Yumurtalık Mikro Ortamını İnceltmek: Fare Yumurtalık Somatik Hücrelerinin İzolasyon, 2D Kültür ve Organoid Kültürü Yöntemleri

Özet

Fare yumurtalık somatik hücrelerinin stroma ile zenginleştirilmiş bir yumurtalık fraksiyonundan izole edilmesi ve iskelesiz bir yaklaşımla fare yumurtalık somatik organoidleri üretme yöntemlerini açıklıyoruz.

Özet

Yumurtalık, hem folikül hem de çevresindeki stroma içinde heterojen somatik hücre popülasyonlarından oluşur; bu hücreler yumurtalık fonksiyonunu desteklemek ve yüksek kaliteli gametlerin oluşumu için kritik öneme sahiptir. Fare yumurtalıklarından endotelyal, epitelyal, steroidojenik, stromal ve bağışıklık hücreleri dahil olmak üzere somatik hücrelerin izole edilmesi için yöntemler rapor ediyoruz. Bu birincil yumurtalık somatik hücreleri geleneksel 2B kültür sisteminde kaplama ve kültüre geçirildiğinde, yumurtalıkta tipik olarak bulunan hücre heterojenliği, organizasyonu ile hücre-hücre ve hücre-matris etkileşimleri kaybolur. Bu nedenle, iskelesiz bir yaklaşımla fare yumurtalıklı somatik organoidlerin nasıl üretileceğini de açıklıyoruz. Bu organoidler kendi kendine oluşur, çeşitli hücre popülasyonlarını korur ve sitokinler dahil olmak üzere hücre dışı matriks ve salgılanan faktörler üretir. Organoidler ortak kültür deneylerinde kullanılabilir ve yüksek canlılıkla en az 3 hafta kültürde tutulabilir. Genel olarak, bu modeller yumurtalık fizyolojisi ve patolojisinin somatik hücre perspektifinden sorgulanmasını mümkün kılar.

Giriş

Oosit, yani dişi gamet, bir sonraki neslin oluşumu için hayati öneme sahip olsa da, yumurtalıktaki somatik hücre popülasyonları gamet gelişiminde, steroid hormon üretiminde ve yumurtalık homeostazında kritik roller oynar. Somatik granüloza ve teka hücreleriyle çevrili oositler, yumurtalığın foliküller olarak bilinen fonksiyonel birimlerini oluşturur. Granuloza hücreleri, transonal projeksiyonlarla oosite fiziksel olarak bağlıdır ve oosite metabolik ve besin desteği sağlar, ayrıca meyotik^{durma 1,2'yi} düzenler. Ayrıca, gonadotropinlere yanıt olarak, granuloza ve teka hücreleri, üreme sisteminin ötesinde etkiler yapan, kardiyovasküler, kas-iskelet ve sinir sistemlerini etkileyen ve böylece genel kadın sağlığını etkileyen östrojen, progesteron ve androjenler gibi steroid hormonlar^üretir. Yumurtalık folikülleri, damar yapısı, bağışıklık hücreleri, birkaç interstisiyal fibroblast ve mezenkimal hücre popülasyonları ile yüksek derecede düzenli bir ekstrasellüler matriks (ECM)4 içeren heterogen bir yumurtalık stromasında gelişir^. Bu stromal mikro ortam, folikül büyümesi, yumurtlama ve luteinizasyonu etkileyen fiziksel ve kimyasal ipuçları^{sağlar 4}.

Gametleri ve folikülleri in vitro izole etmek ve kültürlemek için çeşitli yöntemler mevcuttur ve bu yöntemler oogenez ve follikülogenez konusundaki anlayışımızı^{ilerletmiştir 5}. Ancak, yumurtalığın somatik bölmesi, kısmen sağlam in vitro modellerin eksikliğinden dolayı nispeten az incelenmiştir. Yumurtalık somatik bölmesinin mevcut modelleri büyük ölçüde fibroblastlar, yumurtalık yüzeyi epitel, endotelyal, bağışıklık veya granüloza^hücreleri 6,7,8,9,10,11 gibi tek hücre tipiyle sınırlıdır. Geniş tanımlanmış birincil yumurtalık somatik hücrelerinin 2B kültürü, zamanla makrofaj popülasyonlarını destekler ve bu da hücresel heterojenliğin kaybına yol^{açar 12}. Ayrıca, geleneksel iki boyutlu (2D) tek katmanlı kültür, yumurtalıkta bulunan çeşitli hücre-hücre ve hücre-matris etkileşimlerine izin vermez. Yumurtalık dokusu eksplantları, doğal dokunun hücresel ve yapısal karmaşıklığını korur ancak bileşim olarak yumurtalığın nereden türetildiğine göre^{değişir 13,14}.

Organoidler, organların üç boyutlu, çok hücreli, küçültülmüş versiyonlarıdır ve in vivo organizasyonu ve işlevlerini yeniden düzenlerler^15,16. Organoidler, kök hücrelerden veya normal veya hastalıklı dokudan izole edilen birincil hücrelerden^{üretilebilir 15}. Kadın üreme sistemi bağlamında, endometrium, fallop tüpü, rahim ağzı ve plasenta¹⁷ modellemek için organoid üretilmiştir. Ancak, yumurtalıkla ilgili olarak, yakın zamana kadar organoid modeller yumurtalık yüzeyi epitelyal veya kanser hücreleri gibi tek bir hücre tipiyle sınırlıydı veya yumurtalık stroması yerine folikül yapılarına benzeyen indüklenmiş pluripotent kök^{hücrelerden üretilmişti 17,18}. Son çalışmalar, fare, rezus makak ve insan yumurtalık dokusundan izole edilen heterojen somatik hücre popülasyonları kullanılarak organoid üretilmiş ve karakterize^etmiştir 19,20,21. Bu organoid modeller, yumurtalık yaşlanmasının altında yatan hücresel mekanizmaların ve ftalat maruziyetinin ECM bileşimi üzerindeki etkilerinin^{incelenmesini mümkün kılmıştır 19,21}.

Hem folikülde hem de stromada somatik hücrelerin yumurtalık fonksiyonu için kritik önemi göz önüne alındığında, fare yumurtalıklarının stroma ile zenginleştirilmiş bir fraksiyonundan somatik hücrelerin izole edilmesi ve geleneksel tek katmanlı kültür veya organoid modelde in vitro kültür yöntemlerini açıklıyoruz. İskelesiz agaroz mikrokalıpları kullanılarak, yumurtalık somatik hücreleri 1–3 gün içinde organoidler oluşturur. Organoidler, fibroblastlar, makrofajlar ve steroidojenik hücreler dahil olmak üzere temel yumurtalık hücre popülasyonlarını korur ve yüksek canlılıkla 3 haftaya kadar kültürlenebilir. Yumurtalık somatik organoidler, transkriptomik ve histolojik değerlendirmeler, koşullu ortamların analizi, diğer hücre tipleriyle birlikte kültür ve bileşik tarama yöntemleri için uygundur. Genel olarak, bu organoidler in vitro sorgulama ve yumurtalık somatik bölmesinin modülasyonu için sağlam bir modeldir ve yumurtalık gelişimi, yaşlanma, fizyoloji ve patolojinin incelenmesine uygulanabilir.

