Araştırma makalesi

İnsan İkincil-antral Folikül Gelişimini Destekleyen Üç Boyutlu Kültür Modeli In Vitro

DOI:

10.3791/70713

⸱

16 Haziran 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Female Fertility Promotion, Center for Reproductive Medicine, Department of Obstetrics and Gynecology, Peking University Third Hospital, 2National Clinical Research Center for Obstetrics and Gynecology, Peking University Third Hospital, 3Key Laboratory of Assisted Reproduction (Peking University), Ministry of Education, 4Beijing Key Laboratory of Collaborative Innovation in Frontier Technologies for Population Quality, 5Department of Surgical Oncology, Beijing Children's Hospital, Capital Medical University, National Center for Children's Health, 6The University of Hong Kong- Shenzhen Hospital

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, insan folikül gelişimini ikincil aşamadan antral aşamaya in vitro sürdüren üç boyutlu (3D) bir kültür modeli oluşturmuştur. Bu sistem, somatik hücre moleküler özelliklerini korurken folikül büyümesini ve antrum oluşumunu sağlar ve insan follikülogenezi araştırmaları için kritik bir model sağlar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İnsan yumurtalık follikülogenezi, doğrudan in vivo incelenmesi zor olan karmaşık ve sıkı bir şekilde düzenlenmiş bir süreçtir. In vitro modeller mekanik araştırmalar için gerekli olsa da, mevcut sistemler folikül gelişiminin uzaylı-zamansal dinamiklerini özetleyemedikleri için optimal kalmıyor. Bu çalışma, insan folikül gelişimini ikincil aşamadan antral aşamaya kadar destekleyen 3D bir kültür modeli sunmaktadır. Bu model, kalıcı foliküler büyüme, 10. günden itibaren belirgin bir çaplı genleşme evresi ve 20. gün civarında antral boşluk oluşumu gibi önemli in vivo morfolojik olayları başarıyla özetlemektedir. Önemli olarak, bu gelişimsel ilerleme germinal vezikül (GV) aşamasında canlı oositlerin başarılı bir şekilde alınmasıyla sonuçlandı. Ayrıca, immünoflüoresans analizi, somatik hücrelerde gonadotropin reseptörlerinin granüloza ve theca hücre kimliğiyle uyumlu belirgin ifade kalıplarını ortaya koydu. İç granüloza benzeri hücreler yüksek folikül uyarıcı hormon reseptörü (FSHR) gösterirken, dış teka benzeri hücreler yüksek luteinizasyon hormonu reseptörü (LHR) ekspresyonunu gösterdi. Bu model, insan follikülogenezi ve üreme toksikolojisini incelemek için değerli bir platform sunar ve ikincil ve antral evre gelişim için in vitro folikül kültür sistemlerinin optimize edilmesinde bir referans sağlar.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yumurtalık folikül gelişiminin fizyolojik süreci, ilköğretimden preovulyatif aşamaya kadar kadın doğurganlığı için temelbir süreçtir. Bu süreç, oosit büyümesi/olgunlaşması ve granuloza hücre çoğalması/farklılaşması gibi son derece koordineli bir dizi olayiçerir. Bu karmaşık mekanizmalardaki bozulmalar, kısırlık ve yumurtalık fonksiyon bozukluğunun başlıca nedenlerinden biridir. Follikülogenezin altında yatan düzenleyici ağların ayrıntılı bir şekilde anlaşılması—parakrin sinyal, oosit-somatik hücre etkileşimleri ve hücre dışı matris dinamiklerini kapsayan—kritik patofizyolojik öneme sahiptir. Ancak, insan follikülogenezisinin in vivo doğrudan araştırılması, etik ve pratik sınırlamalarla sınırlı kalıyor ve bu da bu mekanizmaları aydınlatmak için güvenilir in vitro modellere ihtiyaç duymaktadır. Gelişmelere rağmen, özellikle ikincil aşamadan antral aşamaya kadar insan folikül gelişimini destekleyen uzun vadeli bir kültür modelinin kritik bir eksikliği hâlâ vardır.

