Canlı Hücre Görüntüleme İçin Evrensel Basınç Yükleme Cihazı Sürekli Fizyolojik Mekanik Stres Altında

Summary

Burada tanımlanan basınç yükleme cihazı, kültürlenmiş hücrelerin zaman geçişli optik görüntülemesini sağlar ve standart hücre kültür çanakları ile ters mikroskoplarla uyumludur. Bu cihaz kullanılarak, tümör hidrostatik basınç mikro ortamının kalsiyum sinyal iletimini artırdığı doğrulanmış ve tümör mikro ortamında mekanik sinyal iletimini incelemek için uygulanabilir bir platform sağlamıştır.

Abstract

Bu protokol, sürekli hidrostatik basınç uyarısı sırasında yapışkan hücrelerin gerçek zamanlı mikroskobik gözlemini kolaylaştıran ve 3,5 cm ticari hücre kültürü çanaklarıyla uyumlu olan hidrostatik basınç yükleme cihazını tanımlar. Cihaz, alüminyum tabandan yapılmış hava geçirmez bir kültür odası, optik olarak şeffaf poli(metil metakrilat) bir kapak, kapağa entegre gaz giriş/çıkış portları ve mühürlenmiş bir gözlem penceresinden oluşmaktadır. Düzenlenmiş bir gaz kaynağına bağlanarak, cihaz sabit bir hidrostatik basıncı (0–200 kPa, ayarlanabilir) korur ve sürekli faz kontrastı veya floresans görüntüleme imkanı sağlar. Bu basınç yükleme cihazı kullanılarak, morfoloji, proliferasyon ve göç gibi hücre fenotipi ve davranışları üzerinde basınca bağlı doz bağımlı etkiler kaydedilebilir. Ayrıca, floresan sinyaller gerçek zamanlı olarak da kaydedilebilir. Burada, meme kanseri MDA-MB-231 hücrelerinde ve rahim ağıcı kanseri HeLa hücrelerinde basınçla tetiklenen Ca^2⁺ sinyal heterojenliği ve dinamikleri, zaman geçişli görüntüleme kullanılarak ters floresan mikroskopiyle incelendi ve nicelendirildi. Bu platform, mekanik yüklemeyi canlı hücre görüntülemeyle entegre ederek geleneksel uç nokta sistemlerinin sınırlamalarını aşarak mekanikbiyolojik çalışmalar için evrensel bir araç sunar.

Introduction

Çok sayıda hücre, doku ve organ, fizyolojilerinin bir parçası olarak sürekli veya aralıklı baskı kuvvetleri^{yaşar 1}. Örneğin, alveolar hücreler solunum sırasında döngüsel basınçlandırmaya^{maruz kalırken,} mesane epitel hücreleri idrar tutma^{sırasında mekanik yüklere maruz kalır.} Katı tümörler gibi patolojik bağlamlarda, kanser hücreleri sürekli olarak mekansal sıkıştırma ve yüksek interstisiel sıvı basıncından kaynaklanan baskı kuvvetlerine maruz^{kalır 4}. Benzer şekilde, menisküs dejenerasyonu ve pulmoner fibroz gibi diğer hastalıklarda, meniskal^{hücreler 5} ve alveoller epitel^{hücreleri 6} da gerilim ve matriks sertliğinden kaynaklanan basınçtan kaynaklanan sürekli mekanik streslere maruz kalır.

Mekanik basıncın hücre fenotipi ve davranışının güçlü bir düzenleyicisi^{olduğunu doğrulayan artan kanıtlar vardır 7,8}. Malign olmayan hücrelerde, kompresif stres periodontal kök hücrelerin çoğalmasını artırır ve invaziv çıkıntılar yoluyla osteoklast füzyonu^{indüke eder 9}. Buna karşılık, kanser modellerinde sıkıştırma janus etkileri gösterir: melanom hücrelerinin çoğalmasını ve göçünü baskılarken, aynı zamanda kemodirenç artıran transkriptomik yeniden programlamayı aktive^{eder 10,11}. Ayrıca, hiperosmotik basınçtan kaynaklanan hacimsel sıkıştırma hücre içi kalabalıklığa yol açabilir ve sıvı-sıvı faz ayrımı (LLPS) yoluyla protein konsantrasyonu ile iyon şiddetinin yeniden dağılımını teşvik edebilir; bu da hücre davranışlarını ve kaderini derinden değiştirir. Bu fiziksel bozulma, aktif Wnt/β-katenin sinyal iletimi ve bağırsak kök hücrelerinin kendini yenilemesini artırarak bağırsak organoidlerinin genleşmesini artırır¹². Ayrıca, hücre çekirdeğinde, hacim değişiklikleriyle indüklenen LLPS, transkripsiyon başlatma, uzatma ve sonlandırma koordinasyonu yoluyla gen transkripsiyon kontrolünde^{yer alır 13,14}.

