunda, kalıntı dokuya daha az lif bağlı kalır ve liflerin kültür ortamına aktarılması minimal fibroblast kontaminasyonuna yol açar. Buna karşılık, SOL kötü sindirildiğinde, dissosiyasyon yapmış lifler kalıntı dokuya bağlı kalır ve miyoblast kültürünü fibroblastlarla kirler. Araştırmacılar, tohumlanmış hücre örneklerinde fibroblast kontaminasyonunun tipik belirtilerini araştırmalıdır; bunlar, yapışmış Matrigel kaplamalı antenlerdeki çok daha küçük, mil şeklindeki uydu hücrelerine kıyasla çok daha büyük hücre büyüklüğü ve geniş sitoskelet çıkıntılarını içerir. Kontaminasyon olursa, araştırmacılar hücreleri başka yerlerde tanımlandığı gibi ön kaplama adımlarına tabitutabilirler 45. Kısa süreliğine, SC'ler izolasyon sonrası 3 gün kültürlenir, ardından tripsize edilir ve kolajen kaplı tabaklarda kısa bir süre önceden tabaklanır. 15–30 dakikalık kuluçka süresince fibroblastlar yapışırken, SC'ler askıda kalır ve taze Matrigel kaplı plakalara aktarılır.

Yukarıda belirtildiği ve deneyimimizle uyumlu olarak, SOL lifleri extensor digitorum longus (EDL) ve flexor digitorum brevis (FDB) liflerinden daha uzun ve daha kırılgandır. Bu durum, liflerin Pasteur pipetleriyle aktarılmasını zorlaştırır. Lifleri boyuna eksenleri boyunca çekmek, ortadan çekmek yerine çok önemlidir; aksi takdirde, lifler baskı altında büzülür ve küçülür. Fiber izolasyonun başarılı olup olmadığını doğrudan belirleyen belirleyici faktörlerin yanı sıra, soleus lif verimini artırmak için birkaç ek teknik adım da gereklidir. Bunlardan biri, tüm Pasteur pipetlerini, tabaklarını ve toplama tüplerini %5 BSA ile kaplamak. Bu, taze ayrılmış kas liflerinin yüzeylere yapışmasını engeller, böylece liflerin katlanmasını ve ardından küçülmesini engeller. Her kas örnekleri izole edildiğinde yeni ısıyla sterilize edilmiş, BSA kaplamalı Pasteur pipetlerinin hazırlanması önerilir. Alternatif olarak, araştırmacılar uzun vadeli kullanım için bir Pasteur pipetleri seti hazırlayabilirler. Eğer öyleyse, her seferinde ısıyla sterilize edin ve kullanmadan önce taze BSA ile kaplamanızı yapın.

Tek kas lifi izolasyonu için geleneksel protokol, öncelikle FDB ve EDL37 gibi glikolitik kaslar için optimize edilmiştir. Ancak, SOL gibi oksidatif kaslar yapısal olarak farklıdır. Transkriptomik analizler, ekstrasellüler matriks (ECM) ile ilgili gen ekspresyonunun SOL ile EDL46 arasında farklılık gösterdiğini, iskelet kasının44 sitoskelet linker proteini olan distrofin gibi genleri de kapsadığını göstermiştir. Sonuç olarak, 60–90 dakika boyunca %0,2 (2 mg/mL) kollagenaz ile EDL kas sindirimi için standart koşul, SOL kasları için optimal değildir; bu da sindirim sonrası sıkışık lif demetleri veya küçülmüş liflere yol açar. Bu çalışmada, oksidatif SOL kasları için protokolü uyarlamak amacıyla birkaç önemli adımı optimize ettik. Tip I kollagenaz konsantrasyonunu %0,5 (5 mg/mL) olarak ayarlayarak, kuluçka süresini 130 dakikaya çıkararak ve durulama sırasında mekanik stresi en aza indirerek, tek bir fareden tutarlı olarak 300–500 sağlam lif elde edilebilir. EDL ile karşılaştırıldığında, SOL örneklerinin lif sayısı ve verimi daha düşük kalır (EDL > 500 lif verebilir); yine de, lif sayısı ve önemlisi, SOL kaynaklı liflerimizin yüksek kalitesi sağlam ve immünoetiketleme ve immünoblotlama gibi sonraki uygulamalar için uygundur. İmmünoblotlama sonuçlarımız birleştirilmiş tek lifli örneklerden oluşmasına rağmen, bu raporda sunulan teknik, sağlam bireysel lifleri güvenilir şekilde çıkarabilmektedir; bu da onları tek lifli çözünürlükte immünoblottasyon, proteomik ve RNAdizileme 47 gibi sonraki uygulamalar için uygun kılar. Alandaki araştırmacılar, oksidatif ve glikolitik kas lifleri arasındaki metabolik ve kasılma farklarını incelemek için bu tekniği kullanabilirler.

