Mannoz Reseptörü C Tip 2, gliomada kötü sonucu öngörür ve invaziv fenotipler ile β-katenin/EMT ile ilgili değişikliklerle ilişkilidir

Özet

Kamu kohort analizleri ve glioma hücre tabanlı deneyler, MRC2'nin gliomada artan proliferasyon, göç, invaziya ve β-katenin/EMT ile ilgili değişikliklerle ilişkili kötü prognoz belirteci olduğunu belirtmektedir.

Özet

Glioma, merkezi sinir sisteminin ölümcül bir malignitesi olmaya devam etmekte ve prognostik tabakalaşmayı iyileştiren ve terapötik araştırmaları bilgilendiren ek biyobelirteçlere hâlâ ihtiyaç vardır. Bu çalışma, mannoz reseptörü C-tip 2 (MRC2/Endo180) incelenerek kamu transkriptomik kohortlarını in vitro doğrulama ile entegre etti. İpresyon profilleri ve eşleşen klinik notasyonlar, tümör-normal karşılaştırmalar ve pan-kanser taraması için The Cancer Genome Atlas (TCGA) ve Genotip-Doku İfadesi (GTEx) projesinden alındı; prognostik ilişkiler Çin Glioma Genom Atlası (CGGA) kohortunda daha ayrıntılı incelendi. MRC2 ekspresyonu, glioma hücre hatlarında ters transkripsiyon nicel PCR (RT-qPCR) ve immünoblotlama ile değerlendirildi ve lentiviral kısa saç tokası RNA'ları (shRNA'lar) kullanılarak U87 ve U251 hücrelerinde stabil MRC2 knockdown sağlandı. Hücre büyümesi ve klonojenlik CCK-8 ve koloni oluşumu testleriyle değerlendirilirken, göç ve invaziya gözenekli membran insert testleriyle değerlendirildi. CDK4, CDK6 ve β-katenin/epitelyal–mezenkimal geçiş (EMT) ile ilişkili belirteçler immünoblotlama ile analiz edildi. Veri setleri boyunca, gliomda MRC2 yüksekti ve daha yüksek ekspresyon daha kötü genel hayatta kalma, hastalığa özgü sağlık, ilerlemesiz aralık ile ilişkilendirildi. In vitro MRC2 azalması, proliferasyonu, klonojenliği, göçü ve invaziyi azalttı; buna CDK4 ve CDK6 protein seviyelerinin azalması ve β-katenin ile EMT-ile ilgili belirteçlerdeki değişiklikler eşlik etti. Bu bulgular birlikte, MRC2'yi agresif glioma fenotipleriyle ilişkili bir prognostik biyobelirteç olarak desteklemekte ve daha fazla mekanik ve in vivo inceleme gerektirmektedir.

Giriş

Gliomalar, merkezi sinir sisteminde ortaya çıkan en yaygın birincil tümörleri temsil eder ve intrakraniyal neoplazmaların önemli bir^{kısmını oluşturur 1,2}. Epidemiyolojik çalışmalar, her yıl 100.000 kişide birkaç vaka oranında bir vaka oranı tahmin etmekte olup, nüfuslar arasında coğrafi ve cinsiyetle ilgili farklılıklar^{bildirilmiştir (3,4}). Klinik olarak, gliomlar geniş bir davranış yelpazesini kapsar: düşük dereceli gliomlar uzun süreli bir süreç izleyebilirken, yüksek dereceli hastalıklar — özellikle glioblastoma — çoğu hasta için hızla ölümcül^{olmaya devam eder} 5,6,7,8. Modern WHO sınıflandırmaları, histolojiyi temel moleküler özelliklerle (örneğin, IDH mutasyonu, TERT promotor değişikliği, MGMT promotor metilasyonu ve 1p/19q ortak silinmesi) entegre eder; bu özellikler taniyi netleştirir ve^{prognoz 9,10'u} bilgilendirir. Cerrahi, radyoterapi ve kemoterapiyi birleştiren çoklu modal yönetim olmasına rağmen, nükleme yaygındır ve yüksek dereceli tümörler için uzun vadeli sonuçlar kötü kalır. Bu nedenle, ek prognostik işaretleyiciler ve hedeflenebilir açıklıkların tespit edilmesi acil bir öncelik olmaya devam ediyor.