Bu basınç kaynaklı biyolojik etkileri nicel olarak incelemek için, iyi tanımlanmış ve homojen sıkıştırıcı uyarıcıları uygulayabilen deneysel sistemler gereklidir. In vitro kültüre alınan ve etrafı sulu bir ortamla çevrili hücreler için, hidrostatik basınç, bu baskı kuvvetlerinin uygulanmasında birincil ve fizyolojik olarak önemli bir yöntem olarak hizmet eder; bu yöntem, hücresel mekanotransduksiyon¹⁵ incelenmesinde yaygın olarak benimsenmiştir. Hidrostatik basınç, osteoindüktif faktörler takviyesi olmadan alkali fosfataz aktivitesini artırabilir ve insan yağ kök hücrelerinin osteogenezini hızlandırabilir^. Alkol olmayan yağlı karaciğer hastalığında, hidrostatik basınç gibi mekanik kuvvetler, önemli fibroz olmadan portal hipertansiyona katkıda bulunabilir ve doku çeşitliliğindeki rolünü^vurgular. Hidrostatik basınç patofizyolojik düzenlemede önemli bir rol oynasa da, hidrostatik basıncın mekanik çalışmaları kritik bir sınırlamayla karşı karşıyadır: geleneksel basınç odaları, uyarlama sırasında canlı hücrelerin gerçek zamanlı gözlemini engeller. Çoğu deneysel sistem, yalnızca son nokta analizine izin verir ve Piezo1 mekanik aktivasyonu, Ca²⁺ akış heterojenliği ve sitoskelet yeniden organizasyonu gibi mekanotransduksiyon olaylarının mekansal ve zamansal dinamiklerini maskeler. Bu boşluk, hidrostatik basıncın tümör veya diğer dokularda fenotip çeşitliliğini nasıl etkilediğinin anlaşılmasını sınırladı.

Bu teknolojik açığı gidermek için, optik görüntüleme yoluyla hassas kontrol edilen hidrostatik basınca hücresel yanıtların gerçek zamanlı gözlemlenmesini sağlayan yeni bir deneysel platform geliştirildi. Bu sistem üç temel yeteneği entegre eder: (1) ayarlanabilir gaz basıncı kontrolörü aracılığıyla 0–100 kPa aralığında sürekli hidrostatik basınç uygulaması (Basınç göstergesi 0–200 kPa aralığına sahiptir ve uygulanan basınçlar fizyolojik parametrelere göre seçilebilir). Örneğin, çeşitli hücre tiplerinin bildirilen sıkıştırıcı streslerine dayanarak: insan kemik iliği stromal hücreleri için 8-16^{kPa 18}, damar düz kas^{hücreleri için} 12–24 kPa 19 ve insan meme epitel hücreleri için 0–15 kPa²⁰.); (2) hidrostatik basınç uygulaması sırasında yüksek zamansal çözünürlüklü sürekli canlı hücre görüntüleme; ve (3) fizyolojik kültür koşullarının uzun süreli deneyler boyunca korunması. Bu yaklaşım, mekanik uyarıma yanıt olarak gerçekleşen Piezo1 kanal aboru ve aktivasyonu, kalsiyum sinyal dalgaları ve sitoskelet yeniden yapılandırması gibi dinamik süreçlerin doğrudan görselleştirilmesine olanak tanır. Ayrıca, bu cihaz çoğu ticari olarak bulunan kültür kabları ve ters mikroskoplarla uyumludur, bu da laboratuvarlarda kullanımını son derece pratik hale getirir. Bu hücre içi biyokimyasal olayları gerçek zamanlı izleme yeteneği, hücrelerin hidrostatik basınca nasıl uyum sağladığı ve hissettiği konusunda eşi benzeri görülmemiş bilgiler sunar. Mekanik transdüksiyon olaylarının zamansal dizilimini yakalayarak, bu platform, kuvvetin ilk algılanması, aşağı akış sinyalleri ve fenotipik değişiklikleri içeren bu platform, hidrostatik basıncın hücre davranışını fizyolojik ve patolojik bağlamlarda nasıl etkilediğini incelemek için güçlü bir araç sunar.