İki boyutlu (2D) veya üç boyutlu (3D) matrislerdeki insan folikül kültürü erken folikülergelişimi 3,4 daha iyi anlamaya sahip olsa da, bu sistemler ilerlemeyi daha sonraki aşamalara desteklemede sınırlı kalır. İnsan follikülogenezini in vitro ve ilerleyen gelişim evrelerine kadar gerçekleştirmek, daha büyük folikül büyüklükleri ve uzun olgunlaşma zaman çizelgesi nedeniyle özellikle zor olmaya devam etmektedir5. MII oositlerini başarılı şekilde vermiş sınırlı sayıda insan in vitro folikül kültür sistemi arasında bile, olgunlaşma oranları düşük (en fazla yaklaşık %20) kalır6,7,8,9. Belki de daha temel bir zorluk, henüz in vitro olarak yeterince modellenmemiş kritik ve yapısal olarak karmaşık bir aşama olan ikincil-antral geçişin tekrarıdır.

Bu çalışma, insan ikincil foliküllerinin antiral foliküllere ayırt edici boşluk yapılarına dönüşmesini destekleyen in vitro gelişimini destekleyen bir 3D kültür modeli oluşturdu. Bu model, insan folikül gelişiminin altında yatan düzenleyici mekanizmaların daha fazla incelenmesi için temel bir platform sağlar ve ikincil-antral gelişimi hedefleyen folikül kültür sistemlerinin gelecekteki optimizasyonu için bir referans işlevi görür.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma protokolü, Pekin Üniversitesi Üçüncü Hastanesi Etik Komitesi tarafından incelenip onaylandı (Onay No. M2024151). Çalışmaya katılan reşit olmayanların tüm yasal vasileri bilgilendirilmiş onay formunu imzalamıştır.

Doku kaynağı
Bu protokolde kullanılan insan yumurtalık meduller dokusu, yumurtalık teratomu teşhisi konmuş dört pediatrik hastadan (2, 6, 13 ve 16 yaşlarında) ve araştırma amacıyla yumurtalık dokusu bağışlayan dört pediatrik hastadan alınmıştır (Tablo 1). Yumurtalık korteksi yumurtalık dokusu kriyokoruma çalışmaları için kullanılırken, kalan meduller doku in vitro folikül kültürü için kullanıldı. Toplamda 33 ikincil folikül izole edildi; 16 folikül kontrol grubuna, 17 folikül ise 3D kültür grubuna atandı.

Reaktif hazırlama
Taşıma ortamı, Leibovitz'in L-15 ortamından oluşuyordu, %10 serum ikame takviyesi eklendi ve 4 °C'de depolandı. Tam sindirim çözeltisi, MEMα'ya 0.04 mg/mL Liberase DH, 10 IU/mL DNase I ve 100 IU/mL penisillin-streptomisin takviyesi verilerek hazırlanmış ve -20 °C sıcaklıkta saklanmıştır. Sindirim durdurma çözeltisi, DPBS ile %10 serum ikame takviyesi ile takviye edilip 4 °C'de saklandı. Tam büyüme ortamı, MEMα'ya %10 serum ikame takviyesi, %1 insülin-transferrin-selenyum, 50 μg/mL L-askorbin askorbin asit, 2 mM sodyum piruvat ve 100 IU/mL penisilin streptomisin takviyesi ile hazırlandı. Malzeme 4 °C'de depolanmıştır. Rekombinant insan folikül uyarıcı hormonu (FSH), kültür başlatımında nihai konsantrasyona 100 mIU/mL eklendi; önceki birçalışmada belirtildiği gibi. Erken antrum oluşumunun görsel tespiti (yaklaşık 20. gün) sonucunda, rekombinant insan luteinizasyon hormonu (LH) ortam değişimleri sırasında nihai konsantrasyon olarak 10 mIU/mL olarak eklendi. Katı kültür matrisi, %70 (v/v) bazal zar matrisi ile %30 (v/v) buz soğukluğu tam büyüme ortamı karıştırılmış ve tüm işlem aşamalarında buz üzerinde tutularak hazırlanmıştır.

