Dolaşımda bulunan nadir hücrelerin sürekli santrifüj mikrofluidikleri ve hidrojel immünositokimya ile sağlam izolasyonu ve çoklayıcı tanımlanması

Özet

Bu çalışma, dolaşımdaki nadir hücrelerin etkin izolasyonu ve tanımlanması için sürekli santrifüj mikrofluidik iş akışı sunmaktadır. Sistem, hassas sıvı kontrolü sağlar ve hücre kaybını en aza indirerek, CTC ve cCAF dahil birden fazla CRC alt tipinin eşzamanlı analizini sağlayarak daha iyi tanı doğruluğu sağlar.

Özet

Dolaşımımdaki nadir hücreler (CRC'ler), dolaşımdaki tümör hücreleri (CTC'ler) ve dolaşımdaki kanserle ilişkili fibroblastlar (cCAF'lar) dahil, kanser teşhisi ve prognozu için umut vadeden biyobelirteçlerdir. Ancak, son derece düşük bolluk ve fenotipik heterojenlikleri, verimli izolasyon ve çok parametrik analizi teknik olarak zorlaştırır. Burada, tam kandan CRC'lerin ardışık izolasyonu ve tanımlanması için sürekli bir santrifüj mikrofluidik iş akışı sunuyoruz. Kartuş, yoğunluk gradyan ortamı ve kan katmanlarının santrifüj sırasında hassas şekilde işlenmesini sağlayan kontrol edilebilir valflere sahip beş birbirine bağlı odadan oluşur. Daha önce doğrulanmış bir zenginleştirme platformuna dayanan mevcut iş akışı, hidrojel bazlı hücre immobilizasyonunu çoklu immünositokimya ile entegre ederek CTC ve cCAF dahil birden fazla CRC alt tipinin aşağıdan tanımlanmasını ve karakterizasyonunu desteklemektedir. İzolasyon sonrası, hücreler tekrarlanan immünboyama ve görüntüleme tabanlı analizler sırasında hücre tutulmasını desteklemek için hidrojel matriksi içinde immobilize edilir. Bu iş akışı kullanılarak, aynı örnekten hem CTC'ler hem de cCAF'ler tanımlandı ve tek bir sıvı-biyopsi iş akışında dolaşımda birden fazla nadir hücre popülasyonunun entegre analizinin mümkün olduğunu gösterdi. Bu platform, sıvı biyopsi uygulamalarında aşağı yönlü nadir hücre karakterizasyonu için pratik ve tekrarlanabilir bir yaklaşım sunar.

Giriş

Dolaşımda bulunan nadir hücreler (CRC'ler), kan dolaşımında kırmızı kan hücreleri, beyaz kan hücreleri ve trombositler gibi normal kan bileşenlerine kıyasla çok düşük frekansta bulunan hücreler olarak tanımlanır. CRC'ler, biyolojik süreçlerin yan ürünleri, doku yeniden şekillendirilme, yara iyileşmesi veya damar yaralanması gibi çeşitli kaynaklardan kaynaklanır. Örnek örnekler arasında dolaşımdaki endotel hücreleri, dolaşımdaki fetal hücreler, megakariositler, eritroblastlar ve çeşitli öncül veya kök hücreler^{yer alır 1,2}. CRC'lerin varlığı mutlaka patolojik bir durumu yansıtmasa da, yüksek seviyeler genellikle anormal fizyolojik veya patolojik durumları gösterir ^3,4. Buna göre, CRC'lerin hassas tespiti ve karakterizasyonu, vücut içinde gerçekleşen dinamik fizyolojik ve patolojik süreçler hakkında değerli bilgiler sağlar.

