Yöntem makalesi

Peptit Akışlarını Değerlendirmek İçin Standartlaştırılmış Ex Vivo Domuz Oromukozal Modeli

378 görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/70935

⸱

9 Haziran 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1UCD School of Veterinary Medicine and UCD Conway Institute, University College Dublin, 2UCD School of Mechanical and Materials Engineering, University College Dublin

Bu makalede

Özet

Bu protokol, peptit geçirgenliğini değerlendirmek için taze izole edilmiş domuz bukkal epitel dokusu mukozasını kullanan bir tarama platformunu tanımlar. Yöntem, Franz Diffüzyon Hücrelerindeki çözeltilerden, Hilltop odalarından ve filmlerden alınan bir geçirgenlik artırıcı ile 3D baskılı eklemeler ile histolojik mukozal değerlendirme ile birlikte GLP-1RA'nın geçirimliliğini entegre eder.

Özet

İlaçların filmler, tabletler, pastiller ve diğer dozaj formlarında oromukozal kullanımı, pediatrik ve yaşlı hastalar ile kapsül veya tablet kolayca yutamayan hastalar için uygun bir sistemik uygulama yolu sağlar. Bukkal ve sublingual peptid formülasyonlarının geliştirilmesi, insanların keratinize olmayan oromukozal epitel yapılarıyla uyumlu preklinik modeller gerektirir; bu yapılar en uygun olanlardır ve bu yapılar arasında domuzlar ve köpekler en uygundur. Atılmış taze domuz oromukozal dokularını bir mezbahadan temin ettik. Mukozalar, kontrollü ısıtma kullanılarak alttaki düz kastan ayrıldı ve ardından Franz Diffüzyon Hücrelerine veya yeni düşük hacimli 3D baskılı reçine ile kürlenmiş parçalara monte edildi. Donör tarafına peptit geçirimli güçlendirici kombinasyonları eklendi ve alıcı tarafından permeatsiyalanan moleküller örneklenerek ultra yüksek performanslı sıvı kromatografi (uHPLC) ile nicelendirildi. Insertler için, monte edilen mukozaların transepitelyal elektrik direnci (TEER) değerleri EVOM chopstick elektrotları kullanılarak ölçüldü. Hem Franz diffüzyon hücrelerinde hem de 3D eklerde kuluçka sonrası doku histolojisi incelendi. Optimum geçirimli artırıcı konsantrasyonu, peptit ve artırıcı sulu karışımları geçirimlilik artışı sağladığında seçildi. Peptit geçirgenliği, üç boyutlu (3D) eklemelerde 3 saat içinde %4,3'e, Hilltop odası modellerinde ise %1,7'ye ulaştı; Hilltop odası doğrudan bukkal filmden doğrudan pozlama simüle edildi. Peptit-güçlendirici kombinasyonlar içeren katman katman polimerik mukoadhesive filmler geliştirildi ve difüzyon odaları kullanılarak permeasyon çalışmaları için mukoza dokusuna uygulandı. Ex vivo peptid geçirimliliği, domuz bukkal mukozaları bukkal mukozaların bukkal filmlere dahil edilen optimal glycodeoxycholate (GDC) kombinasyonuna maruz kaldığında %2'ye ulaştı. Bu ex vivo tarama çalışmaları, domuzlarda ve insanlarda oromukozal yol ile uygulanan peptid yüklü film formülasyonlarının sonraki farmakokinetik değerlendirmesine yol sağlar.

Giriş

Bukkal ve sublingual oromucosae, doğrudan erişilebilir alanlar sundukları ve karaciğer ilk geçiş metabolizmasından kaçınma sağladıkları için oral ilaç kullanımı için cazip yollardır; bu da oral 1,2 dahil diğer yollara kıyasla biyoyararlanılmayı ve hasta kabul edilebilirliğini potansiyel olarak artırır. Peptitler, bağırsak epiteliyle zayıf geçirim, daha yüksek molekül ağırlıkları, hidrofilisi özellikleri ve enzimatik bozulmaya duyarlılıkları nedeniyle genellikle enjeksiyon yoluyla enjeksiyon yoluyla verilir3. FDA, terapötik uygulamalar için 102 peptidi onaylamış, ~450 terapötik peptid preklinik veya klinik denemelerdedeğerlendirilmektedir 4. Bunlar arasında, Catalent'in Zydis oral disparçalayıcı tablet (ODT) teknolojisi kullanılarak geliştirilen permeasyon artırıcıları (örneğin, semaglutid, Rybelsus)5 ile formüle edilmiş oral tabletler (örneğin, semaglutid, Rybelsus)5 ve oromukozal platformlar (Minirin Melt ve Nocdurna sublingual desmopressin asetat) bulunur. Bukkal ilaç geçirgenliği çalışmaları üzerine yapılan kapsamlı araştırmalara rağmen, moleküllerin geçirgenlik değerleri düşük tekrarlanabilirlik ve sınırlı karşılaştırılabilirlik göstermektedir 7,8. Bu tutarsızlıklar büyük ölçüde kullanılan deneysel hayvan modellerinde farklılıklardan ve izole bukkal mukozaların işlenmesi ve hazırlanmasındakifarklılıklardan kaynaklanmaktadır9.

İzole bukkal ve sublingual doku mukozaları kullanılarak ex vivo geçirgenlik testleri, in vivo oromukozal küçük molekül geçirgenliğini tahmin etmek ve dozajformları 10,11,12 ile ilgili formülasyon bileşenlerinin preklinik taraması için değerli bir araçtır; ancak peptid taramasında kullanımları sınırlı olmuştur çünkü bazal geçirgenlik önemsizdir. Son yıllarda, domuz bukkal mukozası, keratinizesiz yapısı ve fizyolojik ile biyokimyasal özellikleri insanlara çok benzediği için tercih edilen modelhaline gelmiştir 13. Köpek bukkal örnekleri, mezbahalardan alınan domuz dokusuna kıyasla daha az erişilebilir, ancak her iki kaynak da keratinlenmemiş14. Epitel kalınlığı ve işleme yöntemlerinde önemli değişkenlik devam etmektedir. Bukkal ve sublingual oromukozal preparatların standartlaştırılması gereklidir. Kısa ve uzun vadeli depolama koşulları, doku kalınlığı ve deneyler sırasında yaşamın korunması gibi değişkenler, ex vivo geçirgenlik sonuçlarınıetkiler 8. Doku koruma kritik öneme sahiptir, çünkü hem mukozanın yapısal bütünlüğü hem de metabolik aktivitesi difüzyonprofillerini doğrudan etkiler 12,15. Bariyer fonksiyonunun kaybı, ilaç geçirimliliğinin yapay olarak artmasına yolaçabilir 16,17. Depolamanın ötesinde, domuz bukkal mukozalarının permeasyon odalarına montaj edilmesi için kullanılan yöntem daha fazla değişkenlik getirir. Submukozal bağ dokusunun mekanik, kimyasal veya termal yöntemlerle kaldırılmasındaki farklılıklar, geçirgenliğideğiştirebilir 18. Bazı raporlar, epitelin pürüzsüz kastan izole edilmesi için ısı ayrımının geçirgenliği19 koruduğunu öne sürse de, bu konuda bir uzlaşma yoktur. Şu anda, izole bukkalmukoza 20'nin bütünlüğünü incelemek ve değerlendirmek için evrensel olarak kabul edilen bir yöntem yoktur. Etiketli hidrofilik şeker floressein izotiosiyanat-dekstran (FITC dextran 4000, FD-4), domuz bukkal mukozası için bütünlük belirteci olarak yaygın olarak kullanılır çünkü sadece ~500 Da'nın altındaki küçük moleküller dokuya pasif şekilde nüfuz edebilir. Buna karşılık, sağlam bir mukoza FD-4 taşınmasını kısıtlar ve donörden alıcıya %0,6'nın altında transfer genellikle 2-4saat 21,22 sürede kabul edilebilir kabul edilir. Ayrıca, hematoksilin ve eozin doku boyama, epitel morfolojisinin doğrudan bir değerlendirmesinisağlar 23.

