Glioma Araştırmaları İçin Mutant Sinir Kök Hücreleri Üretmek İçin Çift Lentiviral Transdüksiyon

Özet

Bu protokol, glioma araştırmaları için mutant fare sinir kök hücrelerinin (NSC) ardışık lentiviral transdüksiyonlar kullanılarak üretilmesini tanımlar. Onkojenik mutasyonlar önce NSC'lere dahil edilir, ardından raporlayıcı genler içeren bisistronik lentivirüs gelir. Çift antibiyotik seçiminden sonra, mutant NSC'ler tümör büyümesinin ve tedavi yanıtının gerçek zamanlı görüntülenmesini sağlar.

Özet

Gliomalar, yetişkinlerde en yaygın birincil beyin tümörleridir ve fare modellemesi, bunların NSC'lerdeki onkojenik mutasyonlardan veya erken farklılaşan adelerden kaynaklanabileceğini göstermektedir. Mutant NSC'lerden türetilen ortotopik nakil modelleri, glioma patogenezi, sonuçlar ve tedavi yanıtı hakkında değerli preklinik bilgiler sağlama potansiyeline sahiptir. Bu modeller, transfeksiyon/transdüksiyon etkinliğinin belirlenmesine ve tümör büyümesinin in vivo izlenmesine yardımcı olmak için tercihen raporlayıcılarla birlikte onkojenik mutasyonun NSC'lere eklenmesini gerektirir. Bu protokol, in vivo tümör izleme için uygun mutant NSC'ler üretmek için çift transdüksiyon tabanlı bir metodolojiyi ortaya koyar. Bu teknikte, izole NSC'ler önce blastisitin dirençli elementin yanı sıra ilgilendirici bir gen (onkojenik mutasyon veya yeşil floresan protein [GFP] kontrolü) içeren lentivirüslerle transdüksiyon edilir. Blastisidin seçiliminin ardından, hücreler ikincil olarak lusiferaz ve kırmızı floresan protein (RFP) ifade eden bisistronik lentiviral vektör ile ayrıca bir puromisin dirençli element ile transdüksiyon edilir. Puromisin seçildikten sonra, hücreler proliferasyon testleri, ortotopik nakil veya diğer sonraki uygulamalar için genişletilebilir. Bu çift transdüksiyon yaklaşımı, enfeksiyon aşamalarında transdüksiyon etkinliğinin tahmin edilmesine ve invaziv olmayan biyolüminesans görüntüleme (BLI) kullanılarak in vivo tümörün oluşumu, büyümesi ve tedaviye yanıt izlenmesini sağlar. Bu sistem, glioma araştırmaları için faydalı bir araç olarak hizmet veriyor; yetişkin sinir kök hücresinden türetilmiş tümör modellemesinin biyolojik önemini gerçek zamanlı görüntüleme yeteneğinin pratik faydasıyla birleştirerek nihayetinde glioma biyolojisinin anlaşılmasını ve yeni terapötik yaklaşımların ilerlemesini artırıyor.

Giriş

Gliomalar, yetişkinleri etkileyen en yaygın birincil beyin tümörü türüdür ve bu popülasyondaki tüm kötü huylu beyin neoplazmalarının yaklaşık %80'ini^{oluşturur 1}. Bunların çoğu, genellikle çok invazivdir ve kötü prognoza sahip olan yüksek dereceli^{gliom 2'dir} ve beyin cerrahi teknikleri, radyasyon tedavisi ve kemoterapi yaklaşımlarında önemli ilerlemelere rağmen kötü prognoza^{sahiptir 3,4}. Bu tümörlerden etkilenen hastalarda yüksek ölüm oranı, glioma oluşumu ve ilerlemesi üzerine devam eden araştırmaların gerekliliğini vurgulamaktadır.

Merkezi sinir sisteminde gliomagenez, fare modelleme çalışmalarında NSC 6,7,8,9 veya erken farklılaşan 10,11,12 yadelerine onkojenik mutasyonların eklenmesiyle tetiklenebilir. Özellikle, bu çalışmalar aynı onkojenik mutasyonların daha farklılaşmış hücrelere getirildiğinde genellikle tümör üretemediğini^{göstermiştir 13}; bu da artan soy kısıtlamasının dönüşüme karşı azalmış hassasiyetle ilişkili olduğu bir köken hücresi hiyerarşisi^{oluşturur 14}. Genetik olarak değiştirilmiş NSC'ler, biyolojik olarak ilgili ve çok yönlü glioma modelleri oluşturmak için yaygın olarak kullanılır; bu da transjenik teknikler veya ortotopik nakil yöntemleri^{kullanılarak kullanılır 15}. Her iki yaklaşım da, dönüşüm yapmamış bir hücreden doğal beyin ortamında de novo tümör oluşumunun incelenmesine olanak tanır. Genetik olarak tasarlanmış modeller, bağışıklık sistemi sağlam olan hayvanlarda bu çalışmayı mümkün kılar ve genellikle insan tümörlerinde gözlemlenen histoloji ve hücresel heterojenliği daha iyi taklit eder¹⁶. Ancak, bu modellerin üretimi hem emek hem de maliyet açısından yoğun olup, genellikle uzun gecikme süreleri ve düşük tümör oluşum^{sıklıkları sergiler.} Buna karşılık, ortotopik NSC modelleri daha kolay manipüle edilebilir ve maliyet etkinidir. Mutant NSC'ler, deneysel ihtiyaçlara göre fare veya insan birincil veya ölümsüzleştirilmiş hücrelerden üretilebilir ve ayrıca in vitro deneyler^{için uygundur 16,17}. Ayrıca, bu modeller hem NSC'lerin hem de alıcı farelerin gelişim aşamasını ve NSC'lerin türetildiği ve tanıtıldıkları mekansal lokalizasyonu hassas şekilde ayarlama imkanı sunar. Bu, araştırmacıların yaş ve belirli beyin bölgelerinin belirli mutasyonların neden olduğu tümörjenezi nasıl etkilediğini araştırmalarını^{sağlar 17}.