MRC2 (mannoz reseptörü C-tip 2; ayrıca Endo180/CD280/uPARAP olarak da adlandırılır), C-tip lektin reseptör^{ailesi 11'in} bir transmembran üyesidir. Fibroblastlar ve makrofajlar gibi stromal ve bağışıklık bölmeleriyle zenginleştirilmiş olup, ekstraselüler matriks (ECM) dönüşümüne, fibrozla ilgili yeniden yapılanmaya ve tümör-mikroçevre etkileşimlerine^{katılır 12,13}. Yapısal olarak, MRC2 N-terminal sistein açısından zengin bir bölge, kollajen bağlayan bir fibronektin tip II domaini, birden fazla C-tipi lektin benzeri domain, bir transmembran segmenti ve sitoplazmik^{kuyruk 14,15} içerir. Kolajen içselleştirmesi ve yeniden şekillendirilmesiyle MRC2 hücre hareketliliğini ve doku istilasını kolaylaştırabilir; MRC2'nin yükselmesi, meme, pankreas, prostat, melanom ve glioblastoma gibi çeşitli kanserlerde agresif^{davranışla ilişkilendirilmiştir} 11,14,16,17,18 . Önceki çalışmalar ayrıca MRC2 ile pro-invaziv sinyal programları (örneğin, TGF-β ilişkili yollar), matriks metalloproteinaz aktivitesi ve EMT benzeri fenotipik değişiklikler ile kanserle ilişkili fibroblast ve makrofaj durumlarındaki roller arasında^{bağlantılar olduğunu öne sürmektedir} 17,18,19,20,21 . Ancak, gliomada MRC2'nin klinik önemi ve glioma hücrelerinde MRC2 düzensizliğinin fonksiyonel sonuçları belirsizdir.

MRC2, birçok malignitede ekstraselüler matriks yeniden modellenmesi ve invaziv davranışlarda rol oynamış olsa da, gliomdaki klinik önemi bağımsız transkriptomik kohortlar arasında sistematik olarak belirlenmemiş ve glioma hücrelerindeki fenotiple ilişkili etkileri, kamu veri seti analizi ile fonksiyonel doğrulamayı birleştiren entegre bir çerçeve içinde değerlendirilmemiştir. Bu nedenle bu çalışma, MRC2'nin gliomada olumsuz klinik sonuçlar ve kötü niyetli fenotiplerle ilişkili olduğunu öne sürdü. Bu sorunu ele almak için, pan-kanser taraması, bağımsız glioma kohort doğrulaması ve glioma hücre hatlarında stabil knockdown deneyleri entegre edildi; MRC2'nin prognostik önemi ve proliferasyon, göç, istila ve β-katenin/EMT ile ilgili belirteçlerdeki değişikliklerle ilişkisi değerlendirildi. MRC2 mannoz reseptör ailesine ait olduğu ve glioma ilerlemesi tümör mikroçevresi tarafından şekillendirildiği için, glioma alt tipleri arasındaki bağışıklık ilişkili farklılıklar hakkında bağlamsal bilgi sağlamak için IDH durumuna göre MRC1 ekspresyonunun ek bir keşif analizi eklenmiştir.

