Yöntem makalesi

Alzheimer Hastalığı Model Farelerinde Akupunktur Müdahalesi İçin Görüntüleme Stratejileri

186 görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/70998

⸱

21 Nisan 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Traditional Chinese Medicine, General Hospital of the Chinese People's Liberation Army, 2Meizhou Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine (Meizhou Hospital of Traditional Chinese Medicine), 3School of Traditional Chinese Medicine, Capital Medical University, 4Department of Psychosomatic Medicine, Beijing Hospital of Traditional Chinese Medicine Affiliated to Capital Medical University

Bu makalede

Özet

Bu protokol, Alzheimer hastalığı fare modelinde elektroakupunkturun β-amiloid birikimi ve bilişsel fonksiyon üzerindeki etkilerini dinamik olarak değerlendirmek için in vivo mikro-PET görüntüleme stratejisini davranışsal ve moleküler testlerle birleştirerek tanımlar.

Özet

Alzheimer hastalığı (AD), öncelikle ilerleyici bilişsel işlev bozukluğu ile karakterize edilen nörodejeneratif bir bozukluktur. Tipik patolojik özelliklerinden biri, β-amiloid (Aβ) proteinlerinin birikmesi nedeniyle beyinde yaşlılık plaklarının oluşmasıdır. Akupunktur, AD hastalarında bilişsel fonksiyonları iyileştirme potansiyelini klinik uygulamada göstermiştir. Ancak, Aβ patolojisi üzerindeki dinamik etkileri, modern teknolojik yaklaşımlarla nesnel bir açıklama gerektirir. Mikro-pozitron emisyon tomografisi (micro-PET), AD model farelerin beyinlerinde Aβ birikiminin in vivo ve invaziv olmayan gözlemi için güçlü bir araç sağlar. Bu protokolde, elektroakupunktur müdahalesinin etkilerini değerlendirmek için [18F]AV-45 mikro-PET kullanılarak Morris Water Maze davranış testi ve Western blot moleküler analiziyle desteklenen görüntüleme stratejisini detaylandırıyoruz. Entegre yaklaşım, AD model farelerin beyinlerinde Aβ patolojik ilerlemesinin görselleştirilmesi ve nicelendirilmesini sağlar. Bu, akupunkturun Aβ birikimini düzenleyici etkisini incelemek için nesnel ve nicel kanıtlar sağlar. Geleneksel Çin tıbbı prensiplerini modern moleküler görüntüleme ve moleküler biyoloji teknolojileriyle entegre ederek.

Giriş

Beyinde β-amiloid(Aβ) birikiminin in vivo izlemesi, AD1'in patolojik ilerlemesini değerlendirmek için çok önemlidir. Aβ hedefli antikor tedavilerinin (örneğin, Lecanemab) klinik uygulamasının ardından, PET kullanılarak beyin Aβ yükünün uzunlamasına ve nicel değerlendirmesi, terapötik etkinliği belirlemede altın bir standartolarak ortaya çıkmıştır 2. Akupunktur, Aβ metabolizmasını modüle etme preklinik çalışmalarda potansiyel göstermiş olsa da, geleneksel araştırma yaklaşımları büyük ölçüde ex vivo analizlere dayanmış ve canlı organizmalarda Aβ birikimine dinamik etkisinin doğrudan ve nesnel değerlendirilmesi için etkili araçlardan yoksundur. Son yıllarda moleküler görüntüleme teknolojilerindeki gelişmeler, bu boşluğu kapatmak için fırsatlar yaratmıştır. mikro-PET, AD modelfareleri 1'de Aβ birikiminin invaziv olmayan, boylamasına gözlemini mümkün kılmıştır. Daha da önemlisi, yeni görüntüleme stratejileri tek hedefli yaklaşımlardan çoklu modal paradigmalara doğru evrilmektedir. Örneğin, çalışmalar, Aβ fibrillerinin farklı yapısal alt tiplerinin yaygın kullanılan PET izleyicilere farklı bağlanma eğilimleri gösterdiğini ve bu da kesin nicelik için yeni talepleryarattığını doğrulamıştır 3. Aynı zamanda, nöroimmün görüntüleme (örneğin TSPO PET) ve kan-beyin bariyeri fonksiyonunun değerlendirilmesi gibi yeni teknikler, AD'nin karmaşık patolojik mekanizmalarını ve terapötik müdahalelerin çoklu hedefli etkilerini kapsamlı şekilde açıklamak için eşi benzeri görülmemiş perspektifler sunar4.

Bu temele dayanarak, bu çalışma, akupunktur müdahalesinin AD model farelerinin beyinlerinde Aβ birikimini dinamik ve nicel olarak değerlendirmek için en son Aβ-spesifik probları kullanarak gelişmiş bir mikro-PET görüntüleme stratejisi geliştirmeyi amaçlamaktadır. Çalışma, akupunkturun terapötik etkinliğini doğrulamakla kalmayacak, aynı zamanda moleküler görüntüleme düzeyinde altta yatan mekanizmalarına doğrudan kanıt sunmaya çalışacaktır.