Protokol

Bu protokolün geliştirilmesinde hayvanların kullanımı, Northwestern Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi ile Ulusal Sağlık Enstitüleri'nin Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzları (Northwestern Üniversitesi Hayvan Refahı Güvence Numarası: A3283-01; IACUC Protokol Kimliği: IS00013082_IM12). Tüm malzemelerin üretici bilgileri ve katalog numaraları, agaroz mikro kalıplar, ortamlar ve takviyeler için silikon dökümler dahil Malzemeler Tablosu'nda verilmiştir. Protokol adımlarının genel bir özeti Şekil 1'de sunulmaktadır. Tüm protokol adımları, uygun kişisel koruyucu ekipmanlarla, tüm kurumsal biyogüvenlik ve çevre sağlığı ve güvenliği düzenlemelerine uygun şekilde ve aksi belirtilmedikçe, Sınıf II biyogüvenlik kabini içinde yapılmalıdır.

Şekil 1: Fare yumurtalık somatik hücre izolasyonu, yumurtalık somatik organoid üretimi ve sonraki uygulamalar şeması. Fare yumurtalıkları izole edilir ve stromal fraksiyon zenginlenir. Zenginleştirilmiş stromal fraksiyon enzimatik ve mekanik olarak sindirilir. Sindirilmemiş doku zorlanıyor. Hücreler 2D olarak pelletlenir, yıkanır, sayılır ve kültür için plakalanır. Organoid üretimi için, gece boyunca 2B kültür sonrası, hücreler tripsin kullanılarak toplanır, pelet edilir, yıkanır ve sayılır. Hücreler, organoid kültürü için agaroz mikro kalıplara tohumlanıyor. Organoidler histoloji, RNA/protein ekstraksiyonu, koşullu ortam analizi, tedaviler ve ilaç taraması ile birlikte kültür için kullanılabilir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

1. Yumurtalık somatik hücre izolasyonu ve kültürü için ortam hazırlama

NOT: Yumurtalık dokusunun sindirimi ve ardından birincil somatik hücrelerin izolasyonu ve kültürü için dört tür ortam gereklidir: Diseksiyon ortamı (DM; fare yumurtalıklarının diseksiyonu ve delintisi için Adım 2.3–2.4'te kullanılır), enzimatik ortam (EM; stroma ile zenginleştirilmiş fare yumurtalıklarının enzimatik sindirimi için 2.5–2.8. adımlarda kullanılır), söndürme ortamı (QM; enzimatik sindirimi yavaşlatmak için Adım 2.9'da kullanılır), ve kaplama ortamı (PM; Aşama 2.11–2.14 ve Adım 4.6'da birincil yumurtalık somatik hücrelerin yıkanması, kaplaması ve 2D kültürü ile 2D kültürden hücrelerin alınırken tripsinin inaktivasyonu için kullanılmıştır). Tüm ortamlar sterilize edilmiş, Sınıf II biyolojik güvenlik kabininde veya laminar akış başlıkta hazırlanmalıdır. Aşağıda listelenen medya tarifleri, 5–6 farede yumurtalıkların işlenmesi için yeterlidir, ancak gerektiğinde ölçeklendirilmelidir. Tüm ortamlar bir hafta önceden hazırlanabilir ve 4 °C'de saklanabilir, ancak EM için enzimler hücre izolasyonu gününde taze eklenmelidir.

1. Leibovitz'in L-15 ortamında %1 fetal sığır serumu (FBS) ve %0,5 penisillin-streptomisin (PS) içeren DM (15 mL) hazırla. Ortamı steril bir filtre ile sterilize edin.
   NOT: DM, çevre hava değişimi için tamponlanır ve çevre dokulardan yumurtalığın mikrodiseksiyonu sırasında ve stromal fraksiyon için zenginleştirme sırasında kullanılır.
2. %1 FBS ve %0,5 PS içeren EM (10 mL) αMEM ile hazırlanın. 82 enzimatik birim/mL Kolajenaz IV ve 0,2 mg/mL DNaz I (≥400 enzimatik aktivite birimi/mg) ekleyin. Enzimleri ters çevirerek çözün ve ardından ortamı steril bir filtre ile sterilize edin.
   NOT: Enzimatik ortam, %5_CO2 oranında hava değişimi için sodyum bikarbonat tamponlu olup, yumurtalık dokusu parçalarının enzimatik sindirimi için kullanılır.
3. αMEM ortamında %10 FBS ve %0,5 PS içeren QM (20 mL) hazırlayın. Ortamı steril bir filtre ile sterilize edin.
   NOT: QM, %5_CO2 ile hava değişimi için sodyum bikarbonat tamponlu ve enzimatik sindirimin soğutulması için kullanılır.
4. PM (30 mL) hazırla, %10 FBS ve %1 PS içeren RPMI 1640 (25 mM HEPES ve 2 mM L-Glutamin içerir). Ortamı steril bir filtre ile sterilize edin.
   NOT: PM, %5_CO2 oranında hava değişimi için sodyum bikarbonat tamponlu olup, birincil yumurtalık somatik hücrelerinin kaplaması ve 2D kültür için kullanılır.

2. Yumurtalık dokusunun sindirimi ve primer somatik hücrelerin izolyasyonu

NOT: Fare yumurtalıkları hem enzimatik hem de mekanik olarak izole edilip sindirilir ve primer somatik hücreler izole edilir. 5–6 farenin yumurtalıkları aynı tabakta birlikte işlenebilir. Aşağıdaki adımlar aseptik teknikle, tercihen laminar akış başlıkta bir disseksiyon mikroskobu kullanılarak gerçekleştirilmelidir.

