C57BL/6 farelerde MNU ile indüklenen retina dejenerasyonunda ALDH2-SIRT1-endoplazmik retikülüm stres ekseninin farmakolojik modülasyonu: In Vivo Bir Çalışma

Özet

Çalışma, retina hasarını indüklemek için C57BL/6 farelerine metil-nitrosourea uygulanmasını ve ardından ALDH2 aktivatörleri ve inhibitörleriyle SIRT1 ve endoplazmik retikulum stres (ERS) modülatörleriyle tedavi edilmesini içeriyordu. Protokol, bu tedavilerin retina dejenerasyonu üzerindeki koruyucu etkilerini ve aldehit metabolizması üzerindeki etkilerini araştırmayı amaçladı.

Özet

Bu çalışma, aldehit dehidrojenaz 2 (ALDH2) aktivasyonunun (Alda-1 aracılığıyla), ALDH2 inhibitisiyonunun (Daidzin aracılığıyla) ve sirtuin 1 (SIRT1) ile endoplazmik retikulum stresinin (ERS) metil-nitrosourea (MNU) kaynaklı retina hasarı üzerindeki koruyucu etkilerini C57BL/6 farelerinde incelemiştir. Yetmiş iki fare rastgele olarak sekiz gruba ayrıldı; bunlar arasında bir kontrol grubu, bir MNU-tek bir grup ve çeşitli tedavi kombinasyon grupları bulundu. Farelere sırasıyla ALDH2-SIRT1-ERS eksenini hedefleyen agonist ve inhibitör intraperitoneal enjeksiyonları verildi. Vücut ağırlığı, retina tabakası kalınlığı ve aldehit metabolizması biyobelirteçleri tedavi sonrası ikinci ve dördüncü günlerde değerlendirildi. MNU uygulaması retina dejenerasyonuna yol açtı ve kontrol hariç tüm gruplarda önemli vücut kilo kaybına yol açtı. Alda-1 ile yapılan tedavi retina hasarını hafifletti, Daidzin ise daha da kötüleştirdi. SIRT1'in farmakolojik inhibisyonu (EX-527 aracılığıyla) Alda-1'in koruyucu etkilerini azalttı ve ERS indüksiyonu (TUN aracılığıyla) faydalarını neredeyse ortadan kaldırdı. Buna karşılık, SIRT1 aktivasyonu (SRT1720 aracılığıyla) Daidzin'in yan etkilerini azaltmış, ERS inhibisyonu (4-PBA aracılığıyla) ise Daidzin'in etkisini kısmen hafifletmiştir. Ayrıca, MNU aldehit metabolizma belirteçleri (malondialdehit [MDA] ve 4-hidroksi-2-nonenal [4-HNE]) seviyelerini artırdı; Alda-1 azalttı, Daidzin ise bu seviyeleri yükseltti. Ayrıca, SIRT1/ERS yollarının farmakolojik modülasyonu, Alda-1 ve Daidzin'in aldehit metabolizması üzerindeki düzenleyici etkilerine müdahale etmiştir. Genel olarak, ALDH2 aktivasyonu retina yapısını korudu ve aldehit metabolizmasını düzenledi; bu da ALDH2-SIRT1/ERS sinyal ekseninin retina dejenerasyonunu azaltmadaki kritik rolünü vurguladı.