Protokol

Tüm deneyleri, Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından yayımlanan Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzları'na uygun olarak yürütmek. Çalışma protokolü, Pekin Çin Tıp Üniversitesi Deneysel Hayvan Etik Komitesi tarafından onaylandı (No.: bucm-4-2021102707-5421).

1. Deneysel hayvanların hazırlanması

  1. 6 aylık erkek APP/PS1 fareleri ve yaş ile cinsiyet eşleştirilmiş C57BL/6 fareleri 28.0 ± 2.0 g ağırlığında alın.
  2. Fareleri standart kafeslerde, 24 ± 2 °C oda sıcaklığında, %40–60 nem oranında tutun.
    NOT: Hayvanlar, Pekin Çin Tıp Üniversitesi, Capital Medical University Laboratuvar Hayvan Merkezi'nde standart kafeslerde tutuldu.
  3. Hayvanları standart 12 saatlik ışık/karanlık döngü (karanlık dönem: 20:00 - 8:00) altında tutun ve ücretsiz yiyecek ve suya erişim. Yatak takımını her gün değiştirerek temiz ve kuru konut koşullarını sağlayın.
  4. Hayvanları 7 gün boyunca laboratuvar ortamına alıştırın. Alışmanın ardından sekizinci günde deneylere başlayın.

2. Hayvan grupları ve müdahaleler

  1. Yirmi adet 6 aylık erkek APP/PS1 faresini Alzheimer hastalığı model grubuna (AD grubu, n = 10) ve elektroakupunktur grubuna (EA grubu, n = 10) rastgele atanır. Yaş ve cinsiyet eşleştirilmiş on C57BL/6N faresini normal kontrol grubuna (N grubu, n = 10) atayın.
  2. Müdahale için kafadaki üç akupunktur noktasını belirleyin: GV20 (Baihui), GV26 (Shuigou) ve GV29 (Yintang).
    NOT: Akupunktur noktalarının lokalizasyonu, Çin Akupunktur-Motosütün Derneği'nin Deneysel Akupunktur Araştırma Derneği tarafından formüle edilen "Hayvan Akupunktur Akupunktur Atlası"na dayanmaktadır. GV20, her iki kulağın uçları arasında orta noktada yer alır; GV29, kaşların medial uçlarının ortasında yer alır; ve GV26, farenin burun septumunun altında, dudak yarığının alt üçte ikisi ile üst üçte birinin birleşiminde yer alır. Şematik diyagram Şekil 1'de gösterilmiştir.
  3. EA grubuna günde bir kez, 15 gün boyunca 20 dakika boyunca elektroakupunktur uyarısı uygulayın.
    1. Fareyi aynı özel tasarlanmış kumaş emniyet kollarıyla güvenli bir şekilde sabitleyin. Vücudun rahat sarıldığından emin olun, başınız tam olarak açıkta kalarak iğnenin doğru yerleştirilmesi ve normal nefes almanız için dikkatli olun.
    2. Tek kullanımlık steril akupunktur iğneleri (0,25 mm × 13 mm) hazırlayın.
    3. GV26 (Shuigou) akupunktur noktasına steril akupunktur iğnesini kullanarak hızlı bir batlama yöntemi (hızlı yerleştirme ve hemen retrisiyon olmadan çekilme) uygulayın.
    4. GV20 ve GV29 iğnelerinin saplarını elektronik elektroakupunktur cihazının çıkış kliplerine bağlayın.
    5. Cihazın uyarma parametrelerini, 2 Hz frekansta, 2 V sabit voltajda ve 0,1 mA akım yoğunluğunda sürekli seyrek bir dalga sunacak şekilde ayarlayın.
    6. Fareyi dikkatlice inceleyin ve uyarılma yoğunluğunun farenin başında hafif, ritmik bir titreme yarattığını kontrol edin.
  4. N ve AD gruplarındaki fareleri aynı konut koşullarında herhangi bir müdahale olmadan tutun. Deneysel koşullarda tutarlılığı sağlamak için N ve AD gruplarını, EA grubuyla 15 günlük sürede aynı günlük müdahale ve kısıtlama prosedürlerine tabi kılın.

3. Morris su labirenti (MWM) testi

NOT: Davranışsal çerçeve (Morris Water Maze) önceki çalışmalarımızın üzerineinşa edilmektedir 5.