Protocol

1. Malzemeler

1. Cihaz özellikleri ( Bkz. Şekil 1)
   1. Bileşenleri aşağıda belirtilen özelliklere göre hazırlayın:
      Taban: alüminyum (Ø 56 mm, yükseklik 15 mm), merkezi pencere Ø 40 mm.
      Kapak: PMMA (Ø 56 mm) 6 × M3 dişli delik, Luer-lock gaz portu, silikon conta (iç çapı 25 mm, dış çapı 32 mm, kalınlığı 0,8 mm)
      Basınç regülatörü: (0–200 kPa aralığı)
2. Hücreler ve reaktifler
   1. Bu çalışmada MDA-MB-231 ve HeLa hücreleri kullanın. L-15 ortamı, RPMI 1640 ortamı, yenidoğan buzağı serumu (NCS), %1 antibiyotik-antimikotik solüsyesi ve hücre kültürü ile Ca²⁺ etiketleme için kalsiyum görüntüleme probu kullanın.

2. Cihaz hazırlığı

1. Üretim
   1. Bu çalışmanın temel bileşeni özel tasarım. Alüminyum taban ve PMMA kapağını teknik özelliklere göre hassas makine ile yapın ( bkz. Şekil 1 ve Ek Şekil 1).
   2. Silikon contayı kesin ve gerekli boyuta işleyin.
      NOT: PMMA malzemesinin optik geçirimliliği, standart iletim ışık görüntülemesi için yeterlidir. Tüm bileşenler sterilize edilebilir ve sonraki hücre kültürü deneyleri için biyouyumlu olmuştur. Bu odanın üretim toleranslarına özel bir şart getirilmemiştir (bu çalışmada ±0,1 mm tolerans benimsenmiştir).
2. Sterilizasyon
   1. Tabanı (Alüminyum) sterilize etmek için, 121 °C'de 20 dakika boyunca otoklav yapın.
   2. Kapağı sterilize etmek için (PMMA), %75 etanol ile silin, ardından 30 dakika UV ile sterilize edin.
   3. Silikon contayı 121 °C'de 20 dakika boyunca otoklavlayarak sterilize edin.

3. Hücre işleme

1. Hücre kültürü
   1. Tohum hücreleri, 35 mm tabaklarda %30–%70 birleşimde kullanılır. Hücreler, RPMI-1640 veya L15 ortamında (%10 NCS takviyesi olarak)_CO2 kuluçka makinesinde 37 °C'de, %5 CO₂ ile 24 saat boyunca kültürlenin.
   2. Hücre geçişi için, hücreleri %0,25 tripsin ile ayırın ve sindirimi tam ortamla sonlandırın. Hücreler %70–%80 birleşime ulaştığında yeniden tohumlama için kullanın.
2. Ca²⁺ boyama
   1. Ortamı çıkarın ve hücreleri önceden ısıtılmış Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) ile biyogüvenlik dolabında iki kez yıkayın.
   2. Hücrelerarası Ca²⁺ 5 μM kalsiyum görüntüleme probu ile serumsuz ortamda boyan. Hücreleri 37 °C'de ışık korumalı bir ortamda 20 dakika kuluçka edin.
   3. Boyayı çıkarın, hücreleri HBSS ile üç kez yıkayın ve ardından serumsuz ortamda 30 dakika boyunca de-esterifiye edin.