Genel olarak, bu protokol soleus kasından sağlam oksidatif liflerin izole edilmesi için tekrarlanabilir ve erişilebilir bir yöntem sunar ve kas lifi tipine özgü fizyolojiyi ve moleküler mekanizmaları incelemek için mevcut araç setini genişletir.

Açıklamalar

Yazarların beyan edecek çıkar çatışmaları yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışma, bilim teknolojisi yeniliğinin (JST, hibe no) oluşturulması için üniversite burslarının kurulmasıyla desteklenmiştir (JST, hibe no. JPMJFS2139 T.H.'ye) ve Japonya Bilimi Teşvik Derneği'nden (KAKENHI 23H00457 N.L.F.'ye, 20J12849 Y.Mi.'ye, 24K22254 Y. Ma'ya) hibeleri aldı. Bu çalışma ayrıca Tokyo Metropol Hükümeti İleri Araştırma Hibesi [R2-2] tarafından Y.Ma., N.L.F.'ye ve TMU stratejik araştırma fonu tarafından da desteklendi. Tavsiye ve faydalı yorumları için Yasuro Furuichi'ye teşekkür ederiz.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
AccutaseInnovative Cell TechnologiesAT104
Basic fibroblast growth factorPeprotech450-33
Bovine serum albuminSigmaA9418
Butorphanol tartrateMeiji Yakuka Co., Ltd711-12Ürün adı: Vetorphale enjeksiyon
Chicken Embryo ExtractUS BiologicalC3999
Collagenase type IWorthingtonM9B2717
DAPISigma-AldrichD9542
Fetal bovine serumGibco10437-028
Glucose-free DMEMGibcoA14430-01
GlutaMAXGibco10569
High-glucose DMEM+GlutaMAXGibco10569-010
Horse serumLife technology16050-130
Low-protein binding filterMilliporeSLGVR33RB
MatrigelCorning354230
Medetomidine hydrochlorideKyoritsu Seiyaku Co., Ltd8816Ürün adı: Dorbene Enjeksiyon
MidazolamMaruishi Pharmaceutical Co., Ltd4987211762100Ürün adı: Dormicum Enjeksiyon
Penicillin-streptomycin-amphotericin B suspensionWako161-23181
Ponceau S stain solutionSigma-Aldrich24-3875-5
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol redGibco25200056
Ekipman
Santrifüj tüpleri (25 mL)IWAKI2362-025
Floresan mikroskopKeyenceBZ-X810
Pasteur pipetlerIWAKI5 3/4 IK-PAS-5P
StereomikroskopLeicaM165C
Sterilin tabakları (100 mm)Thermo Scientific3020-100El yazısında Petri kabı olarak bahsedilmiştir
İmmün etikeleme için antikorlar
Goat anti-mouse (H+L), Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificA-327231:400
Goat anti-rabbit (H+L), Alexa Fluor 594Thermo Fisher ScientificA-110121:400
Mouse Anti-Myosin Heavy ChainR&D SystemsMAB44701:400
Mouse Anti-Pax7DSHBAB-5284281:100
Rabbit Anti-MyoDSanta Cruz Biotechnologysc-7601:100
İmmünblotting için antikorlar
HRP-konjuge Anti-mouse IgGCytivaNA9311:1000/ at kestanesi peroksidazı
HRP-konjuge Anti-Rabbit IgGCytivaNA9341:1000/ at kestanesi peroksidazı
Mouse Anti-MyHC ISigmaM84211:1000/ Myosin Heavy Chain I
Mouse Anti-MyHC IISigmaM42761:1000/ Myosin Heavy Chain II
Mouse Anti-PGC-1αSanta Cruz Biotechnologysc-5173801:1000/ Pparg koaktivatör 1 alfa
Mouse Anti-α-tubulinCell Signaling Technology#38731:1000/ Alfa tubulin
Rabbit Anti-COXIVCell Signaling Technology#48501:1000/ Cytochrome c oksidaz IV
Rabbit Anti-GAPDHCell Signaling Technology#22181:10000/ Gliseraldehit-3-Fosfat Dehidrogenaz
Rabbit Anti-GLUT4Cell Signaling Technology#22131:1000/ Glukoz Taşıyıcı 4
Rabbit Anti-β-actinProteintech20536-1-AP1:2000/ Nonmüsküler Beta-aktin