  1. Cihaz hazırlığı
    1. Test odasına dairesel bir su tankı (çapı 90 cm, derinliği 50 cm) yerleştirin. Tankı 30 cm derinliğe kadar suyla (22 ± 2 °C) doldurun.
    2. Suya 0,5 kg yağsız süt tozu ekleyerek opak hale getirin. Tankı neredeyse dört eşit dörtre (I, II, III ve IV) bölür.
    3. I. kvadrantın ortasına dairesel, çapı 5 cm, yüksekliği 28 cm olan bir kaçış platformu yerleştirin.
    4. Her dörtgenin iç duvarına farklı şekillerde belirgin görsel ipuçları yerleştirerek farenin platformun konumunu öğrenmesi ve ezberlenmesi için yardımcı olur.
    5. Tankın ortasından 2 m yukarıda tavana dijital kamera takın ve görüntü alma sisteminebağlayın 6.
  2. Alışkanlık
    1. Platformu gizli platform testinden bir gün önce tanktan çıkarın. Farenin sabah ve öğleden sonra 90 saniye boyunca akvaryumda özgürce yüzmesine izin verin, böylece deneysel ortama alışabilir.
  3. Gizli platform testi
    1. Gizli platform testini beş gün ardışık olarak yapın.
    2. Ikinci, üçüncü ve dördüncü bölgelerden sırasıyla başlangıç noktalarını seçin, böylece her başlangıç noktasının tankın merkezine eşit mesafede olmasını sağlayın.
    3. Fareyi suya yerleştirin, tank duvarına bakarak. Farenin suya konduktan sonra çevresini gözlemlemesine 10 saniye izin verin.
    4. Fare gizli platformu bulup 60 saniye sınırı içinde 5 saniye boyunca kalırsa, kaçış gecikmesini ve yüzme yolunu kaydedin. Platformu 60 saniye içinde bulamazsa fareyi elle platforma yönlendirin.
    5. Hayvanın platformda 10 saniye kalmasına izin verin, konumu gözlemleyip ezberleyin ve kaçış gecikmesini 60 saniye olarak kaydedin.
  4. Uzaysal prob testi
    1. Beş gün üst üste yapılan gizli platform eğitiminden sonra tanktan gizli platformu çıkarın.
    2. Her fareyi ikinci, üçüncü veya dördüncü dörtlükte bulunan başlangıç noktalarından birinden suya yerleştirin. Farenin 60 saniye boyunca özgürce yüzmesine izin verin. Yüzme yolunu ve hedef kvadrantta (I. dörtlük) geçirilen zamanı kaydedin.
    3. Tüm fareleri denemeler arasında hemen ev kafeslerine geri göndererek deneyci ile doğrudan teması en aza indirin.

4. Western Blot analizi

  1. 15 günlük müdahalenin tamamlanmasından 24 saat sonra grup başına altı fareyi ötenazi yapın. Buz üzerinde taze hipokampal dokuları hızlıca disek ve izole edin.
  2. Hipokampal dokuları tartın ve önceden soğutulmuş mikrosantrifüj tüplerine yerleştirin. Soğuk RIPA lizin tamponu ekleyin; %1 proteaz inhibitör kokteyli ve %1 fosfataz inhibitör kokteyli ile takviye edilmiş, 1 mg doku başına 10 μL tampon oranında.
  3. Dokuları buz üzerinde mekanik doku homojenizatörü kullanarak iyice homojenleştirin. Homojenleri 12.000 x g ile 15 dakika boyunca 4 °C'de santrifüj ederek hücresel kalıntıları giderir. Süpernatantı dikkatlice toplayın ve yeni, önceden soğutulmuş bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
  4. Protein örneklerini 5× SDS yükleme tamponu ile karıştırın ve karışımı 95 °C'de 10 dakika boyunca kaynatarak proteinleri tamamen denatüre edin. %15 SDS-PAGE jeline eşit miktarda protein (20 μg) yükleyin. Bitişik bir kuyuyda önceden boyanmış bir protein moleküler ağırlık belirteci ekleyin.
  5. Biriktirme jelini sabit 80 V voltajda 30 dakika çalıştırın, ardından ayırıcı jeldeki proteinleri 120 V'da çözerek bromofenol mavi boya ön kısmı jelin altına ulaşana kadar çözer.
  6. Ayrılmış proteinleri 250 mA sabit akımda 90 dakika boyunca buz üzerinde 0,22 μm poliviniliden florür (PVDF) membranına aktarın. PVDF membranını, %5 yağsız yağsız sütle oda sıcaklığında, %0,1 Tween 20 (TBST) içeren tuzlu sümle çözünerek 1 saat boyunca oda sıcaklığında hafifçe çalkalayın.
  7. Zarı, Aβ'ye karşı birincil antikor (bloklayıcı tamponda seyreltilmiş) ve GAPDH'ye karşı birincil antikor (bloklayıcı tamponda seyreltilmiş [1:5000]) ile gece boyunca yatay bir silkeleyicide 4 °C ile inkübe edin. Zarı, oda sıcaklığında 1 saat boyunca yaban turpu peroksidaz (HRP) ile konjuge edilmiş ikincil antikor (bloklayıcı tamponda seyreltilmiş [1:2000]) ile kuluçka yapın.
  8. Membranı TBST ile her biri 10 dakika boyunca üç kez yıkayarak bağlanmamış ikincil antikorları çıkarabilirsiniz.
  9. Membrana geliştirilmiş kemimilüminesans (ECL) alt tabakası uygulayın ve sinyali kemilyünüminesans görüntüleme sistemi kullanarak yakalayın.
  10. Proteinin bandı yoğunluklarını ImageJ yazılımı (sürüm 1.53a) kullanarak nicelikle hesaplayın. Hedef bantların gri tonlu değerlerini GAPDH'nin değerlerine normalleştirin ve ilgilenilen proteinlerin göreli ifade seviyelerini hesaplayın.