Bu protokol, hem in vitro hem de in vivo deneysel uygulamalar için uygun olan mutant fare NSC'lerinin birincil kültürden üretilmesi metodolojisini özetlemektedir (Şekil 1). Protokol, belirli bir zaman dizisinde gerçekleşen iki ayrı transdüksiyon fazından oluşur. İlk transdüksiyon aşamasında, izole fare NSC'leri, hedef genetik yapıyı taşıyan rekombinant lentivirüslerle enfekte edilir; bu ya onkojenik mutasyon ya da yeşil floresan protein (GFP) kontrolü ve blastisidin dirençli kaseti bulunur. Bunun ardından, blastisidin kullanılarak antibiyotik seçim baskısı uygulanır ve yalnızca hayatta kalan transdüksiyon hücreleri ikincil transdüksiyon olayına geçebilir. Bu ikincil olay, hem ateşböceği lusiferaz hem de kırmızı floresan protein (RFP) raporlayıcı genlerini kodlayan bisistronik lentiviral yapıyı kullanır ve sonraki seçim için puromisin direnç elementleriyle birlikte kullanılır. Puromisin ile seçildikten sonra, ortaya çıkan çift transdüksiyonlu NSC popülasyonları in vitro genişletilir ve sonraki deneylerden önce. Bu ardışık transdüksiyon yaklaşımı birkaç metodolojik avantaj sunar: (1) her adımda transdüksiyon etkinliğinin nicel^{olarak değerlendirilmesini kolaylaştırır 18}, (2) uzunlamasına takip için uygun kararlı raporlayıcı hücre hatları oluşturur ve (3) tümör başlangıcı, ilerleme kinetiği ve terapötik yanıtların BLI^{metodolojileri} 18,19,20 üzerinden invaziv olmayan izlenmesini sağlar . Ayrıca birincil veya ölümsüzleştirilmiş^{NSC'ler 21,22,23} ile de kullanılabilir.

Burada sunulan protokol, entegre görüntüleme yeteneklerine sahip yetişkin hayvanlardan NSC kaynaklı glioma modelleri üretmek için standartlaştırılmış, verimli ve biyolojik olarak ilgili bir yaklaşımın acil ihtiyacını karşılar. Ortaya çıkan modellerin, glioma patogenezi hakkında klinik olarak önemli içgörüler sağlaması, yeni terapötik hedeflerin belirlenmesini kolaylaştırması ve gelişmekte olan tedavi stratejilerinin klinik öncesi değerlendirmesi için sağlam platformlar sunması beklenmektedir.

Protokol

Bu çalışma, Washington Üniversitesi tarafından St. Louis'te belirlenen etik standartlar ve düzenleyici yönergeler doğrultusunda gerçekleştirilmiştir. Bu protokol için, yetişkin farelerin korteksi Brossier laboratuvarının daha önce tanımlanan^{tekniği 24'e} göre mikro-disseksiye edilmiş ve yerleşik^{protokol 24,25,26'ya} göre yapışmayan kültürde daha sonra genişleme için birincil fare NSC'lerini izole etmek için kullanılmıştır. Kültürde kullanılan tüm reaktifler ya steril formatta sağlanır ya da sterilliği sağlamak için 0.2 μM membran filtresinden geçirilir. Reaktifler ve kullanılan ekipmanlar Malzeme Tablosu'nda listelenmiştir.

1. Mikro-diseksiye edilmiş dokudan sinir kök hücre izolasyonu

1. Dissosiyasyon Ortamı (DM) ve Tripsin Sindirme Ortamı (TDM) hazırlamak, Şekil 2'de gösterilen tariflere göre.
   1. 1.5 mL mikrosantrifüj tüplerine 200 μL Tripsin Digest Medium ekleyin ve kullanmadan önce en az 20 dakika buz üzerinde kalın. DM, protokolün ilerleyen adımları için oda sıcaklığında bırakılabilir.
   2. Tüpler önceden soğutma aşamasındayken, temel Sinir Kök Hücre Ortamı (NSC; tarif Şekil 2'de gösterilmiştir) hazırlayın ve NSC ile Fetal Sığır Serumunu (FBS) 37 °C'ye su veya boncuk banyosuna koyarak önceden ısındır. Takviye (B27, N2) ve büyüme faktörleri (EGF, FGF) aliquotlarını yavaşça çözülmesi için buz kovasına koyun.
      NOT: TDM her kullanımdan önce taze hazırlanmalıdır, ancak NSC ve DM kullanımlar arasında 4 °C sıcaklıkta saklanabilir; tarifler Şekil 2'de gösterilmiştir. N2, B27, EGF ve FGF stokları aliquote yapılmalı ve -20 °C'de depolanmalıdır; yeniden yapılandırılmış stokların tekrar tekrar donma-çözülmelerini önlemek (EGF ve FGF stoklarının hazırlanmasında daha fazla detay için Materyal Tablosu'na bakınız).
2. TDM içeren mikrosantrifüj tüpleri yeterince soğutulduktan sonra, daha önce tarif edildiği gibi dokuyu mikro-disseksiye^{yapar 24}. Her mikro diseksiyondan sonra, doku bir mikrosantrifüj tüpüne yerleştirilir. Tüm diseksiyonlar tamamlanana kadar tüpü buza geri getirin, çünkü dokunun ısınması enzimatik sindirim sürecini erken başlatabilir ve aşırı sindirime yol açabilir.
3. Mikrosantrifüj tüp(lerini) 37 °C'de su veya boncuk banyosunda 15 dakika boyunca inkübe ederek enzimatik sindirimi başlatın. Kuluçka sırasında, %10 FBS ile 0,5 mL FBS eklenerek 4,5 mL NSC alın.
   1. İnkubasyondan sonra, hücreleri daha da ayrıştırmak için 1 mL mikropipetle pipet örneklerini 5–10 kez nazikçe inceleyin, ardından her numuneye NSC'de %10 FBS eklenerek tripsin nötralize edilir. Pipet ile yukarı aşağı nazikçe karıştırın.
      NOT: Önerilen kuluçka süresine 37 °C olarak uymak çok önemlidir. Aşırı tripsinasyon hücre ölümüne yol açabilirken, az tripsinasyon örneği ayırmayı zorlaştırabilir (bu ve diğer sorun giderme ipuçları için Tablo 1, Noktalar 1–2 bkz.
      NOT: Numuneleri kuluçka altına almak için su banyosu veya boncuk banyosu kullanılabilir; ikincisi, kirlenme^{riskini azaltabilir 27}, ancak bu daha az verimli ısı transferi riskini de beraberinde^getirebilir.
4. İzole edilen birincil hücreleri 630 × g ile 4 °C'de 5 dakika boyunca aşağıya döndürün. Kuyunun altındaki hücreleri rahatsız etmemeye dikkat ederek süpernatantı aspire edin. Hücreleri hücre pelletine 2,5 mL DM ekleyerek yıkayın ve 3–4 kez nazikçe pipetle tekrar süzülerek tekrar süzülür. 630 × g ile tekrar aşağı döndürün, 4 °C'de 5 dakika boyunca ve süpernatantı dikkatlice aspire edin.
5. İkinci yıkama yapmak için 1.3. adımı tekrarlayın. Son yıkamada, önceden ısıtılmış temel NSC ortamına B27, N2, FGF ve EGF ekleyerek tam NSC ortamı oluşturulur (tarif Şekil 2'de gösterilmiştir).
6. Üst natantı aspire edin. Her hücre pelletine 2 mL sıcak tam NSC ortamı ekleyin, ardından 3–4 kez yukarı ve aşağı nazikçe pipetle tekrar süzülün. Yeniden askılanmış hücreleri 6 kuyruklu düşük yapışma plakasının bir kuyusuna yerleştirin ve 37 °C'de kuluçka yapın.
   NOT: Baz NSC ortamı kullanımlar arasında 4 °C'de saklanabilse de, takviyeler ve büyüme faktörleri bu sıcaklıkta bozulmaya uğrayabilir. Bu nedenle, B27, N2, FGF ve EGF maddeleri NSC ortamına eklenerek tam bir NSC ortamı oluşturulmalıdır.