Bu çalışmanın yeniliği, MRC2'nin kamu glioma veri setleri ve in vitro fonksiyonel testler arasında birleşik değerlendirmesinde yatıyor; böylece gliomadaki önemi için tamamlayıcı klinik ve deneysel kanıtlar sağlamaktadır. Tek kohort analizleri veya sadece hücre çalışmalarıyla karşılaştırıldığında, bu entegre iş akışı birkaç pratik avantaj sunar. TCGA, GTEx ve CGGA'nın dahil edilmesi, çapraz kohort doğrulamasını sağlar ve tek bir veri setine bağımlılığı azaltır. Ayrıca, kamu kohort analizlerini glioma hücre knockdown testleriyle birleştirmek, klinik ilişkileri fenotip düzeyindeki kanıtlarla ilişkilendirir. Son olarak, RT-qPCR, immünoblotasyon, CCK-8, koloni oluşumu ve gözenekli membran insert testleri gibi tamamlayıcı okumaların kullanımı, transkripsiyonel, protein seviyesi, proliferatif ve motiliteyle ilgili değişikliklerin paralel olarak değerlendirilmesini sağlar. Genel çalışma tasarımı ve analitik iş akışı Şekil 1'de özetlenmiştir. Bu strateji birlikte, bulguların sadece biyoinformatik veya tek test yaklaşımlarına göre sağlamlığını ve biyolojik yorumlanabilirliğini artırır.

Protokol

Bu çalışma, kamuya açık olan, kimliği silinmiş veri setleri (TCGA, GTEx ve CGGA) ve yerleşik ticari hücre hatlarını kullandı. Yeni işe alınan insan katılımcılar, tanımlanabilir hasta bilgileri veya hasta kaynaklı örnekler dahil edilmedi. Tüm analizler, kamuya açık verilerin kullanımına ilişkin ilgili kurumsal ve uluslararası yönergelere uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Bu nedenle, bu çalışma için ek kurumsal etik onayı veya bilgilendirilmiş onay gerekmemiştir.

1. Biyoinformatik iş akışı ve veri ön işleme

Gen ekspresyonu profilleri ve eşleşen klinik notasyonlar, Kanser Genomu Atlası (TCGA), Genotip-Doku İfadesi (GTEx) projesi ve Çin Glioma Genom Atlası (CGGA) gibi halka açık kaynaklardan elde edilmiştir. İfade matrisleri ve klinik meta veriler R'ye aktarıldı ve örnek tanımlayıcılarına göre uyumlaştırıldı. Tekrarlanan veya eşleşmemiş girişler çıkarıldı ve temel hayatta kalma bilgisi olmayan örnekler sağ kalma analizlerinden hariç tutuldu. MRC2 ekspresyon değerleri ve ilgili klinikopatologik değişkenler sonraki analizler için çıkarıldı. Tümör-normal karşılaştırmaları için, MRC2 ekspresyonu kanser türleri arasında karşılaştırıldı; eşleşen normal dokular mevcut olduğunda sadece TCGA-verileri kullanılarak ve ek normal kontroller gerektiğinde entegre TCGA–GTEx verileri kullanıldı. Glioma odaklı analizler için, TCGA-LGG ve CGGA kohortlarındaki hastalar kohortun medyan MRC2 ekspresyon seviyesine göre yüksek ve düşük ekspresyon gruplarına ayrıldı. Kaplan-Meier sağ kalma analizi, zamana bağlı alıcı çalışma karakteristikleri (ROC) analizi ve Cox orantılı tehlike regresyonu MRC2'nin prognostik önemini değerlendirmek için gerçekleştirildi. Cox modelleri, her kohort içindeki veri tamlığına bağlı olarak yaş, cinsiyet, WHO derecesi ve diğer klinikopatologik değişkenler gibi mevcut kovaryatları içeriyordu. Alt grup analizleri, yaş, histolojik alt tip, WHO derecesi, IDH mutasyon durumu, 1p/19q kodez durumu ve mevcut olduğunda tedaviyle ilgili bilgiler gibi değişkenlere göre yapıldı. Şekiller, R ve GraphPad Prism'de standart istatistiksel grafik iş akışları kullanılarak oluşturuldu.