5. [18F]AV-45 radyosentez

  1. Öncü bileşiğin 3.0 mg nükleofil ikamesi ile [18F]KF ile radyo etiketleme yapılabilir.
  2. Ürünü yüksek performanslı sıvı kromatografi (HPLC) kullanarak %95'ten yüksek radyokimyasal saflık (RCP) elde etmek için arındırın.
  3. Etiketlenmiş bileşiği etanolde çöz.
  4. Çözeltiyi %0,9 sodyum klorür ile seyreldin ve nihai ürünü %10 etanol içinde hazırlayarak sonraki kullanımiçin 7.

6. In vivo PET görüntüleme

  1. Her deneysel gruptan rastgele dört fare seçin.
    1. Fareyi işlemden önce dolaşan bir su ısıtma pedine (37 °C) veya ısıtma lambasının altına 5–10 dakika boyunca koyun, böylece kuyruk damarlarının damar genişlemesini teşvik edin.
    2. Faresi, kuyruğu tamamen açıkta bırakarak uygun şeffaf silindirik kemirgen tutucuya sabitleyin. Kuyruğu dezenfekte edin ve yan kuyruk damarlarını %70 etanol sürüntüyle ciltini silerek daha fazla görselleştirin.
  2. Formüle edilmiş[18F]AV-45 radyotracer'ı, iğne ile donatılmış 0.5 mL insülin şırıngasına çekin. Yaklaşık 100–150 μL enjeksiyon hacmi hazırlayarak hedef radyoaktivite dozu 3,0 MBq (radyokimyasal saflık > %95)2 elde edin.
  3. İzleyici dolu şırınganın ilk radyoaktivitesini doz kalibratörü kullanarak ölçüp kaydedin.
  4. İğneyi, eğim ile sığ bir açıyla (yaklaşık 10°–20°) yan kuyruk damarına sokun. Uygulamadan 60 dakika sonra fareyi %2 isofluran soluyarak anestezi edin.
  5. Fareyi konumlandırın ve 15 dakikalık üç boyutlu statik PET taraması alın.
  6. PET verilerini, üç boyutlu sıralı alt küme beklenti maksimizasyonu (OSEM) algoritması kullanarak yeniden inşa edin.
  7. Yeniden oluşturulan verileri PMOD yazılımı (sürüm 4.5) ile işleyin.
    1. Verileri, PMOD füzyon modülündeki küçük ve orta büyüklükteki fareler için uygun bir beyin şablonuna birlikte kaydet. Yazılımın fare beynindeki ilgi alanlarını (ROI) otomatik olarak tanımlamasına izin verin.
  8. Standartlaştırılmış alım değerlerini (SUV'ler) hesaplayın. Her yatırım getirisi için SUV'u beyincik8 ile karşılaştırarak standart alım değeri oranını (SUVR) elde edin.
    NOT: Verilen dozdaki kabul edilebilir değişkenlik (2.0–3.8 MBq) günlük radyotracer verimi dalgalanmalarını ve bireysel fare vücut ağırlıklarını karşılar. Sonraki nicelikler, hedef bölgeyi referans bölgesine (beyincik) göre normalleştiren standartlaştırılmış alım değeri oranına (SUVR) dayandığı için, bu aralıktaki mutlak doz değişimleri karşılaştırmalı görüntüleme sonuçlarını etkilemez. Mikro-pozitron emisyon tomografisi (Micro-PET) Şekil 2'de gösterilmiştir.

7. İstatistiksel analiz

  1. Tüm istatistiksel analizleri SPSS yazılımı (sürüm 19.0) kullanarak gerçekleştirin.
  2. Verileri ortalama ± standart sapma (SD) olarak sunun.
  3. Gizli platform test sonuçlarını analiz etmek için tek yönlü ANOVA uygulayın.
  4. Mekansal prob testi ve PET görüntüleme verilerini, tekrarlanan ölçülü ANOVA veya tek yönlü ANOVA ile analiz edin, ardından LSD sonrası testler için çiftli karşılaştırmalar yapılabilir.

Sonuçlar

APP/PS1 farelerinde elektroakupunkturun bilişsel fonksiyon üzerindeki etkisi

Mekansal öğrenme yeteneğini değerlendirmek için fareler 1. günden 5. güne kadar eğitim denemelerinden geçti. Gizli platform testinde (Şekil 3A,B), tüm gruplardaki farelerin kaçış gecikmesi eğitim süresi boyunca azalma eğilimi göstermiştir. N grubuyla karşılaştırıldığında, AD grubu anlamlı şekilde uzun bir kaçış gecikmesi (p < 0.05) gösterdi; bu da 6 aylık APP/PS1 farelerinde belirgin öğrenme ve hafıza eksikliklerini gösterdi. AD grubundaki kaçış gecikmesi, hem N hem de EA gruplarındakinden (p < 0.01) önemli ölçüde daha uzundu. Özellikle, 5. gün EA grubundaki kaçış gecikmesi, AD grubununkinden (p 0.05) (p <0.05) (Şekil 3C) önemli ölçüde daha kısaydı. 5 günlük eğitim döneminin ardından, mekânsal hafıza uzaysal prob testi kullanılarak değerlendirildi. Hedef (platform) çeyreğinde yüzme süresinin toplam yüzme süresine oranı hesaplandı; daha yüksek oran daha iyi hafıza tutumunu gösterir. Sonuçlar, AD grubundaki yüzme süresi oranının N grubuna göre anlamlı derecede düşük olduğunu gösterdi (p < 0.01). Buna karşılık, EA grubu AD grubuna kıyasla anlamlı şekilde daha yüksek bir oran gösterdi (p < 0.01). Ancak, EA grubundaki oran, N grubundaki orandan daha düşük kaldı (p < 0,05) (Şekil 3D).