Doku sindirimi ve ikincil folikül izolasyonu
Yumurtalık dokusu taşınma ortamına yerleştirildi ve 4 °C sıcaklıkta laboratuvara taşındı. Steril koşullarda, yumurtalık medullası bir bistüri kullanılarak diseksiye edildi. Doku ince parçalara (~3 × 3 × 1 mm) ayrıldı ve doku doğrayıcıyla küçük parçalara (~0,5 × 0,5 × 1 mm) parçalandı, doku her yerde nemli tutuldu. Kıyma dokusu 35 mm'lik bir kaba aktarıldı ve 100 mg doku başına 2 mL ile önceden ısıtılmış tam sindirim çözeltisi eklendi. Kuluçka işlemi 37 °C'de 45–80 dakika (ortalama: 60 ± 15 dakika) ve her 10 dakikada bir nazikçe karıştırıldı. Mikroskobik incelemede stromal matriksin gevşemesi ve bireysel foliküllerin salındığı ortaya çıkınca sindirim sona ermiştir (Şekil 1). Sağlıklı ikincil foliküller (çapı 100–200 μm, ≥ 2 granüloza hücre tabakası ve görünür bir oosit) cam ağız kontrollü pipet (iç çapı 200 μm) kullanılarak stereomikroskop altında seçildi ve önceden ısıtılmış tam büyüme ortamı ile iki kez yıkandı.

3D gömülme ve uzun vadeli kültür
Bir hücre kültürü eki, 2 mL tam büyüme ortamıyla nemlendirilmiş 35 mm'lik bir kaba yerleştirildi ve 2 saat boyunca bir kuluçka içinde (37 °C, %5 CO₂) önceden dengelendi. Seçilmiş ikincil foliküller inserte aktarıldı ve aynı koşullarda gece boyunca ön kültür yapıldı. Pre-kültürün sonunda, kontrol grubundaki foliküller doğrudan insert içinde (2D kültür) kültürlenmiştir. Buna karşılık, 3D kültür grubu için belirlenen foliküller, büyüme faktörü azaltılmış bazaz zar matrisine (toplam protein 8~12 mg/mL) gömülmek üzere hazırlandı. Matris buz üzerinde eritildi ve %30 (v/v) buz soğukluğu tam büyüme ortamıyla karıştırıldı. Karışımın 40 μL'lik damlacıkları, yaklaşık 1,5 mm yüksekliğinde uniform bir jel tabakası oluşturmak için 35 mm'lik bir kaba (her tabak başına maksimum altı damla) yerleştirildi. Daha sonra, her damlaçaya cam ağız kontrollü pipet kullanılarak tek bir ikincil folikül aktarılır ve damlanın orta-üst üçte birine dikkatlice yerleştirilerek batmasını önlüyordu. Çanak, jelleşme için 30 dakika boyunca bir kuluçka makinesine (37 °C, %5 CO₂) yerleştirildi. Katılaşmadan sonra, uzun süreli kültür başlatmak için 2 mL tam büyüme ortamı nazikçe eklenir.

Kültür bakımı ve izleme
Her 48 saatte bir taze tam büyüme ortamı (FSH içeren) ile %50 bir ortam değişimi yapıldı. Foliküller her gün stereomikroskop altında gözlemlenmiş, çapları ve morfolojik özellikleri kaydedilmiştir. Erken antrum oluşumunun görsel olarak tespit edilmesi (yaklaşık 20. gün), sonraki değişikliklerde ortama rekombinant insan LH eklendi. Kültür, 30 güne kadar veya foliküller antral aşamaya (çapı 400 μm > ve açıkça tanımlanmış sıvı dolu bir boşluğa ulaşana kadar) sürdürüldü.

Post-kültür hücre ayrışması
Kültür sonunda, antral foliküller taze DPBS içeren bir kaba aktarıldı ve steril 29-gauge şırınga kullanılarak mekanik olarak ayrıldı. İzole kümülüs-oosit kompleksleri (COC) daha fazla analiz için ayrı bir tabakaya aktarıldı. Kalan granuloza ve theca hücre süspansiyonu, 2 mL önceden ısıtılmış tam büyüme ortamı içeren yeni 35 mm bir çanağa aktarıldı, eşit dağılım için nazikçe döndü ve 48 saat (37 °C, %5 CO₂) kuluçka edildi.

