Yöntem makalesi

Yaşam Tarzı Hızlandırılmış Yaşlanma Patofizyolojisini Araştırmak İçin Sirkadiyen Bozulma ve Diyet Stresi için Kombinatorel Fare Modeli

252 görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/70866

⸱

28 Nisan 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chinese Materia Medica, Chengde Medical University, 2School of Pharmacy, Hebei Medical University, 3State Key Laboratory for Innovation and Transformation of Luobing Theory, 4College of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine, Hebei University of Chinese Medicine, 5The Second Clinical Medical College, Heilongjiang University of Chinese Medicine

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Burada, sağlıksız yaşam tarzlarını taklit eden ve metabolik bozukluklar ile yaşlanma fenotiplerini tetikleyen düzensiz sirkadiyen ritim ile yüksek yağlı, yüksek şekerli (HFHS) diyetin fare modelini oluşturmak için bir protokol sunuyoruz.

Özet

Bu protokolün amacı, modern ve sağlıksız yaşam tarzlarının neden olduğu çok faktörlü hasarı özetleyen standartlaştırılmış bir fare modeli oluşturmaktır. Bu amaçla, rastgele sirkadiyen ritim bozulması ile yüksek yağlı, yüksek şekerli (HFHS) diyeti birleştiren, kontrol olarak tek faktörlü HFHS ve sirkadiyen bozulma gruplarını içeren yeni bir C57BL/6J modeli geliştirdik. Kontrol gruplarıyla karşılaştırıldığında, bileşik model vücut ağırlığının artması, yüksek açlık glikozu ve lipid seviyeleri, belirgin karaciğer steatozu ve belirgin bilişsel ve motor bozukluklar gibi daha ciddi metabolik bozukluklar gösterdi. Kompozit model ayrıca, kırılganlık indeksi ve hematoksilin ile eozin (HE) boyamalarıyla daha belirgin hızlanmış yaşlanma göstermiştir. Bu entegre model, yaşam tarzıyla ilişkili metabolik-bilişsel düşüşü ve erken yaşlanmayı güvenilir şekilde taklit eder. Bu adım adım tekrarlanabilir protokol, yaşam tarzı aracılı yaşlanma üzerine mekanik çalışmaları ve hedefli tedavi stratejilerinin değerlendirilmesini destekler.

Giriş

Hızlandırılmış modern yaşam tarzları, popülasyonları giderek ritmi bozan davranışlara ve obezojenik diyetlere maruz bırakır; bu faktörleri sistemik fonksiyonel gerileme ve kronik hastalık patogenezi ile ilişkilendiren ikna edicikanıtlar vardır 1. Epidemiyolojik veriler çarpıcı eş hastalıkları ortaya koymaktadır: vardiyalı çalışanlar metabolik sendrom belirteçlerinin yüksek yaygınlığını gösterirken, uzun süreli yüksek yağlı ve yüksek şekerli diyet alımı, demans riski ile güçlü şekildeilişkilendirilmiştir 2,3. Bu hakaretler çok organlı patolojiyi yönlendirmek için birleşir—metabolik işlevsizlik sıklıkla bilişsel gerileme ve kardiyovasküler yeniden modellenme ile örtüşür; çevresel ve merkezi bozulmalar arasında çift yönlü çapraz konuşma gösterir. Bilinen klinik sinerjilere rağmen, yaşam tarzı kaynaklı organ düşüşünün entegre patofizyolojisini yakalayan standartlaştırılmış preklinik modeller hâlâ gelişmemiştir.

Moleküler düzeyde, kronik sirkadiyen hizalanma suprakiazmatik çekirdekten kaynaklanan patolojik bir kaskad başlatır; bu da paraventriküler hipotalamusa glutamaterjik sinyal ilemini bozur ve kortikotropin salgılayan hormonun nabız etkisini köreltir. Bu, hipotalamus-hipofiz-adrenal (HPA) eksenli negatifgeri beslemeyi bozarak glukokortikoid reseptörlerinin duyarsızlaşmasına ve kortizolün sürekli yükselmesine neden olur. Sonuç olarak hepatik glukoneogenez aktivasyonu ve iskelet kası insülin reseptörü substrat-1 fosforilasyon baskısı, periferik insülin direncini birlikte yönlendirir ve hiperglisemi ile dislipidemi için metabolik bir temeloluşturur 5,6. Aynı zamanda, diyetle doymuş yağ asitleri, endotel sıkı bağlantıproteinleri 7,8'in aşağı regulasyonu yoluyla zayıf kan-beyin bariyerini nüfuz eder ve mikroglial TLR4/NF-κB sinyalini aktive eder. Bu, TNF-α/IL-1β aracılı nöroinflamasyonutetikler9. Önemli nokta, bu iki sağlıksız yaşam tarzı faktörünün bağımsız değil, sinerjik bir şekilde hareket etmesidir. Ancak, mevcut literatürde birleşik maruziyetleri üzerine sistematik bir araştırma eksikliği vardır. Bu nedenle, sirkadiyen ritim bozulmasını yüksek yağlı ve yüksek şekerli diyetlerle birleştiren modelleme çalışmaları yapmak anlamlıdır.

