DNA Hasar Onarım Verimlilik Değerlendirme Stratejilerinde Araştırma İlerlemesi

Xiao Liu; Yiwei Zhu; Ling Li; Siyu Hang; Sipei Wu; Song-Bai Liu

doi:10.3791/71031

Derleme makalesi

DNA Hasar Onarım Verimlilik Değerlendirme Stratejilerinde Araştırma İlerlemesi

DOI:

10.3791/71031

⸱

23 Haziran 2026

Xiao Liu^*¹^,² , Yiwei Zhu^*³ , Ling Li¹^,² , Siyu Hang¹ , Sipei Wu⁴ , Song-Bai Liu¹^,²

¹Jiangsu Province Engineering Research Center of Development and Translation of Key Technologies for Chronic Disease Prevention and Control, Suzhou Vocational Health College, ²School of Chemistry and Life Sciences, Suzhou University of Science and Technology, ³Department of Orthopedics, The First Affiliated Hospital of Soochow University, ⁴Department of Hematology, The First Affiliated Hospital of Soochow University

^* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

DNA hasar onarım verimlilik testleri genel olarak üç gruba ayrılabilir: hücre tabanlı fonksiyonel testler, in vitro biyokimyasal testler ve moleküler belirteç testleri. Bu yaklaşımlar, birden fazla DNA hasar onarım yolunda onarım verimliliğinin niteliksel veya nicel olarak değerlendirilmesini sağlar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücresel genomik DNA, çeşitli DNA hasarı türlerine neden olan endojen ve dışsal faktörlere sürekli maruz kalmaktadır. Memeli hücrelerinde, günlük DNA hasarı yükü hücre başına 10⁴–10⁵ lezyona ulaşabilir. S fazına kadar devam eden DNA hasarı mutasyonlara yol açabilir. Bu tür mutasyonlar onkogenlerde, tümör baskılayıcı genlerde veya hücre çoğalmasına karışan genlerde meydana geldiğinde, hücresel dönüşüm ve karsinogenezi teşvik edebilir. Bu nedenle, DNA hasar onarımı, genomik istikrarın korunmasında ve kanser gelişiminin önlenmesinde kritik bir rol oynar. DNA onarım kapasitesinin değerlendirilmesi, DNA onarım sistemlerinin fonksiyonel aktivitesinin ölçülmesiyle en iyi şekilde sağlanır. DNA hasar onarım yolları ve onarım verimlilikleri, kemoterapî ilaç geliştirme, gen fonksiyonu doğrulama ve kanser tedavisi için son derece önemlidir. Bu nedenle, bireysel DNA hasar onarım yollarının onarım verimliliğinin araştırılması teorik ve pratik öneme sahiptir. Bu derleme, başlıca DNA hasarı onarım yolları, onarım verimliliğini değerlendirmek için kullanılan yöntemler ve bu yaklaşımların avantajları ile sınırlamaları özetlemektedir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

DNA hasar onarım sistemi, mutasyon sıklığını azaltarak ve karsinogenezi bastırarak genomik stabiliteyi koruyan kritik bir hücresel savunma^{mekanizmasıdır 1}. Farklı DNA hasar türleri, ayrı ama birbirine bağlı onarım yolları^{aracılığıyla onarılır 2}. Örneğin, DNA çoğaltımı sırasında oluşan baz uyumsuzlukları uyumsuzluk onarımı (MMR) ile düzeltilirken, kimyasal olarak modifiye edilmiş bazlar, örneğin alkillenmiş bazlar, esas olarak baz eksizyon onarımı (BER)³ ile onarılır. Ultraviyole (UV) kaynaklı 6-4 fotoürün ve belirli kimyasal ajanlar tarafından üretilen hacimli nükleotid adduktları, nukleotid eksizyon onarımı (NER) ile çıkarılır. Zincirlerarası çapraz bağlantı (ICL) hasarı, Fanconi anemi yolu⁴ ile ilişkili proteinlerin koordineli aktiviteleri sayesinde onarılır. Tek iplikli kırılmalar (SSB'ler) tek iplikli kırılma onarım (SSBR) yolu ile onarılırken, çift iplikli kırılmalar (DSB'ler) öncelikle homolog olmayan uç birleştirme (NHEJ) veya homolog rekombinasyon (HR) yoluyla onarılır. Çoğu durumda, karmaşık DNA lezyonları, birden fazla DNA onarım yolu arasındaki koordineli etkileşimlerle^{çözülür 5}.

Hücrelerde DNA hasarı ve onarım verimliliğinin değerlendirilmesi genellikle Comet testi, immünoflüoresans (IF), Western blotting (WB), konak hücre reaktivasyonu (HCR) ve plazmid bazlı onarım testleri gibi deneysel yaklaşımların birleşimine dayanır. Bu yöntemler, DNA zinciri kopuklarını, DNA hasar belirteçlerini ve onarımla ilişkili proteinlerin ifadesini veya lokalizasyonunu tespit ederek DNA hasarını ve onarımını^{değerlendirir.} Ancak, hücresel onarım verimliliğinin doğru nicelenmesi genellikle dinamik zorluk temelli testler gerektirir. Bu yaklaşımlarda, spesifik DNA lezyonları deneysel olarak indüklenir ve hücreler sıralı zaman noktalarında örneklenerek hasar sinyallerinin oluşumu ve temizlenmesi izlenir. Zaman içinde kalıntı hasar seviyelerinin başlangıç hasar yüküne göre karşılaştırılması, onarım kinetiği ve yol işlevselliğinin nicel olarak değerlendirilmesini sağlar.