2. Nörosfer kültürünün kuruluşu ve genişlemesi

1. Her 3 günde bir NSC kültürlerinin her kuyusuna 0,5–1 mL taze NSC besleme ortamı ( tarif Şekil 2'de gösterilmiştir) verilmelidir.
2. Nörosfer oluşumunu izleyin. Tam formasyona sahip küçük küreler göründüğünde, kültür geçişe hazır olur (genellikle ilk kaplamadan 5–10 gün sonra).
   NOT: Hücreler en iyi şekilde sık sık geçildiğinde ve logaritmik büyüme aşamasında büyür. Daha büyük nörosferler bu süreçte ayrılması daha zor ve hücre ölümüne daha yatkındır. Bu nedenle, hücre sağlığını desteklemek için daha erken ve daha sık geçiş önerilmektedir. Geçişe hazır olduğunda, izole nörosferler ~100–200 μm çapında, sıkı paketlenmiş hücrelere ve parlak alan mikroskopisi altında düzgün, iyi tanımlanmış sınırlara sahip olacaktır. Nörosferler düzensiz projeksiyonlar veya uzantılar göstermez. Nörosferlerin merkezi dış kenarlardan biraz daha koyu olur, ancak aşırı değil; Aşırı koyu çekirdekler, nörosferler aşırı büyüdüğünde besin yoksunluğu nedeniyle merkezi hücrelerin nekrozu sonucu ortaya çıkar. Aşırı büyümüş nörosferlerin geçişi genellikle yüksek miktarda hücre ölümüne yol açar ve bu da sonraki uygulamaları etkileyebilir. Bu ve diğer sorun giderme ipuçları için Tablo 1, Noktalar 3–4'e bakınız.
3. NSC ortamını, DM, %0,05 Tripsin-EDTA ve fosfatla tamponlanmış tuzlu su (PBS) sıcaklığında 37 °C'de su veya boncuk banyosu ile önceden ısıtın. B27, N2, FGF, EGF ve FBS stoklarını ihtiyaç duyulana kadar buzda bırakın.
4. Geçiş için, iyi büyümüş nörosferleri serolojik pipet kullanarak 15 mL'lik steril konik bir tüpe aktarın. Nörosferleri yerleştirmek için 630 × g sıcaklıkta 4 °C'de 1 dakika boyunca santrifüj yapın. Aspirat süpernatant, peletlenmiş nörosferleri rahatsız etmemeye dikkat ederek. Hücreleri steril 1x PBS'de yeniden süzülerek yıkayın, ardından tekrar 630 × g ile 5 dakika boyunca 4 °C'de santrifüj yapın ve süpernatantı aspire edin.
5. Hücre pelletine 1 mL %0,05 Tripsin/EDTA ekleyin. 1 mL'lik mikropipette ile 3–5 kez yukarı aşağı pipet yapın, ardından 37 °C'de su veya boncuk banyosunda 5–6 dakika kuluçka yapın.
   1. İnkubasyondan sonra, nörosferleri parçalamak için 1 mL mikropipetle 5–10 kez nazikçe yukarı ve aşağı pipet yapın. NSC ortamında 1 mL %10 FBS ekleerek tripsini nötralize edin; Pipet nazikçe karıştırın.
      NOT: Nörosferlerin aşırı tripsizasyonu ve/veya aşırı güçlü pipetlenmesinden kaçının; çünkü bu NSC'lere zarar verebilir ve hücre canlılığını etkileyebilir.
6. 2.5 mL DM ekleyip 630 × g'de 4 °C'de 5 dakika boyunca santrifüj yapın. Üst natantı aspire edin. Yıkama adımını 2.5 mL DM daha ile tekrarlayın, ardından santrifüj ve süpernatantın aspirasyonu uygulanarak ortamdaki FBS izlerini giderin.
7. Hücreleri 1 mL taze, tam NSC ortamında yeniden süspansiyona alın. Filtre hücresi süspansiyonu, 40 μm steril bir filtreyi 50 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne yerleştirerek, ardından hücre çözeltisini filtrenin üstüne ekleyerek yerçekiminin çözeltiyi tüpe boşaltmasına izin vererek filtreleyin. Kalan ayrışmamış hücreler filtre tarafından yakalanırken, tek hücreler aşağıdaki çözeltiye geçer.
8. Yeniden süzülmüş, filtrelenmiş hücrelerden 10 μL hücre sayımı için alın ve 10 μL trypan mavisiyle karıştırın. Manuel hemositometre kullanılarak, örnekten 10 μL yükler ve canlı hücreleri (yani mavi olmayan hücreleri) standart^{uygulama 29'a} göre sayar. Alternatif olarak, otomatik hücre sayacı kullanılabilir, ancak hücre kalıntıları veya^{agregalar 30,31} varlığında daha az doğru olabilir.
   NOT: Genel olarak, toplam hücrelerin %10–%15'inden azı hücre ölümü belirtileri göstermelidir (örneğin, tripan mavisi dışarı edilememesi). Daha yüksek hücre ölüm oranları, aşırı tripsizasyon, hücreleri ayırmada aşırı mekanik kuvvet veya tripsinasyondan önce kültürün genel sağlığının kötü olmasından kaynaklanabilir ( bkz. Tablo 1, Noktalar 1–3). Bu durum sonraki uygulamaları olumsuz etkileyebileceğinden, yüksek hücre ölüm oranları gözlemlenirse hücrelerin yeniden kaplanması (Adım 2.9) ve tekrar genişletilmesi (örneğin, 2.1–2.9. Adımlar tekrarlanması) önerilir; eğer hücre ölüm oranları yüksek olduğunda transdüksiyona geçilmek yerine.
9. 5 x 10⁵ hücreyi 2 mL taze tam NSC ortamına seyreldin ve ultra düşük tutucu, 6 yuvalı bir plakanın bir kuyusuna plaka ekleyin. Her kuyuya her üç günde 0,5–1 ml taze NSC beslemesi uygulanarak optimum kültür sağlığı sağlanır. Tam oluşmuş, sağlıklı küreler göründüğünde ( bkz. Tablo 1, Nokta 4), kültür 3. veya 4. adımda kullanıma hazırdır.
   NOT: Ekstra NSC'ler bu noktada, 1 milyon NSC'nin 1 mL serumsuz hücre dondurma ortamında 1,5 mL kriyovialde yeniden süzülerek ve -80 °C'de depolanarak depolanabilir. NSC'ler gerekirse, 6 kuyu plakasının ekstra kuyularına ek hücreler yerleştirilerek veya T-25 şişelerine kaplama yapılarak daha da genişletilebilir.