1. Ayrı 100 mm Petri kaplarına 10 mL EM, 20 mL QM ve 20 mL PM ekleyin. Kullanımdan önce en az 1 saat boyunca bakları doku kültürü kuluçka makinesinde (nemlendirilmiş ortam, 37 °C ve %5_CO2) dengeleyin.
2. Kullanmadan önce DM'yi su banyosunda (37 °C) ısıtın.
3. Fare yumurtalıklarını 3 mL DM içeren 35 mm Petri kabına ayırın. Yumurtalıkları, bağlı yağ dokusundan, yumurtalıktan ve yumurtalık bursasından ince uçlu forseps ve/veya mikromakasla ayırın (Şekil 2A, i,ii). Mikrodiseksiyon için gerektiğinde bir disseksiyon mikroskobu kullanın.
4. Diseksiyon edilen yumurtalıkları 2–3 mL DM içeren 45 mm saat camına aktarın. Bir diseksiya mikroskobu altında, 28-G insülin iğneleriyle sırasıyla nondominant ve dominant ellerle yaklaşık 10 dakika boyunca yumurtalıkların tüm bölgelerini sabitleyip delin. Tüm bölgelerin bozulduğundan emin olmak için yumurtalık dokusunu sık sık döndürün.
   NOT: Yumurtalıkların delinmesi, antral foliküllerden preantral foliküller, kümülüs-oosit kompleksleri ve granüloza hücreleri serbest bırakarak stromal fraksiyonu zenginleştirir (Şekil 2Aiii–iv).
5. Stroma ile zenginleştirilmiş fare yumurtalıklarını dengelenmiş EM ile Petri kabına taşımak için ince uçlu forseps kullanın (Şekil 2Bi).
6. Ortamdaki sıcaklık ve pH değişikliklerini en aza indirmek için hızlıca çalışarak, stroma ile zenginleştirilmiş yumurtalıkları ince uçlu forsepslerle yaklaşık 2–3 mm boyutunda parçalara ayırın (Şekil 2Bii).
7. Petri kabını açı ile tutun ve yumurtalık dokusu parçalarını içeren EM pipetini p1000 pipeti ile 1 mL, 100 veya 3 dakika boyunca (hangisi önce gelirse× tekrar tekrar pipet yapın (Şekil 2Biii). Tüm doku parçalarının pipetlendiğinden emin olmak için Petri kabını gerektiğinde karıştırın.
   NOT: Eğer doku p1000 ucu ile pipet yapılamayacak kadar büyükse, ucu steril bir bistürpelle kesilerek açıklığı daha geniş hale getirebilir. Açık, doku parçalarının çoğunun (%>%50) içine girmesine izin verecek kadar geniş olmalı, ancak hepsinin değil, bu da kesme etkisi yaratmalıdır.
8. EM ve yumurtalık dokusu parçalarını içeren Petri kabını doku kültürü kuluçka makinesine (nemlendirilmiş ortamda, %5_CO2 ile 37 °C) aktarın ve toplamda 30 dakika kuluçka yapın, kabı çıkarıp 15 dakika sonra tekrar (100× veya 3 dakika) pipet yapın, ardından 30 dakikalık kuluçka sonunda tekrar devam edin (Şekil 2Biii).
   NOT: İlk 15 dakikalık kuluçkadan sonra, doku parçaları o kadar sindirilmelidir ki >%80 p1000 pipet ucuna sığabilir, açılışı genişletmek için ucu kesmeye gerek kalmaz. Sindirimin toplam süresi ve gerekli pipetleme miktarı, yırtılmış doku parçalarının başlangıç boyutuna bağlıdır. Ayrıca, farenin yaşı ve zorluğu, enzimlerin aktivitesindeki lot-lot değişkenliği ve pipet boru boyutu, doku parçalanma hızını etkileyebilir. Sindirim, yumurtalık dokusu parçaları yaklaşık 1 mm büyüklüğünde, göze görünen parçalara bölündüğünde sindirilmelidir (Şekil 2Biv). Aşırı sindirim hücre kaybına ve hücre canlılığının azalmasına yol açabilir.
9. Enzimleri incelterek doku sindirimini yavaşlatmak için 20 mL önceden dengelenmiş QM ekleyin (Şekil 2Ci).
10. Hücre süspansiyonu, sindirilmemiş doku parçalarını çıkarmak için 50 mL'lik konik bir tüpün üzerine yerleştirilen 40 μm hücre süzgecinden geçirin (Şekil 2Cii). Filtreyi oda sıcaklığında 300 × g boyunca 5 dakika boyunca santrifüjle ederek hücreleri pelet edin (Şekil 2Ciii).
11. Hücreleri aspirasyonla süpernatantı çıkararak, hücre peletini 1 mL önceden dengelenmiş PM'de yeniden süspansiyona yerleştirerek, hücre süspansiyonunu 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktararak ve oda sıcaklığında 300 × g'de 5 dakika santrifüj ederek hücreleri tekrar peletle (Şekil 2Civ).
12. Süpernatantı çıkarın, hücre pelletini 1 mL PM'ye yeniden süzülür, 10 μL aliquot hücre alikotunu trypan mavisiyle boyanarak hücre canlılığını değerlendirirsiniz ve hücreleri hemositometre ile sayabilirsiniz.
    NOT: Bu izolasyon protokolünde fare sürünü ve yaşa bağlı olarak birincil yumurtalık somatik hücrelerinin beklenen sayısı için Tablo 1'e bakınız. Bu aşamada hücre yaşamı %>80 olmalıdır.
13. Hücreleri, doku kültürü ile işlenmiş bir damarda yaklaşık 1,25 × 10 5-1,5 × 10 ⁵/^cm2 yoğunlukta plaka yapın (örneğin, yaklaşık 3 × 10⁶ hücre sayıları için, plaka hücreleri doku kültürü ile işlenmiş 60 mm bir çembere ve yaklaşık 1 × 10⁶ hücre sayıları için hücreleri doku kültüründe işlenmiş 6 kuyruklu bir plakanın bir kuyusuna yerleştirin).
    1. Tabak veya kabın toplam hacmine bağlı olarak ek PM ekleyin (örneğin, 60 mm çanak kullanıyorsanız ek 4 mL PM veya 6 kuyruklu bir tabak kuyusu kullanıyorsanız ek 2 mL PM ekleyin).
       NOT: Yukarıda listelenen kaplama yoğunluğu, hücrelerin gece boyunca 2B kültür sonrası organoid üretimi için kullanılacaksa önerilir. Daha uzun bir 2B kültür için, hücreler daha düşük yoğunlukta kaplama yapılabilir. Dengelenmemiş ekstra kaplama ortamı, 4 °C'de 1 haftaya kadar saklanabilir. PM, hem organoid üretimi hem de yumurtalık somatik hücrelerinin 2D kültürde korunması için gereklidir. Protokolün bu noktasında, yumurtalık somatik hücreleri 2D tek katmanlı kültürde tutulabilir (adım 2.14) veya organoid üretmek için kullanılabilir (Bölüm 3'e geçin). Organoid üretiminden önce gece boyunca 2D kültür, 40 μm hücre süzgecisinden geçmiş olabilecek erken evre foliküllerden oositlerin çıkarılması için gereklidir.
14. Gece boyunca (en az 16 saat) kaplamadan sonra hücreleri fosfatla tamponlanmış tuzlu (PBS; Mg/Ca-içeri, pH 7.0–7.3) için ölü hücreleri ve kalıntıları (Şekil 3A) çıkardı. Yıkamadan sonra taze PM ekleyin ve kültür boyunca her iki günde bir taze PM ile değiştirin (Şekil 3B).
    NOT: İzolasyon sonrası yüksek hücre canlılığına rağmen, hücre ölümü veya doku kültürü damarına bağlanamaması nedeniyle gece boyunca plaka yapıldıktan sonra toplam hücre sayısında büyük bir kayboluş genellikle gözlemlenir (Şekil 3A).

Şekil 2: Fare yumurtalık somatik hücre izolasyonunun şeması. (A) (i,ii) fare yumurtalık diseksiyon ve (iii,iv) stroma zenginleştirmesinin temsilci görüntüleri. Fare yumurtalığı, A, i'de kesik çizgiyle çizilmiştir. (B) Mekanik ve enzimatik sindirim boyunca yumurtalık dokusu parçalarının temsil eden görüntüleri. Stroma ile zenginleştirilmiş yumurtalıklar (i) yırtılmadan önce ve (ii) sonra, (iii) pipetleme sırasında yumurtalık dokusu parçaları ve (iv) sindirimden sonra yumurtalık dokusu parçaları. (C) (i) sindirimi söndürme, (ii) hücre süspansiyonunu filtreleme ve (iii,iv) fare yumurtalık somatik hücrelerinin peletlenmesi gibi temsil eden görüntüler. Cii ve Ciii'deki insetler, sırasıyla santrifüjleme sonrası hücre süzücüsü ve hücre pelleti tarafından yakalanan sindirilmemiş doku parçalarını gösterir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Birincil yumurtalık somatik hücreleri 2D olarak kültürlenebilir. (A) Plaka yapıldıktan 16 saat sonra, PBS ile yıkamadan önce ve sonra 60 mm'lik bir kapta kaplanmış birincil yumurtalık somatik hücrelerin temsil eden ışık iletimi. (B) Kültürde 3 gün boyunca 24 kuyruklu bir plakada plakalanmış birincil yumurtalık somatik hücrelerin temsil eden ışık iletimi. Ölçek çubukları = 400 μm. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

3. Organoid üretimi ve kültürü için agaroz mikro kalıpları ve ortamlarının hazırlanması

NOT: Yumurtalık somatik organoidleri, iskelesiz agaroz mikrokalıplarda yumurtalık organoid ortamıyla üretilir ve kültürlenir. Agararoz mikrokalıpları ve yumurtalık organoid ortamları, sterilize edilmiş, Sınıf II biyolojik güvenlik kabininde veya laminar akış başlıkta aseptik teknikle hazırlanmalıdır.