4. Cihaz montajı (Şekil 2)

1. Kültür kabını basınç odasının merkezi penceresine taşıyın, ardından kültür ortamını çıkarın.
2. Sterilize edilmiş contanı kültür kabına yerleştirin.
3. Kapağı çanak contası yığınının üzerine hizalayın.
4. Vidaları çapraz olarak önce elle sıkarak direnç hissedilene kadar sıkın, ardından tork kontrollü sürücü kullanarak 1,5 ek tur ekleyin.
5. Silikon gaz borusunu Luer-lock portuna bağlayın ve sızıntı olup olmadığını kontrol etmek için cihaza karışık gaz enjekte edin.
6. Silikon gaz tüpünü ayırın ve 5 mL steril bir şırınga ile Luer-lock portundan hücre kültür kabına taze ortam enjekte edin.

5. Basınç yüklemesi ve görüntüleme

1. Silikon gaz borusunu (iç çapı 4 mm) silikon contadaki Luer-lock portundan dijital basınç göstergesine ve gaz tankına bağlayın.
2. Monte edilmiş cihazı mikroskop aşamasına monte edin.
3. Basıncı kalibre edin.
   1. 0–200 kPa aralığının stabilitesini gösterge cihazıyla doğrulayın.
      NOT: HeLa hücre kültürü için %75 azot, %20 oksijen ve %5 karbondioksit içeren karışık bir gaz kullanılır. MDA-MB-231 hücre kültürü için %80 azot ve %20 oksijen içeren karışık bir gaz kullanılır. Basınç yükleme deneyinde kullanılan gaz türü, hücre tipine, ortam tipine veya özel deneysel gereksinimlere göre değiştirilebilir. Hiçbir bileşen modele özgü değildir ve basınç tespit modülü ile giriş borusunun boyutları gerektiğinde seçilebilir.
4. Hedef basıncı (örneğin, 100 kPa) dijital basınç regülatörü aracılığıyla ayarlayın.
5. Hedef basınca ulaşıldığında görüntülemeyi başlatın.
6. Görüntüleme
   1. Sahneyi ayarlayın, görüntüleme alanını doğrulayın ve hücrelerin odakta olduğundan emin olun.
   2. 20× objektif ile donatılmış ters floresans mikroskobu kullanarak lekeli hücrelerin floresan görüntülerini alın ve aşağıdaki parametrelerle alın: 400 ms pozlama süresi, 5 saniye zaman geçişi aralıkları ve toplam görüntüleme süresi 10 dakika (FITC filtresi: Ex/Em = 490/525 nm, kesme = 515 nm).
   3. Sistemin doğru çalışmasını sağlamak ve temel sinyal verilerini elde etmek için basınçsız koşullarda 10 dakika görüntü alın.
   4. Gaz valfini yük basıncına açtıktan sonra, hücrelerin odakta olduğundan emin olmak için sahne yüksekliğini yeniden ayarlayın, ardından dinamik kalsiyum sinyallerinin görüntülenmesine başlayın.
   5. Objektif merceği, kültür kabının alt kalınlığına ve nesnenin çalışma mesafesine göre seçin. Kalsiyum sinyal salınımlarının izlenmesini mümkün kılmak için kullanılan maruz kalma süresini seçin; aşırı foto ağartma ve foto hasarını önleyin.
   6. Diğer dinamik sinyalleri gözlemlerken prob tipine ve deneysel gereksinimlere göre parametreleri ayarlayın.

6. Sorun Giderme

1. Sorun giderme tavsiyesi için Tablo 1'e bakınız.

7. İstatistiksel analiz

1. Tüm verileri ortalama ± standart sapma (SD) olarak sunun. GraphPad Prism yazılımı (ABD), eşleşmemiş öğrencinin t-testiyle iki grup arasındaki sonuçları karşılaştırmak için kullanıldı. **p 0.01, ***p 0.001 << veya ****p < 0.0001 olduğunda farkları istatistiksel olarak anlamlı olarak kabul edin.