Giriş

Retina dejenerasyonu, dünya çapında körlüğün önde gelen nedenlerinden biri olup, retinitis pigmentosa (RP), yaşa bağlı makula dejenerasyonu (AMD) ve diyabetik retinopati (DR) gibi durumları kapsar; bunlar birlikte milyonlarca kişiyi etkiler ve önemli sosyoekonomik yükler^{oluşturur 1,2,3}. Ancak, klinik uygulamada bu kör edici retina hastalıklarının ilerlemesini durduracak son derece etkili farmakolojik tedaviler şu anda eksiklik yaşamaktadır. Retina dejenerasyonunun patogenezi çok faktörlüdür ve oksidatif stres, kronik iltihap ve endoplazmik retikulum stresi (ERS) içerir; bu stres retina hücre homeostazını bozur. Bu stres faktörleri genellikle iç metabolik düzensizlik (örneğin mitokondriyal disfonksiyon) tarafından tetiklenir ve nihayetinde apoptoza ve geri döndürülemez retina^{hasarına yol açar 4}. Metil-nitrosourea (MNU), güçlü bir DNA alkilasyon ajanı olup, retina dejenerasyonu modellemesinde yaygın olarak kullanılan bir kimyasal^{indükleyici olarak ortaya çıkmıştır 5}. MNU kaynaklı retinal hastalık modeli, hastalık mekanizmalarını araştırmak ve potansiyel terapötik müdahaleleri değerlendirmek için değerli bir araç olarak hizmet vermektedir. Mekanik olarak, MNU reaktif oksijen türleri (ROS) üreterek oksidatif stresi indükler ve redoks dengesini bozarak fotoreseptör membranlarına ve organellere zarar verir. Bu aynı zamanda aldehit metabolizmasını etkileyebilir ve lipid peroksidasyonunun detoksifikasyonunu bozabilir. Sonrasında toksik aldehitlerin birikimi oksidatif hasarı daha da kötüleştirebilir ve fotoreseptör^{apoptozunu artırabilir 6}.

Aldehit dehidrojenaz 2 (ALDH2), mitokondriyal NAD⁺ bağımlı bir enzim olup, 4-hidroksi-2-nonenal (4-HNE) ve malondialdehit (MDA) gibi toksik aldehitleri daha az reaktif karboksilik asitlere dönüştürerek oksidatif hasarı önlemede kritik rol^{oynar 7}. Güçlü ALDH2 aktivitesi, redoks homeostazını sürdürmek için kritiktir ve ALDH2 fonksiyonunun bozulması hızlı yaşlanma ve nörodejeneratif patolojilerle^{ilişkilendirilmiştir 8}. ALDH2'nin farmakolojik aktivasyonunun, özellikle küçük moleküllü agonist Alda-1 aracılığıyla, çeşitli modellerde sitoprotektif etki^{gösterdiği gösterilmiştir (9,10}). Sirtuin 1 (SIRT1), nikotinamid adenin dinükleotid + (NAD+)-bağımlı deasetilaza olarak, p53 ve nükleer faktör kappa B (NF-κB)¹¹ dahil olmak üzere transkripsiyon faktörlerini modüle ederek stres yanıtlarını ve enerji metabolizmasını düzenler. SIRT1 aktivasyonu, mitokondriyal fonksiyonu ve hücre hayatta kalmasını teşvik etme konusunda umut vaat eden bir gelişme göstermiştir; yapılan çalışmalar, retina dejenerasyonunda oksidatif hasarın ve iltihabın azalmasıyla^{ilişkilendirilmiştir 12}. Yanlış katlanmış proteinlerin birikmesiyle tetiklenen endoplazmik retikulum stresi (ERS), kronik stres altında pro-apoptotik bir zincirleme haline gelebilen katlanmamış protein yanıtını (UPR) aktive eder. ERS, retina dejenerasyonunda rol oynamış ve fotoreseptör^{apoptozu 13'e} katkıda bulunmuştur. Bu bulgulara rağmen, MNU kaynaklı retina dejenerasyonu modeli bağlamında ALDH2, SIRT1 ve ERS arasındaki spesifik etkileşim hâlâ yeterince anlaşılmamaktadır. Ayrıca, bu birbirine bağlı yolların koordineli rolleri daha fazla sistematik inceleme gerektirir.

Bu nedenle, mevcut çalışma, ALDH2-SIRT1-ERS ekseninin temel bileşenlerinin — ALDH2 (Alda-1 veya Daidzin aracılığıyla), SIRT1 (SRT1720 veya EX527 aracılığıyla) ve ERS (4-PBA veya TUN vasitle) — Mnu kaynaklı retina hasarı üzerindeki C57BL/6 farelerinde etkilerini incelemeyi amaçladı. Histopatolojik ve biyokimyasal analizler kullanarak, bu ekseni hedeflemenin fotoreseptör hayatta kalma ve aldehit metabolizmasını nasıl etkilediğini inceledik. ALDH2'nin koordineli aktivasyonu, SIRT1'in güçlendirilmesi ve ERS'in baskılanmasının MNU kaynaklı retina dejenerasyonu sinerjik olarak azaltacağını ve böylece retina dejeneratif hastalıklarında bu ekseni hedeflemek için bir gerekçe sağlayacağını öne sürdük.

