Canlı Hücre Görüntüleme İçin Evrensel Basınç Yükleme Cihazı Sürekli Fizyolojik Mekanik Stres Altında

Summary

Burada tanımlanan basınç yükleme cihazı, kültürlenmiş hücrelerin zaman geçişli optik görüntülemesini sağlar ve standart hücre kültür çanakları ile ters mikroskoplarla uyumludur. Bu cihaz kullanılarak, tümör hidrostatik basınç mikro ortamının kalsiyum sinyal iletimini artırdığı doğrulanmış ve tümör mikro ortamında mekanik sinyal iletimini incelemek için uygulanabilir bir platform sağlamıştır.

Abstract

Bu protokol, sürekli hidrostatik basınç uyarısı sırasında yapışkan hücrelerin gerçek zamanlı mikroskobik gözlemini kolaylaştıran ve 3,5 cm ticari hücre kültürü çanaklarıyla uyumlu olan hidrostatik basınç yükleme cihazını tanımlar. Cihaz, alüminyum tabandan yapılmış hava geçirmez bir kültür odası, optik olarak şeffaf poli(metil metakrilat) bir kapak, kapağa entegre gaz giriş/çıkış portları ve mühürlenmiş bir gözlem penceresinden oluşmaktadır. Düzenlenmiş bir gaz kaynağına bağlanarak, cihaz sabit bir hidrostatik basıncı (0–200 kPa, ayarlanabilir) korur ve sürekli faz kontrastı veya floresans görüntüleme imkanı sağlar. Bu basınç yükleme cihazı kullanılarak, morfoloji, proliferasyon ve göç gibi hücre fenotipi ve davranışları üzerinde basınca bağlı doz bağımlı etkiler kaydedilebilir. Ayrıca, floresan sinyaller gerçek zamanlı olarak da kaydedilebilir. Burada, meme kanseri MDA-MB-231 hücrelerinde ve rahim ağıcı kanseri HeLa hücrelerinde basınçla tetiklenen Ca^2⁺ sinyal heterojenliği ve dinamikleri, zaman geçişli görüntüleme kullanılarak ters floresan mikroskopiyle incelendi ve nicelendirildi. Bu platform, mekanik yüklemeyi canlı hücre görüntülemeyle entegre ederek geleneksel uç nokta sistemlerinin sınırlamalarını aşarak mekanikbiyolojik çalışmalar için evrensel bir araç sunar.

Introduction

Çok sayıda hücre, doku ve organ, fizyolojilerinin bir parçası olarak sürekli veya aralıklı baskı kuvvetleri^{yaşar 1}. Örneğin, alveolar hücreler solunum sırasında döngüsel basınçlandırmaya^{maruz kalırken,} mesane epitel hücreleri idrar tutma^{sırasında mekanik yüklere maruz kalır.} Katı tümörler gibi patolojik bağlamlarda, kanser hücreleri sürekli olarak mekansal sıkıştırma ve yüksek interstisiel sıvı basıncından kaynaklanan baskı kuvvetlerine maruz^{kalır 4}. Benzer şekilde, menisküs dejenerasyonu ve pulmoner fibroz gibi diğer hastalıklarda, meniska....

Protocol

1. Malzemeler

1. Cihaz özellikleri ( Bkz. Şekil 1)
   1. Bileşenleri aşağıda belirtilen özelliklere göre hazırlayın:
      Taban: alüminyum (Ø 56 mm, yükseklik 15 mm), merkezi pencere Ø 40 mm.
      Kapak: PMMA (Ø 56 mm) 6 × M3 dişli delik, Luer-lock gaz portu, silikon conta (iç çapı 25 mm, dış çapı 32 mm, kalınlığı 0,8 mm)
      Basınç regülatörü: (0–200 kPa aralığı)
2. Hücreler ve reaktifler
   1. Bu çalışmada MDA-MB-231 ve HeLa hücreleri kullanın. L-15 ortamı, RPMI 1640 ortamı, yenidoğan buzağı serumu (NCS), %1 antibiyotik-antimikotik solüsyesi ve hücre kül....