Platform geçiş sayısı da analiz edildi; bu da mekânsal belleğin hassasiyetini yansıtır. Daha fazla çaprazlık daha iyi hafıza tutumunu gösterir. AD grubu, N grubuna göre (p 0,05< kıyasla anlamlı şekilde daha az platform geçişi gösterdiken, EA grubu AD grubuna kıyasla anlamlı bir artış gösterdi (p < 0,05). Buna rağmen, EA grubu N grubuna göre (p < 0.05) daha az çaprazlığa sahipti (Şekil 3E).

APP/PS1 mikrofonunun hipokampusunda elektroakupunkturun Aβ birikiminde etkileri

Aβ biriktirmesi PET görüntüleme kullanılarak değerlendirildi ve radyo etiketli Aβ izleyicisinin standartlaştırılmış alım değeri oranı (SUVR) APP/PS1 farelerinin hipokampusunda hesaplandı (Şekil 4A). Mikro-PET taramaları, hem N grubu hem de EA grubunun AD grubuna kıyasla SUVR değerlerinin önemli ölçüde daha düşük olduğunu gösterdi (Şekil 4B). Daha fazla nicel analiz, EA grubundaki hipokampal SUVR ve Aβ'nun N grubundakilerden anlamlı şekilde daha yüksek olduğunu (p < 0,05) doğrularken, elektroakupunktur müdahalesi sonrası AD grubundakiden anlamlı şekilde daha düşük kaldığını (p < 0,05) (Şekil 4C).

Elektroakupunkturun Aβ protein ekspresyonu üzerindeki etkileri

Davranışsal ve görüntüleme değerlendirmelerinin ardından, hipokampustaki Aβ protein ekspresyonu Western blot analiziyle değerlendirildi (Şekil 5A). Nicel analiz, AD grubundaki Aβ'nun göreli ifadesinin N grubuna (p < 0.05) kıyasla anlamlı şekilde yüksek olduğunu gösterdi. EA grubu, AD grubuna kıyasla hipokampal Aβ ekspresyonunda anlamlı bir azalma gösterdi (p < 0.05). Ancak, EA grubundaki ifade seviyeleri N grubununkinden daha yüksek kalmıştır; bu da müdahalenin Aβ birikimini etkili bir şekilde azalttığını ancak mevcut plakları tamamen temizlemediğini göstermektedir (Şekil 5B).