CRC alt tipleri arasında, dolaşımdaki tümör hücreleri (CTC'ler) ve dolaşımdaki kanserle ilişkili fibroblastlar (cCAF'lar) kanserin başlıca biyobelirteçleridir. CTC'ler, tümör hücre yayılımının doğrudan kanıtı sunar ve yaygın olarak^{incelenmiştir 5}. CTC sayımındaki değişiklikler genellikle erken tespit, prognoz ve terapötik yanıtın izlenmesi^{ile ilişkilidir 6}. Paralel olarak, cCAF'lar kan dolaşımına dökülen stromal bileşenleri temsil eder; bu da tümör mikroortam etkileşimlerini ve pre-metastatik^{nişin oluşumunu yansıtır. 7}. Ancak, CTC'lerle karşılaştırıldığında, cCAF'lar üzerine yapılan araştırmalar sınırlı kalıyor ve klinik faydaları ancak keşfedilmeye^{başlanıyor 8}.

CTC'ler ve cCAF'lar, sıvı biyopside tamamlayıcı biyolojik bilgi sağlayabilir; çünkü CTC'ler tümör hücre yayılımını ve metastatik özellikleri yansıtırken, cCAF'lar stromal yeniden yapılanma ve tümör mikroçevresiyle ilişkili ilerleme sinyallerini temsil edebilir. Bu iki dolaşımda bulunan nadir hücre popülasyonunun eşzamanlı analizi, yalnızca her iki popülasyonun analizinden daha entegre bir kanser ilerlemesini destekleyebilir. Ancak, klinik ve translasyonel faydaları, periferik kanda aşırı nadirlikleri, evrensel olarak kabul edilen cCAF belirteçlerinin olmaması ve hücre alt popülasyonları arasında belirteç ekspresyonunun önemli heterojenliği nedeniyle önemli ölçüde sınırlıdır; bu da birlikte güvenilir tanımlamayı engeller. Bu nedenle, zenginleştirme ve tanımlama sırasında hücre kaybını en aza indirmek, sağlam ve güvenilir analiz sağlamak için kritik öneme sahiptir. Ayrıca, CTC ve cCAF'lerin fonksiyonel ve belirtici çeşitliliğinin kapsamlı karakterizasyonu, metastazdaki rollerini aydınlatmak ve klinik anlamlı biyobelirteçlerin geliştirilmesi^{için gereklidir 8,9}.

Burada, cCAF ve CTC^10,11'in eşzamanlı izolasyonu için bir yöntem sunuyoruz; bu yöntem nadir hücrelerin immünositokimyasının (ICC)12 hidrojel kapsülasyonu kullanılarak çoklu belirteç tanımlaması ^ile birleştirilmiştir. Mevcut CRC izolasyon yöntemleri genellikle teknik sınırlamalarla karşı karşıyadır; bunlar arasında çok aşamalı işleme sırasında hücre kaybı, fenotipik heterojen hücrelerin sınırlı yakalanması ve belirteç bağımlısı zenginleştirme stratejileriyle ilişkili seçim yanlılığı yer alır. Buna karşılık, bu çalışmada kullanılan sürekli santrifüj mikrofluidik platform, kapsamlı bir zenginleştirme çerçevesine dayanır ve böylece geleneksel pozitif seçim belirteçlerine olan bağımlılığı azaltır. Temel zenginleştirme platformunun analitik ve iş akışı performansı, önceki çalışmalarımızda^{tanımlanmıştır 9}.

Bu doğrulanmış platforma dayanarak, bu çalışma hidrojel bazlı hücre immobilizasyonu ve çoklu immünositokimyanın entegrasyonuna odaklanarak, CTC'ler ve cCAF'lar dahil olmak üzere birden fazla dolaşımda bulunan nadir hücre popülasyonunun birleşik bir iş akışı içinde kapsamlı izolasyonu ve tanımlanmasını mümkün kılmaktadır. Zenginleştirme, stabil hücre tutumu ve tekrar eden boyama uyumlu analizleri birleştirerek, bu protokol sıvı biyopsi örneklerinden entegre nadir hücre analizi için pratik bir çerçeve sağlar.

Protokol

Hastalardan ve sağlıklı bağışçılardan alınan insan kanı örneklerini içeren tüm işlemler, Severance Hastanesi Kurumsal İnceleme Kurulu'nun (IRB) yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Çalışma protokolü, Severance Hastanesi Kurumsal İnceleme Kurulu (IRB No. 4-2013-0059) tarafından onaylandı. Reaktifler ve kullanılan ekipmanlar Malzeme Tablosu'nda listelenmiştir.