İzole yaşlanma mekanizmalarını incelemede faydalarına rağmen, mevcut fare modelleri yaşam tarzı kaynaklı bozulmanın entegre patofizyolojisini yeniden yansıtamıyor. Doğal yaşlanma, bireyler arası belirgin değişkenlik gösterir ve deneysel verimlilikle uyuşmayan uzun zaman çizelgeleri gerektirir. Doksorubisin gibi farmakolojik ajanlar, kronik metabolik düzensizlik tekrarlamadan öncelikle DNA hasarı ve akut yaşlanmaya neden olur10. Genetik olarak değiştirilmiş modeller, sistemik nöroendokrin-metabolik çapraz konuşmayı göz ardı ederek tek moleküler yollarıhedefliyor 11,12. D-galaktoz uygulaması, oksidatif stresi tetiklese de, sirkadiyen bozulmanın glukokortikoid ritmikliği veya diyet lipid aracılı nöroinflamasyon üzerindeki etkisini yeterince taklit etmez13. Kritik olarak, tek faktörlü müdahaleler klinik olarak gözlemlenen sinergistik çoklu organ gerileme kalıplarını yakalayamaz. Bu translasyonel boşluk, kronik sirkadiyen bozulma ve obezotik diyet streslerini aynı anda dahil eden gelişmiş bir kombinatoryal platformun gerekmesini gerektirir; böylece birbirine bağımlı nörodejenerasyon, kalp fonksiyon bozukluğu ve metabolik bozulmayı sadık bir şekilde hızlandırır.

Bu sorunu ele almak için, stokastik sirkadiyen bozulmayı yüksek yağlı ve yüksek şekerli bir diyetle birleştiren bir C57BL/6J fare modeli geliştirdik ve sinerjik çağdaş yaşam tarzı hakaretlerini yeniden ortaya koyduk. Fareleri döner ışık programlarına maruz bırakmak, sürekli obezojenik beslenme ile birleştiğinde, yüksek yağlanma, açlık hiperglisemisi ve dislipidemi gibi metabolik bozuklukları önemli ölçüde kötüleştirdi. Bilişsel değerlendirmeler, mekansal ve tanıma hafızasında belirgin eksiklikler gösterirken, hareket testleri dayanıklılıkta azalma gösterdi. En önemlisi, kırılganlık indeksinin uzunlamasına nicelenmesi, yaşa bağlı eksikliklerin hızlanmış birikimi göstermiştir. Çift zorluk paradigmamız, çok yönlü hızlandırılmış yaşlanmayı sağlam bir şekilde özetleyerek yaşam tarzı odaklı patofizyolojiyi incelemek için doğrulanmış yeni bir platform sunar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Tüm deneysel prosedürler, Hebei Yiling İlaç Araştırma Enstitüsü Hayvan Araştırmaları Etik Komitesi tarafından onaylandı (Onay No: N2024043). Otuz iki adet 8 aylık erkek C57BL/6J faresi ( bkz. Materyal Tablosu), Yeni İlaç Değerlendirme Merkezi, Hebei Yiling İlaç Araştırma Enstitüsü'ne bağlı belirli bir patojensiz (SPF) hayvan tesisinde tutuldu. Yetiştirme ortamı standart koşullarda korundu: ortam sıcaklığı 20–26 °C arasında değişiyordu, göreli nem %40–%70 arasında kontrol edildi ve 12 saat ışık/12 saat karanlık döngü uygulandı. Fareler, standart laboratuvar kemirgen diyetine ve sterilize edilmiş içme suyuna ücretsiz erişime sahipti.

1. Sirkadiyen bozulma ve diyet stresinin kombinatoryal fare modelinin oluşturulması (Şekil 1)

NOT: Deney sırasında beklenmedik şekilde ölen, ciddi kilo kaybı gösteren veya modelleme prosedürünü tamamlayamayan hayvanlar nihai analizden hariç tutuldu. Başlangıçta grup başına 8 hayvan sayısı ve nihai geçerli örneklem büyüklüğü grup başına 5 idi.