İmmünoflüoresans analizi
Kültür sonrası, hücreler oda sıcaklığında %4 paraformaldehit ile 30 dakika sabitlendi. Daha sonra örnekler PBS ile üç kez yıkanmış, %0,5 Triton X-100 ile 20 dakika geçirimli hale getirilmiş ve ardından %1 BSA ile 4 °C'de gece boyunca bloklanmıştır. Hücreler gece boyunca 4 °C'de primer antikorlarla kuluçka edildi. Kullanılan birincil antikorlar anti-FSHR (tavşan, 1:200) ve anti-LHR (fare, 1:100) idi. İnkubasyon sonrası hücreler, her biri 15 dakika boyunca üç kez yıkanarak %1 BSA içeren PBS ile yıkanmıştır. Daha sonra, floresan ikincil antikorlarla (anti-tavşan ve anti-fare, 1:200) oda sıcaklığında karanlıkta 2 saat kuluçka edildi. Son olarak, hücreler her biri 20 dakika süren üç son yıkama geçirdi. Çekirdekler oda sıcaklığında 5 dakika boyunca DAPI ile boyandı. Sonra örnekler 5 dakika boyunca üç kez yıkandı, PBS %1 BSA içeriyordu. Görüntüleme, konfokal modda Operetta CLS yüksek içerikli görüntüleme sistemi kullanılarak gerçekleştirildi. Floresan sinyalleri, DAPI (405 nm), Alexa Fluor 488 (LHR) ve Alexa Fluor 647 (FSHR) kanalları kullanılarak alındı; tüm örneklerde tutarlı pozlama ayarları sağlandı.

İstatistiksel analiz
5., 10. ve 15. günlerde kontrol grubu ile 3D kültür grubu arasında folikül çapı karşılaştırmaları bağımsız bir t-testi kullanılarak yapıldı. P < değeri 0.05 istatistiksel olarak anlamlı olarak kabul edildi. Folikül çapının istatistiksel analizi 15. günden sonra yapılmadı, çünkü kontrol grubundaki neredeyse tüm foliküller 15. günden sonra hayatta kalamadı. Bu durum, yetersiz bir örneklem büyüklüğüne yol açtı ve böylece güvenilir ve anlamlı grup karşılaştırmaları mümkün olmadı. Tüm istatistiksel analizler GraphPad Prism (sürüm 9.0) kullanılarak gerçekleştirildi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İnsan foliküllerinin antral aşamaya kadar büyümesini destekleyen 3D kültür modelinin geliştirilmesi
Yumurtalık folikül araştırmalarında büyük bir zorluk, antral boşluk oluşumunu önemli bir dönüm noktası olarak gösteren tam folikül gelişimini destekleyen in vitro kültür sistemi geliştirmektir. Bu nedenle, bu çalışma insan folikülleri için in vitro olarak 3B kültür modeli oluşturdu (Şekil 2). 4 donörden to...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İnsan yumurtalık foliküllerinin in vitro ve ikincil ve antral geçiş boyunca başarılı bir şekilde korunması, önemli bir teknik ilerlemeyi temsil eder. Bu çalışmada, uygun biyofiziksel destek ve aşamaya özgü hormonal ipuçları sağlayan 3D kültür sistemi bu ilerlemeyi mümkün kıldı. Bu sonuçlar, doku fizyolojisini yeniden anlatmak için 3B kültür sistemlerinin gerekliliğini vurgulayan son kanıtlarla örtüşmektedir. Geleneksel 2B monokatmanlar operasyonel olarak basit olsa da, yerel hüc...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm yazarlar, rekabet eden çıkarları olmadığını belirtir.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Pekin Doğa Bilimleri Vakfı (Z230013) tarafından desteklendi; Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (T2293764, 82501980, 82288102); Ulusal Anahtar Teknoloji R& Çin D Programı (2022YFC2703000); Pekin Üniversitesi'nin Klinik Tıp Plus X - Genç Akademisyenler Projesi (PKU2025PKULCXQ033); Pekin Üniversitesi Üçüncü Hastanesi Klinik Anahtar Projesi (BYSYZD2021019); Yüksek İnovasyon Planı (202504841089); ve Çin Doktora Sonrası Bilim Vakfı (GZC20230145). Şematik diyagram https://BioRender.com. yılında oluşturulmuştur.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Anti-FSHRHuaBioER1909-08
Anti-LHRSanta Cruzsc-293165
Anti-mouse(secondary)AbcamAB150113
Anti-rabbit(secondary)AbcamAB205718
Basement membrane matrix for organoid cultureMCEK6004 
BSASigmaA1933
Cell culture insert MilliporePICMORG50
Culture dishCorning430165
DAPIBeyotimeC1006
DNase I ThermoEN0525
DPBSGibco14190144
FSHMerckF4021
IncubatorThermoHeracell 3111
Insulin-Transferrin-SeleniumGibco41400045
L-Ascorbic acidMCEHY-B0166
Leibovitz's L-15 mediumGibco11415064
LHMerckL6420
Liberase DHRoche5401054001
McIlwain Tissue chopperMickle Laboratory Engineering Co. Ltd.MP10180-220
MEMαGibco41061029
ParaformaldehydeSolarbioP1110
PBSGibco10010023
Penicillin-StreptomycinGibco15140122
Serum substitute supplementFUJiFILM Irvine90194
Sodium pyruvateGibco11360070
StereomicroscopeNikonSMZ1270
The high-content imaging systemPerkinElmer Operetta CLS
Triton X-100SigmaX100