1. Cihaz hazırlığı

1. Güç düğmesine basarak enstrümanı açın.
2. Lazer kilit anahtarını açın, ardından lazer güç anahtarını açın.
3. İşletim yazılımını başlatın ve sistemin normal şekilde başlatıldığını doğrulayın.
4. Ana yazılım arayüzünden Cihaz İşlemi'ni seçin ve standart EDTA tam kan örnekleri için ön ayarlanmış protokolü seçin.

2. Cihaz çalışması - 1^. adım

NOT: Giriş konumları ve kartuş yapısı detayları Şekil 1A'da gösterilmiştir.

1. 6. girişten, başlangıç odasına 2 mL Reaktif A (yoğunluk gradyan ortamı) ekleyin.
2. 8. girişten, boşalma odasına 875 μL Reaktif A eklenin.
3. Kartuşu disk rafına monte ederek santrifüjleme için doğru dengeyi sağlayın.
4. CTCeptor'daki Kapı düğmesine basarak montajı açın, sonra disk rafını CTCeptor'a monte edin ve sabitleme vidalarıyla sabitleyin.
5. Monte bağlamak için Kapı düğmesine basın ve CTCeptor yazılımıyla (yaklaşık 30 saniye) Spin Down adımını çalıştırın.
6. Reagent A'nın ilk odanın alt kısmına aktarıldığı doğrulandıktan sonra, sabitleme vidalarını serbest bırakın ve kartuş sabit kalarak disk rafını aletten çıkarın.

3. Cihaz çalışması - 2^. adım

1. Kan örneklerini almadan önce, tüm işlemleri sertifikalı biyolojik güvenlik dolabında gerçekleştirin ve kurumsal biyogüvenlik yönergelerine uygun olarak eldiven, laboratuvar önlüğü ve göz koruma gibi uygun kişisel koruyucu ekipmanlar giyin.
2. Kartuş aletten çıkarıldıktan sonra, giriş 6 üzerinden ilk odaya 3 mL kan enjekte edilsin.
3. Disk rafını CTCeptor'a monte edin ve sabitleme vidalarıyla sabitleyin.
4. CTCeptor yazılımını kullanarak RBC'nin Çıkarılması adımını çalıştırın (yaklaşık 40 dakika). Bu aşamada, santrifüjleme kartuş içindeki plazma, RBC'ler ve periferik kan mononükleer hücrelerini (PBMC) ayırır ve PBMC içeren fraksiyon, sonraki lökosit tükenmesi için sonraki odaya aktarılır.
5. RBC'nin çıkarma adımı tamamlandıktan sonra, disk rafını enstrümandan çıkarın.

4. Cihaz çalışması - 3^. adım

1. Çalışma alanını sterilliği korumak için dikkatlice dezenfekte edin.
2. Homojen süspansiyon sağlamak için Reaktif B (lökosit izolasyon boncukları) girdabına alın.
3. Yıkama tamponunu Ca²⁺/^{Mg 2}⁺ içermeyen DPBS ile %0,1 BSA ve 2 mM EDTA (pH 7,4) karıştırarak hazırlayın.
4. İstenilen Reaktif B hacmini 1.5 mL'lik bir tüpe aktarın (örneğin, kartuş başına 50 μL).
5. Yıkama tamponunu Reagent B hacmünin beş katı ile ekleyin ve pipetle nazikçe karıştırın.
6. Tüpü manyetik bir standa 1 dakika boyunca koyun, böylece Reagent B'deki boncuklar toplanabilir, ardından süpernatantı dikkatlice atın.
7. Boncukları yıkama tamponuna ilk boncuk hacmine eşit bir hacimde tekrar askıya alın.
8. Boncukları 4 °C'de kullanana kadar sakla.
9. Hemen kullanılmadan önce, hazırlanan boncuklardan 50 μL DPBS ile karıştırın ve 100 μL karışımı 7 numaralı girişe yükleyin.
10. Disk rafını CTCeptor'a monte edin ve sabitleme vidalarıyla sabitleyin.
11. WBC Kaldırma adımını CTCeptor yazılımıyla çalıştırın (yaklaşık 50 dakika). Bu programlanmış adımda, yüklü lökosit izolasyon boncukları, boncuk–WBC bağlanmasını teşvik etmek için PBMC içeren fraksiyonla karıştırılır, ardından boncukla bağlı WBC fraksiyonunun santrifüjasyon bazlı çıkarılması yapılır.
12. WBC'nin çıkarılması adımı tamamlandıktan sonra, disk rafını enstrümandan çıkarın.