2. Pan-kanser ifadesi ve sağkalım analizleri

MRC2 ekspresyonu, TCGA ve GTEx veri setleri kullanılarak kanser tipleri arasında tümör ve normal dokular arasında karşılaştırıldı. Farklar kutu grafikleriyle görselleştirildi ve radar grafikleriyle özetlendi. MRC2 ekspresyonu ile genel sağkalım (OS), hastalığa özgü sağkalma (DSS) ve kanser türleri arasında ilerlemesiz aralık (PFI) arasındaki ilişkileri değerlendirmek için Cox orantılı riskler regresyon analizleri yapıldı. Tehlike oranları ve ilgili önem seviyeleri orman alanları ve ısı haritaları kullanılarak görselleştirildi.

3. Glioma kohortlarında prognostik doğrulama ve alt grup analizleri

TCGA alt dereceli glioma (TCGA-LGG) kohortunda hastalar yüksek ve düşük MRC2 ekspresyon gruplarına ayrıldı. Gruplar arasında OS, DSS ve PFI karşılaştırmak için Kaplan–Meier hayatta kalma analizleri yapıldı. Tahmin performansını değerlendirmek için zamana bağlı alıcı çalışma karakteristikası (ROC) eğrileri oluşturuldu. MRC2'nin bağımsız prognostik değerini değerlendirmek için tek değişkenli ve çok değişkenli Cox regresyon analizleri yapılmıştır. Dış doğrulama, Kaplan–Meier sağ kalma analizi, ROC analizi ve Cox regresyonu dahil olmak üzere CGGA glioma veri seti kullanılarak gerçekleştirildi. Yaş, tümör derecesi, histolojik alt tip, IDH mutasyon durumu, 1p/19q kodelasyon durumu ve tedaviyle ilgili değişkenler dahil olmak üzere klinikopatolojik değişkenler arasında MRC2 ekspresyonunu değerlendirmek için alt grup analizleri yapıldı.

4. IDH-mutant ile IDH-vahşi tip gliomalarda MRC1 ekspresyonu

MRC1 ekspresyonu ile IDH mutasyon durumu arasındaki ilişki, GlioVis web platformu ve TCGA GBMLGG veri seti kullanılarak değerlendirildi. Vakalar, annotasyonlu IDH durumuna göre IDH-mutant ve IDH-vahşi tip gliomalar olarak gruplandırıldı. MRC1 mRNA ekspresyonu seçilen veri seti içinde sorgulandı ve iki grup arasındaki ifade seviyeleri platformun yerleşik istatistiksel analiz fonksiyonu kullanılarak karşılaştırıldı. Grup bazında ifade dağılımları platform tarafından üretildiği şekilde gösterildi ve istatistiksel anlamlılık P < 0.05 olarak tanımlandı.

5. Hücre kültürü

İnsan glioma hücre hatları ve normal insan astrositleri yerleşik hücre depolarından alındı. Hücreler, %10 fetal sığır serumu (FBS) ile takviye edilmiş ve %5 CO₂ ve yaklaşık %95 göreli nem içeren nemli bir kuluçka ayakta 37 °C'de 37 °C'de tutuldu. U87 ve U251 hücreleri, test edilen glioma hücre panelinde taban taraması, bu iki hücre hattının nispeten daha yüksek MRC2 seviyelerini ifade ettiğini ve bu nedenle knockdown tabanlı fonksiyonel analizler için uygun olduğunu gösterdiği için fonksiyon kaybı deneyleri için seçildi.