  1. Deneyden önce yüksek yağlı/yüksek şekerli (HFHS) bir diyet ( bkz. Malzeme Tablosu) ve esnek ışık-karanlık döngü kontrolü için programlanabilir zamanlayıcı ile donatılmış bağımsız bir oda hazırlayın.
    NOT: Oksidasyonu önlemek için diyeti 4 °C veya -20 °C sıcaklıkta sakla; Yoğuşmanın bileşimini etkilemesini önlemek için kullanmadan önce oda sıcaklığına getirin.
  2. Hayvan adaptasyonu ve rastgele gruplama
    1. Tüm 8 aylık fareleri standart koşullarda 7 günlük adaptif beslenme dönemi altında tutturulmadan önce deneye başlanın.
    2. Uyum döneminden sonra fareleri vücut ağırlığına göre (grup başına n = 8) dört gruba rastgele yerleştirin: Kontrol grubu, birleşik stres modeli (Model) grubu, HFHS grubu ve sirkadiyen ritim bozması (CR) stres grubu.
  3. HFHS diyetinin 8 aylık müdahalesini ve sirkadiyen ritim bozulmasını birleştirerek birleşik stres model grubuna uygulayın. HFHS grubunu aynı süre boyunca tek başına HFHS diyetiyle besleyin.
  4. CR grubunu sadece sirkadiyen ritim bozulmasına maruz bırakın. Kontrol grubunu tüm deney boyunca standart bir bakım diyetiyle besleyin. Tüm hayvanlar için içme suyuna ücretsiz erişim sağlanır.
    NOT: 8 aylık müdahale, deneysel sonucu etkilemeden geçici olarak (örneğin, farelerin rutin sağlık kontrolleri için) duraklatılabilir ve kontrol tamamlandıktan sonra müdahale devam edilebilir.
  5. Sirkadiyen ritim bozulması protokolü (Şekil 2A,B)
    1. Haftalık ışık-karanlık döngüsünü esnek bir şekilde kontrol etmek için programlanabilir bir zamanlayıcı kullanın ( bkz. Malzeme Tablosu). Dört farklı ışık rejimi uygulayın: hızlı ışık-karanlık geçişi (her 7 dakikada bir ve karanlık dönüşümlü olarak günde 2 saat ardışık), ters ışık-karanlık döngüsü (ışıklar her gün 8:00'de kapalıp 20:00'de açılır), sabit ışık (24 saat aydınlatma) ve sürekli karanlık (24 saat karanlık).
    2. Her haftanın başında istatistiksel yazılım (sabit rastgele tohum ile R dili) kullanarak rastgele bir dizi oluşturun. Dört ışık modu haftanın her gününe rastgele atanır ki, her modun 1–2 gün boyunca ardışık olarak uygulandığından emin olun.
  6. Farelere libitum'a HFHS diyeti sağlayın ve haftalık olarak gıda alımını takip edin. HFHS diyetinin ayrıntılı bileşimi Tablo 1'de sunulmaktadır.
    NOT: Yiyecek tedarikinin incelenmesi, yetersiz beslenme veya gıda eksikliğini önlemek için gereklidir.
  7. Fareleri haftalık olarak sabit bir zaman noktasında (Perşembe günleri 09:00) elektronik bir bakiye ile 8 aylık müdahale döneminde tartın. Tüm vücut ağırlığı verilerini ayrıntılı olarak kaydedin.
    NOT: Tartma işlemini hızlı bir şekilde gerçekleştirin (her seans 30 saniyeden kısa sürede tamamlanır) böylece stresi ve sirkadiyen ritmin bozulmasını en aza indirin.