Kaynaklar

  1. Janssen, I., Heymsfield, S. B., Wang, Z. M., Ross, R. Skeletal muscle mass and distribution in 468 men and women aged 18–88 yr. J Appl Physiol. 89 (1), 81-88 (2000).
  2. Mauro, A. Satellite cell of skeletal muscle fibers. J Biophys Biochem Cytol. 9 (2), 493-495 (1961).
  3. Zammit, P. S., Partridge, T. A., Yablonka-Reuveni, Z. The skeletal muscle satellite cell: The stem cell that came in from the cold. J Histochem Cytochem. 54 (11), 1177-1191 (2006).
  4. Zammit, P. S., et al. Pax7 and myogenic progression in skeletal muscle satellite cells. J Cell Sci. 119 (9), 1824-1832 (2006).
  5. Seale, P., et al. Pax7 is required for the specification of myogenic satellite cells. Cell. 102 (6), 777-786 (2000).
  6. Günther, S., et al. Myf5-positive satellite cells contribute to Pax7-dependent long-term maintenance of adult muscle stem cells. Cell Stem Cell. 13 (5), 590-601 (2013).
  7. Gnocchi, V. F., White, R. B., Ono, Y., Ellis, J. A., Zammit, P. S. Further characterisation of the molecular signature of quiescent and activated mouse muscle satellite cells. PLoS One. 4 (4), e5205(2009).
  8. Halevy, O., et al. Pattern of Pax7 expression during myogenesis in the posthatch chicken establishes a model for satellite cell differentiation and renewal. Dev Dyn. 231 (3), 489-502 (2004).
  9. Biressi, S., Rando, T. A. Heterogeneity in the muscle satellite cell population. Semin Cell Dev Biol. 21 (8), 845-854 (2010).
  10. Zammit, P. S. All muscle satellite cells are equal, but are some more equal than others. J Cell Sci. 121 (18), 2975-2982 (2008).
  11. Ortuste Quiroga, H. P., Fujimaki, S., Ono, Y. Pax7 reporter mouse models: A pocket guide for satellite cell research. Eur J Transl Myol. 33 (4), (2023).
  12. Schiaffino, S., Reggiani, C. Fiber types in mammalian skeletal muscles. Physiol Rev. 91 (4), 1447-1531 (2011).
  13. Pette, D., Staron, R. S. Myosin isoforms, muscle fiber types, and transitions. Microsc Res Tech. 50 (6), 500-509 (2000).
  14. Ahmetov, I. I., Vinogradova, O. L., Williams, A. G. Gene polymorphisms and fiber-type composition of human skeletal muscle. Int J Sport Nutr Exerc Metab. 22 (4), 292-303 (2012).
  15. Guth, L., Samaha, F. J. Qualitative differences between actomyosin ATPase of slow and fast mammalian muscle. Exp Neurol. 25 (1), 138-152 (1969).
  16. Aguilera-Alcala, N., Morales-Reyes, Z., Martin-Lopez, B., Moleon, M., Sanchez-Zapata, J. A. Role of scavengers in providing non-material contributions to people. Ecol Indic. 117, 11(2020).
  17. Sullivan, S. M., Pittman, R. N. Relationship between mitochondrial volume density and capillarity in hamster muscles. Am J Physiol. 252 (1), H149-H155 (1987).
  18. Fujita, N., et al. Changes in lipid metabolism and capillary density of the skeletal muscle following low-intensity exercise training in a rat model of obesity with hyperinsulinemia. PLoS One. 13 (5), e0196895(2018).
  19. Narusawa, M., et al. Slow myosin in developing rat skeletal muscle. J Cell Biol. 104 (3), 447-459 (1987).
  20. Faerman, A., Shani, M. The expression of the regulatory myosin light chain 2 gene during mouse embryogenesis. Development. 118 (3), 919-929 (1993).
  21. Denardi, C., et al. Type 2x-myosin heavy chain is coded by a muscle fiber type-specific and developmentally regulated gene. J Cell Biol. 123 (4), 823-835 (1993).
  22. Ciciliot, S., Rossi, A. C., Dyar, K. A., Blaauw, B., Schiaffino, S. Muscle type and fiber type specificity in muscle wasting. Int J Biochem Cell Biol. 45 (10), 2191-2199 (2013).
  23. Talbot, J., Maves, L. Skeletal muscle fiber type: Using insights from muscle developmental biology to dissect targets for susceptibility and resistance to muscle disease. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 5 (4), 518-534 (2016).
  24. Celegato, B., et al. Parallel protein and transcript profiles of FSHD patient muscles correlate to the D4Z4 arrangement and reveal a common impairment of slow to fast fibre differentiation and a general deregulation of MyoD-dependent genes. Proteomics. 6 (19), 5303-5321 (2006).
  25. Ganassi, M., Muntoni, F., Zammit, P. S. Defining and identifying satellite cell-opathies within muscular dystrophies and myopathies. Exp Cell Res. 411 (1), 112906(2022).