Bu çalışmada, belirli bir süre boyunca mukoza bütünlüğünü ve geçirgenliğini optimize etmek için tasarlanmış izole domuz bukkal mukozalarının mukozal mukoza tutulması için standart bir protokol oluşturduk. Hedeflerimiz, domuz bukkal epitel dokusunun disseksiyası için deneysel bir çerçeve sağlamak ve difüzyon odaları ve insertlerde monte edilmiş oromukozalar boyunca peptitlerin ex vivo geçirgenlik değerlendirmelerinin güvenilirliğini artırmaktı. İlk olarak, mezbahaneden alınan hasarsız bukkal mukozayı tespit etmek için görsel analizler yaptık. Deneyler sırasında doku işleme tekniklerini, mukozal kalınlığını ve doku bütünlüğünü koruma yöntemlerini optimize ettik. Stabil düşük güçlü Glukagon benzeri peptid-1 reseptör agonisti (GLP-1 RA) analogunu araç molekülü olarak kullanarak, Franz diffüzyon hücrelerine monte edilen bukkal mukoza üzerinde safra tuzu geçirgenlik artırıcı olan sodyum glikodikodilat (GDC) varlığı ve yokluğunda ve özel ev yapımı 3D baskılı transwell tipi eklerde peptid geçirgenlik çalışmaları yürüttük. GDC ve GLP-1 RA, çözeltilerden, Hilltop odalarından ve mukoyapışkan polimer çift katmanlı filmlerden bukkal mukozalara sunuldu. Geçirgenlik belirteçleri, doku histolojisi ve Trans-epitelyal/endotel elektriksel direnç (TEER) değerlerini birincil değerlendirme noktalarımız olarak kullandık.

Protokol

Bu çalışmada kullanılan domuz yanakları yerel bir mezbahaneden toplanmıştır; bu nedenle etik onay gerekmiyordu.

1. Domuz bukkal epitelinin izolasyonu, hazırlanması ve depolanması

  1. Domuz yanağı dokularını yerel bir mezbahaneden toplayın ve 90 dakika içinde buz gibi soğuk fosfat tampon tuzlu sonu (PBS, pH 7.4) içinde laboratuvara taşının. Sonraki 60 dakika içinde, daha önce tanımlananmetodolojiye göre dokuları hazırlamak üzere 19,24 farklı oromucosae bölgeleri için küçük değişiklikler yapılarak Şekil 1'de gösterilmiştir.
  2. Bir bistüri kullanarak, bukkal mukozayı alt tabakalı dokudan ayırın ve dokuyu fosfatla tamponlanmış tuzlu suyla üç kez durulayın. Görsel yüzey hasarı olan mukozaları at.
  3. Sağlam mukozayı PBS'ye 65 °C'de 3 dakika boyunca batırın ve epitel ile kalan bağ dokusunu 5 numara saat ustası pensepsiyle düz kaslardan ayırın. Bu yöntem ayrıca dil altı ve dil epitelyal mukozalarının izolasyonu için de geçerlidir.
  4. Diseksiye edilen oromukozaları selüloz filtre kağıdında nazikçe kurutun ve permeasyon çalışmalarına geçin (tercih edilen seçenek) veya en fazla 4 hafta dondurun.
  5. Ayrıldıktan sonra dondurma işlemi için, oromucosae'yi 2 saat boyunca %85 gliserol25 kapasiteli kriyoprotektanta nazikçe sallayarak daldırın. Yüksek viskoziteli gliserol, hücrelerarası suyun yerini alır ve doku yapısına zarar verebilecek su kristallerinin oluşumunu önler.
  6. Bu dönemden sonra gliserol yerine taze PBS ve %10 gliserol verin. Mukoza örnekleri, gerekli depolama süresine bağlı olarak -20 °C veya -70 °C'de dondurun. Dondurma işlemini ~-1 °C·min-1 kontrollü bir hızda gerçekleştirin.
    NOT: Tüm deneyler, farklı hayvanların yanaklarından alınan en az üç doku örneği kullanılarak gerçekleştirilir.

2. Franz difüzyon hücrelerinde mukozalarda ex vivo geçirgenlik çalışması ve GLP-1 RA ile GDC ile sunum için Hilltop odalarının kullanımı

NOT: Ex vivo geçirgenlik çalışmaları, Franz diffüzyon hücreleri (FDC) kullanılarak taze izole domuz bukkal mukozaları üzerinde başlangıçta gerçekleştirilmektedir.