Results

Bu hidrostatik basınç yükleme cihazının gerçek zamanlı görüntüleme fonksiyonunu doğrulamak için, hidrostatik basınç uygulandıktan sonra tümör hücrelerindeki kalsiyum sinyallerinin dinamikleri gözlemlenmiştir. Konfluent MDA-MB-231, HeLa ve A549 hücreleri, sonraki kullanım için 35 mm kültür kablarına tohumlanmıştır. Kalsiyum görüntüleme probuyla boyandıktan sonra, serumsuz kültürlenmiş hücreler 40 kPa hidrostatik basınca maruz kaldı. 10 dakika hidrostatik basınç yüklemesinden sonra, kanser.......

Discussion

Bu protokol, ayarlanabilir hidrostatik basınç altında mekanik transdüksiyon dinamiklerinin gerçek zamanlı gözlemini mümkün kılan evrensel olarak uyarlanabilir bir basınç yükleme cihazı gösterdi. Optik olarak şeffaf bir PMMA kapağının hassas bir işleme alüminyum tabanla entegre edilmesiyle, sistem sadece uç nokta analizi yapabilen geleneksel odaların kritik sınırlamalarını aşmaktadır. Bu basınç yükleme cihazı, standart bir ters mikroskopla çalışarak, zaman geçişli görüntüleme yoluyla dina.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibiyotik-Antimikotik (100x)	Thermo Fisher Scientific, ABD	15140122	Tam ortamda %1 konsantrasyon
Otoklav	Panasonic, Japonya	MLS-3751-PC	Alüminyum taban ve silikon contayı sterilize etmek için
Biyogüvenlik Dolabı	Thermo Fisher Scientific, ABD	1300 Serisi A2 Sınıf II, Tip A2 Biyolojik Güvenlik Kabinetleri	Hücre yönetimi için steril bir ortam sağlar
Cal-520, hücre tarafından alınan kalsiyum göstergesi	AAT Bioquest, ABD	21131	Canlı hücrelerde kalsiyum iyonu konsantrasyonunun dinamik tespiti için
Hücre Kültürü Çanakı (35 mm)	BIOFIL, Çin	TCD010035	Tohumlama hücreleri için kullanılan standart 35 mm çanak
Oda Tabanı (Alüminyum)	Quanyi, Çin	/	Özel tasarım Ø 56 mm, H 15 mm, merkezi pencere ve Oslash; 40 mm
Chamber Cover (PMMA)	Quanyi,  Çin	/	Özel tasarım Ø 56 mm, 6& kez ile; M3 dişli delikler, Luer-kilitli gaz portu
CO2 Kuluçka Makinesi	Thermo Fisher Scientific, ABD	HERAcell 3111	Kültür koşullarını 37°C; C %5 CO2
HBSS (Hanks'in Dengeli Tuz Çözeltisi)	Beyotime, Çin	C0219	Boyamadan önce ve sonra hücreleri yıkamak için
HeLa hücre hattı	Hücre Kaynak Merkezi, Temel Tıp Bilimleri Enstitüsü, CAMS/PUMC, Çin	CRM-CCL-2	İnsan rahim ağız kanseri hücreleri
Ters Flüoresans Mikroskobu	Nikon, Japonya	Eclipse Ti2	Floresans görüntüleme için
Leibovitz'in L-15 Medium	Thermo Fisher Scientific, ABD	41300039	MDA-MB-231 hücre kültürü için
MDA-MB-231 hücre hattı	Hücre Kaynak Merkezi, Temel Tıp Bilimleri Enstitüsü, CAMS/PUMC, Çin	CRM-HTB-26	İnsan meme kanseri hücreleri
Yeni Doğan Balağı Serumu (NCS)	Thermo Fisher Scientific, ABD	16010142	Tam ortamda %10 konsantrasyon
Basınç Regülatörü	Hongrun, Çin	DP20	Menzil: 0-200 kPa
RPMI 1640 Orta	Thermo Fisher Scientific, ABD	31800022	MDA-MB-231 hücre kültürü için
Steril Şırınga (5 mL)	KDL, Çin	1101010198	Luer-lock portundan ortam veya reaktiflerin enjekte edilmesi için
Tripsin (%0,25)	Thermo Fisher Scientific, ABD	2520056	Geçiş için yapışkan hücreleri ayırmak için