1. Agararoz mikro kalıplarının hazırlanması
   1. Mikrokalıplar ve Graefe forsepsleri için silikon kalıpları sterilizasyon torbasına yerleştirin ve kuru bir döngüyle otoklav yapın (Kılıf basıncı: 20 psi, Bölme sıcaklığı: 250 °F (121,11 °C, Sterilizasyon süresi: 15 dakika).
      NOT: Birkaç silikon döküm otoklavlanabilir ve aynı anda daha hızlı agaroz mikrokalıp üretimi için kullanılabilir.
   2. Agararoz mikrokalıplarının depolanması için 24 delikli doku kültürü plakasının her kuyusuna %1 PS içeren 1 mL PBS ekleyin.
   3. PBS'de %1,5 (w/v) steril agarozu mikrodalgada, sıcak su banyosunda veya sıcak plakada ısıtarak çözebilirsiniz.
      NOT: Agararoz, su ile doldurulmuş 100 mL'lik bir beakerde yerleştirilen 50 mL'lik konik bir tüpte mikrodalgada çözünerek çözülür (Şekil 4Ai). Kontrollü kaynatmaya izin vermenin yanı sıra, beakerde oluşturulan sıcak su banyosu, agarozun yeniden katılaşmasını yavaşlatır.
   4. Sıvı agarozun yaklaşık 50 °C'ye kadar soğumasına izin verin, tüp rahatça ele alınana kadar.
   5. Silikon döküme %1,5 agaroz içeren 300–350 μL pipetle yavaşça saplayın, dökümü aşırı veya yetersiz doldurmamaya dikkat edin ve baloncuklar oluşmamaya dikkat edin (Şekil 4Aii). Agararozun dökümün üstünde, içbükey veya konveks kenar yerine düz bir tabaka oluşturduğundan emin olun (Şekil 4Aiii,iv). Agaroz katılaşmaya başlamadan önce steril bir p10 pipet ucu kullanarak kabarcıkları patlatın (Şekil 4Bi–iii).
   6. Agarozun silikon dökümde oda sıcaklığında 2–3 dakika katılaşmasına izin verin (Şekil 4Biv).
   7. Katı olduğunda, silikon dökümü PBS + %1 PS içeren 24 kuyruklu doku kültür plakasının bir kuyusu üzerine ters çevirin. Silisonu dikkatlice bükerek agaroz mikro kalıpı plakaya bırakın (Şekil 4Ci).
      NOT: PBS +%1 PS içinde batırılmış agaroz mikrokalıpları, parafilm ile sarılmış 24 kuyu doku kültür plakasında 4 °C'de kullanılmadan 1 ay öncesine kadar saklanabilir (Şekil 4Cii). Agaroz mikrokalıpları kullanımdan en az 16 saat önce hazırlanmalıdır, çünkü mikro kuyular genellikle döküm ve batırmadan hemen sonra hava kabarcıkları içerir ve PBS + %1 PS içinde batırılır (Şekil 4Ciii). Ancak, bu hava kabarcıkları depolama sırasında dağılır (Şekil 4Civ). Organoid kültür için kullanılmadan önce, agaroz mikro kuyu ekleri mikroskop altında dikkatlice incelenerek döküm sırasında mikro kuyrukların birleşmediği veya bozulmadığı doğrulanmalıdır (Şekil 4Di–iv). Organoid üretimi ve kültürü için kusurlu mikro kalıplar önerilmez. Fazla agaroz mikroküfünün %%25'ini açıklayacak şekilde hazırlanması önerilir
2. Yumurtalık organoid ortamının hazırlanması
   1. Bir biyogüvenlik kabinde, üreticinin talimatlarına göre bazal ortama organoid büyüme ortamı (Mouse) takviyeleri 1 ve 2 ve %1 PS ekleyin. Hazırlanmış yumurtalık organoid ortamı kullanımdan önce en fazla 2 hafta boyunca 4 °C'de saklayın.
      NOT: Takviyeler 1 ve 2 aliquote ile -20 °C'de saklanabilir.

Şekil 4: Agararoz mikro kalıplarının hazırlanmasını gösteren şema. (A) (i) %1,5 agaroz hazırlığı, (ii) silikon dökümlere pipetleme, (iii) doğru şekilde doldurulmuş ve (iv) aşırı doldurulmuş silikon dökümlerin temsil eden görüntüleri. Aiii ve Aiv'deki kesik çizgiler, sırasıyla agarose mikrokalıplarının düz ve konveks tabanlarını gösterir. (B) (i,ii) agarozda kabarcıklı dolgulu silikon dökümlerin temsil eden görüntüleri, (iii) agaroz katılaşışından önce pipet ucu ile kabarcıkların patlatılması ve (iv) silikon döküm içinde katı bir agaroz mikro kalıbının temsil eden görüntüleri. (C) (i) silikonlu dökümlerden katı agararoz mikrokalıplarının çıkarılması, (ii) agaroz mikrokalıplarının PBS + %1 PS içeren 24 kuyu plakasında saklanması, (iii) dökümden hemen sonra mikro kuyruklarda bulunan baloncuklar ve (iv) 16 saat depolamadan sonra kabarcıksız, düzgün dökülmüş agaroz mikrokalıbının temsil eden görüntüleri. (D) (i,ii) birleşik kuyulara, (iii) bozulmuş kuyular veya (iv) hasara sahip mikro kalıpların temsil eden görüntüleri. Kısaltmalar: PBS = fosfatla tamponlanmış tuzlu send; PS = penisillin-streptomisin. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

4. Organoidlerin üretimi ve kültürü

NOT: Gece boyunca 2D kültür yapıldıktan sonra, birincil yumurtalık somatik hücreleri 2B kültürden alınır ve organoidler oluşturmak için agaroz mikro kalıplarına tohumlanarak tohumlanmaktadır. Aşağıdaki adımlar, sterilize edilmiş, Sınıf II biyolojik güvenlik kabininde aseptik teknikle gerçekleştirilmelidir.