  1. Parçalanmış doku mukozasını Şekil 2'de gösterilen odalara (pencere alanı 1.2cm2) monte edin ve PBS, pH 6.8 (donör tarafı, 1 mL hacim) ve PBS, pH 7.4 (alıcı tarafı, 10 mL hacim) ile 30 dakika boyunca dengelendirin.
  2. 30 dakikalık denge sürecinden sonra, donör çözelti PBS (pH 6.8) yerine 1 mL PBS ile değiştirin; bu oranda GLP-1RA (25 mg/mL) ve GDC (25 mg/mL) oranı 1:1 olur.
  3. Alıcı odasını 10 mL PBS pH 7.4 ile karıştırmaya devam edin; 300 rpm'de 37 °C'de tutulur. Alıcı bölmesinden her 60 dakikada bir 180 dakika boyunca 1 mL örnek alın. Deneyin başında ve sonunda donör bölmelerinden üçlü örnekler alın. Her örneklemeden sonra, odaları 1 mL PBS ile doldurun.
  4. Deneyin sonunda, doku histoloji için %10 formalinde saklanır veya dokuda kalan GLP-1RA peptidini niceliklendirmek için homojenleştirilir.
  5. Benzer şekilde, GLP-1RA'nın geçirgenliğini Hilltop odaları (HTC) kullanarak gerçekleştirin.
    NOT: HTC kullanımının amacı, iki katmanlı bukkal film formüle etmeden önce çözelti içindeki GLP-1 RA üzerindeki GDC'nin oromukozal geçirgenlik etkisini doğrulamaktır. HTC, dış çapı 19 mm olan, biyouyumlu stiren-etilen-bütilen-stilen (SEBS) blok kopolimeri olan Kraton G-2705'ten yapılmış bir odadır ve %100 dokunmamış pamuk liflerinden oluşan bir Webril pedi (12,7 mm çapında) içerir; bu ped, çözelti uygulaması için emici yapışmaz bir malzemeolarak hizmet eder 26.
  6. Benzer şekilde, HTC için tanımlandığı gibi, GLP-1RA ve GDC'nin (1:1 oranı) mukoadhesive çift katmanlı filmlere yüklenmiş olarak ex vivo geçirgenliğini değerlendirin; filmler FDC'lerin donör odalarına veya 3D insertlere yerleştirilir.
  7. Domuz bukkal epitel dokusunun bütünlüğünü doğrulamak için, FD-4 (0,05 mM) floresan akı işaretleyicisi olarak kullanın ve doku boyunca sızıntıyı değerlendirmek için donör tarafına ekleyin.
    NOT: Sızıntı gösteren dokular geçirgenlik hesaplamalarından hariç tutulur.
  8. 3 saat deneyden sonra, bazolateral bölmeden üçlü olarak alınan 200 μL örneklerin uHPLC analiziyle kümülatif GLP-1 RA akışını nicelikle ölçün. Tüm geçirimli deneyleri üç kez tekrarlayın. GLP-1RA konsantrasyonlarından oluşan bir kalibrasyon eğrisinden GLP-1RA'nın kümülatif akışını nicelikle ölçemek.

3. GLP-1RA ve GDC ile hapsolmuş bukkal filmlerin hazırlanması

NOT: Mukoyapıştırıcı ve arka tabaka içeren bukkal çift katmanlı filmler, yarı otomatik kaplama27 ile solvent döküm kullanılarak üretilir.

  1. GLP-1RA'yı hapsetmek için HPMC ve PVP-K90'ı film oluşturma polimerleri olarak kullanarak, ayrıca bir mukoyapışkan bileşen olan Na-CMC'yi kullanarak iki katmanlı bir film hazırlayın.
    NOT: Bukkal filmin mukoyapışkan ve arka tabakasının bileşimi için Tablo 1'e bakınız. GDC, düşük mg miktarlarda model filmlerde GLP-1 RA peptidi ile entegre edilir; bu da odalara monte edilmiş domuz bukkal mukozaları boyunca peptid geçirimliliği üzerindeki etkisini görmek için kullanılır.
  2. Mukoyapışkan tabakayı, film şekillendiren polimerleri — 45 mg HPMC, 10 mg Na-CMC ve 25 mg PVP-K90'ı, %3 gliserol içeren deionize suda 400 rpm'de 10 dakika boyunca manyetik sıcak plaka karıştırıcı kullanılarak hazırlanır.
    NOT: HPMC oda sıcaklığında çözünürken, PVP-K90 çözünmesi için 40 °C'de 30 dakika ısıtma gerektirir.
  3. Karıştırma sırasında 2 mg Aerosil 200 F ekleyin, ardından GLP-1 RA ekleyin. Sonra GDC ekleyin ve 600 rpm'de 30 dakika boyunca dağıtın.
  4. Son polimer çözeltiyi ultrason banyosu ile ultrasonla 90 dakika ultrasonla geçirerek köpükleri çıkarabilirsiniz.
  5. Filmleri polietilen tereftalat (PET) astarına döküm ve doktor bıçağı ile 2 mm/s hızda 2600 μm hassasiyete ayarlanmış kaplama üzerine döküm. Filmleri sıcak hava fırınında 40 °C'de ~1 saat kurutun.
  6. Arka tabaka için, %5 etil selüloz (EC) ve %5 propilen gliserol (PG) hidroalkolik suda (etanol:su) çözünür, ardından çözünmüş çalambaç bir PET astarına dökülür. Son olarak, kurutulmuş filmleri 1 cm × 1 cm karelere kesin, alüminyum poşete koyup 4 °C'de saklayın.

4. Özel 3D transwell taklit eden bir eklemenin baskısı

NOT: 3D baskılı özel ekler, daha önce açıklanan bir yöntemle küçükdeğişikliklerle üretilmektedir 28.

  1. Kısaca, bilgisayar destekli tasarım (CAD) yazılımı kullanarak 3D modeli tasarlamak.
  2. 3D insertin boyutları ana silindirik gövde (donör odası) ile aynı tutulur; maksimum yüzey alanı 1659,06mm 2 ve genel dış boyutlar x ekseni boyunca 25,20 mm, y ekseni boyunca 14,50 mm ve z ekseni boyunca 21,63 mm olur.
  3. Ayrıca, epitel dokusunu desteklemek için çıkarılabilir dairesel bir tutucu halka tasarlayışın. Halkanın dış çapı yaklaşık 19,90 mm, iç çapı ise ana silindirik gövdenin boyutlarına karşılık gelen 17,93 mm'dir ve Transwell 12 kuzeyli plakalara sığabilir (Şekil 3).
  4. Tüm bileşenleri, UV ile kürlenebilen şeffaf reçine ile masaüstü stereolitografi (SLA) 3D yazıcı kullanarak üretin. Tüm boyutlar yaklaşık olarak ayarlanabilir ve Transwell'lerde uygun uyum ve deneysel uyumluluk sağlamak için gereklidir.
    NOT: Reaksiyona girmemiş monomerlerin ve potansiyel süzülebilir maddelerin çıkarılmasını sağlamak için, tüm parçalar standart bir işlem sonrası protokolden geçti; bunlar arasında 10 dakikalık yıkama, tertemiz %99 izopropil alkol (IPA) ile yıkama ve ardından üretici spesifikasyonlarına göre UV kürleme, yani ortam sıcaklığında 1 dakika Form Kürleme 2 yapıldı. 3D model tasarımı için stereolitografi dosyası (STL) https://doi.org/10.5281/zenodo.19368577 veya ek dosyalarda (Ek Dosya 1 ve Ek Dosya 2) bulunabilir.

5. 3D eklemelerle monte edilmiş mukoza boyunca geçirim.

NOT: Mukoyapışkan çift katmanlı bukkal filmlere entegre edilmiş GLP-1RA ve GDC'nin ex vivo geçirgenliği, FDC'lere alternatif olarak düşük hacimli, özel tasarlanmış Transwell taklit eden 3D eklemeler (Şekil 2) kullanılarak da değerlendirilebilir. Bunun nedeni, FDC'lerin 10 mL alıcı tarafının peptidi seyreltmesi ve uHPLC'nin algılama hassasiyetini zorlaştırmasıdır. Bu nedenle FDC tasarımı, peptid akışları için maliyet etkin veya pratik değildir; çünkü sürekli olarak enzim bağlantılı immünosorbent testi (ELISA) veya radyoimmünoassay (RIA) tespiti gerektirir.