6. MRC2'nin lentiviral etkisi

MRC2 ve hedefsiz kontrol hedef alan kısa saç tokası RNA'ları (shRNA'lar) lentiviral vektörlere klonlandı. Lentiviral parçacıklar, HEK293T hücrelerin transfer plazmidleriyle birlikte transfekte edilmesi ve standart bir transfeksiyon reaktifiyle paketleme plazmidlerinin üretilmesiyle üretilmiştir. Viral süpernatantlar, transfeksiyondan sonra 48 saat ve 72 saat içinde toplanmış, ambalaj hücreleri ve hücre atıkları için 2.100 × g ağırlığında 5 dakika santrifüjlenmiş, ardından 0,45 μm filtreden geçirilerek hemen kullanılacak veya −80 °C¹⁹ sıcaklıkta depolanmıştır. Virüs içeren süpernatanlar hemen veya aliquote olarak kullanılıp −80 °C'de saklanıyordu. Tekrarlanan donma–erime döngülerinden kaçınıldı. Glioma hücreleri, polibren varlığında lentiviral parçacıklarla enfekte olmuştur. Enfeksiyondan sonra, hücreler puromisin ile seçilerek stabil knockdown hücre hatları oluşturuldu. Kullanılan diziler şöyleydi: sh-MRC2-1: 5′-GAAATGAATGAGCAGCAAGAA-3′; sh-MRC2-2: 5′-CCGGTATTGCTATAAGGTGTT-3′; sh-NC: 5′-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3′.

7. MRC2 knockdown'un RT-qPCR ve immünoblotlama ile doğrulanması

Toplam RNA TRIzol reaktifi kullanılarak çıkarıldı ve cDNA, üreticinin talimatlarına göre bir ters transkripsiyon kiti kullanılarak sentezlendi. SYBR Green kimyası kullanılarak nicel PCR şu döngü koşullarında gerçekleştirildi: ilk denatürasyon 95 °C'de 30 saniye boyunca, ardından 40 döngü boyunca 95 °C'de 5 saniye ve 60 °C'de 30 saniye boyunca uygulandı; amplifikasyonun sonunda dissosiyasyon eğrisi analizi yapıldı. Primer dizileri şöyleydi: MRC2 ileri, 5′-GGCAAGGACAAAGTGCGTGT-3′; MRC2 tersi, 5′-CTTTGGTGACGTTGCTGCGCTT-3′; GAPDH forvet, 5′-TCCACCCATGGCAAATTCC-3′; ve GAPDH ters tarafında, 5′-TCGCCCCACTTGATTTTTGG-3′. Göreli mRNA ifadesi, GAPDH'nin iç kontrol²⁰ olarak kullanıldığı karşılaştırmalı C_t (2^-ΔΔCt) yöntemiyle hesaplandı. Protein seviyesinde MRC2'nin etkisini doğrulamak için paralel olarak immünoblotlama yapıldı. RT-qPCR için üç bağımsız biyolojik kopya analiz edildi ve her örnek teknik üçlü olarak çalıştırıldı.

8. Hücre proliferasyon testi

Hücre çoğalması CCK-8 testi kullanılarak değerlendirildi. Hücreler, uygun yoğunlukta 96 kuyu tabaklarına tohumlanarak belirtilen zaman dilimleri için kültürlendi. Her zaman noktasında, her kuyuya CCK-8 reaktifi eklenip üreticinin talimatlarına göre kuluçka yapıldı, ardından 450 nm'de emilim, mikroplaka okuyucu kullanılarak ölçüldü. En az üç bağımsız biyolojik kopyalama gerçekleştirildi.

9. Koloni oluşumu testi

Hücreler düşük yoğunlukta altı kuyu plakalarına tohumlanarak 10–14 gün kültürlendi. Koloniler oda sıcaklığında %4 paraformaldehit ile 15 dakika sabitlendi ve 15 dakika boyunca %0,1 kristal violet ile boyandı. Koloniler fosfatla tamponlanmış tuzlu (PBS) ile yıkanmış, hava yoluyla kurutulmuş ve manuel olarak veya görüntü analiz^{yazılımı 21} kullanılarak sayılmıştı. En az üç bağımsız biyolojik kopyalama gerçekleştirildi.