  26. Gallagher, P., et al. Effects of 84-days of bedrest and resistance training on single muscle fibre myosin heavy chain distribution in human vastus lateralis and soleus muscles. Acta Physiol Scand. 185 (1), 61-69 (2005).
  27. Grimby, G., Broberg, C., Krotkiewska, I., Krotkiewski, M. Muscle fiber composition in patients with traumatic cord lesion. Scand J Rehabil Med. 8 (1), 37-42 (1976).
  28. Shenkman, B. S. From slow to fast: Hypogravity-induced remodeling of muscle fiber myosin phenotype. Acta Naturae. 8 (4), 47-59 (2016).
  29. Ohira, T., Kawano, F., Goto, K., Ohira, Y. Responses of skeletal muscles to gravitational unloading and/or reloading. J Physiol Sci. 65 (4), 293-310 (2015).
  30. Higashino, K., et al. Early changes in muscle atrophy and muscle fiber type conversion after spinal cord transection and peripheral nerve transection in rats. J Neuroeng Rehabil. 10, 46(2013).
  31. Webster, C., Silberstein, L., Hays, A. P., Blau, H. M. Fast muscle fibers are preferentially affected in Duchenne muscular dystrophy. Cell. 52 (4), 503-513 (1988).
  32. Pedemonte, M., Sandri, C., Schiaffino, S., Minetti, C. Early decrease of IIx myosin heavy chain transcripts in Duchenne muscular dystrophy. Biochem Biophys Res Commun. 255 (2), 466-469 (1999).
  33. Rafael, J. A., et al. Dystrophin and utrophin influence fiber type composition and post-synaptic membrane structure. Hum Mol Genet. 9 (9), 1357-1367 (2000).
  34. Kotelnikova, E., et al. Novel approach to meta-analysis of microarray datasets reveals muscle remodeling-related drug targets and biomarkers in Duchenne muscular dystrophy. PLoS Comput Biol. 8 (2), e1002365(2012).
  35. Banerji, C. R. S., Zammit, P. S. Pathomechanisms and biomarkers in facioscapulohumeral muscular dystrophy: Roles of DUX4 and Pax7. EMBO Mol Med. 13 (8), e13695(2021).
  36. Lassche, S., et al. Sarcomeric dysfunction contributes to muscle weakness in facioscapulohumeral muscular dystrophy. Neurology. 80 (8), 733-737 (2013).
  37. Bischoff, R. Proliferation of muscle satellite cells on intact myofibers in culture. Dev Biol. 115 (1), 129-139 (1986).
  38. Rosenblatt, J. D., Lunt, A. I., Parry, D. J., Partridge, T. A. Culturing satellite cells from living single muscle fiber explants. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 31 (10), 773-779 (1995).
  39. Collins, C. A., Zammit, P. S. Isolation and grafting of single muscle fibres. Methods Mol Biol. 482, 319-330 (2009).
  40. Ravenscroft, G., et al. Dissociated flexor digitorum brevis myofiber culture system—a more mature muscle culture system. Cell Motil Cytoskeleton. 64 (10), 727-738 (2007).
  41. Keire, P., Shearer, A., Shefer, G., Yablonka-Reuveni, Z. Isolation and culture of skeletal muscle myofibers as a means to analyze satellite cells. Methods Mol Biol. 946, 431-468 (2013).
  42. Smith, L. R., Meyer, G. A. Skeletal muscle explants: Ex-vivo models to study cellular behavior in a complex tissue environment. Connect Tissue Res. 61 (3-4), 248-261 (2020).
  43. Tarpey, M. D., et al. Characterization and utilization of the flexor digitorum brevis for assessing skeletal muscle function. Skeletal Muscle. 8 (1), 14(2018).
  44. Omairi, S., et al. Regulation of the dystrophin-associated glycoprotein complex composition by the metabolic properties of muscle fibres. Sci Rep. 9 (1), 2770(2019).
  45. Moyle, L. A., Zammit, P. S. Isolation, culture and immunostaining of skeletal muscle fibres to study myogenic progression in satellite cells. Methods Mol Biol. 1210, 63-78 (2014).
  46. Hettige, P., Tahir, U., Nishikawa, K. C., Gage, M. J. Comparative analysis of the transcriptomes of EDL, psoas, and soleus muscles from mice. BMC Genomics. 21 (1), 808(2020).
  47. Blackburn, D. M., Lazure, F., Soleimani, V. D. RNA sequencing of single myofibers from Mus musculus. Bio Protoc. 10 (4), e3525(2020).

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

skelet KasMiyofiber B t nlKollagenaz SindirimiUydu H cre zolasyonuSoleus KasKas DisosiasyonuN rom sk ler Bozukluklarmm n aretleme
Oksidatif Miyofiber Davranışının Değerlendirilmesi İçin Tek Lifli İzolasyon Testi
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.