  1. Insertleri masaüstü SLA 3Dyazıcı 28 kullanarak UV ile kürlenebilen reçine içinde üretin/bastırın ve bunları 12 delikli doku kültür plakalarına monte edin.
  2. Domuz bukkal mukozasını apikal ve bazolateral odalar arasında 1,4cm2 pencere alanına yerleştirin, EVOM 2 voltohmmetre ile STX2 chopstick elektrotları ile temel transepitelyal elektrik direncini (TEER) ölçün. TEER, Ohm Yasası ile hesaplanır.
  3. Filmi (1,0 × 1,0 cm2) dokunun üstüne yerleştirdikten sonra, 0,5 mL PBS (pH 6,8) apikal odaya ve 1,5 mL PBS (pH 7,4) bazolateral odaya pipet yapın.
  4. Alıcı taraflarından 3 saat boyunca 1 saat aralıklarla (0,2 mL) örnekler toplan ve eşit hacimde taze tampon ile değiştirin.
  5. Flux edilmiş GLP-1 RA peptidi uHPLC ile nicelendirilin.
    NOT: 3 saat sonra 3D eklemelerle GLP-1RA adsorpsiyonu gözlemlenmez; bu, Ek Şekil 1 ve Ek Dosya 3'te gösterilmiştir.
  6. Transepitelyal elektrik direncini (TEER) STX2 çubuk elektrodlarıyla EVOM 2 voltohmmetre ile 3 saat boyunca 1 saat aralıklarla ölçün. TEER, Ohm Yasası ile hesaplanır.
  7. Domuz bukkal ve sublingual epitel doku bütünlüğünü doğrulamak için, floresan belirteç olarak FD-4 (0,05 mM) kullanın.
    NOT: Tüm deneyler üçlü olarak yapılır ve bildirilen sonuçlar üç veri setinin ortalama ± SD'sidir.

6. GLP-1 RA'nın uHPLC tespiti

  1. FDC'lerde ve insertlerde monte edilmiş oromukozalar boyunca GLP-1 RA miktarını, donör yan çözeltiler, HTC ve filmler arasında, uHPLC ile CSH C18 kolonu (130 Å, 1,7 μm, 2,1 mm × 50 mm) kullanılarak CSH C18 kolonu ile (Eluent A) ve %0,1 TFA (Eluent B) hareketli fazına göre nicelendirilerek (Eluent A) 30 °C'de 8 dakika boyunca gradyan elüsyonu, 20 μL enjeksiyon hacmi ve 0,7 mL/dakika akış hızı, UV algısı 214 nm'de (tutma süresi: ~4,2 dakika) sağlanmıştır.
  2. Doğrusal bir çalışma yapın.
    1. 2.5–20.0 μg·mL⁻1 aralığında GLP-1 kalibrasyon standartları kullanarak optimize edilmiş uHPLC koşullarının analitik yanıtını tahmin etmek için doğrusal bir çalışma tasarlamak.
    2. Kalibrasyon standardlarını (n = 6–8 seviyeler) bağımsız olarak hazırlayın ve örnekleri üçlü olarak enjekte edin. Nominal konsantrasyona karşı en küçük kare doğrusal alanını (mAU) gerçekleştirin ve belirleme katsayısı (r2), %'yi y-kesişimi ve köküntü dağılımı (gözlemlenen–tahmin edilen yanıt) kullanarak doğrusal değeri değerlendirin.
      NOT: Kalibrasyon grafiği ve katık grafiklerinin görsel incelenmesi, en düşük hassasiyet seviyesinde (2,5 μg·mL⁻1) doğrusal çizgiden önemsiz bir sapma olduğunu gösterdi ve kalıntılar önceden tanımlanmış kabul sınırı içinde (±%3) bulundu. Kalibrasyon aralığı daha sonra 2,5–20,0 μg·mL⁻1 aralığında sınırlandırılır; bu aralığında regresyon kabul edilebilir doğrusal bir performans göstermiştir (r2 ≥ 0,999, % y-kesim %2 < ve tüm artıklar %±3% içindedir).

7. Bukkal dokuda tutulan GLP-1RA'nın tahmini

  1. GLP-1 RA ve GDC'ye maruz kalan domuz bukkal epitel mukozasını FDC/insertlerden çıkarın.
  2. Dokuyu üç kez PBS ile durulayın, adsorbe edilen ilaçları ve film yardımcılarını çıkarın.
  3. Sonra, dokuyu masa üstü homojenizatör kullanarak 5 mL PBS içinde homojenize ederek tamamen parçalanana kadar homojenleştirin.
  4. Numuneyi 4 °C'de gece boyunca saklayarak homojenleşmiş doku ile PBS arasında peptid bölünmesinin dengelenmesini sağlar.
  5. Daha sonra, karışımı 5000 × g boyunca 5 dakika boyunca santrifüjle ederek parçaları çökeltme ve kantitasyon için üst yüzeyi toplayın.
  6. Süpernatantı 0,22 μm santrifüj filtreleriyle sterilize ederek uHPLC analizinden önce kalıntı parçacıkları çıkarın.

8. Oromukozal doku histolojisi

NOT: GLP-1 RA'nın karışımlardan, HTC'lerden veya filmlerden 3 saat geçiriminden sonra, mukozalar hasarın değerlendirilmesi için işlenilir.

  1. Dokuları %10 formalin ile 48 saat düzeltin ve sonra sabit dokuları parafine gömedin.
  2. Dokuları 5 μm boyutunda mikrotom kullanarak kesimleyin.
  3. Daha sonra dokuları hematoksilin ve eozin (HE) ile boyanarak histolojik bütünlüğü ışık mikroskopisiyle 4× büyütmede incelenin.
  4. Slaytlar, dik bir mikroskopla görüntülenir ve görüntü analiz yazılımı kullanılarak analiz edilir.
    NOT: Genel iş akışı Şekil 4'te özetlenmiştir.

Sonuçlar

Domuz bukkal epitel dokularının izolasyonu ve diseksiyonu
Domuz bukkal mukozası, insan oromukozaları için yaygın olarak bir taşıyıcı doku olarak kullanılır çünkü benzer anatomik özellikler ve fizyolojik bariyer özellikleripaylaşırlar 29. Domuz bukkal epitel dokuları, Şekil 4'te gösterildiği gibi hem cerrahi hem de ısıtma yöntemleriyle izole edilmiştir. Başlangıçta, yanaklardan kasları ve derin bağ dokularını çıkarmak için bir skalpel kullanılır. Birleşik ve sağlam mukoza tabakaları ile bağ dokusu olan izole doku parçaları, 3 dakika boyunca 65 °C'ye ısıtılan sıcak PBS'ye yerleştirilir. Doku tampondan çıkarılır ve epitel ile alttaki lamina propria 5 boyutlu forseps ile soyulur. Isıtma, ortaya çıkan disseksiyon epitelinde tutarlı ve eşit bir kalınlık sağlar.