10. Hücre göçü ve istila testleri

Hücre göçü ve istilası, gözenekli membran insert^{testleri 22} kullanılarak değerlendirildi. İstila testleri için, üst ekler ekstrahücre matriks jeliyle önceden kaplandı; Göç testleri için kaplamasız insertler kullanıldı. Serumsuz ortamda askıya alınan hücreler üst odaya eklendi ve serum içeren ortam alt odaya kemoattrektif olarak yerleştirildi. İnkubasyon sonrası, üst membran yüzeyindeki göç etmemiş hücreler pamuk çubuğuyla nazikçe çıkarıldı. Alt yüzeye göç eden veya işgal eden hücreler %4 paraformaldehit ile 15 dakika sabitlenmiş, %0,1 kristal violet ile 15 dakika boyanmış, soğuk fosfatla tamponlanmış tuzlu suyla durulanmış, hava ile kurutulmuş ve ters mikroskop altında ×200 büyütmeyle görüntülenmiştir. Hücreler, her bir yerleştirme için beş rastgele seçilmiş mikroskobik alanda sayıldı. En az üç bağımsız biyolojik kopyalama gerçekleştirildi.

11. Western Blot analizi

Hücreler, proteaz inhibitörleriyle desteklenen RIPA tamponunda lizize edildi ve protein konsantrasyonu BCA testi kullanılarak belirlendi. Eşit miktarda toplam protein SDS-PAGE ile ayrıldı ve PVDF membranlarına aktarıldı. Zarlar, %5 yağsız sütte oda sıcaklığında 1 saat boyunca tıkanmış ve 4 °C'de primer antikorlarla gece boyunca kuluçka altına alınmıştır. Western blotting için aşağıdaki birincil antikorlar ve çalışan sulandırıcılar kullanıldı: anti-MRC2 (1:5.000), anti-CDK4 (1:1.000), anti-CDK6 (1:2.000), anti-β-katenin (1:5.000), anti-E-kadherin (1:10.000), anti-N-kadherin (1:3.000) ve anti-β-aktin (1:5.000). Yıkamadan sonra, zarlar oda sıcaklığında 1 saat boyunca yaban turpu peroksidaz ile konjuge edilmiş keçi anti-fare IgG veya keçi anti-tavşan IgG ikincil antikorları (1:5.000) ile kuluçka edildi. Sinyaller kemimilüminesans kullanılarak görselleştirildi ve bant yoğunlukları β-aktine olarak nicelendirilip normalleştirildi. En az üç bağımsız biyolojik kopyalama gerçekleştirildi.

12. İstatistiksel analiz

İstatistiksel analizler R ve GraphPad Prizması kullanılarak gerçekleştirildi. Hayatta kalma eğrileri log-rank testi kullanılarak karşılaştırıldı. Tek değişkenli ve çok değişkenli analizler için Cox orantılı riskler regresyon modelleri kullanılmıştır. Hücre tabanlı deneylerde veriler ortalama ± SD olarak sunulur. Parametrik testten önce, normallik Shapiro–Wilk testi kullanılarak değerlendirildi. Normal dağılımlı veriler için, iki grup arasındaki farklar Student's t-testi kullanılarak değerlendirildi ve birden fazla grup arasında karşılaştırmalar tek yönlü ANOVA kullanılarak yapıldı. Normallik varsayımları sağlanmadıysa, ilgili parametrik olmayan testler kullanıldı. P değerleri, Benjamini–Hochberg yanlış keşf oranı^{prosedürü 23,24} kullanılarak çoklu testler için ayarlandı. İki taraflı P < 0.05 istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi.

Sonuçlar

MRC2'nin pan-kanser ifadesi ve prognostik ortamı
Pan-kanser analizleri, MRC2'nin insan maligniteleri üzerindeki ifade desenini ve prognostik önemini karakterize etmek için ilk olarak gerçekleştirilmiştir. TCGA ve GTEx veri setlerine dayalı karşılaştırmalar, MRC2 ekspresyonunun birden fazla kanser tipinde tümör ve normal dokular arasında anlamlı şekilde farklı olduğunu göstermiştir (Şekil 2A, 2B). Radar grafik özeti, kanse...