3. Ebeveyn hücrelerde blastisidin öldürme eğrisi

NOT: Geçiş yapılan NSC'ler sağlıklı nörosferler oluşturduğunda, hücreler sonraki deneylere hazırdır. Transdüksiyondan önce, seçici antibiyotiğin (bu durumda blastisitin) optimal konsantrasyonunu belirlemek kritik öneme sahiptir. Bu ampirik olarak yapılmalıdır, çünkü farklı NSC popülasyonları antibiyotiğe farklı duyarlılığa sahip olabilir. Eğer bu zaten verilen hücre tipi için belirlenmişse, 4. Adıma geçin.

1. Baz NSC ortamını, DM, %0,05 Tripsin-EDTA ve PBS'yi 37 °C'de önceden ısıtın. B27, N2, FGF, EGF, FBS ve blastisidin eritme stokları. Başlamadan önce veya aşağıdaki kuluçka aşamaları sırasında, yukarıda açıklandığı gibi taze, tam NSC ortamı ve %10 FBS üretin.
2. Yukarıda Adım 2.9'dan kültür sonrası yeni genişletilmiş nörosferler kullanılarak, tripsinasyon ve ardından 2.5–2.6. adımlara göre bölünür, ardından saymak için 1 mL taze NSC ile tekrar süzülür. Hücreleri yukarıda açıklandığı gibi 40 μm steril filtreden geçirerek ayrışmamış hücreleri çıkarın, ardından Adım 2.8'de açıklandığı gibi hücreleri sayın.
3. 25.000 canlı hücreyi 15 mL konik koniklerde 2,5 mL taze tam NSC alikotuna yeniden askıya alın, her antibiyotik konsantrasyonu için 1 aliquot hazırlanarak test edilecektir. En az 4–6 farklı konsantrasyon test etmeyi planlayın, ancak istenirse daha fazlası da test edilebilir.
4. İstenen son konsantrasyonu elde etmek için her 2,5 mL aliquot'a uygun miktarda blastisidin ekleyin (örnek hesaplamalarına Tablo 2'deki bakınız). Her kuyu için 500 μL askıda hücreler (5.000 hücre) 24 delikli ultra düşük bağlantı plakasında her konsantrasyon dört katlı olarak plaka olarak yerleştirilir.
   NOT: Doğru nihai konsantrasyonu elde etmek için, blastisidin stokunun ortama eklenmeden önce seyreltilmesi gerekebilir. Blastisidin NSC ortamında veya PBS'de seyreltilebilir; 1:1000 seyreltilmiş stok (10 mg/mL) için, 999 mL NSC veya PBS'ye 1 mL seyreltilmemiş (10 mg/mL) blastisidin stok ekleyin. Araştırmacıların, malzemeler ısınırken istenen konsantrasyonları elde etmek için tüm gerekli hesaplamaları yapmaları önerilmektedir; Adım 3.1; örnek hesaplamalar Tablo 2'de gösterilmiştir.
5. Hücreleri 37 °C'de kuluçka altına alın. Hücreleri her 24 saatte bir morfolojide değişiklikler ve hücre/nörosfer ölümü için dikkatlice parlak alan mikroskopisiyle kontrol edin. Hücreleri her 3 günde bir 0,5–1 mL taze NSC besleme ortamı ve doğru blastisidin konsantrasyonu eklenerek besleyin.
6. Sonraki blastisidin seçimi için uygun konsantrasyonu, kaplamadan 72–120 saat sonra transdüksiyon yapılmamış hücreleri öldüren en düşük blastisidin konsantrasyonunu belirleyin.
   NOT: Yetişkin fare NSC'leri için, antibiyotik seçimi için en iyi konsantrasyon olarak 1000 ng/mL (1 mg/mL) blastisidin belirlenmiştir (Şekil 3). Sonraki adımlar bu konsantrasyonda blastisidin kullanılarak gerçekleştirilir. Optimal blastisidin konsantrasyonunun hücre preparatları arasında önemli ölçüde değişebileceği, örnek türüne, geçiş sayısına ve kültür koşullarına bağlı olarak genellikle 0,5–10 μg/mL arasında değişebileceği belirtilmelidir^32,33; Bu nedenle, her yeni hücre tipi için ampirik öldürme eğrileri isteğe bağlı değil, gereklidir. Ek sorun giderme ipuçları için Tablo 1, Nokta 5'e bakınız.

4. İlk lentiviral transdüksiyon

NOT: Transdüksiyona geçmeden önce, lentiviral parçacıkların (LVP) transdüksiyonu için optimal enfeksiyon çokluğu (MOI) bilinmek önemlidir. Bu, farklı hücre tipleri için ampirik olarak belirlenmelidir; Bunu yapma yöntemleri daha önce iyi^{tanımlanmıştır 34,35}. Gösterilen örnek sonuçlarda, birincil fare NSC'lerinin transdüksiyonu konusundaki önceki deneyime dayanarak 20 MOI kullanılmıştır.