Protokol

Etik ifade
Tüm deneysel protokoller, Fujian Tıp Üniversitesi Fuzong Klinik Tıp Fakültesi Deneysel Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından incelenip onaylanmış ve Görme ve Oftalmoloji Araştırmaları Derneği'nin (ARVO) Oftalmik ve Görme Araştırmalarında Hayvanların Kullanımı Bildirimi ile sıkı uyum içinde yürütülmüştür.

Hayvanlar ve grup dağılımı
Ulusal laboratuvar hayvanı yetiştiriciliği standartlarına uygun olarak, sertifikalı tedarikçiden toplam 72 erkek C57BL/6 fare (8–10 haftalık, vücut ağırlığı 20–25 g) alındı. Fareler, standart çevresel koşullarda bireysel olarak havalandırılan kafeslerde tutuldu; bunlar arasında 12 saatlik ışık/karanlık döngü, kontrollü sıcaklık (22 ± 2 °C) ve göreli nem (%50 ± %10) yer alıyor, yiyecek ve suya ima ise erişim sağlanıyordu. ALDH2, SIRT1 ve ERS yollarının MNU kaynaklı retina hasarı üzerindeki modülatör etkilerini araştırmak için, fareler bilgisayar tarafından oluşturulan randomizasyon dizisi kullanılarak sekiz deneysel gruba (n = 9; ikinci gün grubu için n = 5; dördüncü gün grubu için n = 4) yerleştirildi ve seçim yanlılığını en aza indirmek için bilgisayar tarafından oluşturulan bir randomizasyon dizisi kullanıldı. Çalışmanın grafik özeti Şekil 1'de gösterilmiştir.

Reaktif hazırlama ve tedavi rejimleri
Bu çalışmada kullanılan deneysel reaktifler, Malzeme Tablosu'nda listelenmiş, hazırlık ve dozaj hakkında ayrıntılı bilgiler aşağıdaki gibidir. (1) MNU (50 mg/kg): 100 mg MNU, 2 mL normal salin içinde çözünerek 50 mg/mL bir çözelti hazırlandı. Daha sonra, bu çözeltinin 1,4 mL normal salinle 5,6 mL normal salin ile seyreltilerek hayvan uygulaması için nihai konsantrasyon 10 mg/mL oldu. (2) Alda-1 (10 mg/kg): 50 mg Alda-1 tozu, 1 mL dimetil sülfoksit (DMSO) içinde çözündürülerek 50 mg/mL bir çözelti hazırlandı; bu çözelti 24 mL normal tuzlu suyla seyreltilerek son konsantrasyon 2 mg/mL oldu. (3) Daidzin (10 mg/kg): 50 mg Daidzin tozu, 1 mL DMSO'da çözünerek 50 mg/mL bir çözelti hazırlandı, ardından 24 mL normal salin ile seyreltilerek son konsantrasyon 2 mg/mL oldu. (4) EX-527 (10 mg/kg): 5 mg EX-527 tozu, 0.1 mL DMSO'da çözündürülerek 50 mg/mL bir çözelti hazırlandı; bu çözelti 2.4 mL normal tuzlu suyla seyreltilerek son konsantrasyon 2 mg/mL oldu. (5) SRT1720 (10 mg/kg): 5 mg SRT1720 tozu 0.1 mL DMSO'da çözüldü ve iyi karıştırıldı. Daha sonra, 400 μL PEG300, 50 μL Tween-80 ve 450 μL normal salin eklenerek 2 mg/mL çalışma çözeltisi hazırlandı. (6) TUN (10 mg/kg): 5 mg TUN tozu, 0.1 mL DMSO'da çözündürülerek 50 mg/mL bir çözelti hazırlandı; ardından 2.4 mL normal salin ile seyreltilerek son konsantrasyon 2 mg/mL oldu. (7) 4-Fenilbütirat (4-PBA; 10 mg/kg): 2 mg 4-PBA tozu 1 mL normal tuzlu suyla çözünerek 2 mg/mL bir çözelti hazırlandı. Yukarıdaki tüm uygulama hacimleri 5 × M mililitreydi (burada M = hayvan vücut ağırlığı kg cinsinden). Bundan sonra, fareler aşağıdaki tedavi protokolleriyle sekiz gruba ayrıldı:

Kontrol grubu: Normal salin içeren tek intraperitoneal enjeksiyon.
MNU grubu: Tek bir intraperitoneal MNU enjeksiyonu.
MNU + Alda-1 grubu: Alda-1'in intraperitoneal enjeksiyonu, ardından 2 saat sonra tek bir MNU uygulaması. Alda-1 daha sonra günde bir kez intraperitoneal olarak verildi.
MNU + Daidzin grubu: Daidzin'in intraperitoneal enjeksiyonu, ardından 2 saat sonra tek bir uygulamalı MNU enjeksiyonu. Daidzin daha sonra günde bir kez intraperitoneal uygulandı.
MNU + Alda-1 + EX-527 grubu: Alda-1'in intraperitoneal enjeksiyonu, ardından 1 saat sonra EX-527 enjeksiyonu ve 1 saat sonra MNU enjeksiyonu (tek uygulama). Alda-1 daha sonra günde bir kez intraperitoneal olarak verildi.
MNU + Alda-1 + TUN grubu: Alda-1'in intraperitoneal enjeksiyonu, ardından 1 saat sonra TUN enjeksiyonu ve 1 saat sonra MNU enjeksiyonu. Alda-1 daha sonra günde bir kez intraperitoneal olarak verildi.
MNU + Daidzin + SRT1720 grubu: Daidzin intraperitoneal enjeksiyonu, 1 saat sonra SRT1720 enjeksiyon ve 1 saat sonra MNU enjeksiyonu. Daidzin daha sonra günde bir kez intraperitoneal uygulandı.
MNU + Daidzin + 4-PBA grubu: Daidzin intraperitoneal enjeksiyonu, 1 saat sonra 4-PBA enjeksiyonu ve 1 saat sonra MNU enjeksiyonu. Daidzin daha sonra günde bir kez intraperitoneal uygulandı.

Vücut ağırlığı takibi
Sistemik toksisite ve tedaviye bağlı fizyolojik etkiler, MNU uygulamasından sonra dört gün ardışık olarak her farenin vücut ağırlığı kaydedilerek izlendi. Ağırlıklar, ±0,1 g doğrulukla hassas dijital bir ölçek kullanılarak ölçüldü ve veriler gruplar arasında kilo kaybı veya alım eğilimlerini takip etmek için belgelendi; bu da tedavi toleransı ve sistemik stresin dolaylı göstergeleri olarak hizmet verdi.

Retinal histopatoloji muayenesi
Deneyden sonraki ikinci ve dördüncü günlerde, fareler anestezi sonrası servikal dislokasyon ile intraperitoneal (i.p.) sodyum pentobarbital enjeksiyonu ile vücut ağırlığı 50–60 mg/kg dozda ötenazi edildi ve kurumsal ötenazi yönergelerine sıkı sıkıya uyuldu. Gözler, özellikle sol gözler, hemen enülleşirdi. Enukleasyondan önce, burun limbüsünde yönelimi işaretlemek için küçük bir kesi yapıldı. Küreler, daha sonra fosfatla tamponlanmış tuzlu (PBS, pH 7.4) içinde %4 paraformaldehit (PFA) içinde 24 saat boyunca 4 °C sıcaklıkta fiksasyon için daldırıldı. Sabit gözler, daha sonra dereceli etanol serisi (%70, 80%, %95 ve %100) ile ksilenden temizlendi ve histolojik işlem için parafin bloklarına gömüldü. Gömme sırasında, işaretli burun tarafı aşağıya doğru konumlandırılarak yön standartlaştırıldı.

Seri kesitler (5 μm kalınlığında) optik sinir başından (ONH) geçen döner mikrotom kullanılarak hazırlanarak merkezi retina bölgesinin temsilli örneklenmesini sağladı. Özellikle, üst kısımdan işaretli burun noktasına doğru kesim yapıldı ve tüm bölümlerin ONH'den geçmesini sağladı. Bölümler daha sonra pozitif yüklü cam kaydıraklara monte edildi. Hematoksilin ve eozin (HE) boyama standart protokollere göre gerçekleştirildi. Retina morfolojisi, ışık mikroskobu ile 400 × büyütme ile değerlendirildi. Ölçümler, ONH'den önceden belirlenmiş mesafelerde temporal retinadan sistematik olarak alındı: 200, 400, 600, 800, 1000 ve 1200 μm. Her konumda toplam retina kalınlığı, iç ve dış segment (IS/OS) uzunluğu, dış nükleer tabaka (ONL) kalınlığı, dış pleksiform tabaka (OPL) kalınlığı ve iç nükleer tabaka (INL) ölçüldü.