Tartışma

Glioma için standart bakım tedavisi, maksimum güvenli rezeksiyon ve ardından radyoterapi ve kemoterapi ile en yaygın temozolomid^4'e dayanır. Buna rağmen, yaygın infiltrasyon sıklıkla tamamen cerrahi çıkarmayı sınırlar ve özellikle yüksek dereceli^{hastalıkta kaçınılmaz nüks (nüks yapmaya yol açar) katkıda} bulunur ^3,25. MGMT promotor metilasyonu, IDH mutasyonu, 1p/19q birlikte silinmesi ve EGFR değişiklikleri...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
anti-CDK4 antikor	Proteintech Group, Inc., ABD	11026-1-AP	Western blotting için birincil antikor. RRID:AB_2078702.
anti-CDK6 antikor	Proteintech Group, Inc., ABD	66278-1-Ig	Western blotting için birincil antikor. RRID:AB_2881661.
anti-E-kadherin antikor	Proteintech Group, Inc., ABD	20874-1-AP	Western blotting için birincil antikor. RRID:AB_10697811.
anti-MRC2 antikor	Proteintech Group, Inc., ABD	86028-1-RR	Western blotting için birincil antikor. RRID:AB_2879692.
anti-N-cadherin antikor	Proteintech Group, Inc., ABD	22018-1-AP	Western blotting için birincil antikor. RRID:AB_2813891.
anti-β-aktin antikor	Proteintech Group, Inc., ABD	66009-1-Ig	Batı bulaştırma için kontrol antikoru yükleniyor. RRID:AB_2687938.
Anti-β-katenin antikor	Proteintech Group, Inc., ABD	51067-2-AP	Western blotting için birincil antikor. RRID:AB_2086128.
BCA protein test kiti	Beyotime Biotechnology, Çin	P0012	Protein konsantrasyonu belirleme için BCA protein test kiti.
Hücre Sayma Kiti-8 (CCK-8)	Dojindo Laboratuvarları, Japonya	CK04-500T	Hücre canlılığı/proliferasyon testi.
Kemilyüminsans görüntüleme sistemi	Uvitec Limited, Fransa	Alliance Q9 İleri El Kitabı	Batı leke tespiti için görüntü alma sistemi.
CO2 kuluçka makinesi	Genel laboratuvar ekipmanları	Belirtilmedi	Nemlendirilmiş CO2 inkübatörü hücre kültürü için 37 derece ve derece; C ve %5 CO2.
Kristal mor çözeltisi (%0,1)	Beyotime Biotechnology, Çin	C0121-100 mL	%0,1 çalışma konsantrasyonu ile kullanılan kristal mor boyama çözeltisi.
DMEM, yüksek glikoz	Gibco, Thermo Fisher Scientific, ABD	C11995500BT	Glioma hücre kültürü için bazal ortam.
Fetal sığır serumu (FBS)	ExCell Bio, Çin	FSP500	Hücre kültürü için serum takviyesi.
GlioVis	gliovis.bioinfo.cnio.es	Geçerli değil	Beyin tümörü ifade veri setlerinin, özellikle gliomların görselleştirmesi ve analizi için web tabanlı platform.
GraphPad Prizması	GraphPad Software, ABD	Sürüm 10.4.0	İstatistiksel analiz ve grafik yazılımı. RRID:SCR_002798.
HEK293T hücreleri	Çin Bilimler Akademisi'nin Tip Kültür Koleksiyonu, Şanghay, Çin	GNHu43	Lentiviral üretimi için kullanılan ambalaj hücre hattı. RRID:CVCL_0063.
HRP ile konjuge edilmiş keçi anti-fare IgG (H+L)	Proteintech Group, Inc., ABD	SA00001-1	Western blotting için ikincil antikor. RRID:AB_2722565.