1. Yukarıda 2.9. adımda hücrelerin genişlemesinden sonra oluşan sağlıklı nörosferler oluşturan genişlemiş, aktarılmamış NSC'lerle başlayın. Hücreleri yukarıdaki Adım 2.3–2.8'e göre ayırın, yeniden süzülür, filtreleyin ve sayın, ardından hücreleri 1,5 x 10^{6 hücre} yoğunluğunda iki kuyuya (biri onkojenik virüs için, biri kontrol için) 6 kuyruklu ultra düşük yapışma plakasına yerleştirin. Plakaları gece boyunca 37 °C'de kuluçka edin.
2. Ertesi gün hücreleri inceleyin. NSC'ler küçük kümeler oluşturuyorsa enfeksiyona hazır olur.
3. Hücreleri enfekte etmeden önce, lentiviral aliquot'u buz üzerinde dikkatlice eriterek yavaş bir çözülme sağlansın. Bu süreci acele ettirmemek çok önemlidir.
   NOT: Örnek amaçlı olarak, bu protokol lentiviral transdüksiyonu iki temsilci yapı kullanarak tanımlar: (1) blastisidin direncine sahip EF1-α promotor altında GFP'yi ifade eden kontrol vektörü ve (2) EF1-α promotör altında N-terminal HA etiketli BRAF V600E onkojenik mutantı ifade eden deneysel vektör, yine blastisidin direncine sahip. Lentivirüs üretimi bu protokolün kapsamının dışındadır ancak daha önce iyi tanımlanmıştır^36,37.
4. Eritildikten sonra, enfeksiyondan hemen önce virüsü kısa bir süreliğine 37 °C'ye kadar ısıtın. Her kuyuya eklenecek LVP hacmini MOI x hücre sayısı/virüs titri formülü kullanarak belirleyin. Hesaplanan hacme ayarlanmış bir mikropipet kullanarak, kültürlenen hücrelere yavaş yavaş LVP'ler damla olarak ekleyin. Plakayı nazikçe döndürerek dağıtın, bitişikteki kuyulara medya dökmemeye dikkat edin. Hücreleri 37 °C'de 24 saat kuluçka edin.
   NOT: Viral aliquot oda sıcaklığına kadar çözüldükten sonra tekrar dondurulamaz ve 24 saat içinde kullanılmalıdır. Aliquot 37 °C'ye ısıtıldığında, 30 dakika içinde kullanılmalıdır.
5. Bu kuluçka döneminin ardından, nörosferleri 630 × g ile 4 °C'de 5 dakika boyunca santrifüj edilir, ardından aspirasyon süpernatı yapılır. 2 mL taze tam NSC ile alıp al, virüs veya antibiyotik olmadan, taze bir yuvada düşük tutucu, 6 kuyruklu bir plakaya yerleştirin.
6. Ertesi gün, birden fazla alanda floresan mikroskopisiyle floresan etiketli hücrelerin/kümelerin toplam hücrelere/kümelere oranını belirleyerek GFP kontrol hücrelerindeki transdüksiyon verimliliğini değerlendirin. Başarılı transdüksiyon için beklenen raporlayıcı ifadesi (GFP) %80'in üzerinde olmalıdır.
   NOT: Optimal olmayan transdüksiyon verimliliği tespit edilirse, ikinci bir enfeksiyon turu (4.4–4.6 adımları tekrarlanarak) gerçekleştirilebilir. Verimlilik iyileşmezse, MOI'nin yeniden optimizasyonunu veya lentivirüsün farklı bir preparatını denemeyi düşünün. Bunlar ve diğer sorun giderme ipuçları için Tablo 1, Nokta 6'ya bakınız.
7. Gelişen nörosferlerin sağlıklı göründüğünü ve enfeksiyon kanıtlarının bulunduğunu (GFP pozitif; ~%80) gözlemledikten sonra, yukarıdaki 2.3–2.6. adımlara göre hücreleri bölmeye devam edin. Hücreleri, uygun blastisidin konsantrasyonu (1000 ng/mL) içeren taze 5 mL tam NSC ortamında yeniden süzülür, ardından 40 μm steril filtrelerden geçirerek hücre kümelerini ortadan kaldırır. Hücreleri sayın, ardından ultra düşük bağlanma T-25 şişelerinde yaklaşık 5 x 10⁴ hücre/mL olarak plaka yapın.
   NOT: Antibiyotikin ilk eklenmesinden sonra, transdüksiyon yapılmayan hücrelerin ölümü nedeniyle hücre ölümü oranı yüksek olabilir; Bu beklenen bir durum ve devam eden seçimle daha iyi hale gelecektir.
8. Hücreleri her 3 günde bir blastisidin içeren bir takviye ile besleyerek genişletin. Tam oluşmuş, sağlıklı küreler genellikle bölünmeden 5–10 gün sonra görünür olur ve kültür 5. veya 6. adımda kullanıma hazır olur.
   NOT: Dirençli klonların daha fazla genişlemesinden sonra, hücreler Western blotting (Adım 7'de açıklanan) için toplanabilir ve floresan olmayan, HA etiketli onkojenik yapının uygun şekilde ifade edildiğini doğrulayabilir. Bu aşamada Western blotting yapılırsa, uygun süreli ifadeyi sağlamak için^ikinci transdüksiyondan (7. adımda) sonra ifadenin kontrol edilmesi yine de önerilir.

5. Blastisitin dirençli NSC'lerde Puromycin öldürme eğrisi

NOT: İkinci transdüksiyon için optimal seçim yoğunluğu da ampirik olarak belirlenmelidir. Bu aşamada blastisitine dirençli transdüksiyon edilmiş NSC'ler kullanılır ve hücreler blastisidin seçimi (1000 ng/mL) altında tutulur; çünkü transdüksiyon ve eşzamanlı blastisidin seçimi puromisine duyarlılığı değiştirebilir.