GLP-1RA'nın domuz bukkal oromukozaları üzerinde FDC'lere ve 3D baskılı eklere monte edilmiş ex vivo geçirimliliği
GLP-1RA'nın ex vivo geçirimliliği, FDC'ler ve insertlere monte edilen domuz bukkal epitel dokusu mukozaları kullanılarak değerlendirildi. GLP-1 RA: GDC'nin optimal konsantrasyon oranını değerlendirmek için, 12,7 mm alana sahip pamuk pedleri içeren HTC'ler, FDC'lere monte edilen mukozanın donör tarafına yapıştırıldı ve peptit güçlendirici karışım pamuk pedine pipet edildi. GDC 1:1 oranında dahil edildiğinde (GLP-1RA 25 mg: GDC 25 mg) GLP-1 RA'nın kümülatif geçirgenliği, 3 saat içinde yaklaşık %4,3'e ulaşmıştır. Buna karşılık, GDC yokluğunda tespit edilebilir GLP-1RA akısıgözlemlenmedi 27. Puygulaması dahil olmak üzere nicel geçirgenlik parametreleri aşağıdaki formülle hesaplanır:

Puygulaması = figure-results-1

Burada:
Puygulaması: Görünür geçirgenlik katsayısı (cm/s).
dQ/dt: GLP-1RA'nın sabit durumda taşınma hızı, birim zamana (μg/s) taşınan peptid miktarı olarak hesaplanır.
A: 3D ekleme alanı (cm 2).
Co: Peptidin donör (apikal) bölmedeki başlangıç konsantrasyonu (μg/mL).

GLP-1RA'nın domuz bukkal mukozaları üzerindeki görünür geçirgenlik katsayısı (Papp) Ek Şekil 2'de gösterilmiştir. GLP-1RA:GDC oranı 1:1 olduğunda, HTC'lerde olduğu konsantrasyonlar çift katmanlı filmlere dahil edilmiştir; ancak, izole domuz bukkal dokuları üzerindeki GLP-1RA geçirimliliği, geleneksel FDC düzeniyle ölçülenemezdi; çünkü GLP-1RA'nın filmlerden mukozalara sunumu, çözelti karışımlara veya HTC'lere göre daha yavaştır. Bu sınırlamayı aşmak için, alıcı hacmini 1,5 mL'ye düşürmek ve böylece algılama hassasiyetini artırmak için özelleştirilmiş düşük hacimli 3D baskılı ekler geliştirildi. 3D eklemeler kullanılarak, bukkal filmlerden 3 saat boyunca GLP-1RA kümülatif geçirimliliği ölçülebilir ve Şekil 5'te gösterildiği gibi yaklaşık %1,8'e ulaşmıştır. TEER değerleri ve FD-4 akışları epitel bariyer bütünlüğü ve parasellüler geçirgenliği değerlendirmek için kullanıldı. Tedavi gruplarında TEER'de zamana bağlı bir düşüş gözlemlendi (Ek Şekil 3) ve bu durum artan GLP-1RA geçirgenliğiyle karşılık geldi. PBS ve boş film ile işlenmiş dokularda TEER'de herhangi bir değişiklik bulunmamış olup, iki katmanlı film matrisinin bariyeri bozmadığını göstermiştir. Bu veriler, GDC'yi permeasyon artırıcı etkinin başlıca katkısı olarak gösteriyor.

Domuz dokusu histolojik değerlendirmesi
GLP-1RA ve GDC'ye 3 saat maruz kaldıktan sonra epitel bütünlüğünü incelemek ve doku izolasyon yöntemlerinin etkisini değerlendirmek için ex vivo domuz bukkal mukozasının histolojik değerlendirmesi yapıldı. Şekil 6'da gösterildiği gibi, ısıtma yöntemiyle elde edilen taze izole dokular, sağlam tabakalı tabakalar ve sürekli yüzey mukusu ile normal epitel fizyolojik mimariyi korudu ve yapısal hasar belirtisi göstermedi. Buna karşılık, mekanik ayrılma ile izole edilen veya depolama/dondurulmaya maruz kalan dokularda, epitel hücre morfolojisinde küçük değişiklikler ve yüzey mukus kalınlığında azalma görülür. 25 mg GLP-1RA ile maruz kalan bukkal mukoza, 25 mg GDC varlığına maruz kaldığında epitel bütünlüğünü korudu ve tedavi edilmemiş kontrol sınıflarına çok benziyordu. Sadece hafif ödem ve yüzeysel epitel erozyonu gözlemlendi. Yalnızca GLP-1RA'ya veya boş ve GLP-1RA'ya maruz kalmak: GDC yüklü çift katmanlı filmler görünür doku hasarı oluşturmadı ve histolojik özellikler PBS ile işlenmiş kontrol dokularıyla karşılaştırılabilirdi.

figure-results-2
Şekil 1: Domuz ağız boşluğunda bukkal ve sublingual mukozal bölgeler gösteriliyor. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 2: FDC'ler ve bileşenler. Altı oda entegre bir sistemde (solda) monte edilmiştir. Bir birey, Franz Cell, ortada gösterilmiştir. Bireysel bir odada bukkal doku için montaj sistemi (sağda). Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-4
Şekil 3: 3D baskılı 1 cm2 reçine eklemelerin bileşenleri. Bu şekilin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-5
Şekil 4: Domuz bukkal epitelyum izolasyonu, montajı, geçirimli ve histolojik karakterizasyon süreçleri için iş akışı. BioRender.com'de oluşturuldu. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-6
Şekil 5: GLP-1 RA'nın kümülatif miktarı. 25 mg/mL GLP-1RA (Kırmızı), 25 mg/mL GDC çözeltisi (Siyah) ve 25 mg/mL GDC çözeltisi (Siyah) ve 25 mg/mL GLP-1RA: 25 mg/mL GDC (mor) ile HTC, FDC ve 3D eklemeler aracılığıyla uygulanan 25 mg/mL GDC uygulandıktan sonra domuz bukkal epitel mukozasının alıcı tarafında GLP-1 RA'nın ex vivo kümülatif miktarı. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-7
Şekil 6: Farklı maruz kalma koşullarında domuz bukkal epitel mukozasının HE-boyalı mikroskobik görüntüleri. (A) Boş film, (B) GLP-1RA: GDC sulu karışımı, (C) GLP-1RA:GDC ile hapsolmuş filmler, (D) ısı işlemiyle taze dokudan izole edilen mukozalar (65 °C), (E) ısı işlemiyle donmuş dokudan izole edilen bukkal epitel, (F) mekanik yöntemle izole edilen mukoza. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Mukoadhesive tabakasının bileşimi
BileşenlerKonsantrasyon (mg)
GLP-1RA12,5 mg
GDC12,5 mg
HPMC45 mg
Na-CMC10 mg
PVP-K9025 mg
Gliserol3 mg
Aerosil 200F2 mg
Destek katmanı
Etil selüloz5 mg
Propilen glikol5 mg

Tablo 1: Mukoyapışkan bileşimi ve bukkal film arka katmanları.