HRP ile bağlanmış keçi Anti-Tavşan IgG (H+L)	Proteintech Group, Inc., ABD	SA00001-2	Western blotting için ikincil antikor. RRID:AB_2722564.
İnsan astrositleri	Çin Bilimler Akademisi'nin Tip Kültür Koleksiyonu, Şanghay, Çin	Kamuya açık değil	Tümör olmayan kontrol olarak kullanılan normal insan astrositleri; Katalog numarası halka açık değildir.
Ters mikroskop	Genel laboratuvar ekipmanları	Belirtilmedi	Göç ve istila testlerinde görüntü alımı için kullanılan ters mikroskop.
Matrigel matrisi	Corning, ABD	354234	İstila testleri için insertleri kaplamak amacıyla kullanılan bazal zar matrisi.
Microplate okuyucu	Genel laboratuvar ekipmanları	Belirtilmedi	CCK-8 testlerinde 450 nm'de absorbans ölçümü için kullanılan mikroplaka okuyucu.
PAGE Jel Hazırlık Kiti, %10	EpiZyme, Çin	PG212	SDS-PAGE jel hazırlama kiti.
PAGE Jel Hazırlık Kiti, %7,5	EpiZyme, Çin	PG111	SDS-PAGE jel hazırlama kiti.
Paraformaldehit çözeltisi (%4)	Beyotime Biotechnology, Çin	P0099-100 mL	Koloni oluşumu ve göç/istila testleri için %4 paraformaldehit fiksator.
Penisillin-Streptomisin çözeltisi	Gibco, Thermo Fisher Scientific, ABD	15140163	Hücre kültürü için antibiyotik takviyesi.
Polybrene	Beyotime Biotechnology, Çin	C0351-1 mL	Lentiviral transdüksiyonu kolaylaştırmak için kullanılan heksadimetrin bromid çözeltisi (10 mg/mL).
Prestained protein belirtecisi	Elabscience, Çin	E-IR-R331	Protein moleküler ağırlık belirteci.
PrimeScript RT Reagent Kit	Takara Bio Inc., Japonya	RR047A	cDNA sentezi için ters transkripsiyon kiti.
Puromysin	Beyotime Biotechnology, Çin	ST551-10 mg	Stabil knockdown hücrelerinin seçimi için kullanılan Puromycin dihidroklorür.
PVDF membranı	Beyotime Biotechnology, Çin	FFP20	Hidrofilik PVDF membranı (0.45 ve mikro; m) Western Blot transferi için.
R	R İstatistiksel Hesaplama Vakfı, Avusturya	Sürüm 4.5.1	Biyoinformatik analizler için kullanılan istatistiksel hesaplama ortamı. RRID:SCR_001905.
RIPA liz tamponu	Beyotime Biotechnology, Çin	P0013B	Protein ekstraksiyonu için RIPA lizin tamponu (güçlü).
SDS-PAGE yükleme tamponu (5& kez;)	Beyotime Biotechnology, Çin	P0015L	Protein örneği yükleme tamponu.
SYBR Premix Ex Taq II	Takara Bio Inc., Japonya	RR066A	qPCR master karışımı.
Transwell eklemeleri, 8.0-µ m gözenek boyutu	Corning, ABD	3422	8.0 & mikro; m gözenek boyutunda polikarbonat zar; Göç ve İstila testleri için standart 24-kuyu formatı.
TRIzol reaktifi	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, ABD	10296010CN	RNA ekstraksiyon reaktifi.
U251 glioma hücreleri	Çin Ulusal Doğrulanmış Hücre Kültürleri Koleksiyonu	SCSP-559	Knockdown ve fonksiyonel testler için kullanılan insan glioma hücre hattı. RRID:CVCL_0021.
U87 glioma hücreleri	Çin Ulusal Doğrulanmış Hücre Kültürleri Koleksiyonu	SCSP-5432	Knockdown ve fonksiyonel testler için kullanılan insan glioma hücre hattı. RRID:CVCL_0022.