figure-results-1
Şekil 1: Farelerde GV20 (Baihui), GV26 (Shuigou) ve GV29 (Yintang) aküznotlarının konumlarını gösteren şematik diyagram. Bu figür, Sun ve ark.5'in izniyle yeniden kullanılmıştır. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: Mikro-pozitron emisyon tomografisi (Micro-PET). IRIS PET/CT (Inviscan), fareler ve sıçanlar için yüksek hassasiyete (%>9) ve 1 mm uzamsal çözünürlüğe sahip, 96 mm eksenel görüş alanına sahip preklinik görüntüleme sistemidir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: Elektroakupunkturun bilişsel fonksiyon üzerindeki etkisi. (A) MWM cihazı. (B) Fareler Morris su labirenti (MWM) cihazı kullanılarak test edildi. (C) Gizli platform testi sırasında kaçış gecikmesindeki eğilimler. N grubuna kıyasla ◆◆p < 0.05; Alzheimer hastalığı (AD) grubuna kıyasla ▲▲p < 0,05. (D) Birinci çeyrekteki yüzme süresinin oranı. N grubuna kıyasla ◆◆p < 0.05; AD grubuna kıyasla ▲▲p < 0,05. (E) Platform çeyreğindeki platform geçiş sayısı. N grubuna kıyasla ◆◆p < 0.05; AD grubuna kıyasla ▲▲p < 0.05. Bu figür, Sun ve ark.5'in izniyle yeniden kullanılmıştır. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-4
Şekil 4: Elektroakupunkturun Aβ biriktirmesi üzerindeki etkileri. (A) Fare hipokampusunda ilgi alanı yeşil renkte gösterilmiştir. (B) Her gruptan farelerde Aβ'nin mikro-pozitron emisyon tomografisi görüntüleri. (C) Her grubun hipokampusunda [18F]AV-45 standartlaştırılmış alım değer oranlarının (SUVR; hedef bölge/beyincik) karşılaştırılması, mikro-PET ile nicelendirilmiştir. N grubuna kıyasla ◆◆p < 0.05; Alzheimer hastalığı (AD) grubuna kıyasla ▲▲p < 0.05. Bu figür, Sun ve ark.5'in izniyle yeniden kullanılmıştır. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-5
Şekil 5: Elektroakupunkturun Aβ protein ekspresyonu üzerindeki etkileri. (A) Aβ (4 kDa) ve GAPDH (146 kDa) ifade seviyelerini yük kontrolü olarak gösteren temsil Western blot bantları. Bantlar, AD modeline kıyasla N grubunda düşük Aβ ifadesini, AD grubunda yüksek ekspresyonu ve EA grubunda azaltılmış ifadeyi gösterir. (B) Deneysel gruplar arasında Aβ'nin GAPDH'ye olan göreli ifadesinin nicel analizi. N grubuna kıyasla ◆◆p < 0.05; Alzheimer hastalığı (AD) grubuna kıyasla ▲▲p < 0.05. Bu figür, Sun ve ark.5'in izniyle yeniden kullanılmıştır. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Hipokampustaki bir birikmeyi görselleştirmek ve niceliklendirmek, AD9'un patolojik ilerleyişine kritik bir pencere sağlar. Birden fazla nörogörüntüleme modalitesi mevcut olmasına rağmen, yüksek çözünürlüklü, nicel ve türler arası translasyona ulaşmak önemli bir engel olmaya devam etmektedir. Örneğin, yakın kızılötesi floresan görüntüleme genellikle mekânsal çözünürlükle sınırlanır ve MR — yapısal değişiklikleri haritalayabilen — amiloid plaklarını in vivo belirlemek için genellikle aşırı yüksek kontrast ajan dozları gerektirir. Buna karşılık, PET optimal bir translasyon aracıdır ve hem hayvan modellerinde hem de klinik popülasyonlarda nöroinflamasyon, glukoz metabolizması ve A birikiminin dinamik değerlendirilmesine olanaktanır 10,11. PET ile moleküler görüntüleme, sadece erken tanı ve hassas patolojik aşamalamayı kolaylaştırmakla kalmaz. ancak aynı zamanda gelişmekte olan AD tedavilerinin hedefe katılımı ve etkinliğini izlemek için de vazgeçilmezdir12. Mikro-PET teknolojisinin preklinik alanda ortaya çıkışı, PET'in faydasını klinik ortamlar ve insan dışı primat araştırmalarının ötesine önemli ölçüde genişletmiştir. Küçük görüş alanlarına özel olarak üstün mekansal çözünürlük ve yüksek hassasiyetle karakterize edilen mikro-PET, araştırmacıların kemirgen modellerinde nörodejeneratif ilerlemeyi boylamasınatakip etmesini sağlar 13,14. Önemli olarak, sağlam A patolojisi olmayan referans bölgelere göre SUVR ile hesaplanan yerleşik nicel metrikler, örneğin beyincik, banktan15. yatak başı noktasına sorunsuz şekilde aktarılabilir. Tarihsel olarak, belirli izleyiciler kullanılarak yapılan PET görüntüleme, AD16,17 için yüksek tanısal hassasiyet (%90'a kadar) ve spesifiklik (%89) göstermiştir. [11C]PIB izleyicisi erken amiloid görselleştirmesini devrimleştirirken, kısa yarı ömrü yaygın yayılmasınıkısıtladı 18. Sonraki geliştirme ve 2012 FDA onayı [18F]AV-45 (Florbetapir) bu sınırlamalarıazalttı 19, Aβ için mükemmel bağlanma afinitesi ve seçicilik ile birlikte daha uzun yarı ömür sağladı. Sonuç olarak, [18F]AV-45 hem klinik tanı hem de preklinik değerlendirmeler için temel bir temel halinegelmiştir 20.

Bu protokol kullanılırken birkaç kritik adım ve olası değişiklikler göz önünde bulundurulmalıdır. Birincisi, radyosentez parametrelerinin titiz kontrolü gereklidir; öncül miktar veya reaksiyon sıcaklığındaki herhangi bir sapma, [18F]AV-45'in radyokimyasal saflığını ve verimini ciddi şekilde tehlikeye atabilir. İkinci olarak, PET görüntüleme sırasında hassas stereotaksik hizalama, kısmi hacim etkilerinden kaçınmak için kritik öneme sahiptir; bu etkiler farelerin küçük hipokampal bölgelerinde SUVR hesaplamalarını yapay olarak saptırabilir. PET görüntülerdeki düşük sinyal-gürültü oranlarını çözmek için, araştırmacılar enjekte edilen izleyicinin spesifik aktivitesini doğrulamalı ve izofloran anestezi derinliğinin sabit kalmasını sağlamalıdır; çünkü solunum hareketi görüntüleri bulanıklaştırabilir.