1. Baz NSC ortamını, DM, %0,05 Tripsin-EDTA ve PBS'yi 37 °C'de önceden ısıtın. B27, N2, FGF, EGF, FBS, blastisidin ve puromisin eritme stokları. Başlamadan önce veya aşağıdaki kuluçka aşamaları sırasında, yukarıda açıklandığı gibi taze, tam NSC ortamı ve %10 FBS üretin.
2. Blastisidine dirençli nörosferler kullanılarak, tripsine edilip ardından 2.5–2.7. Adımlara göre bölünür, 1 mL taze NSC'ye tekrar süzülerek sayma ve filtreleme ile kümeleri çıkarır. Hücreleri Adım 2.8'de tarif edildiği gibi say, ardından 25.000 canlı hücreyi 15 mL koniklerde 2,5 mL taze tam NSC alikotuna yeniden süzülür, her antibiyotik konsantrasyonu için 1 aliquot hazırlanır. En az 4–6 farklı konsantrasyon test etmeyi planlayın, ancak istenirse daha fazlası da test edilebilir.
3. Daha önce optimize edilmiş konsantrasyona ulaşmak için blastisidin ekleyin (1000 ng/mL = 0,25 mL seyreltilmemiş stok / 2,5 mL aliquot). Daha sonra her tüpe uygun miktarda puromisin ekleyerek istenen son konsantrasyonu elde edin (örnek hesaplamalarına Tablo 2'deki bakınız).
4. Her kuyu için 500 μL askıda hücreler (5.000 hücre) 24 delikli ultra düşük bağlantı plakasında her konsantrasyon dört katlı olarak plaka olarak yerleştirilir.
5. Hücreleri 37 °C'de kuluçka altına alın. Hücreleri her 24 saatte bir morfolojide değişiklikler ve hücre/nörosfer ölümü için dikkatlice parlak alan mikroskopisiyle kontrol edin. Hücreleri her 3 günde bir, blastisidin ve doğru konsantrasyonda 0,25 mL taze NSC besleme ortamı ekleyerek besleyin.
6. Sonraki puromisin seçimi için uygun konsantrasyonu, kaplamadan sonraki 72–120 saat arasında hücreleri öldüren en düşük puromisin konsantrasyonunu belirleyin.
   NOT: İllüstrasyon veren GFP ve/veya BRAF-V600E lentivirüslerle transdüksiyon edilen yetişkin fare NSC'leri için, antibiyotik seçimi için en iyi konsantrasyon olarak ampirik olarak 100 ng/mL puromisin belirlenmiştir (Şekil 4). Örnek transdüksiyonlar için, sonraki adımlar yukarıdaki 3. Adımdan 1000 ng/mL blastisidin ve yukarıdaki 5. Adımdan 100 ng/mL puromisin kullanılarak gerçekleştirildi. Sorun giderme ipuçları için Tablo 1, Nokta 5'e bakınız.

6. İkinci lentiviral transdüksiyon

NOT: Hücreler, ikinci transdüksiyon aşamasında blastisidin içeren ortamda kalır, böylece birinci transdüksiyon aşamasında getirilen onkojenik yapı veya GFP kontrolünün hücrelerde korunmasını sağlar.

1. İşleme, aktif olarak çoğalan, stabil şekilde transdüksiyona sahip blastisitine dirençli NSC'ler (Adım 4'te oluşturulmuş) kullanarak başlatın. Kaplama sırasında düzenliliği sağlamak için NSC'leri tek hücreli bir süspansiyona ayırarak başlayın (Adımlar 2.3–2.7).
2. Plaka hücreleri, blastisidin (3. adımda belirlendiği üzere 1000 ng/mL) ile tam NSC ortamında, her kuyu başına 1,5 x 10⁶ hücre yoğunluğunda 6 delikli ultra düşük yapışma plakasına dönüştürülür. Plakaları gece boyunca 37 °C'de kuluçka edin.
3. Ertesi gün, hücreler küçük kümeler oluşturursa transdüksiyona hazır olur. Bicistronik lentivirüsü (lusiferaz ve RFP içeren) buz üzerinde eritiler, ardından enfeksiyondan hemen önce kısa bir süreliğine 37 °C'ye kadar ısınır. Her kuyuya eklenecek LVP hacmini belirleyin; MOI x hücre sayısı/virüs titri formülünü kullanarak; Burada 20 MOI kullanılır.
   1. Hesaplanan hacme ayarlanmış bir mikropipet kullanarak, kültürlenen hücrelere yavaş yavaş LVP'ler damla olarak ekleyin. Plakayı nazikçe döndürerek dağıtın, bitişikteki kuyulara medya dökmemeye dikkat edin. Hücreleri 37 °C'de 24 saat kuluçka edin.
4. Ertesi gün, nörosferleri 630 × g ile 4 °C'de 5 dakika boyunca santrifüj edin ve taze tam NSC içeren blastisidin (Adım 3'e göre 1000 ng/mL) ile yeniden kaplama yapın.
5. Ertesi gün, birden fazla alanda floresan mikroskopisiyle RFP pozitif hücrelerin/kümelerin toplam hücrelere/kümelere oranını belirleyerek ikinci transdüksiyon aşamasının verimliliğini değerlendirin ve optimal verimlilik ~%60 olur.
6. Nörosferlerin sağlıklı göründüğünü ve ikinci transdüksiyon adımının etkili olduğunu (örneğin, hücre kümelerinin çoğunluğu RFP+) gözlemlendikten sonra hücreler çift seçilime hazırdır. NSC'leri tek hücreli bir süspansiyona ayırarak başlayın (Adım 2.3–2.7), ardından yaklaşık 5 x 10⁴ hücre/mL ile ultra düşük bağlanma T-25 şişelerinde blastisidin (1000 ng/mL) ve puromisin (100 ng/mL) içeren tam NSC içinde yeniden kaplama yapın.
   NOT: Yukarıdaki Adım 4.6'da olduğu gibi, optimal olmayan transdüksiyon verimliliği tespit edilirse, ikinci bir enfeksiyon turu (6.3–6.6. adımların tekrarı) gerçekleştirilebilir. Daha fazla sorun giderme ipuçları için Tablo 1'e bakınız.
7. Hücreleri her 3 günde bir blastisidin ve puromisin içeren bir takviye ile besleyin.
   NOT: Kültürlerin dikkatli izlenmesi, çift dirençli klonların belirlenmesi için gereklidir; bu klonlar her iki seçici baskı altında hayatta kalmalarıyla karakterize edilir. Tam oluşmuş, sağlıklı küreler genellikle bölünmeden 5–10 gün sonra görünür olur ve kültür daha fazla doğrulamaya hazırdır (Adım 7).