5. Örnek kurtarma

1. Son odanın 9. çıkışına bir pipet ucu yerleştirin ve içeriği tekrar askıya alın, ardından toplanan örneği 15 mL'lik bir tüpe aktarın.
2. Çıkış 9'a 2 mL DPBS enjekte edin, pipetle hazneyi iyice durulayın ve yıkamayı aynı 15 mL tüpe aktarın.
3. Yıkama adımını iki kez tekrarlayın.
4. 15 mL'lik tüpteki toplanan sıvının hacmini DPBS ile 14 mL'ye ayarlayın, tüpü kapalı kapatın ve çevirerek nazikçe karıştırın.
5. Tüpü oda sıcaklığında 4 dakika boyunca 380 × g sıcaklıkta santrifüjle yapın.
6. Süspansiyonu dikkatlice çıkarın, yaklaşık 1 mL kalın, kalan süspansiyonu ise aşağı akış analizi için kullanın.

6. CRC'lerin Tanımlanması

1. Pre-hidrojel polimeri hazırlamak için, Ca^2⁺/^{Mg 2⁺}-serbest DPBS, hidrojel pellikül immünositokimya (HypICC) çözeltisi A (prepolimer) ve Fotoinitiatör 80:20:1 oranında karıştırın.
2. 870 μL CRC süspansiyonu 270 μL ön hidrojel polimerle karıştırın.
3. Karışımı HypICC odasına aktarın ve hücrelerin platformda yerleşmesini sağlamak için 500 × g seviyesinde 5 dakika santrifüj yapın.
4. Hidrojel kalınlığını ayarlamak için kalınlık kontrolcüsünü HypICC odasına yerleştirin.
5. Örneği alt kısımdan 20–30 saniye UV ışığı ile ışınlayarak hidrojel tabakasını çapraz bağlamak için ışınlayın.
6. Kalınlık kontrolcüsü çıkarın ve hidrojel kapsüllü hücreleri DPBS ile üç kez yıkayın.
7. Hücreleri oda sıcaklığında %4 paraformaldehit (PFA) ile 10 dakika sabitleyin, ardından örnekleri DPBS ile üç kez, her biri 10 dakika yıkayın.
8. Hücreleri oda sıcaklığında %0,05 Triton X-100 ile 10 dakika boyunca geçirimlileştirin. Sonra örnekleri DPBS ile üç kez, her biri 10 dakika yıkayacak.
9. Numuneleri %2 BSA ile oda sıcaklığında 1 saat bloklayın.
10. Örnekleri birincil antikorlarla gece boyunca 4 °C'de kuluçka yapın.
11. Örnekleri DPBS ile beş kez yıkayın, her yıkama 20 dakika.
12. Çekirdekleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca Hoechst ile boyan, sonra örnekleri DPBS ile üç kez, her biri 10 dakika yıkayacak.
13. Gerekirse, ikincil antikor kuluçkası, birincil antikor kuluçkasının gece koşullarında yapılabilir.
14. Floresans mikroskopisi görüntüleme yapın ve CRC'leri tespit edin.

7. CRC'lerin çoklu immünbojeneri

1. İmbaşkan boyama ve görüntülemeden sonra, CRC'ler söndürme sonrası ek bir antikor boyama turuna tabi kalabilir.
2. %4,5 H₂O₂ ve 24 mM NaOH içeren bir söndürme çözeltisi PBS içinde.
3. DPBS'yi HypICC odasından çıkarın ve söndürme çözeltisini ekleyin.
4. Oda sıcaklığında, beyaz ışık altında sallayarak 1 saat kuluçka yapın.
5. Söndürme çözümünü değiştirin ve aynı koşullarda ek 1 saat kuluçka yapın.
6. Numuneleri DPBS ile dört kez 10 dakika boyunca yıkayın.
7. Bağışıklık boyama işlemini %2 BSA kullanarak bloklama aşamasından yeniden başlatın.