Bu metodolojinin bazı sınırlamaları vardır. [18F]AV-45 mikro-PET, bölgesel Aβ yükünün makroskobik bir görünümünü sağlarken, mekânsal çözünürlüğü tek mikroskobik amiloid plakların görselleştirilmesine izin vermez. Ayrıca, bu çalışmada uygulanan 15 günlük elektroakupunktur müdahalesi, tedavi edilmemiş AD farelerine kıyasla Aβ yükünde önemli bir azalma göstermiştir; ancak yerleşik Aβ plaklarının tamamen temizlenmesi genellikle aylarca süren sürekli müdahale gerektirdiği göz önüne alındığında, mevcut paradigma öncelikle çözünür Aβ dinamiklerinin erken modülasyonunu veya ilerleyici birikimin durmasını yansıtır; tam yapısal plak boşalması yerine. Ayrıca, aynı denek içinde müdahaleden önce ve sonra PET taramaları elde etmek, gelecekteki deneysel tasarımlarda benimsenmesi gereken daha güçlü uzunlamasına bir kontrol sağlar.

Özetle, bu çalışmanın sonuçları, elektroakupunktur (EA) müdahalesinin APP/PS1 farelerinde Aβ birikimini önemli ölçüde azalttığını ve mekansal bilişsel fonksiyonu koruduğunu göstermektedir. Bu iyileşmenin mekanik temeli, Governor Vessel (Du Mai) akupunkturnoktaları 21'in uyarılmasının nöro-modülatör etkileriyle ilgili olabilir; bu etkiler, anatomik olarak cephalic kan akışını ve klirens yollarını destekleyen fasyaal ve nörovasküler ağlarla bağlantılıdır. Sağlam ve ölçülebilir moleküler görüntüleme kanıtları sunarak bu protokol, geleneksel terapötik yöntemlerin gelişmiş nörogörüntüleme ile entegrasyonunun önemini vurgular. Bu metodolojik çerçeve, AD ile mücadelede akupunkturun terapötik yollarının daha derinlemesine araştırılmasının yolunu açar.

Açıklamalar

Tüm yazarlar potansiyel çıkar çatışması olmadığını belirtmiştir.

Teşekkürler

Bu araştırma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (No. 82004482, 82274654, 82274644), Pekin Doğa Bilimleri Vakfı (No. 7252219) ve PLA Genel Hastanesi'nin Altıncı Tıp Merkezi İnovasyon Yetiştirme Fonu (No. CXPY202405). Bu çalışmada kullanılan grafik araçları sağladığı için Biorender (biorender.com)'a teşekkür ederiz.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
[18F]AV-45Pekin Normal Üniversitesi Radyofarmasîkotik Laboratuvarı— —Sektörde en yaygın kullanılan iz makinesi
0.22 μ m PVDF membranıBeyotimeFFP71Verimli film transferi
%15 SDS-PAGE JelBeyotimeP0066Küçük molekül proteinlerinin göçünü engellemek.
5& kez; SDS yükleme tamponuBeyotimeP0015Net çizgiler ve doğru ayrım sağla.
6 aylık erkek APP/PS1 fareleriCavenberg (Suzhou) Labotator Hayvan Araştırmaları Şirketi, Ltd.SCXK (Su) 2018-0002Alzheimer hastalığı araştırmalarında yaygın olarak kullanılır.
 
6 aylık erkek C57BL/6 fareCavenberg (Suzhou) Labotator Hayvan Araştırmaları Şirketi, Ltd.SCXK (Su) 2018-0002Normal kontrol grubu için
Aβ Antikorproteintech25524-1-APA ve beta tespit edilmek; monomer
Tek kullanımlık steril akupunktur iğneleriZhongYan TaiHe Tıbbi Enstrümanlar Şirketi, LtdZYTH2013030504Yaygın akupunktur aletleri
ECL altlığıTermo Balıkçı (Pierce)  32106 (500 mL)Hedef proteinlerin tespiti
Elektroakupunktur (EA) cihazıPekin Huawei Sanayi Kalkınma Şirketi, Ltd.HANSLH202Çin'de yaygın kullanılan elektroakupunktur ekipmanları
GAPDHproteintech23567-1-CBKlasik referans protein (1:5000)
HRP ile konjuge ikincil antikorThermo Fisher Scientific (Invitrogen)31430 (2mL) / C31430100 (100μ L)Hedef proteinlerin tespiti (1:2000)
ImageJ yazılımıNIH  Sürüm 1.53aŞerit gri tonlama değerlerinin analizi
İzofluranKentaur30135687 (250ml)Farelerin güvenli ve hızlı anestezisi
PET-CTİRIS PET/CT görüntüleme sistemiIRISYüksek PET hassasiyeti ve mükemmel nicel performans
Fosfataz inhibitörü kokteyliBeyotimeP0055BProteinlerin fosforilasyon durumunu korumak
PMOD yazılımıPMOD Teknolojileri  Sürüm 4.5 Kullanılan  PET görüntü verilerinin işlenmesi ve analizi
Önceden boyalı protein moleküler ağırlık belirtecisiTermo Balıkçı (Pierce)26619 (2& kez; 250µ L) Elektroforez ve membran transferinin izlenmesi 
Proteaz inhibitörü kokteyliBeyotimeP1046Endojen proteaz aktivitesinin geniş spektrumlu inhibisyonu
RIPA liz tamponuBeyotimeP0013CProtein fosforilasyonu modifikasyonunu sürdürmek
Morris Water Maze cihazında kullanılan yağsız süt tozuYili6907992637815Suyu opak yapın ve su altı platformlarını saklayın
Morris su labirent sistemiChengdu Taimeng Yazılım Şirketi, Ltd.WMT-100SÇin'de yaygın olarak kullanılan su labirenti ekipmanları