2. Yeni nesne tanıma

  1. Fareleri eğitimden bir gün önce 60 cm, 60 × 60 cm × 40 cm ölçülerindeki test kutusuna yerleştirin ve test ortamına alışmaları için 5 dakika boyunca serbestçe keşfetmelerine izin verin.
    NOT: Her denemeden sonra kutudan dışkı ve idrarı çıkarın. Kutuyu kalan kokuları gidermek için %75 etanol ile silin.
  2. Test kutusunun alt-sol ve alt-sağ köşelerine sırasıyla iki aynı silindiri (A ve B) yerleştirin. Her fareyi nesnelere bakacak şekilde kutuya sokun ve farenin 5 dakika boyunca özgürce keşfetmesine izin verin.
    1. Konumsal yanlılığı önlemek için iki silindirin sol-sağ pozisyonlarını konular arasında rastgele değiştirin.
    2. 5 dakikalık keşif eğitiminden sonra, deneyi 23 saate kadar duraklatın ve tanıma testinin geçerliliğini sağlamak için eğitimden sonraki 24 saat içinde yeni nesne değiştirme adımını (adım 2.3) tamamlayın.
  3. Eğitimden 24 saat sonra sol alt köşedeki nesne A'yı yeni bir küp (nesne C) ile değiştirin. Üst kamerayı etkinleştirin. Fareyi kutuya koyup 5 dakika boyunca davranış kaydına alın.
    NOT: Farenin yeniliğini tanıyabilmesi için tanıdık nesnelere benzer boyutta ancak malzeme, renk veya doku açısından belirgin şekilde farklı olan yeni bir nesne kullanın.
  4. Videoları video takip sistemi kullanarak analiz edin ( bkz. Materyal Tablosu).
    1. Keşif, farenin burnunu bir nesneye doğru veya 2 cm içinde yönlendirmesi olarak tanımlayın. Tanıdık nesneyi (TB) ve yeni nesneyi (TC) keşfetmek için harcanan zamanı kaydedin.
    2. Tanıma endeksi şu formüle göre hesaplayın: Tanıma indeksi = TC / (TB + TC) × %100.
      NOT: Analisti deneysel gruplara karşı kör tutun ki öznel önyargıdan kaçının; Tırmanma veya kemirme gibi keşif dışı davranışları keşif süresi kayıtlarından sistematik olarak dışlar.

3. Tutma gücü testi

  1. Farelerin ön uzuv tutma gücünü bir tutuş gücüölçer 14 ile ölçün ( bkz. Malzemeler Tablosu). Kuvvet göstergesini dikey olarak 90 derece döndürün ve her test seansından önce metal bir standa sıkıca sabitleyin, böylece sistem tamamen hareketsiz kalsın.
  2. Fareyi nazikçe kuyruk tabanından tutun. Ön patilerin barı doğal olarak tutmasına izin verin. Okuma sabitlendikten sonra göstergeyi sıfırlayın, ardından kuyruğu yatay olarak sabit ve yavaş bir hızla geriye çekin, ta ki fare tutuşunu bırakana kadar.
  3. Bırakma anında maksimum maksimum tepe kuvveti (kgf) kavrama gücü olarak kaydedin. Her fare için günde üç ardışık deneme yapın. Sonraki analizler için üç ölçümün ortalamasını kullanın.
    NOT: Çekme hızını eşit ve farenin çekişe karşı tam direnç oluşturabilmesi için yeterince yavaş tutun.
  4. Aşağıdaki durumlarda herhangi bir deneme analizden çıkarılabilir: fare sadece bir ön pati kullanır, arka ayaklar çubuğa temas eder veya tutuşa katkıda bulunur, fare çekerken vücudunu bükerse veya bar aktif direnç olmadan serbest bırakılırsa.
    NOT: Belirsiz veya alaycı denemeleri incelemek üzere işaretleyin. Gerektiğinde ölçümleri tekrarlayın.

4. Zayıflık Endeksi (FI)

NOT: Tüm ekipman parametrelerini test öncesi standart ayarlara kalibre edin. Her farenin toplam değerlendirme süresini yorgunluktan kaynaklanan fenotipik değişiklikleri önlemek için 30 dakikadan az sınırlayın. Tüm testleri sabit bir sabah zaman aralığı içinde (9:00–12:00) yaparak sirkadiyen ritmin etkilerini en aza indirin.

  1. Fareleri 12 saat boyunca oruç tutun ve testten önce serbest suya erişimle besin alın, böylece gıda alımının fizyolojik ölçümler üzerindeki keskin etkilerini en aza indirin.
  2. Fareleri değerlendirmeden 30 dakika önce test ortamına taşıyarak alıştırın ve stresle ilgili paraziti azaltın.
  3. Tümör, enfeksiyon veya uzuv deformiteleri gibi ağır patolojik durumlara sahip fareleri dışlayarak kırılganlık değerlendirmesinde kafa karıştırıcı etkileri önleyin.
  4. Beş alanda 31 fenotipik eksiklik göstergesine dayanarak kırılganlık indeksini değerlendirin: motor fonksiyon, beslenme durumu, duyusal fonksiyon, spontan aktivite ve davranış ile fizyolojikkusurlar 15,16.
    NOT: Belirli 31 değerlendirme maddesi beş alanı kapsar: motor fonksiyon (azalan tutuş gücü, anormal yürüyüş ve tırmanma yeteneğinin azalması gibi 7 madde), beslenme durumu (kilo kaybı, vücut durumu puanının düşmesi ve yiyecek tüketiminin azalması gibi 6 madde), duyusal fonksiyon (5 madde görme bozukluku, işitme bozukluğu ve dokunsal uyuşukluk gibi), spontan aktivite ve davranış (7 madde gibi azalan spontan aktivite, bakım davranışının azalması ve keşif davranışının azalması) ile fizyolojik kusurlar (göz kusurları, kulak kusurları ve cilt kusurları gibi 6 madde). Tüm öğeler ikili puanlama yöntemini benimser (0 = kusursuz, 1 = kusurlu) ve nihai kırılganlık indeksi = toplam kusurlu öğe sayısı / 31.
  5. Deneysel gruplara kör olan iki araştırmacı tüm değerlendirmeleri bağımsız olarak yapması için ata.
  6. Her göstergeyi, kavrama gücü, yürüyüş hızı, vücut ağırlığı değişimi, kürk durumu, duyusal tepki, kendiliğinden aktivite kapasitesi ve fiziksel anormallikleri kapsayan önceden belirlenmiş kriterlere göre 0 (eksiklik yok) veya 1 (eksiklik) olarak puanlayın.