Ek Şekil 1: 3D eklerle 6 saat boyunca 0,5 mg GLP-1RA kuluçka edildikten sonra GLP-1RA adsorpsiyonu. Veri, üç deneyin (n = 3) ± SD ortalamasıdır.Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 2: 3D insertlere monte edilmiş domuz bukkal mukoza dokusunun 3 saat maruz kalmasından sonra GLP-1RA'nın görünür geçirgenlik katsayısı (Papp). 25 mg/mL GLP çözeltisi (kırmızı), 25 mg/mL GLP + 25 mg/mL GDC sulu çözelti (siyah) ve 25 mg/mL GLP + 25 mg/mL GDC bukkal filmlere dahil edilmiş (mor). Temsil edilen veriler ortalama SD ± (n = 3) şeklindedir. Gruplar arasındaki istatistiksel anlamlılık gözlemlendi: p < 0.05. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 3: Transepitelyal direnç (TEER). 3D insertlerde sabitlenmiş izole domuz bukkal epitel dokusundan transepitel direncinin (TEER) kademeli azalması; 25 mg/mL GLP-1 + 25 mg/mL GDC çözeltisi (kırmızı), 25 mg/mL GLP-1 + 25 mg/mL GDC (bukkal filmlerde) ve 25 mg/mL GLP-1RA (mavi) ile PBS (mavi) arasında maruziyet. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 4: Doku bütünlüğü ve sızıntı. Doku bütünlüğü ve sızıntı, donör tarafta 0,05 mM FD4'e 3D insertlerde domuz bukkal epitel dokularının maruz bırakılması ile değerlendirildi. Örnekler, 6 saat boyunca sabit aralıklarla 60 dakikalık aralıklarla çekildi. Üç deneyin ortalama +SD'si. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 1: transwell-Oring-v7 (JOVE).stl.Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 2: transwell-v9 (JOVE).stl.Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 3: Ek deneysel detaylar.Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Bu metodoloji, domuz bukkal ve diğer oromukozal epitellerin izolasyonu için deneysel protokolleri ve düşük potensiye sahip stabil GLP-1RA analogu kullanılarak peptid tabanlı tedaviler için geçirgenlik testlerini örnek30 olarak tanımlar. Peptitler, mukozal membranlar boyunca önemsiz geçirgenliğe sahip hidrofilikmakromoleküllerdir 17. Yukarıdaki protokolün başarılı uygulanması, bukkal ve sublingual mukozanın hassas izolasyonu ve montajına dayanır. İzolasyon özel bir beceri ve titiz sıcaklık kontrolü gerektirir; Isıtma sürecinde küçük termal dalgalanmalar bile epitel dokusunda zararlı fizyolojik ve morfolojik değişikliklere yol açabilir ve sonuçta geçirimlilik verilerinin bütünlüğünü tehlikeye atabilir. Ayrıca, kişiselleştirilmiş 3D baskılı eklerde izole dokunun sabitlenmesi kritik bir adımdır. Epitel katmanlarının hassas yapısı nedeniyle, montaj sırasında doku yırılması veya sızıntı riski daha yüksektir. Bunu azaltmak için, akış çalışmalarına başlamadan önce membran bütünlüğünü sağlamak için kalite kontrol önlemi olarak hizmet eden FD4 sızıntı testi uyguladık. FD4 sızıntısı başlangıçta görsel olarak değerlendirilmiş ve UV-görünür spektroskopi kullanılarak daha da nicelendirilmiştir. İlgili veriler ek verilerde sağlanmıştır (Ek Şekil 4 ve Ek Dosya 3).

Geleneksel FDC, ex vivo çalışmalar için standart olarak kabul edilir ve alıcı odasındaki yüksek hacimler (genellikle 10 mL) nedeniyle peptit tedavilerini niceliklendirmede genellikle zorluklar yaratır. Yüksek hacim, aşırı numune seyrelmesine yol açar ve standart analitik yöntemler için permeated peptid konsantrasyonlarını düşük LOD'un altına iter. Bunu önlemek için, epitel hücre monokatmanları için kullanılan transwell sisteminin ölçek ve hacimlerini taklit eden yeni bir 3D baskılı ek geliştirdik; bunlar arasındaCaco-2 31 de var. Insertler doğrudan standart 12 delikli doku kültür plakalarına yerleştirilebilir ve izole domuz bukkal epitel mukozalarını güvenli bir şekilde barındırabilir. Bu değişiklik, donör bölme hacmini neredeyse 7 kat azaltarak 1,5 mL'ye düşürür; böylece analize odaklanır ve uHPLC'nin hassasiyet sınırlamalarını aşır. Bu adaptasyon, pahalı düşük geçirgenlikli peptid ilaçların nicelendirilmesi için özellikle önemlidir.

GDC varlığında GLP-1 RA geçirgenliğinde 3D yerleştirme sistemi kullanılarak artış gözlemlenmiştir. GLP-1RA birikimli permetif miktarı 3 saat içinde ~55,3 μg'ye ulaştı; bu da donör tarafına uygulanan başlangıçta uygulanan konsantrasyonun %4,3'üne karşılık gelir. Buna karşılık, bukkal filmlerde hapsolmuş benzer GLP-1RA ve GDC konsantrasyonları FDC'lerde bulunan bukkal mukozalara uygulandığında, ölçülebilir GLP-1 RA akısı tespit edilmedi; bu da peptit geçirgenliğinin gerçekleşmiş olabileceğini ancak büyük alıcı hacmindeki aşırı seyreltme nedeniyle analitik olarak tespit edilemez kaldığını düşündürmektedir. Ancak, iki katmanlı bukkal film formülasyonundan GLP-1 RA'nın kümülatif geçirimliliği, 3 saat boyunca 3 saat içinde 3D eklemelerde yaklaşık %1,8'e ulaştı ve minyatürize alıcı sistemi kullanılarak dozaj formlarından bukkal doku üzerinden düşük seviyeli peptit taşınımının tespit edilmesinin mümkün olduğunu gösterdi. GLP-1 RA'nın ex vivo geçirimliliği de peptit ve GDC ile yüklü pamuk pedleri içeren HTC'ler kullanılarak değerlendirildi. Bu, bir peptit gösteriminin bir permeasyon artırıcı ile filmlerden sunulabileceğini kanıtlamak için çok faydalı bir ilk tarama cihazıdır. Domuz bukkal epitelinin bariyer bütünlüğü TEER ve FD-4 sızıntısı kullanılarak deney sırasında izlenebilir. GLP-1 reseptör agonisti (GLP-1 RA) maruz kaldığında TEER'de yavaş ve zamana bağlı bir azalma gözlemlendi; bu, safratuzu 32 tarafından bukkal mukozalarda indüklenen artan parasellüler taşınımla tutarlıdır.