Sonuçlar

Şekil 1A , nadir hücre izolasyonu için kullanılan tek bir kartuşun görüntüsünü göstermektedir. Kartuş, sıvı akışını düzenleyen mikrokanallar ve kontrol edilebilir valflerle birbirine bağlı beş ayrı odadan oluşur. Kartuşun yapısı şöyledir: (1) tüm kandan ayrılmış plazmayı toplayan bir plazma odası; (2) tüm kanın plazma, kırmızı kan hücresi ve PBMC katmanlarına ayrıldığı başlangıç odası; (3) izole PBMC'lerin lökosit izolasyon boncuklarıyla birleştirildiği bir ...

Tartışma

CRC'ler, hem kanser tanısı hem de prognoz için potansiyel değere sahip önemli biyobelirteçlerdir. Ancak CRC analizinin klinik faydasını artırmak için, fenotipik olarak çeşitli CRC popülasyonlarının daha geniş bir yelpazesini yakalamak ve paralel çok parametrik karakterizasyonu desteklemek^{önemlidir 13}. Ayrıca, onko-immünolojide artan kanıtlar, bağışıklık bileşenleri ve tümör mikroçevresinin terapötik yanıtın şekillenmesinde kritik roller oynadığını göstermekte, yal...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
15 mL Konik Tüp	SPL	50015
%16 Formaldehit (w/v), Metanolsüz	Thermo Scientific	28908
Alexa Fluor 488 AffiniPure Eşek Anti-Tavşan IgG (H+L)	Jackson immunoresearch	711-545-152
Alexa Fluor 594 AffiniPure Eşek Anti-Keçi IgG (H+L)	Jackson immunoresearch	705-585-003
Sığır Serum Albumini	GenDepot	A0100-010
CD45 antikoru	Biolegend	304060
CellTracker Yeşil CMFDA	Invitrogen	C7025
CTCD	CTCELLS	CTD-C103	Disk kartuşu
CTCD rafı	CTCELLS	CTDR-CM3	Disk rafı
CTCeptor	CTCELLS	CTM-C2203	CTCeptor
CTR-S Reaktifi A	CTCELLS	CTR-S1001	yoğunluk gradyanı ortamı
CTR-S Reaktifi B	CTCELLS	CTR-S1002	lökosit izolasyon boncukları
FAP antikoru	Invitrogen	PA5-99313
Hoechst 33342	Thermo Scientific	62249
HypICC Fotoinitiatör	CTCELLS	CTR-G1002
HypICC Çözeltisi A	CTCELLS	CTR-G1001
HypICC Ünitesi	CTCELLS	CTH-V01	HypICC haznesi
Lateks eldiven	Ansell	93743080
Manyetik stand			3D yazıcı kullanılarak şirket içi yapılmış
Manuel Pipetleme  (0,5-10 µL)	Eppendorf	3120000020
Manuel Pipetleme  (100-1000 µL)	Eppendorf	3120000062
Manuel Pipetleme  (10-100 µL)	Eppendorf	3120000046
Manuel Pipetleme  (20-200 µL)	Eppendorf	3120000054
Manuel Pipetleme  (2-20 µL)	Eppendorf	3120000038
pansitokeratin antikoru	Invitrogen	53-9003-82
PBS (Fosfat Tamponlu Salin Çözeltisi)	Welegene	LB001-02
SMA antikoru	Invitrogen	PA5-18292
Uç, 10 µL	TipOne	9104020333
Uç, 1250 µL	TipOne	9104020740
Uç, 200 µL	TipOne	9104020422
Triton X-100	Signma	X100-100ML
Tam Kan			EDTA içinde toplanarak 4-8 °C'de saklanır
β aktin antikoru	abcam	ab8226