5. Açlık kan şekeri tespiti

NOT: Hızlı farelerde 12 saat boyunca serbest suya erişimi sağlanarak kan şekeri üzerindeki akut beslenme kaynaklı etkileri en aza indirmek için yapılmalıdır. Sirkadiyen dalgalanmaları azaltmak için 9:00–12:00 arası ölçümler yapın. Deneme öncesi olarak glukometreyi standart bir glikoz çözeltisiyle kalibre edin, böylece partiler arası tutarlılık sağlanır.

  1. Fareleri nazikçe tutun, kuyruk uçlarını %75 etanol ile dezenfekte edin. Kuyruk damarlarında steril tek kullanımlık lanset kullanarak 1–2 mm kesi yapın. İlk damla kanı doku-sıvı kontaminasyonunu önlemek için atın.
  2. Küçük bir hacmde kapiller kan toplayın ve uyumlu test şeritleriyle taşınabilir bir glukometre (bkz. Malzeme Tablosu) hemen analiz edin. Veri doğruluğunu sağlamak için her örneği ikili olarak test edin.

6. Kan lipid tespiti toplam kolesterolü (TC) içeriyordu

NOT: Şiddetli hemoliz veya bulanıklık içeren örnekleri analizden hariç tutun. Üçlü ölçülerde %10 varyasyon katsayısı > tekrarlayın.

  1. Toplanan kanı antikoagülan olmayan tüplere yerleştirin. Oda sıcaklığında doğal olarak pıhtılaşmaya 2 saat bırakın. Santrifüj örnekleri 1000 × g sıcaklığında 4 °C'de 15 dakika boyunca serumu ayırmak için alın.
    NOT: Çalışmadan önce santrifüjün düzgün dengede olduğundan emin olun ve güvenlik iç kapağını güvence kapatın.
  2. Üst serum tabakasını dikkatlice aspire edin, aliquot yapın ve lipid oksidasyonunu önlemek için hemen -80 °C'de saklayın.
    NOT: Serum aliquote ve -80 °C'de saklandıktan sonra deney birkaç gün ila haftalar duraklatılabilir; Sonraki toplam kolesterol tespiti (adım 6.3), test kiti ve ekipman hazır olduğunda gerçekleştirilebilir, böylece serum tekrar tekrar dondurup çözülmez.
  3. Üreticinin talimatlarına göre ticari bir Greiss's TC test kiti ( bkz. Malzeme Tablosu) kullanarak serum toplam kolesterol seviyelerini ölçin. Her örneği üçlü olarak test edin ve kalibrasyon için standart referans örnekleri eşzamanlı çalıştırın.