Nesnelliği sağlamak ve ölçüm yanlılığını en aza indirmek için titiz bir kalite kontrol protokolü uygulandı. Özellikle, sekiz deneysel grubun her biri beş veya dört alt gruba bölünmüştür (örneğin, Alt grup 1, 2, 3, 4, 5). Beş veya dört bağımsız gözlemci, grup atamalarına kör olarak, tüm deneysel gruplarda aynı ilgili alt grubu ölçmek üzere atandı (örneğin, Gözlemci A her gruptan her zaman Alt Grup 1'i ölçerdi). Her ölçüm noktasında, ~5 μm aralığında (örneğin, 200 μm, 195 μm ve 205 μm) üç ölçüm alındı ve teknik hata en aza indirilmek için ortalamalar alındı. Nicel ölçümler ImageJ yazılımı (sürüm 1.54g) kullanılarak yapıldı ve her noktanın ortalama kalınlık değeri tekrarlanabilirliği sağlamak için hesaplandı.

Aldehit metabolizma belirteçleri
Oksidatif stres ve aldehit metabolizmasını değerlendirmek için, serum örnekleri lipid peroksidasyon ve aldehit stresinin temel biyobelirteçleri olan MDA ve 4-HNE seviyeleri açısından analiz edildi. Özellikle, tüm fareler intraperitoneal (i.p.) sodyum pentobarbital enjeksiyonuyla vücut ağırlığı 50–60 mg/kg dozda anestezi edildi. Fareler derin bir anestezi edildikten sonra, servikal dislokasyon yoluyla ötenazi yapıldı. Ötenazi sonrası hemen ardından göz kürekleri enülasyon yapıldı ve retrobulbar kan hızla toplandı. Örnekler oda sıcaklığında 30 dakika pıhtılaşmaya bırakıldı, ardından 3.000 × g ile 10 dakika santrifüjlendi. Serum fraksiyonu dikkatlice enzimsiz mikrosantrifüj tüplerine aktarıldı ve sonraki analizlere kadar -80 °C sıcaklıkta saklandı. Serum MDA seviyeleri, üreticinin protokollerine uygun olarak ticari olarak mevcut enzim bağlantılı immünosorbent test (ELISA) kitleriyle ölçüldü. Kısacası, standartlar ve örnekler önceden kaplanmış mikroplakalara eklendi, spesifik birincil antikorlarla kuluçka yapıldı, bağlanmamış maddeler çıkarılması için yıkandı ve yadağ peroksidaz (HRP) ile konjuge edilmiş ikincil antikorlarla reaksiyona girdi. Daha sonra tetrametilbenzidin (TMB) substratı eklendi ve reaksiyon sülfürik asit ile sonlandırıldı. Optik yoğunluk (OD) değerleri 450 nm'de mikroplaka okuyucu kullanılarak okundu ve MDA/4-HNE konsantrasyonları, bilinen analit konsantrasyonları kullanılarak üretilen standart eğrilerle karşılaştırılarak belirlendi.

İstatistiksel analiz
Tüm veriler ortalama ± standart hata (SE) olarak sunuldu. Küçük örneklem büyüklüğü göz önüne alındığında (ikinci gün grubu için n = 5; dördüncü gün grubu için n = 4), Bootstrap test istatistiksel yöntemleri kullanıldı. Özellikle, Bootstrap yeniden örnekleme yöntemi (1.000 yineleme ve değiştirilme) grup ortalamaları için %95 güven aralıklarını (CI) tahmin etmek ve gruplar arasındaki farkları karşılaştırmak için kullanıldı. Her sonuç için (örneğin, ağırlık, retina kalınlığı, MDA/4-HNE seviyeleri) orijinal veri setinden Bootstrap örnekleri alındı ve her yeniden örnekleme için ortalama hesaplandı. %95 CI, bootstrap dağılımının 2,5^. ve 97.5'lik perdeliklerinden türetilmiştir. Anlamlılık, güven aralığı incelenerek dolaylı olarak aşağıdaki yaklaşımla değerlendirildi. Bootstrap sonuçlarının CI'si sıfır içermiyorsa, bu genellikle farkın anlamlı olduğunu gösterir (iki veya daha fazla grup arasındaki ortalamaların karşılaştırılması varsayarsak). Şekiller Graphpad yazılımı (sürüm 5.01) kullanılarak oluşturuldu.