Bu tekniğin sınırlamalarından biri, mezbahalardan talep üzerine her zaman temin edilmeyecek taze domuz dokusuna bağımlılık olmasıdır ve doku kalitesi değişken olabilir. Laboratuvardan makul bir mesafede taze doku elde etme kısıtlamalarını gidermek için, daha sonra kullanabileceğimiz yüksek kaliteli örnekleri saklamak için kriyoprotektasyonu değerlendirdik. Taze doku kullanmak en uygun olsa da, izole depolanmış mukozal dokuların kullanılması, buz kristali oluşumunu ve ardından bariyer hasarını önlemek için kriyoprotektanların dikkatli kullanımı ve donma oranlarının kullanılması gerekir. Protokol, standart makro ölçekli geçirgenlik çalışmaları ile yüksek hassasiyetli peptid analizi arasındaki boşluğu kapatma kapasitesine sahiptir. 3D insertler kullanılarak doku izolasyon sürecini ve geçirimlilik protokolünü optimize ederek, FDC'lerde genellikle bildirilenden daha yüksek bir tekrarlanabilirlik ve hassasiyet elde ettik. Ayrıca, 3D insertlerin kullanımı, araştırmacılara pahalı peptit molekülleri için tespit limitleri sunmaları için bir çerçeve sağlar ve ex vivo mukozal araştırmaların esnekliği ve verimliliğinde önemli bir iyileşmeyi temsil eder.

Bu protokoller, peptidlerin ötesinde ilaç sınıfları kullanılarak mukozal doku geçirimliliğinin güvenilir ölçülmesi için bir temel sağlar. Ex vivo modellerden yüksek çözünürlüklü geçirgenlik profilleri üretme kapasitesi, hayvan modellerinden elde edilen preklinik emilim verilerinin tahminlerine yardımcı olacaktır. GLP-1 RA ex vivo geçirgenliği ayrıca, peptit yüklü pamuk pedi ve GDC olan bir geçirimlilik artırıcı çözelti içeren HTC'ler kullanılarak değerlendirildi. Bu teslimat yaklaşımı, karışım ile mukozal yüzey arasında samimi, tekrarlanabilir temas sağladı. Transwelllerde GDC oranı 1:1 ile GLP-1RA geçiriminde anlamlı artış gözlemlendi; bu oranlar transwell'leri taklit eden 3D insertlerdir. Bu, epitel hücrelerinin kültürlenmiş monokatmanlarından doku mukozalarına uyarlanmış yapılandırılmış bir tasarımda bir peptit sunumunun, bir permeasyon artırıcı ile filmlerden sunumunun mümkün olabileceğini kanıtlamak için çok faydalı bir tarama cihazıdır. Domuz bukkal epitelinin bariyer bütünlüğü TEER ölçümü ve FD4 sızıntısı kullanılarak deney sırasında izlenebilir.

Genel olarak, ex vivo geçirgenlik ve histolojik değerlendirmeler, bukkal ve sublingual peptid taşınımının bir permeasyon artırıcı varlığında güvenilir değerlendirmesinin doku hazırlığı, akı protokolleri ve analitik hassasiyete bağlı olduğunu göstermektedir. İncelenen izolasyon yaklaşımları arasında, taze kaynaklı domuz bukkal ve sublingual epitelin ısı yöntemiyle ayrılması, epitel bütünlüğünü koruma ile doku diseksiyonu arasında iyi bir denge sağladı; bu, stabil başlangıç TEER, minimum FD4 sızıntısı ve korunmuş doku hücre yapılarıyla kanıtlanmıştır. Önemli olarak, 3D baskılı insert, alıcı bölme seyrelmesini azaltarak deneysel güvenilirliği belirgin şekilde artırdı ve FDC'lerde tespit edilemeyen düşük peptid akışlarının nicelendirilmesini sağladı. Bir arada, bu bulgular izole domuz bukkal epitel mukozasının doku insert odasında sistemik teslimat için bukkal uygulamanın değerlendirilmesini değerlendirmek amacıyla ex vivo platform olarak kullanılmasını desteklemektedir.

Açıklamalar

Yazarların açıklamak için herhangi bir mali ilişkisi veya çıkar çatışması bulunmamaktadır.

Teşekkürler

Yazarlar, teknik yardımı için Ben Shovlin'e (UCD Veterinerlik Okulu) teşekkür ediyor. Ayrıca uHPLC analizine destek olan Dr. Hans Eckhardt'a (UCD Kimya Fakültesi) teşekkür ederiz. Bu proje, Avrupa Birliği'nin Horizon Europe araştırma ve inovasyon programından 101071054 numaralı hibe kapsamında finansman almıştır. Ayrıca, Grant Number 13/RC/2073_P2, Research Ireland CURAM Tıbbi Cihazlar Merkezi ve Avrupa Kalkınma Fonu'ndan ek fon desteğini de kabul ediyoruz. Yazarlar, domuz yanakları sağlayan Rosderra Irish Meats'ten Kenneth McNamara'ya teşekkür etmek ister.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Computer / LaptopGenericAny standard system≥8 GB RAM önerilir
Veri toplama betiğiÖzelcollect.pyPython tabanlı toplama betiği
Tek kullanımlık jel elektrotlarGenericÖn jel uygulanmış Ag/AgCl elektrotlarTek kullanımlık, yapışkan
EEG toplama modülüUpside Down LabsBioAmp EXG PillBiyopotaansiyel sinyalleri için analog ön uç
Elektrot jel (yeniden kullanılabilir elektrotlar kullanıldığında)Genericİletken jelSinyal iletkenliğini artırır
Etkileşimli uygulama (oyun)GenericHerhangi bir basit oyun (örn., yarış)Klavye kontrollü arayüz
Jumper kablolarGenericErkek-Kadın konnektörlerStandart breadboard kabloları
Matplotlib / SeabornAçık kaynakEn son sürümlerGörselleştirme kitaplıkları
Mikrokontrolör kartıArduinoUno / Maker Uno10-bit ADC, USB arayüzü
Python programlama ortamıPython Software FoundationPython ≥3.8Açık kaynak programlama dili
PyTorch kitaplıkMeta AIVersiyon ≥1.12Derin öğrenme çerçevesi
Scikit-learnAçık kaynakEn son kararlı sürümML yardımcı programları
Sinyal işleme kitaplıklarıSciPyEn son sürümFiltreleme, STFT
USB kablosuGenericUSB Tip-A'dan B'yeVeri aktarım kablosu