7. Hematoksilin-eozin boyama (HE boyama)

  1. Davranışsal testler sonrası sodyum pentobarbital (20 mg/kg) ile fareleri anestezi edin.
  2. Kan toplanması retro-orbital venöz pleksus yoluyla yapılır. Dokuları disseksiye yapın ve %4 paraformaldehit ile 48 saat sabitleyin.
    NOT: %4 paraformaldehit ile doku fiksasyonundan sonra 48 saat boyunca deney duraklatılabilir; sabit dokular, dehidrasyon aşamasına geçmeden önce %4 paraformaldehitte 4 °C'de 1 haftaya kadar saklanabilir.
  3. Dehidratasyon, otomatik işlemci ile kadelı etanol serisi kullanan dokuları düzelttiler (her biri 1 saat için 60%, %70%, %90 etanol; %95, %100 etanol).
    DIKKAT: Etanol, düşük alıntı noktasına sahip yanıcı bir sıvıdır. Depolama ve çalışma sırasında açık alevlerden, ısı kaynaklarından ve kıvılcımlardan uzak durun. İyi havalandırılan bir alanda kullanın, statik olmayan eldiven ve laboratuvar önlüğü giyin. Deney alanında büyük hacimli depolamadan kaçının; Özel bir yanıcı sıvı dolapta sakla.
  4. Dehidratlanmış dokuları ksilende 2 saat temizleyin, ardından 3 saat boyunca 60 °C'de parafinle infiltrasyon yapın ( bkz. Malzeme Tablosu). Standart anatomik düzlemlere yöneltilmiş dokuları göm.
    NOT: Doku kırılganlığını önlemek için temizleme süresi aşırı uzun olmamalıdır; Kristalleşmeyi önlemek için sızma sırasında sabit parafin sıcaklığı sağlanır. Parafin gömülmesinden sonra, gömülü doku blokları oda sıcaklığında birkaç ay boyunca saklanabilir ve gerektiğinde bölümleme aşaması (adım 7.5) gerçekleştirilebilir.
  5. Parafin blokları tamamen katılaştığında, parafin dilimleyici ile 4 μm kesitleri kesin (bkz. Malzeme Tablosu), poli-L-lizin kaplı slaytlara aktarın, oda sıcaklığında hava kurutmanız, ardından depolama için sızdırmazlık yapın.
    NOT: Bölüm montajı ve hava kurutmasından sonra, kaydıraklar oda sıcaklığında, tozsuz bir ortamda 1 aya kadar saklanabilir, ardından boyama aşamasına geçilir (adım 7.6).
  6. Otomatik boyama sistemiyle boyama kesitleri (bkz. Malzeme Tablosu).
    1. Ksilen I ve ksilen II'de deparaffinize edin (her biri 10 dakika).
    2. Aşağı inen etanol serisi ile (her biri 100%, 95%, 80%, 2 dakika) yeniden hidrelen, ardından damıtılmış suyla durulayın.
    3. Çekirdekler net görünene kadar 3–8 dakika boyunca hematoksilin ile boyanın, mavızılmayı teşvik etmek için akan suyun altında durulayın ve yeterli sitoplazmik pembe renk elde etmek için 1–3 dakika boyunca eozin ile karşı boyama yapın.
  7. Lekeli bölümleri mutlak alkolde, ksilende şeffaf ve nötr balsamla monte ederek slayt tarayıcı analizi yapın ( bkz. Malzeme Tablosu).

8. Yağ Kırmızı O boyama

  1. Toplandıktan sonra 30 dakika içinde taze karaciğer dokularını optimal kesme sıcaklığı (OTC) bileşiğine (bkz. Malzemeler Tablosu) gömül.
    NOT: Taze karaciğer dokuları OTC bileşiğine gömmesinden sonra, gömülü dokular -80 °C'de kesitlenmeden önce 1 aya kadar saklanabilir (adım 8.3), böylece tekrar tekrar donma ve erime engel olur.
  2. Gömülü dokuları bir kriyosta içine yerleştirin ve kesitlenmeden önce tamamen donmalarına izin verin.
  3. Kriyostat sıcaklığını -22 °C'ye ayarlayın ve tam donmuş doku bloklarını ardışık 8 μm kalınlığında kesitlere kesin.
  4. Bölümleri doğrudan kaplamasız cam slaytlara aktarın ve bölümler ile sürgüler arasında sıkı yapışma sağlamak için nazikçe düzleştirin.
  5. Slaytları nötr formalin ile oda sıcaklığında 10 dakika sabitleyin. Fiksasyondan hemen sonra bölümleri %60 izopropanolde 5 saniye durulayın.
  6. Önceden işlenmiş bölümleri nem odasına yerleştirin, Yağ Kırmızı O boyama çözeltisi ekleyin ( bkz. Malzemeler Tablosu) ve 20 dakika kuluçka yapın.
  7. Boyandıktan sonra, lipid damlası ve interstisiel doku sınırları net bir şekilde ayırt edilene kadar %60 isopropanol içeren kesitleri ayırt edin.
    NOT: Diferensiasyon sırasında aşırı farklılaşmayı önlemek için kesitleri yakından izleyin; bu da solgun lekelenmeye neden olur.
  8. Aydın mikroskobu altında farklılaşmış boyalı kesitleri inceleyerek hepatik lipid birikintisine bağlı histopatolojik değişiklikleri gözlemleyin.
    NOT: Boyama ve farklılaştırmadan sonra, kesitler mikroskobik muayeneden önce 4 °C'de 3 güne kadar saklanabilir, böylece boyama etkisi etkilenmez.