Sonuçlar

Vücut ağırlığı değişiklikleri
Deneyden önce, gruplar arasında vücut ağırlığında önemli bir fark yoktu. Deneyden sonraki ikinci günde, Kontrol grubu hariç, vücut ağırlığı 17,0 ± 0,5 g'dan 17,4 ± 0,4 g'a yükseldi, diğer tüm gruplardaki farelerin vücut ağırlığı önemli ölçüde azaldı. Özellikle, MNU grup fareleri 17,4 ± 0,3 g'den 16,2 g'e ± 0,2 g'a, MNU + Alda-1 grubu 17,3 ±g'den 0,3 g'den 16,7 ± 0,4 g'a, MNU + Daidzin grubu 17,3 ± 0,3 g'den 16,2 g'e ± 0,3 g 0,3 g'a, MNU ...

Tartışma

Önceki çalışmalar, ALDH2 agonistlerinin MNU kaynaklı retinal dejenerasyona karşı koruyucu etkiler^{sağlayabileceğini öne sürmüştür.} Ancak, inhibitörünün müdahale etkileri ve SIRT1 ile ERS gibi potansiyel aşağı akış yolları detaylı olarak incelenmemişti. SIRT1 ve ERS'nin retina dejenerasyonu modellerindeki rol oynadığına dair çalışmalar bulunmuştur; bunlar arasında ışıkla tetiklenen retina dejenerasyonu ve retina dejenerasyonu olan genetik olarak değiştirilmiş

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
4HNE Kit	Elabscience,China	E-EL-0128	Serum 4HNE seviyelerinin ölçümü için
4-Fenilbütrik asit (4-PBA)	MCE, ABD	HY-A0281	ERS inhibisyonu için reaktif
Alda-1	MCE, ABD	HY-18936	Araştırma için ALDH2 aktivatörü
Daidzin	MCE, ABD	HY-N0018	Araştırma için ALDH2 inhibitörü
Floresein sodyum	Guangzhou	N/A	Fluoresein anjiyografi sistemi kullanılarak elde edilen anjiyografi görüntüleri, herhangi bir sızıntı, perfüze edilmemiş alanlar veya retinal damar morfolojisindeki değişiklikler açısından analiz edildi.
ImageJ yazılımı	National Institutes of Health, ABD	Versiyon 1.53t
MDA Kit	Beyotime, Çin	S0131S	Serum MDA seviyelerinin ölçümü için
N-Nitrozo-N-metilüre (MNU)	MCE, ABD	HY-34758	Retinal dejenerasyonu indüklemek için DNA alkilasyon ajanı
Paraformaldehit	Sigma-Aldrich, ABD	30525-89-4	Retinal doku kesitleri için kullanılır
Hassas dijital terazi	Elektronik terazi, Çin	SF-400	KAPASİTE: 5000 g & acute; 1 g/177ozX0.10z, her farenin vücut ağırlığını kaydetmek için kullanılır
Prism	GraphPad	Versiyon 5.01	İstatistiksel analiz yazılımı
Döner mikroton	LEICA, Almanya	RM2016	Retinal kesitlerin hazırlanması için kullanılır
Selisistat (EX-527)	MCE, ABD	HY-15452	Araştırma için SIRT1 inhibitörü
Sodyum Pentobarbital	Sigma-Aldrich, ABD	1.93248	İntraperitoneal (IP) enjeksiyon yoluyla sonraki araştırmalar için anestezi yapılması için kullanılır
SRT1720	MCE, ABD	HY-10532	Araştırma için SIRT1 aktivatörü
Sumianxin	Jilin Shengda Animal Pharmaceutical Co	N/A	İntraperitoneal (IP) enjeksiyon yoluyla sonraki araştırmalar için anestezi yapılması için kullanılır
Tunikamisin (TUN)	MCE, ABD	HY-A0098	ERS indüksiyonu için reaktif