Results

Bu hidrostatik basınç yükleme cihazının gerçek zamanlı görüntüleme fonksiyonunu doğrulamak için, hidrostatik basınç uygulandıktan sonra tümör hücrelerindeki kalsiyum sinyallerinin dinamikleri gözlemlenmiştir. Konfluent MDA-MB-231, HeLa ve A549 hücreleri, sonraki kullanım için 35 mm kültür kablarına tohumlanmıştır. Kalsiyum görüntüleme probuyla boyandıktan sonra, serumsuz kültürlenmiş hücreler 40 kPa hidrostatik basınca maruz kaldı. 10 dakika hidrostatik basınç yüklemesinden sonra, kanser...

Discussion

Bu protokol, ayarlanabilir hidrostatik basınç altında mekanik transdüksiyon dinamiklerinin gerçek zamanlı gözlemini mümkün kılan evrensel olarak uyarlanabilir bir basınç yükleme cihazı gösterdi. Optik olarak şeffaf bir PMMA kapağının hassas bir işleme alüminyum tabanla entegre edilmesiyle, sistem sadece uç nokta analizi yapabilen geleneksel odaların kritik sınırlamalarını aşmaktadır. Bu basınç yükleme cihazı, standart bir ters mikroskopla çalışarak, zaman geçişli görüntüleme yoluyla dina...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibiyotik-Antimikotik (100x)	Thermo Fisher Scientific, ABD	15140122	Tam ortamda %1 konsantrasyon
Otoklav	Panasonic, Japonya	MLS-3751-PC	Alüminyum taban ve silikon contayı sterilize etmek için
Biyogüvenlik Dolabı	Thermo Fisher Scientific, ABD	1300 Serisi A2 Sınıf II, Tip A2 Biyolojik Güvenlik Kabinetleri	Hücre yönetimi için steril bir ortam sağlar
Cal-520, hücre tarafından alınan kalsiyum göstergesi	AAT Bioquest, ABD	21131	Canlı hücrelerde kalsiyum iyonu konsantrasyonunun dinamik tespiti için
Hücre Kültürü Çanakı (35 mm)	BIOFIL, Çin	TCD010035	Tohumlama hücreleri için kullanılan standart 35 mm çanak
Oda Tabanı (Alüminyum)	Quanyi, Çin	/	Özel tasarım Ø 56 mm, H 15 mm, merkezi pencere ve Oslash; 40 mm
Chamber Cover (PMMA)	Quanyi,  Çin	/	Özel tasarım Ø 56 mm, 6& kez ile; M3 dişli delikler, Luer-kilitli gaz portu
CO2 Kuluçka Makinesi	Thermo Fisher Scientific, ABD	HERAcell 3111	Kültür koşullarını 37°C; C %5 CO2
HBSS (Hanks'in Dengeli Tuz Çözeltisi)	Beyotime, Çin	C0219	Boyamadan önce ve sonra hücreleri yıkamak için
HeLa hücre hattı	Hücre Kaynak Merkezi, Temel Tıp Bilimleri Enstitüsü, CAMS/PUMC, Çin	CRM-CCL-2	İnsan rahim ağız kanseri hücreleri
Ters Flüoresans Mikroskobu	Nikon, Japonya	Eclipse Ti2	Floresans görüntüleme için
Leibovitz'in L-15 Medium	Thermo Fisher Scientific, ABD	41300039	MDA-MB-231 hücre kültürü için
MDA-MB-231 hücre hattı	Hücre Kaynak Merkezi, Temel Tıp Bilimleri Enstitüsü, CAMS/PUMC, Çin	CRM-HTB-26	İnsan meme kanseri hücreleri
Yeni Doğan Balağı Serumu (NCS)	Thermo Fisher Scientific, ABD	16010142	Tam ortamda %10 konsantrasyon
Basınç Regülatörü	Hongrun, Çin	DP20	Menzil: 0-200 kPa
RPMI 1640 Orta	Thermo Fisher Scientific, ABD	31800022	MDA-MB-231 hücre kültürü için
Steril Şırınga (5 mL)	KDL, Çin	1101010198	Luer-lock portundan ortam veya reaktiflerin enjekte edilmesi için
Tripsin (%0,25)	Thermo Fisher Scientific, ABD	2520056	Geçiş için yapışkan hücreleri ayırmak için