Kaynaklar

  1. Chiotis, K., Wang, Y., La Joie, R., Rabinovici, G. D. The role of amyloid-β and tau PET in the new era of Alzheimer disease therapies. J Nucl Med. 67 (2), 175-185 (2026).
  2. Zhao, Q., et al. Unraveling Alzheimer's complexity with a distinct Aβ42 fibril type and specific AV-45 binding. Nat Chem Biol. 22 (3), 482-490 (2025).
  3. Machado, L. S., et al. Association between FDG- and TSPO-PET signals across human and animal studies investigating neurodegenerative conditions: a systematic review. Mol Psychiatry. 31 (1), 559-575 (2025).
  4. Yin, H., Lu, Z., Deng, Y., Tian, X., Gong, Q. Decoding blood-brain barrier dysfunction in Alzheimer's disease: innovations and challenges in multimodal MRI and PET imaging biomarkers. Ageing Res Rev. 114, 102952(2025).
  5. Sun, R. -Q., et al. Improvement of electroacupuncture on APP/PS1 transgenic mice in behavioral probably due to reducing deposition of Aβ in hippocampus. Anat Rec (Hoboken). 304 (11), 2521-2530 (2021).
  6. Lakatos, I., et al. AI-driven framework for enhanced and automated behavioral analysis in Morris water maze studies. Sensors (Basel). 25 (5), 1564(2025).
  7. Zha, Z., Ploessl, K., Choi, S. R., Alexoff, D., Kung, H. F. Preclinical evaluation of [18F]D3FSP, deuterated AV-45, for imaging of β-amyloid in the brain. Nucl Med Biol. 92, 97-106 (2020).
  8. Wong, D. F., et al. In vivo imaging of amyloid deposition in Alzheimer disease using the radioligand 18F-AV-45 (florbetapir [corrected] F 18). J Nucl Med. 51 (6), 913-920 (2010).
  9. Almeida, Z. L., Vaz, D. C., Brito, R. M. M. Morphological and molecular profiling of amyloid-β species in Alzheimer's pathogenesis. Mol Neurobiol. 62 (4), 4391-4419 (2024).
  10. Naganuma, F., et al. A novel near-infrared fluorescence probe THK-565 enables in vivo detection of amyloid deposits in Alzheimer's disease mouse model. Mol Imaging Biol. 25 (6), 1115-1124 (2023).
  11. Kim, E., et al. In vivo multi-parametric manganese-enhanced MRI for detecting amyloid plaques in rodent models of Alzheimer's disease. Sci Rep. 11 (1), 12419(2021).
  12. van Dyck, C. H., et al. Lecanemab in early Alzheimer's disease. N Engl J Med. 388 (1), 9-21 (2022).
  13. Masdeu, J. C., Pascual, B., Fujita, M. Imaging neuroinflammation in neurodegenerative disorders. J Nucl Med. 63 (Suppl 1), 45S-52S (2022).
  14. Zhan, Y., et al. Hybrid PET/MRI imaging of Alzheimer's disease based on 18F-AV-1451. J Vis Exp. (218), e67574(2025).
  15. Lopresti, B. J., et al. Simplified quantification of Pittsburgh compound B amyloid imaging PET studies: a comparative analysis. J Nucl Med. 46 (12), 1959-1972 (2005).
  16. Herschman, H. R. Micro-PET imaging and small animal models of disease. Curr Opin Immunol. 15 (4), 378-384 (2003).
  17. Patwardhan, M. B., McCrory, D. C., Matchar, D. B., Samsa, G. P., Rutschmann, O. T. Alzheimer disease: operating characteristics of PET–a meta-analysis. Radiology. 231 (1), 73-80 (2004).
  18. Mintun, M. A., et al. [11C]PIB in a nondemented population: potential antecedent marker of Alzheimer disease. Neurology. 67 (3), 446-452 (2006).
  19. Romano, M., Buratti, E. Florbetapir F 18 for brain imaging of β-amyloid plaques. Drugs Today (Barc). 49 (3), 181-193 (2013).
  20. Choi, S. R., et al. Preclinical properties of 18F-AV-45: a PET agent for Abeta plaques in the brain. J Nucl Med. 50 (11), 1887-1894 (2009).
  21. Wang, G. -J., Ayati, M. H., Zhang, W. -B. Meridian studies in China: a systematic review. J Acupunct Meridian Stud. 3 (1), 1-9 (2010).

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

Mikro-PET GörüntülemeAmiloid Beta BirikimiElektroakupunkturMorris Su LabirentiWestern BlotKognitif DisfonksiyonMoleküler Görüntüleme
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.