1. PM ve organoid ortamı su banyosunda 37 °C'ye ısıtın ve %0,05 Tripsini oda sıcaklığına getirin.
2. Graefe forsepsleri kullanarak, mikrokalıpları dikkatlice yeni bir 24 delikli plakanın yuvalarına aktarın (Şekil 5Ai).
3. 24 kuyuyla plakanın her bir kuyusuna 500 μL yumurtalık organoid ortam ekleyin, içinde agaroz mikro kalıp bulunur (Şekil 5Aii). Mikro kalıpların ortamda tamamen batırıldığından emin olun ve mikrokalıpları ile ortamları en az 30 dakika boyunca bir kuluçka içinde (nemli ortam, %5_CO2 ile 37 °C sıcaklık) dengede tutun.
4. PM'yi yapışkan yumurtalık somatik hücrelerinden aspirasyon yoluyla çıkarır ve hücreleri Mg/Ca-sız PBS ile yıkayın.
5. 2D kültürden hücreleri toplamak için %0,05 Tripsin (6 kuyu tabak veya 60 mm tabak için 1–2 mL tripsin) ekleyin. Hücreleri tripsin ile 37 °C'de bir kuluçkada 2–3 dakika boyunca kuluçka içinde.
6. Hücrelerin mikroskop altında ayrıldığını doğrulayın ve kullanılan her bir tripsin hacmi için iki hacim ısıtılmış PM ekleyerek tripsini inaktive edin.
7. Hücre süspansiyonunu 15 mL'lik konik bir tüpe aktarın ve hücreleri oda sıcaklığında 300 × g boyunca 5 dakika boyunca santrifüjle geçirerek pellet yapın.
8. Hücreleri 1 mL ısıtılmış PM'de yeniden süsküylen, hücre canlılığını değerlendirmek için bir aliquot hücre mavisiyle boyanacak ve hücreleri hemositometre ile sayın.
   NOT: Fare suşuna ve yaşa bağlı olarak, gece boyunca 2B kültür ve ardından tripsizasyon sonrası beklenen birincil ovari somatik hücre sayısı için Tablo 1'e bakınız. Tripsize hücrelerin canlılığı genellikle %90'dan fazladır.
9. Hücreleri santrifüjle (oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 × g) pellet ile paketleyin ve hücre pelletini yumurtalık organoid ortamında 1 mL ortamda 3,33 × 10⁶ canlı hücre yoğunluğuna kadar süsle edin, yani 75 μL ortamda 2,5 × 10,5^canlı hücre.
   NOT: Burada, agaroz mikro küfü için 2,5 ×^{10,5 hücre} tohumlanmıştır. Bu nedenle, üretilebilecek toplam mikro kalıp sayısı toplam hücre sayısına bağlıdır. Organoidler, agaroz mikroküfü başına 2,5 × 10-5 hücreden daha az üretilebilir, ancak organoid boyutu, agregasyon kinetikleri, göreceli hücre bileşimi ve hormon üretimi dahil fonksiyonları etkilenebilir.
10. Dengelenmiş agaroz mikrokalıplarını kuluçka makinesinden çıkarın, mikro kalıpların hücre tohumlama odasının yukarıya bakacak şekilde konumlandırıldığından emin olun ve yumurtalık organoid ortamını hücre tohumlama odalarından çıkarın (Şekil 5Aiii).
    1. Mikrokalıpların hücre tohumlama odalarından medya, Graefe forsepsleri kullanılarak mikrokalıpları kaldırıp eğildirerek veya pipetleme yoluyla çıkarılır. Hücre tohumlama odalarından maddeyi pipetle çıkarmak için, pipet ucunu hücre tohumlama odasının köşesinin üzerinde nazikçe havaya getirin. Mikro kuyrukların bozulmasını önlemek için agaroz mikro küfle doğrudan temas kurmayın.
       NOT: Hücre tohumlama odaları mümkün olduğunca kuru olmalı, böylece mikro kuyular göze görünebilir, ancak mikro kalıpların dışı yine de yumurtalık organoid ortamlarla çevrili olmalıdır (Şekil 5Aiii).
11. Hücre süspansiyonundan 75 μL (yani 2,5 ×^10-5 hücre) doğrudan her agaroz mikrokalıbının hücre tohumlama odasına dağıtın ve baloncukların oluşmasını önlemek için (Şekil 5Bi). 24 kuyu tabağı kuluçka makinesine geri gönderin.
12. Hücre tohumlanmasından bir ila iki saat sonra, agaroz mikrokalıplarının dış kısmına ek olarak 250 μL ısıtılmış yumurtalık organoid ortam ekleyin, hücre tohumlama odalarını rahatsız etmemeye dikkat edin (Şekil 5Bii).
    NOT: Birincil yumurtalık somatik hücreleri, agaroz mikroküflerinde tohumlamadan 1–24 saat içinde toplanmaya başlamalıdır (Şekil 5Biii).
13. Agaroz mikrokalıplarının çevresindeki ortamı, hücre tohumlanmasından sonraki gün ve ardından kültür boyunca her iki günde bir 750 μL taze yumurtalık organoid ortam ile değiştirin.
    1. Malzemeyi değiştirmek için, agarose mikrokalıplarının çevresindeki harcanmış ortamı çıkarmak için plakayı hafif bir açıyla tutun. Hücre tohumlama odalarından ortam çıkarmayın. Hücre tohumlama odalarını rahatsız etmemek için taze malzemeyi kuyu duvarına doğru nazikçe pipetleyin.
       NOT: Medya değişikliklerinden elde edilen koşullu ortamlar, organoid salgılanan faktörlerin analizi için -80 °C'de saklanabilir ve saklanabilir. Organoidler oluştuğunda (hücre tohumlanmasından 1–3 gün sonra), ortam rekombinant proteinler, inhibitörler vb. içeren medyalarla değiştirilebilir; böylece çeşitli tedavilerin organoid fonksiyonu üzerindeki etkileri incelenebilir veya bileşik taraması yapılabilir.

Şekil 5: Yumurtalık somatik organoid oluşumunun şeması. (A) (i) agaroz mikrokalıplarının Graefe forsepsiyle kültür plakasına aktarılması, (ii) yumurtalık organoid ortamında agaroz mikrokalıplarının dengelenmesi ve (iii) hücre tohumlama odalarından medyanın çıkarılmasının temsil eden görüntüleri. Aiii'deki ok, boş hücre tohumlama odasını gösterir. (B) (i,ii) hücrelerin agaroz mikro kalıplara tohumlanmasının ve (iii) yumurtalık somatik hücrelerin agregasyonlu mikro kalıbının ileten ışık taramasının temsil eden görüntüleri. Ölçek çubuğu (Biii): 2500 μm. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

5. Organoidlerin sonraki uygulamalar için kullanımı

NOT: Organoidler, histoloji, moleküler biyoloji uygulamaları (örneğin, RNA/protein analizleri), koşullu ortam analizi ve ortak kültür gibi çeşitli sonraki uygulamalarda kullanılabilir.