9. İstatistiksel analiz

  1. Tüm deneysel verileri ortalama ±± ortalama standart hata (SEM) olarak ifade edin
  2. Verinin normal dağılıma uyup uymadığını doğrulamak için Shapiro-Wilk testini uygulayın. Normallik doğrulanırsa gruplar arasında varyans homojenliğini değerlendirmek için Levene testini gerçekleştirin.
    NOT: Veri normallik varsayımını karşılamazsa doğrudan parametrik olmayan testler uygulanır.
  3. Birden fazla grup arasındaki genel farklılıkların istatistiksel anlamlılığını test etmek için tek yönlü varyans analizi (ANOVA) kullanın ve Fisher'ın en az anlamlı farkı (LSD) testiyle çift karşılaştırmalar yapın.
    NOT: Varyanslar heterojen olduğunda Welch ANOVA kullanın.
  4. İki bağımsız örneklem grubu arasındaki karşılaştırmalar için iki kuyruklu Öğrenci t-testi kullanın.
  5. İstatistiksel anlamlılığı iki taraflı bir p-değeri olarak tanımlayın < 0.05. Tüm istatistiksel analizleri istatistiksel analiz yazılımı kullanarak gerçekleştirin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Çift marşürasyonlu kohortlarda metabolik patolojinin sinerjik alevlenmesi
Uzunlamasına vücut ağırlığı izleme, kohortlar arasında belirgin büyüme trajektorları ortaya koydu. Model grubu ve HFHS grubu, hem Kontrol hem de CR gruplarına kıyasla hızlanmış kilo artışı gösterdi. Özellikle, CR grubu Kontrol'e göre mütevazı bir ivme göstermiştir (Şekil 3A). Metabolik disfonksiyonun ek kanıtı olarak, hem açlık kan şekeri hem de kan lipid seviyeleri...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Güncel araştırmalar, sirkadiyen bozulma ile yüksek yağlı, yüksek şekerli diyetin organizmada sistemik fonksiyonel düşüşün iki bağımsız nedeni olduğunu kesin olarak doğrulamıştır. Verilerimiz, bu iki faktörün birleşik etkisiyle oluşan patolojik hasarın, tek başına her birinin basit katkı etkisinden çok daha ciddi olduğunu göstermektedir. Tek faktörlü müdahale gruplarına kıyasla, bileşik model grubu HFHS grubuna göre yağlanmada anlamlı bir fark göstermedi, ancak CR grubuna kıyasla belirgin...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

Bu çalışma, Hebei Bilim ve Teknoloji Programı Projesi (246W2501D, 252W7716D), HEBEI Bilim ve Teknoloji Programı (24462501D) ve Yanzhao Altın Platformu (A20240022) tarafından desteklendi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
ANY-mazeScienceSA225
Accu-Chek Active Kan Şekeri Monitörüİsviçre, Roche Diagnosticsaccu check active
C75BL/6J farelerBEIJING HFK BIOSCIENCE CO.,LTDNo.110324241101250228
Kavralma güç ölçerABD, Columbus Instruments1027CSM-E54
Yüksek yağ ve yüksek sükrozlu diyetÇin, Xietong Biotechnology Co., Ltd.XT303
HistoCore MULTICUT - Yarı Otomatik Döner MikrotomAlmanya, LeicaRM2245
Oil Red O çözeltisiÇin, Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd.G1260
Optimal kesme sıcaklığı bileşiğiJaponya, Sakura4583
Programlanabilir Zamanlayıcı SoketiÇin, GONEOGND-1
Tissue Tech Prisma PlusJaponya, Sakura20B2X00014000034
Tissue-Tek TEC 6 Gömme ModülüJaponya, SakuraM01-021E-02
Toplam Kolesterol (TC) Test KitiÇin, Suzhou Grace Biotechnology Co., Ltd.G0909W