7. İkili dönüştürülmüş NSC'lerin doğrulaması ve karakterizasyonu

NOT: Daha fazla in vitro veya in vivo deney yapmadan önce, HA etiketli yapıların ve lusiferazın uygun şekilde ifade edildiğinden emin olmak için ek doğrulama önerilir.

1. HA-etiketli yapının ifadesini doğrulamak için Western blotting
   1. Kültür NSC'leri (GFP kontrolü ve HA etiketli BRAF. V600E, verilen örnekte) T-25 ultra düşük yapışma şişelerinde bölünmeye hazır olana kadar (Adım 2.2'ye göre) kullanılır.
      NOT: Bir sonraki adıma geçmeden önce, kültürlerin devam eden GFP ekspresyonu (GFP kontrol hücrelerinde) ve RFP ekspresyonu (tüm hücrelerde) açısından çift kontrol edilmesi önerilir.
   2. Kültürün yarısını çıkarın ve 2.2–2.7. Adımlara göre bölünün, ardından taze, tam NSC ortamına blastisidin (1000 ng/mL) ve puromisin (100 ng/mL) ile yeniden kaplama yapılarak kültür genişlemesi devam eder. Kalan nörosferleri 4 °C'de 630 × g olarak aşağı döndürün, ardından süpernatanttan çekilin.
   3. Daha sonra, peletli NSC'leri iki kez buz gibi PBS ile yıkan, 4 °C'de 630 × g hızla döndürülür ve her yıkamadan sonra süpernatantı emer. Her numuneye yaklaşık 200 μL buz gibi soğuk RIPA lizin tamponu ve proteaz ile fosfataz inhibitörleriyle desteklenerek eklenin.
   4. Lizatların 30 dakika boyunca buzda kuluçka oluşmasına izin verin, böylece her 10 dakikada bir aralıklı girdap oluşmasını sağlayın. Örnekleri 14.000 × g sıcaklığında 4 °C'de 15 dakika boyunca santrifüj yapın. Temizlenmiş lizat olarak adlandırılan süpernatantı dikkatlice taze önceden soğutulmuş bir tüpe aktarın. Lizatları -80 °C sıcaklıkta derin dondurucuda sakla.
   5. Lizat, daha önce belirlenmiş^{protokollere göre} Western blotting (yapıların ifadesini doğrulamak için) için kullanılabilir.
      NOT: Hemen kullanmıyorsanız, lizatları kullanana kadar -80 °C sıcaklıkta saklayın. Numunenin bütünlüğünü korumak için tekrar eden donma-erime döngülerinden kaçının ( bkz. Tablo 1, Nokta No. 7).
2. Ateşböceği lusiferazının uygun ifadesini doğrulamak için biyolüminesans yoğunluğu (BLI)
   NOT: Bu protokol, canlı hücrelerin BLI izlenmesi kullanılarak lusiferaz ifadesini doğrulamakta (daha fazla detay için Materyal Tablosu'na bakınız). BLI algılama ve nicelik için farklı bir sistem kullanılırsa, metodoloji değişkenlik gösterebilir.
   1. NSC'leri ayırın ve yukarıdaki Adım 2.2–2.8'e göre nicelikle ölçün, ardından hücreleri tam NSC ortamında ve plakada farklı konsantrasyonlarda (örneğin, 2,5 x 10⁴ hücre, 1 x 10⁵ hücre/kuyuyu) 24 deliklik ultra düşük yapışma plakasında (500 mL/kuyuy) seyreltin; her hücre konsantrasyonu dörtlü olarak kaplanmıştır. Hücreler, blastisidin (1000 ng/mL) ve puromisin (100 ng/mL) içeren tam NSC ortamında tutulur.
      NOT: Ölçüm sırasında bir kuyunun lusiferaz salgıladığı lüminesans yoğunluğunun bitişik kuyulara sızmasını önlemek için, bitişik kuyulara NSC kaplama yapmaktan kaçının.
   2. Şarj bağlantılı cihaz kameranın optimal çalışma sıcaklığına (yaklaşık -90 °C) soğumasını sağlamak için görüntüleme sistemini en az 30 dakika önceden açın. Nicel yazılımını başlatın ve görüntüleme odasını %70 etanol kullanarak tamamen kurumasını sağlayarak dezenfekte edin.
      NOT: Uzun süreli görüntüleme seansları sırasında hücrenin canlılığını sağlamak için görüntüleme odasının sıcaklığını 37 °C'de tutun.
   3. D-luciferin'in stok aliquotlarını eritire, ışığa karşı korunmasını sağlar. Her hücre içeren her kuyuya nazikçe 5 μL 15 mg/mL D-luciferin çalışma çözeltisi ekleyerek nihai konsantrasyon 150 mg/mL elde edilir. Çözeltinin eşit dağılımı için plakayı hafifçe çevirin.
   4. Plakayı 37 °C'de 10 dakika boyunca kuluçka edin, böylece substratın hücrelere yayılmasını kolaylaştırarak maksimum ışık üretimini teşvik eder.
   5. Plakayı hassas biyolüminesans görüntüleme sistemine yerleştirin. Plakanın üzerine bir ızgara yerleştirin. Pozlama süresi için otomatik pozlama ile başlayarak luminesans görüntüleme modunu seçin. Binning'i orta seviyeye ayarlayın ve ışık toplamayı optimize etmek için f-stop'u 1'e ayarlayın.
      1. 24 kuyu plakalar için görüş alanını 'D' olarak ayarlayın ve konu yüksekliğini 1,5 cm olarak sabitleyin. Görüntüleme yazılımını kullanarak görüntü alın. Sinyal düşük görünüyorsa, pozlama süresi manuel olarak ayarlanabilir (bkz. Sorun Giderme Tablosu Noktası No. 8).
   6. Kontrol kuyruklarına karşı arka plan düzeltmesi yapın ve görüntüleme yazılımı kullanılarak sonraki analizler için gerekli göreceli ışık birimlerini nicelikle ölçün.
      NOT: BLI'nin doğrulanmasının ardından, hücreler daha önce belirlenmiş protokollere uygun olarak singenetik veya bağışıklık sistemi zayıf farelerin beyinlerine ortotopik olarak nakledilebilir^{. 19}.