1. Histoloji
   NOT: Organoidler, agaroz mikroküflerinden çıkarılmadan histolojik son noktalar için işlenebilir. Aslında, agaroz mikrokalıplarındaki organoidler doku mikrodizilerine benzer şekilde hareket eder ve böylece aynı anda birkaç, tutarlı aralıklı organoidlerin yüksek verimli histolojik değerlendirmesine olanak tanır.
   1. %1,5 (w/v) steril agarozu PBS'de kaynatarak çözebilirsiniz.
   2. Yumurtalık somatik organoidlerin kültürünü takip ederek, plakayı açı olarak tutun ve agaroz mikrokalıplarının çevresindeki ortamı çıkarın.
   3. Bir disekseksiya mikroskobu altında, her hücre tohumlama odasının köşesinde pipet ucunu nazikçe havaya getirerek hücre tohumlama odalarından ortamı çıkarın; organoidleri rahatsız etmeden veya mikroküfü bozmadan ortamı dikkatlice çekin.
   4. Organoid odalarını rahatsız etmemeye özen göstererek yaklaşık 50 °C soğutma sıcaklığında yaklaşık 50 °C'ye soğutmuş 100–125 μL sıvı 1,5% agaroz dikkatlice pipet yapın (Şekil 6Ai).
   5. Agarozun oda sıcaklığında 2–3 dakika katılaşmasına izin verin.
   6. Her kuyuya 750 μL Modified Davidson veya %4 paraformaldehit ekleyin ve organoidleri gece boyunca 4 °C'de kapalı agaroz mikrokalıpları içinde sabitleyin.
   7. Fiksasyondan sonra fiksanti çıkarın ve agaroz mikrokalıplarını %70 etanol ile yıkayın.
      NOT: Mikroküfler, doku işlemeye (dehidrasyon, temizlenme ve mum sızması) kadar %70 etanol içinde 4 °C'de depolanabilir. Doku işleme sırasında, agaroz mikro kalıplarının yönelimini takip edin.
   8. Doku işlemesinden sonra, agaroz mikrokalıpları parafine gömülür; mikrokalıplar parafin bloklarının içinde düz olur ve mikrokalıpların alt kısımları ilk kesitlenir (Şekil 6Aii).
   9. Parafin bloklarını 5 μm aralığında kesin ve doku kesitlerini yüklü mikroskop slaytlarına yerleştirin.
      NOT: Mikro kuyrukların varlığı, hem doku kesitlerinde hem de parafin bloklarında kesitleme sırasında göz tarafından görselleştirilebilir (Şekil 6Aiii,iv). Mikroküf kesitlerinde organoidlerin varlığı, mikroskop altında kesitlenmiş slaytların incelenmesiyle doğrulanabilir (Şekil 6Av). Aynı slayta 2–3 ardışık bölüm koymak yerine, her biri 50 μm aralıkta olan 2–3 bölümü (yani her 10^bölümden bir) tek bir slayta yerleştirmek, çoğu organoidin her slaytta en az bir bölümde temsil edilme olasılığını artırır. Organoidler doku kesitleri içinde tutarlı aralıklarla yerleştirilir, bu da histolojik boyama sonrası görüntülemenin kolaylığını artırır (Şekil 6Avi).
   10. Sürgüleri gece boyunca 37 °C sıcaklıkta fırında kurumasına izin verin.
   11. Histolojik veya immünohistokimyasal boyama veya slaytları oda sıcaklığında saklayacak şekilde^{devam edin 19}.
2. Moleküler uygulamalar için organoidlerin hasadı
   NOT: Kültür sonrası, organoidler agaroz mikrokalıplarından çıkarılabilir ve gen veya protein ifadesini değerlendirmek için RNA veya protein ekstraksiyonu dahil olmak üzere çeşitli sonraki moleküler biyoloji uygulamaları için işlenebilir.
   1. Agaroz mikrokalıplarını içeren plakayı hafif bir açıyla tutun ve agaroz mikrokalıplarının çevresindeki ortamı pipetle çıkarın.
   2. Agararoz mikrokalıplarını içeren kuyruklara 750 μL oda sıcaklığında PBS ekleyin.
   3. Graefe forsepslerini kullanarak agaroz mikrokalıplarını ters çevirip karıştırarak organoidleri çevredeki PBS'ye salabilirsiniz. Agaroz mikro kalıplarından organoidlerin mikroskop altında salındığını doğrulayın.
   4. Graefe forsepsiyle boş agaroz mikrokalıplarını çıkarın ve organoitleri içeren PBS'yi pipetle mikrosantrifüj tüplerine aktarın.
   5. Organoidleri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 10.000 × g boyunca santrifüjle geçirerek pellet yapın.
   6. Süpernatantı aspirasyon yoluyla çıkarın ve RNA veya protein ekstraksiyonuna geçin. Alternatif olarak, hücre pelletini fırlatıp -80 °C¹⁹ sıcaklıkta saklayabilirsiniz.
3. Analiz için organoid koşullu ortamın saklanması
   NOT: Organoidlerden elde edilen koşullu ortamlar, kültür boyunca hormonlar, sitokinler ve büyüme faktörleri dahil organoid salgılanan faktörlerin analizi için saklanabilir. Organoid koşullu ortamda sitokinlerin analizinden elde edilen temsil edici sonuçlar Şekil 7A'da gösterilmiştir.
   1. Agararoz mikrokalıplarını içeren plakayı hafif bir açıyla tutun ve mikrokalıpların çevresindeki koşullandırılmış ortamı pipetle çıkarın. Organoidleri rahatsız etmemek için hücre tohumlama odalarından ortam çıkarmayın.
   2. Koşullandırılmış ortamı mikrosantrifüj tüplerine aktarın ve ortam analizine veya flaş-dondurmaya devam ederek -80 °C^19,22 sıcaklıkta saklanın.
      NOT: Isteğe bağlı, koşullu ortamı 10.000 × g ile 5 dakika boyunca santrifüjle ederek ölü hücreleri veya kalıntıları pellet edin. Süpernatantı medya analizi veya depolamadan önce yeni mikrosantrifüj tüplerine aktarın.
4. Organoid ortak kültür
   NOT: Yumurtalık somatik organoidler, diğer hücreler ve dokularla çeşitli yöntemlerle birlikte kültürlenebilir. Organoid yumurtalık kanser hücreleri ve folikülleriyle yapılan organoid ortak kültüründen, sırasıyla 5.4.1 ve 5.4.3'te açıklanan yöntemlerle temsil edilen sonuçlar şu şekilde gösterilmiştir Şekil 7B,C.
   1. Birincil fare yumurtalık somatik hücreleri ve diğer hücre tiplerinin kombinasyonunu kullanarak organoidler üretmek ve doğrudan hücre-hücre etkileşimlerinin etkilerini incelemek için 5.4.1.1–5.4.1.4 adımlarını takip edin.
      1. 4.1–4.9. adımları takip ederek 2D kültür yaptıktan sonra birincil yumurtalık somatik hücreleri gece boyunca yıkayarak, 2D kültürden hücreleri %0,05 Tripsin kullanarak toplayın, pellet yapın, sayın ve hücreleri yumurtalık organoid ortamında 75 μL ortamda 2,5 ×^10-5 canlı hücre yoğunluğunda yeniden süspansiyona yerleştirin.
      2. İlgilenen diğer hücre tipi yapışkınsa, hücreleri 2B kültürden alın. Hücreleri say, santrifüjle pellet edin ve 75 μL ortam başına 2,5 ×^10-5 canlı hücre yoğunluğunda yumurtalık organoid ortamında yeniden süzülün.
      3. Birincil yumurtalık somatik hücrelerinin süspansiyonu, ilgi duyulan diğer hücre tipinin askıya alınmasıyla bilinen bir oranda birleştirin.
      4. 4.10–4.13 adımlarını takip ederek ortaya çıkan hücre süspansiyonunu agaroz mikrokalıplarına ve kültür organoidlerine tohumlantırın.
   2. Oluşmuş organoidleri içeren agaroz mikrokalıplarını, diğer hücreler veya organoidler içeren 24 delikli plakalara aktarmak için 5.4.2.1–5.4.2.4 numaralı adımları takip edin.
      NOT: Organoidlerden kaynaklanan salgılanan faktörlerin diğer hücre tipleri üzerindeki etkilerini değerlendirmek için ve tam tersi, oluşturulmuş organoidler agaroz mikro kalıplarında kalabilir ve tüm agaroz mikrokalıpları diğer hücreler veya organoidleri içeren 24 delikli bir plakaya aktarılabilir. Bu eş kültür yöntemleri, yumurtalık organoid ortamlarının hem hücre/doku tiplerini kültürlemek için kullanılabileceğinde kullanılabilir.
      1. Su banyosunda yumurtalık organoid ortamını 37 °C'ye kadar ısıtın.
      2. Agaroz mikrokalıplarını içeren plakayı açı olarak tutun ve agaroz mikrokalıplarının çevresindeki ortamı pipetle çıkarın.
      3. Graefe forsepsleri kullanarak, mikrokalıpları dikkatlice diğer hücreler veya organoidler içeren 24 delikli plakalara aktarın.
      4. Agararoz mikrokalıplarını çevrelemek için 750 μL taze yumurtalık organoid ortamı ekleyin.
   3. Agarose mikro kalıplarından oluşan organoidleri çıkarıp yeni agaroz mikro kalıplarına aktarmak için 5.4.3.1–5.4.3.13 numaralı adımları takip edin.
      NOT: Eğer yumurtalık organoid ortamı ortak kültür deneyleri için istenen ortam değilse, 5.4.2'de açıklanan paradigma, agaroz mikroküflerinin yumurtalık organoid ortamlarla doygun olması nedeniyle önemli ortam taşıma zorluğunu teşkilatmaktadır. Oluşmuş organoidler (hücre tohumlanmasından 1-3 gün sonra) agarose mikrokalıplarından taşınıp yeni agaroz mikrokalıplarına aktarılıp ek kültür veya ortak kültür için aktarılabilir; böylece ortamın taşınmasını önlemek sağlanır.
      1. Birlikte kültür için istenen ortamı su banyosunda 37 °C'ye ısıtın.
         NOT: DMEM, αMEM ve F12 bazlı ortamlar, yumurtalık somatik organoidlerle birlikte kültür deneylerinde başarıyla kullanılmıştır.
      2. Graefe forsepsleri kullanarak, PBS +%1 PS'den yeni agaroz mikrokalıplarını dikkatlice diğer hücreler veya organoidlerin bulunduğu 24 kuyruklu bir plakanın kuyularına aktararak birlikte kültür için.
      3. Mikro kalıpların ortamda tamamen daldırıldığından emin olun, gerekirse birlikte kültür için istenen ek ortamları ekleyin ve mikro kalıpları ile ortamı en az 30 dakika boyunca bir kuluçka içinde (nemli ortamda, %5_CO2 ile 37 °C sıcaklıkta) dengeleyin.
      4. Agaroz mikrokalıplarını içeren plakayı hafif bir açıyla tutun ve agaroz mikrokalıplarının çevresindeki ortamı pipetleme yöntemiyle çıkarın.
      5. Agarose mikroküflerinin etrafında oluşturulmuş organoidlerle birlikte kültür için istenen ortamı ekleyin.
      6. Graefe forsepslerini kullanarak agarose mikrokalıplarını ters çevirip karıştırarak organoidleri çevredeki ortama salabilirsiniz. Agarose mikrokalıplarından organoid salınımını mikroskop altında doğrulayın.
         NOT: Birincil yumurtalık somatik hücreler yeterince birleşmemişse, organoidler agaroz mikroküflerinden çıkarıldıklarında sağlam kalmayabilir. Organoid montajı, yumurtalık somatik hücrelerinin izole edildiği farelerin suşuna ve yaşına bağlı olarak 1–3 gün sürebilir.
      7. Graefe forsepsiyle boş agaroz mikrokalıplarını çıkarın ve organoidleri içeren ortamı pipetle mikrosantrifüj tüplerine aktarın.
      8. Organoidleri oda sıcaklığında 300 × g boyunca 5 dakika boyunca santrifüjleyin.
      9. Bir disseksiya mikroskobu altında, süpernatantı pipetle çıkarın; böylece organoidleri içeren 50–75 μL ortam kalın.
      10. Dengelenmiş mikro kalıpları kuluçka makinesinden çıkarın ve mikro kalıpların hücre tohumlama odasının yukarıya bakacak şekilde konumlandırıldığından emin olun.
      11. Hücre tohumlama odalarından medyayı Graefe pensleri veya pipetleme ile çıkarın.
          NOT: Kuyular 500 μL'den fazla ortam içermemelidir, böylece mikro kalıpların hücre tohumlama odaları boşaldılabilir.
      12. Organoidleri pipetleme yoluyla doğrudan her yeni agaroz mikrokalıbının hücre tohumlama odasına aktarın. 24 kuyu tabağı kuluçka makinesine geri gönderin.
      13. 1–2 saat sonra, agaroz mikrokalıplarının dış kısmına istenen 250 μL ek ortam ekleyin, hücre tohumlama odalarını rahatsız etmemeye dikkat edin.