Kaynaklar

  1. Wang, F., et al. Meta-analysis on night shift work and risk of metabolic syndrome. Obes Rev. 15, 709-720 (2014).
  2. Zhang, S., et al. Associations of sugar intake, high-sugar dietary pattern, and the risk of dementia: a prospective cohort study of 210,832 participants. BMC Med. 22, 298 (2024).
  3. Yeomans, M. R., Armitage, R., Atkinson, R., Francis, H., Stevenson, R. J. Habitual intake of fat and sugar is associated with poorer memory and greater impulsivity in humans. PLoS One. 18, e0290308 (2023).
  4. Sharma, V. K., Singh, T. G. Chronic stress and diabetes mellitus: Interwoven pathologies. Curr Diabetes Rev. 16, 546-556 (2020).
  5. Kaikaew, K., Steenbergen, J., van Dijk, T. H., Grefhorst, A., Visser, J. A. Sex difference in corticosterone-induced insulin resistance in mice. Endocrinology. 160, 2367-2387 (2019).
  6. Guillaume-Gentil, C., Assimacopoulos-Jeannet, F., Jeanrenaud, B. Involvement of non-esterified fatty acid oxidation in glucocorticoid-induced peripheral insulin resistance in vivo in rats. Diabetologia. 36, 899-906 (1993).
  7. Gori, M., et al. Palmitic acid affects intestinal epithelial barrier integrity and permeability in vitro. Antioxidants (Basel). 9 (5), 417 (2020).
  8. Dong, Q., et al. Effects of Tremella fuciformis polysaccharides on intestinal barrier and its functional mechanism. Mycosystema. 44 (03), 104-113 (2025).
  9. Velloso, L. A., Folli, F., Saad, M. J. TLR4 at the crossroads of nutrients, gut microbiota, and metabolic inflammation. Endocr Rev. 36, 245-271 (2015).
  10. Marques, M., et al. Doxorubicin induces a senescent phenotype in murine and human astrocytes. J Neurochem. 169, e70177 (2025).
  11. Krüger, P., et al. Inflammation and fibrosis in progeria: Organ-specific responses in an HGPS mouse model. Int J Mol Sci. 25 (17), 9323 (2024).
  12. Cristòfol, R., et al. Neurons from senescence-accelerated SAMP8 mice are protected against frailty by the sirtuin 1 promoting agents melatonin and resveratrol. J Pineal Res. 52, 271-281 (2012).
  13. Azman, K. F., Safdar, A., Zakaria, R. D-galactose-induced liver aging model: Its underlying mechanisms and potential therapeutic interventions. Exp Gerontol. 150, 111372 (2021).
  14. Takeshita, H., et al. Modified forelimb grip strength test detects aging-associated physiological decline in skeletal muscle function in male mice. Sci Rep. 7, 42323 (2017).
  15. Whitehead, J. C., et al. A clinical frailty index in aging mice: comparisons with frailty index data in humans. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 69, 621-632 (2014).
  16. Feridooni, H. A., Sun, M. H., Rockwood, K., Howlett, S. E. Reliability of a frailty index based on the clinical assessment of health deficits in male C57BL/6J mice. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 70, 686-693 (2015).
  17. Zhang, Y., Chu, J. M., Wong, G. T. Cerebral glutamate regulation and receptor changes in perioperative neuroinflammation and cognitive dysfunction. Biomolecules. 12 (4), 597 (2022).
  18. Fujiwara, M., Ferdousi, F., Isoda, H. Investigation into molecular brain aging in senescence-accelerated mouse (SAM) model employing whole transcriptomic analysis in search of potential molecular targets for therapeutic interventions. Int J Mol Sci. 24 (18), 13867 (2023).
  19. Ong, J., et al. Senescence accelerated mouse-prone 8: a model of neuroinflammation and aging with features of sporadic Alzheimer's disease. Stem Cells. 43 (2), sxae091 (2025).
  20. Linders, A. N., et al. A review of the pathophysiological mechanisms of doxorubicin-induced cardiotoxicity and aging. NPJ Aging. 10, 9 (2024).
  21. Sadigh-Eteghad, S., et al. D-galactose-induced brain ageing model: A systematic review and meta-analysis on cognitive outcomes and oxidative stress indices. PLoS One. 12, e0184122 (2017).
  22. Kohsaka, A., et al. High-fat diet disrupts behavioral and molecular circadian rhythms in mice. Cell Metab. 6, 414-421 (2007).
  23. Morris, C. J., Purvis, T. E., Hu, K., Scheer, F. A. Circadian misalignment increases cardiovascular disease risk factors in humans. Proc Natl Acad Sci U S A. 113, E1402-E1411 (2016).
  24. Latimer, M. N., Rhoads, M. K., Reynolds, L. D., Pollock, D. M. Chronic circadian stress impairs blood pressure and sodium homeostasis in a diet- and sex-specific manner. Am J Physiol Renal Physiol. 330, F186-F198 (2026).
  25. Joo, J., et al. The acute effects of time-of-day-dependent high fat feeding on whole body metabolic flexibility in mice. Int J Obes (Lond). 40, 1444-1451 (2016).
  26. Pati, P., et al. Time-restricted feeding reduces cardiovascular disease risk in obese mice. JCI Insight. 10 (4), e160257 (2025).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Y ksek Ya l DiyetY ksek ekerli DiyetMetabolik BozukluklarKognitif BozulmaHepatik SteatozK r lganl k ndeksi

İlgili makaleler