Sonuçlar

Yetişkin NSC'ler, yetişkin C57BL/6 farelerinin korteksinden izole edilip, yapışmayan kültür^39'da yetiştirildi; bu da 7 ila 10 gün içinde birincil nörosferlerin (20 – 250 μm) oluşumuna yol açtı (Şekil 1). Hücreler daha sonra in vitro genişletildi. Blastisidin seçiminin optimizasyonu daha sonra transdüksiyon edilmemiş NSC'lerde gerçekleştirildi (Adım 3). 24 saat süren seçimden sonra, blastisidin 1000 ng/mL veya üzerind...

Tartışma

Bu iki aşamalı lentiviral transdüksiyon yöntemi, onkoloji araştırmalarına uygun genetik olarak modifiye edilmiş NSC'ler oluşturmuştur. Burada, BRAF V600E onkojenik mutasyonunun (yetişkin yüksek dereceli gliomaların bir alt kümesinde bulunan ve burada kavram kanıtı olarak kullanılan) veya GFP kontrolünün çift raporlayıcı sistemlerle biyolüminesans görüntüleme (lusiferaz) ve floresan mikroskopi tespiti (RFP) için etkili entegrasyonu gösterilmiştir. Sabit MOI 20 ile ardışık transdü...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
β-mercaptoethanol (BME)	Sigma	M3148-25ML	Biyolojik güvenlik dolabında kullanın. 10 mL düşük glikozlu DMEM'e 35 mL BME ekleyerek 50 mM stoklarını yapın, sterilize edin ve 500 mL'lik kullanım alıkları halinde ortam hazırlığı için paylaşın.
Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody	Cell Signal Technology	7076	% 1 Yağsız sütte 1: 2000 seyreltikte kullanılır
B-27 Supplement (50X),	Gibco	17504-044	İlk kullanımda çözdürün ve gelecekte kullanılmak üzere 1ml'lik alıklar yapın; alıkları -20 °C'de saklayın. Kullanmaya hazır hale gelene kadar çözeltiyi buz üzerinde bekletin
Blasticidin S HCl (10 mg/mL)	Gibco	A1113903	10 mg/mL stoğun alıklarını yapın; 200 mL'lik küçük tüplere koyun ve kullanılinceye kadar -20 °C'de saklayın.
Bovine Serum Albumin (BSA)	Millipore-Sigma	A1470-10G	% 10 BSA ağırlık/hacim olarak 1x PBS'de kullanılır. BSA yapışkandır; doğru şekilde tartıp uygun hacimde çözücü ekleyerek tam çözeltiyi yapmaya dikkat edin.
Cell Strainer (40 µm)	Midsci	40ICS	Önceden sterilize edilmiş ve bireysel olarak sarılmış. Biyolojik güvenlik dolabında açılmalıdır. Elinizle dokunmayın
D-Luciferin, Potassium Salt	Gold Biotechnology	eLUCK-100	Moleküler sınıf suda seyreltilerek 15 mg/mL çalışma çözeltisi yapın ve kullanmadan önce sterilize edin. Her seferinde taze stoklar hazırlayın ve son çalışma konsantrasyonunu 150 mg/mL elde etmek için doğrudan ortama ekleyin (örn. 500 mL kültüre 5 mL çalışma çözeltisi)
DMEM, Low-Glucose	Gibco	11885-084	Temel NSC ortamını yapmak için kullanılır
Epidermal Growth Factor (EGF)	Corning	354001	Steril liyoflilize toz halinde tedarik edilir; 1000X stokunu hazırlamak için 100 µg liyoflilize EGF tozuna 4,95 mL PBS ve 50 µL % 10 BSA (1x PBS'de) ekleyin ve karıştırmak için pipetleyin.  Tam NSC ortamı ve NSC besleme takviyesi için küçük tüplerde 500 µL veya daha küçük alıklar yapın ve kullanılmadan önce -20° C'de saklayın. Tekrar donma-çözme döngülerinden kaçının.
Fibroblast Growth Factor, Basic (FGF)	R&D systems	233-FB	Steril liyoflilize toz halinde tedarik edilir; 1000X stokunu hazırlamak için 25 µg liyoflilize FGF tozuna 1,24 mL PBS ve % 10 BSA'nın 12,5  µL'ini (1x PBS'de) ekleyin ve karıştırmak için pipetleyin.  Tam NSC ortamı ve NSC besleme takviyesi için küçük tüplerde 500 µL veya daha küçük alıklar yapın ve kullanılmadan önce -20° C'de saklayın. Tekrar donma-çözme döngülerinden kaçının.
Glucose, 45%	Corning	25-037-CI	Steril çözelti olarak tedarik edilir. Biyolojik güvenlik dolabının dışında açmayın
HA-Tag (C29F4) Rabbit mAb	Cell Signal Technology	3724	HA-tag ekspresyonunu doğrulamak için Western blotting'de % 3 Bovin serum albümininde 1: 1000 seyreltikte kullanılır
HBSS, 10x	Gibco	14185-052	Steril çözelti olarak tedarik edilir. Biyolojik güvenlik dolabının dışında açmayın
HEPES, 1 M	Corning	25-060-CI	Steril çözelti olarak tedarik edilir. Biyolojik güvenlik dolabının dışında açmayın
IVIS 50	PerkinElmer		Cihaz, kameranın optimal sıcaklığa soğuması için kullanılmadan 30 dakika önce açılmalıdır. Nicelleştirme için Living Image yazılımı (sürüm 4.3.1) kullanılır.
Lentivirus-Luciferase (Firefly)-2A-RFP	AMSBio	LVP324-PBS	LVP, -80 °C'de buzdolabında alıklanarak saklanmalıdır
L-Glutamine, 200 mM	Corning	25-005-CI	Steril çözelti olarak tedarik edilir. Biyolojik güvenlik dolabının dışında açmayın
Molecular-Grade Water	Corning	46-000-CM	Steril çözelti olarak tedarik edilir. Biyolojik güvenlik dolabının dışında açmayın
N-2 Supplement (100x)	Gibco	17502-048	İlk kullanımda çözdürün ve gelecekte kullanılmak üzere 1ml'lik alıklar yapın; alıkları -20 °C'de saklayın. Kullanmaya hazır hale gelene kadar çözeltiyi buz üzerinde bekletin
Nestin (E5C7I) Rabbit mAb	Cell Signal Technology	89529	NSC belirteci ekspresyonunu doğrulamak için Western blotting'de % 3 Bovin serum albümininde 1: 1000 seyreltikte kullanılır
Neurobasal Media	Gibco	21103-049	Temel NSC ortamını yapmak için kullanılır
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140-122	Steril