Şekil 6: Temel yumurtalık hücre tipleri yumurtalık somatik organoidlerde korunmuştur. (A) (i) kültürün sonunda agaroz ile mikro kalıbın mühürlenmesi, (ii) kesilmemiş bir mikro kalıp ve (iii) parafin bloğuna gömülü kesitlenmiş mikro kalıbın temsil eden görüntüleri. Mikro kuyular (iv) monte edilmiş bölümlerde görselleştirilebilir ve organoidlerin kesitlenmiş mikro kalıplarda varlığı, (vi) histolojik boyamadan önce mikroskop altında doğrulanabilir. (B) Vimentin, F4/80, Foxl2 ve 3β-HSD'ye karşı antikorlar kullanılarak immünohistokimyasal boyama sonrası fare yumurtalık dokusu kesitleri ve yumurtalık somatik organoid kesitlerinin temsil görüntüleri. Ölçek çubukları = 20 μm. Kısaltmalar: H&E = hematoksilin ve eozin. Bu figür, Dipali ve ^ark.19'un izniyle uyarlanmıştır. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 7: Yumurtalık somatik organoidlerin foliküller ve yumurtalık kanser hücreleriyle birlikte kültürü. (A) Organoid sitokin salgısı, kültürün 5. gününde agaroz mikroküfü başına ölçüldü ve organoid içermeyen agaroz mikroküflerinden alınan koşullu ortama normalleştirildi. N = 4 agaroz mikro kalıp. (B) Kültürün 0, 4 ve 8. günlerinde (kontrol) organoidlerle veya olmadan yumurtalık foliküllerinin temsil eden ışık iletim görüntüleri ve (i) ortak kültür paradigmasının bir şeması. Ölçek çizgileri = 400 μm. (ii) foliküllerin hayatta kalma ve (iii) 8 gün boyunca (kontrol) organoidlerle veya olmadan kültür büyümesinin nicelendirilmesi. Veriler ortalama SD ± olarak gösterilir. Bazı hata çubukları görselleştirilemez durumda. N = grup başına 56 folikül. **P < 0.01. (C) Kültürün 1., 3. ve 5. günlerinde organoidlerde kırmızı floresan protein etiketli yumurtalık kanser hücreleri (OVCAR8-RFP) ile 10:1 oranında kültürlenen birincil yumurtalık somatik hücrelerinin temsil eden iletim ışık (üst) ve floresan (alt) görüntüleri. Ölçek çizgileri = 400 μm. Kısaltma: RFP = kırmızı floresan protein. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