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zhang, H., Liu, K. Cellular and molecular regulation of the activation of mammalian primordial follicles: somatic cells initiate follicle activation in adulthood. Hum Reprod Update. 21 (6), 779-786 (2015).
  2. McGee, E. A., Hsueh, A. J. Initial and cyclic recruitment of ovarian follicles. Endocr Rev. 21 (2), 200-214 (2000).
  3. Hovatta, O. Cryopreservation and culture of human primordial and primary ovarian follicles. Mol Cell Endocrinol. 169 (1-2), 95-97 (2000).
  4. Wang, T. R., et al. Basic fibroblast growth factor promotes the development of human ovarian early follicles during growth in vitro. Hum Reprod. 29 (3), 568-576 (2014).
  5. Telfer, E. E. Future developments: In vitro growth (IVG) of human ovarian follicles. Acta Obstet Gynecol Scand. 98 (5), 653-658 (2019).
  6. Guo, Y., et al. Neurotrophin-4 promotes in vitro development and maturation of human secondary follicles yielding metaphase II oocytes and successful blastocyst formation. Hum Reprod Open. 2024 (1), hoae005(2024).
  7. Xiao, S., et al. In vitro follicle growth supports human oocyte meiotic maturation. Sci Rep. 5, 17323(2015).
  8. McLaughlin, M., Albertini, D. F., Wallace, W. H. B., Anderson, R. A., Telfer, E. E. Metaphase II oocytes from human unilaminar follicles grown in a multi-step culture system. Mol Hum Reprod. 24 (3), 135-142 (2018).
  9. Xu, F., et al. Matrix-free 3D culture supports human follicular development from the unilaminar to the antral stage in vitro yielding morphologically normal metaphase II oocytes. Hum Reprod. 36 (5), 1326-1338 (2021).
  10. Wang, H., et al. Rejuvenation of aged oocyte through exposure to young follicular microenvironment. Nat Aging. 4 (9), 1194-1210 (2024).
  11. Brevini, T. A. L., Pennarossa, G., Gandolfi, F. A 3D approach to reproduction. Theriogenology. 150, 2-7 (2020).
  12. Kapałczyńska, M., et al. 2D and 3D cell cultures - a comparison of different types of cancer cell cultures. Arch Med Sci. 14 (4), 910-919 (2018).
  13. Francés-Herrero, E., et al. Bioengineering trends in female reproduction: a systematic review. Hum Reprod Update. 28 (6), 798-837 (2022).
  14. He, X. Microfluidic Encapsulation of Ovarian Follicles for 3D Culture. Ann Biomed Eng. 45 (7), 1676-1684 (2017).
  15. Healy, M. W., et al. Creating an Artificial 3-Dimensional Ovarian Follicle Culture System Using a Microfluidic System. Micromachines (Basel). 12 (3), 261(2021).
  16. Aziz, A. U. R., et al. A Microfluidic Device for Culturing an Encapsulated Ovarian Follicle. Micromachines (Basel). 8 (11), 335(2017).
  17. Laronda, M. M., et al. A bioprosthetic ovary created using 3D printed microporous scaffolds restores ovarian function in sterilized mice. Nat Commun. 8, 15261(2017).
  18. Hugues, J. N., Massart, P., Cedrin-Durnerin, I. Assessment of theca cell function: a prerequisite to androgen or luteinizing hormone supplementation in poor responders. Fertil Steril. 99 (2), 333-336 (2013).
  19. Zhu, Z., et al. LSD1 promotes the FSH responsive follicle formation by regulating autophagy and repressing Wt1 in the granulosa cells. Sci Bull. 69 (8), 1122-1136 (2024).
  20. Shao, T., et al. Autophagy regulates differentiation of ovarian granulosa cells through degradation of WT1. Autophagy. 18 (8), 1864-1878 (2022).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

nsan Folik l Geli imiOveryan Folik logenezn Vitro Folik l K lt rSekonder Folik lFolik ler B y memm nofloresan AnalizGonadotropin Resept rleriGran loza H creleri

İlgili makaleler