Kaynaklar

  1. Karki, S., et al. Oromucosal films for peptide delivery: formulation strategies using permeation enhancers and polymers. Drug Deliv Transl Res. , (2025).
  2. Karavasili, C., Eleftheriadis, G. K., Gioumouxouzis, C., Andriotis, E. G., Fatouros, D. G. Mucosal drug delivery and 3d printing technologies: a focus on special patient populations. Adv Drug Deliv Rev. 176, 113858(2021).
  3. Brayden, D. J., Hill, T., Fairlie, D., Maher, S., Mrsny, R. Systemic delivery of peptides by the oral route: formulation and medicinal chemistry approaches. Adv Drug Deliv Rev. 157, 2-36 (2020).
  4. Al Musaimi, O. FDA's stamp of approval: unveiling peptide breakthroughs in cardiovascular diseases, ACE, HIV, CNS, and beyond. J Pept Sci. 30 (11), e3627(2024).
  5. Lewis, A. L., McEntee, N., Holland, J., Patel, A. Development and approval of Rybelsus (oral semaglutide): ushering in a new era in peptide delivery. Drug Deliv Transl Res. 12 (1), 1-6 (2022).
  6. Zhang, Y., Zhang, H., Ghosh, D., Williams, R. O. Just how prevalent are peptide therapeutic products? a critical review. Int J Pharm. 587, 119491(2020).
  7. Wanasathop, A., Patel, P. B., Choi, H. A., Li, S. K. Permeability of buccal mucosa. Pharmaceutics. 13 (11), 1814(2021).
  8. Mazzinelli, E., et al. Oral mucosa models to evaluate drug permeability. Pharmaceutics. 15 (5), 1559(2023).
  9. Djekic, L., Martinovic, M. In vitro, ex vivo and in vivo methods for characterization of bioadhesiveness of drug delivery systems. Bioadhesives Drug Deliv. , (2020).
  10. Mura, P., et al. A preliminary study for the development and optimization by experimental design of an in vitro method for prediction of drug buccal absorption. Int J Pharm. 547 (1-2), 530-536 (2018).
  11. Majid, H., Bartel, A., Burckhardt, B. B. Development, validation and standardization of oromucosal ex-vivo permeation studies for implementation in quality-controlled environments. J Pharm Biomed Anal. 194, 113769(2021).
  12. Wakchaure, R. S., Dhial, K., Pathak, A. Ethical and Safety Considerations in Drug Delivery Systems. Next-Generation Drug Delivery Systems. , Springer, Humana. New York, NY. (2025).
  13. Wang, S., Zuo, A., Guo, J. Types and evaluation of in vitro penetration models for buccal mucosal delivery. J Drug Deliv Sci Technol. 61, 102122(2021).
  14. Sa, G., et al. Histological features of oral epithelium in seven animal species: as a reference for selecting animal models. Eur J Pharm Sci. 81, 10-17 (2016).
  15. Patel, V. F., Liu, F., Brown, M. B. Modeling the oral cavity: in vitro and in vivo evaluations of buccal drug delivery systems. J Control Release. 161 (3), 746-756 (2012).
  16. Tian, Y., et al. Oromucosal films: from patient centricity to production by printing techniques. Expert Opin Drug Deliv. 16 (9), 981-993 (2019).
  17. Malhotra, S., Lijnse, T., O'cearbhaill, E., Brayden, D. J. Devices to overcome the buccal mucosal barrier to administer therapeutic peptides. Adv Drug Deliv Rev. 220, 115572(2025).
  18. De Vries, M. E., et al. Localization of the permeability barrier inside porcine buccal mucosa: a combined in vitro study of drug permeability, electrical resistance and tissue morphology. Int J Pharm. 76 (1-2), 25-35 (1991).
  19. Diaz Del Consuelo, I., Pizzolato, G. P., Falson, F., Guy, R. H., Jacques, Y. Evaluation of pig esophageal mucosa as a permeability barrier model for buccal tissue. J Pharm Sci. 94 (12), 2777-2788 (2005).
  20. Pather, S. I., Rathbone, M. J., Şenel, S. Current status and the future of buccal drug delivery systems. Expert Opin Drug Deliv. 5 (5), 531-542 (2008).
  21. Junginger, H. E., Hoogstraate, J. A., Verhoef, J. C. Recent advances in buccal drug delivery and absorption—in vitro and in vivo studies. J Control Release. 62 (1-2), 149-159 (1999).
  22. Goswami, T., Jasti, B. R., Li, X. Estimation of the theoretical pore sizes of the porcine oral mucosa for permeation of hydrophilic permeants. Arch Oral Biol. 54 (6), 577-582 (2009).
  23. Otali, D., Fredenburgh, J., Oelschlager, D., Grizzle, W. A. Standard tissue as a control for histochemical and immunohistochemical staining. Biotech Histochem. 91 (5), 309-326 (2016).
  24. Franz-Montan, M., et al. Evaluation of different pig oral mucosa sites as permeability barrier models for drug permeation studies. Eur J Pharm Sci. 81, 52-59 (2016).
  25. Pegg, D. E. Cryopreservation and Freeze-Drying Protocols. , Springer, Humana. New York, NY. (2014).
  26. Hoogstraate, A., et al. In vivo buccal delivery of fluorescein isothiocyanate-dextran 4400 with glycodeoxycholate as an absorption enhancer in pigs. J Pharm Sci. 85 (5), 457-460 (1996).
  27. Karki, S., et al. A pullulan-based bilayer film for buccal delivery of a GLP-1 peptide analogue. Carbohydr Polym. 380, 125064(2026).
  28. Shu, W., et al. Computational and experimental analysis of drug-coated microneedle skin insertion: the mode of administration matters. Adv Mater Interfaces. 12 (17), 2500202(2025).
  29. Marxen, E., Axelsen, M. C., Pedersen, A. M. L., Jacobsen, J. Effect of cryoprotectants for maintaining drug permeability barriers in porcine buccal mucosa. Int J Pharm. 511 (1), 599-605 (2016).
  30. Rebollo, R., et al. Salcaprozate-based ionic liquids for GLP-1 gastric delivery: a mechanistic understanding of in vivo performance. J Control Release. 377, 267-276 (2025).
  31. Hubatsch, I., Ragnarsson, E. G., Artursson, P. Determination of drug permeability and prediction of drug absorption in Caco-2 monolayers. Nat Protoc. 2 (9), 2111-2119 (2007).
  32. Brayden, D. J., Stuettgen, V. Sodium glycodeoxycholate and sodium deoxycholate as epithelial permeation enhancers: in vitro and ex vivo intestinal and buccal bioassays. Eur J Pharm Sci. 159, 105737(2021).

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Peptit PermeasyonuEx Vivo ModelBukkal MukozaFranz Dif zyon H creleri3D Yazd r lm nsetlerPermeasyon Art r cTransepitelyal Elektriksel DirenMukoadhezif FilmlerUltra Y ksek Performansl S v Kromatografisi
Peptit Akışlarını Değerlendirmek İçin Standartlaştırılmış Ex Vivo Domuz Oromukozal Modeli
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.