6. Sorun giderme ipuçları

1. Sorun 1: İzole birincil yumurtalık somatik hücrelerinin sayısı beklenenden daha azdır.
   NOT: Enzimatik sindirim sonrası yumurtalık dokusu parçaları sürekli olarak 1 mm'den küçükse veya gözle görülemiyorsa, aşırı sindirim nedeniyle canlılık azaldığı için izole hücre sayısı düşük olabilir. Enzimatik sindirimden sonra yumurtalık dokusu parçaları 1 mm'den büyükse, yumurtalık dokusunun yetersiz sindirimi nedeniyle izole hücre sayısı düşük olabilir.
   1. Enzimatik sindirimden sonra yumurtalık dokusu parçaları 1 mm'den büyükse, 6.1.1.1–6.1.1.2. adımları takip edin.
      1. Kollagenaz IV ve DNase I'in önerilen raf ömrü içinde olduğunu ve yanlış depolama veya DNase I durumunda tekrar eden donma-çözülme döngüleri nedeniyle enzimatik aktivite kaybetmediğini doğrulayın.
      2. Yumurtalık dokusunun tekrar pipetleme miktarını artırmak, p1000 ucu açılışı genişletmek için kesilmişse delik boyutunu azaltmak ve/veya elektromanyetik kuluçka süresini artırmak için artırın.
   2. Enzimatik sindirimden sonra yumurtalık dokusu parçaları sürekli olarak 1 mm'den çok daha küçükse, yumurtalık dokusunun tekrar pipetlenmesi miktarını azaltın, p1000 ucunun delik boyutunu kesme yoluyla artırarak açılışı genişletin ve/veya EM içindeki toplam kuluçka miktarını azaltın.
2. Sorun 2: Döküm agaroz mikro kalıpların ~%25'inden fazlasında kusur bulunur
   1. Silikon alçak kumaşın herhangi bir agaroz ve kalıntıdan arınmış olduğundan emin olun. Gerekirse, silikon kalıpları PBS'de yıkayın ve otoklavla tekrar sterilize edin. Gerekirse, dökümde kullanılan %1 agarozu yeniden ısıtın; çünkü katılaşan agaroz silikon dökümü eşit şekilde doldurmayabilir ve/veya kabarcıklara yol açabilir.
   2. Silikon kalıp içine pipetlendikten sonra, agarozun tamamen katılaşmasına izin verin; çünkü agaroz mikro küfün dökümden erken çıkarılması mikro kuyrukların bozulmasına neden olabilir.
   3. Silikon kalıpların az doldurulmadığını doğrulayın, çünkü bu, agaroz mikro küfünün yapısal bütünlüğünü azaltabilir ve silikon, agaroz mikro küfü çıkarmak için büküldüğünde hasara yol açabilir.
   4. Ayrıca, silikon döküm üreticisi, bunların en fazla 12 kez otoklav yapılmasını önerir. Silikon alçak aşırı sterilizasyon geçirdiyse, değiştirin.
3. Sorun 3: Mikro kuyrukların %10'undan fazlasında organoid oluşamaz
   1. Agarose mikrokalıpları dökerken silikon kalıpların aşırı doldurulmadığını doğrulayın; çünkü bu, hücrelerin mikro kuyruklara düzensiz dağılmasına yol açabilir ve agarose mikro kalıbındaki merkezi mikrokuyular dış mikrokuyular yerine tercih edilir.
   2. Hücre süspansiyonunu agarose mikrokalıplarının hücre tohumlama odasına dağıtırken baloncuklar oluşturmaktan kaçının; çünkü kabarcıklar hücrelerin mikro kuyruklara dağılımını bozabilir.
   3. Gerekirse, her mikrokalıp için 75 μL'den fazla hücre süspansiyonu (1 mL'de 3,33 × 10⁶ canlı hücre) ile başlayın, böylece pipet ucundaki yetersiz hacim nedeniyle baloncuklar oluşmamalıdır.
   4. Hücrelerin mikro kalıblara yerleşmesi için hücrelerin mikro kalıbın dışına yumurtalık organoid ortamı eklenmesi arasındaki aralığı artırın.

Sonuçlar

Yumurtalık somatik organoidlerin hücresel bileşimini belirlemek için, ana yumurtalık hücre tiplerine karşı antikorlar kullanılarak 6 gün kültür sonrası organoid doku kesitlerinin immünohistokimyasını yaptık. Organoidler vimentin pozitif fibroblastlar, F4/80 pozitif makrofajlar ve steroidojenik hücre popülasyonları içeriyordu (Şekil 6B)¹⁹. Granuloza ve granulosa-lutein hücrelerini işaretlemek için Foxl2'ye karşı bir antikor, ayrıca 3β-...

Tartışma

Bu makale, yumurtalığın stroma ile zenginleştirilmiş bir fraksiyonundan birincil fare yumurtalık somatik hücrelerini izole etme yöntemlerini açıklar; bu yöntem yumurtalık somatik bölmenin heterojenliğini koruyacak şekilde korunur. Birincil fare yumurtalık somatik hücreleri, 2D bir monokatmanda kültürlenebilir veya iskelesiz agaroz mikrokalıpları kullanılarak yumurtalık somatik organoidler üretmek için kullanılabilir. Agaroz mikrokalıpları, organoid oluşumu için 96 mikro kuyu içerir ve 24...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
0.2 μm, Polyethersulfone syringe filter	Corning	431229
1.5 mL microcentrifuge tubes	MIDSCI	PR-MCT15
100 mL glass beaker	Fisherbrand	FB100100
100 mm Petri dishes	Corning	351029
15 mL conical tubes	ThermoFisher Scientific	339651
24-well plates (TC-treated)	Corning	353047
28-gauge insulin needles	Exel International	26027
35 mm Petri dishes	Corning	351008
3β-HSD antibody	Cosmo Bio	K0607	1:1000
4% Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	1574100
40 µm cell strainer	Corning	431750
45 mm watch glass	Electron Microscopy Sciences	7054345
50 mL concial tubes	ThermoFisher Scientific	339652
60 mL sterile syringe	Air-Tite	ML60
60 mm TC-treated plates	Corning	353037
6-well plates (TC-treated)	Corning	353046
Agarose	Hoefer	GR140-500	Gel strength >1200 g/cm2; Gel Temperature 36 °C
Autoclave sterilization pouch	Fisherbrand	01-812-55
Biotinylated Goat Anti-Mouse IgG	Vector Laboratories	BA-9200-1.5	1:200
Biotinylated Goat Anti-Rabbit IgG	Vector Laboratories	PK-6101	1:200
Biotinylated Goat Anti-Rat IgG	Vector Laboratories	BA-9400-1.5	1:100
Bluing reagent	Fisherbrand	23-245681
Centrifuge with swing bucket rotor for 50 mL conical tubes	ThermoFisher Scientific	Sorvall X1R Pro-MD
Class II biosafety cabinet	The Baker Company	SG403A
Cleaved Caspase-3 (CC3) antibody	Cell Signaling Technology	9579T	1:250
CO2 incubator	ThermoFisher Scientific	Heracell VIOS 160i CO2 Incubator
Collagenase, Type IV, powder	Gibco, Fisher Scientific	17-104-019
C-Series Mouse Cytokine Antibody Array 3 Kit	RayBiotech	AAM-CYT-3-8
Cytoseal XYL	Epredia	83124
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas	Millipore Sigma	DN25-100MG	Dnase I
Dissecting microscissors	World Precision Instruments	WPI-14003
Dissecting scissors	World Precision Instruments	WPI-15922
Dissection microscope	Leica	MZ9.5, S9 series
DPBS, no calcium, no magnesium	Gibco, Fisher Scientific	14-190-250	pH 7.0–7.3
Eosin	Fisherbrand	23-314631
F4/80 antibody	Bio-Rad	MCA497G	1:50
Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, United States	Gibco, ThermoFisher Scientific	10082147
Fine-tipped dissecting forceps	World Precision Instruments	WPI-14098
FOXL2 antibody	Abcam	ab246511	1:200
Graefe Forceps	Fine Science Tools	1105010
Hematoxylin	EK Industries	EKI 47971GL
Hemocytometer	MedOne	DHCN015
Imaging System	ThermoFisher Scientific	EVOS FL Auto
IntestiCult Organoid Growth Medium (Mouse)	STEMCELL Technologies	06005	Basal medium, Supplements 1 and 2
Laminar flow hood	IVFtech	IVFtech sterile workstation
Leibovitz's L-15 Medium	Gibco, Fisher Scientific	11415114
Microscope slides	Mercedes Scientific	MER 7255/90/WH/CC
MicroTissues 3D Petri Dish micro-mold spheroids	Millipore Sigma	Z764043-6EA	Silicone casts for agarose micromolds
Modified Davidson's Fixative	Electron Microscopy Sciences	6413350
OVCAR8-RFP cells			Gift from Joanna Burdette PhD, University of Illinois Chicago
Penicillin-Streptomycin	Millipore Sigma	P4333-100ML
Picrosirius Red staining solution	StatLab	STPSRPT
RPMI 1640 Medium (ATCC modification)	Gibco, Fisher Scientific	A1049101
Tabletop centrifuge	Eppendorf	Centrifuge 5430 R
Trypan blue	ThermoFisher Scientific	T10282
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Gibco, ThermoFisher Scientific	25300054
Vimentin antibody	Cell Signaling Technology	5741S	1:100
αMEM, GlutaMAX Supplement, no nucleosides	Gibco, Fisher Scientific	32561102