Şu anda mevcut olan DNA hasar onarım verimliliği testlerinin özelliklerini ve uygulamalarını sistematik olarak karşılaştırmak için, bu inceleme ana tespit yöntemlerini beş parametreye göre özetlemektedir: lezyon/substrat özgüllüğü, analitik çözünürlük, hassasiyet, nicel yetenek ve enstrümantasyon gereksinimleri (Tablo 1). Bu derleme, temel, translasyonel ve klinik araştırmalarda DNA hasar onarım yollarını araştırmak için uygun yaklaşımların seçilmesi için pratik bir metodolojik rehber sağlamayı amaçlamaktadır.

Tespit yöntemi	Lezyon/substrat özgüllüğü	Analitik çözüm	Duyarlılık/algılama eşiği	Nicel ve niteliksel çıktı	Enstrümantasyon gereksinimleri
Western Blot	CPD'ler, 6-4PP'ler, onarım proteinleri (örneğin, MGMT, RAD51)	Nüfus	Tılımlı	Yarı-nicel	Protein elektroforezi, zar transferi, kemilyünesans görüntüleme sistemi
İmmünoflüoresans	CPD'ler, DSB odakları (örneğin, γ-H2AX, RAD51)	Tek hücreli	Tılımlı	Yarı-nicel	Flüoresans mikroskobu
HPLC-MS/MS	CPD'ler, 6-4PP'ler, oksidatif ve alkilatif baz hasarı	Popülasyon/In vitro	Çok yüksek	Nicel	HPLC-MS/MS
MGMT enzim aktivite testi	O⁶-meG alkilasyon hasarı	Popülasyon/In vitro	Yüksek	Nicel	Microplate okuyucu
Kuyruklu yıldız testi	SSB'ler, DSB'ler, oksitlenmiş bazlar (FPG/OGG ön işlem ile)	Tek hücreli	Yüksek	Nicel	Floresans mikroskobu/elektroforez sistemi
İnsisiyon testi	AP bölgeleri, NER kesileri, BER kesileri	Popülasyon/In vitro	Yüksek	Nicel	Jel görüntüleme, radyo etiketleme/floresan tespiti
Yeniden kurulmuş onarım sistemi	Siteye özgü taban hasarı, AP siteleri, strand kopmaları	In vitro	Yüksek	Nicel	Jel elektroforezi, floresans/MS tespiti
Plazmid bazlı onarım testi	Sahaya özgü hasar	Nüfus	Tılımlı	Nicel	Mikroplaka okuyucu, akış sitometresi, koloni sayımı
Muhabir testi	Sahaya özgü hasar; BER, NER, HR, NHEJ, MMR	Nüfus	Yüksek	Nicel	Mikroplaka okuyucu, akış sitometresi, floresan mikroskobu
HCR/FM-HCR	UV hasarı, platin çapraz bağlantılar, siteye özgü hasar	Nüfus	Yüksek	Nicel	Akış sitometresi, floresans/kemilyümülümensans dedektörü
RADD	Geniş spektrumlu DNA hasarı	Tek hücreli	Çok yüksek	Nicel	Tek moleküllü floresan mikroskobu
qPCR	UV hasarı, zincir engelleyici lezyonlar	Nüfus	Tılımlı	Nicel	Gerçek zamanlı qPCR cihazı
MSI tespiti	MMR eksikliğine bağlı mikro uydu kararsızlığı	Nüfus	Tılımlı	Niteliksel	PCR cihazı/kapiller elektroforezi
DR-GFP/EJ5-GFP	İK ve NHEJ aracılı DSB onarımı	Nüfus	Yüksek	Nicel	Akış sitometresi/floresan mikroskobu
KUTSA/MUTLULUK	Genom çapında DSB haritalama	Tek hücreli	Çok yüksek	Nicel	Yüksek veri verimli sequencer
iPOND	DDR proteinleri replikasyon çatalları/TLS ile ilişkili onarımda	Replikasyon çatalı/proteom	Yüksek	Yarı-nicel	Kütle spektrometrisi/dizileme platformu

Tablo 1: DNA hasarı onarım verimliliğini tespit etme yöntemlerinin sistematik karşılaştırması. DNA hasar onarım verimliliğinin birden fazla onarım yolu boyunca değerlendirilmesi için yaygın kullanılan yöntemlerin karşılaştırılması. Tablo, biyokimyasal, moleküler ve hücre tabanlı yaklaşımlar dahil olmak üzere her test için lezyon veya substrat özgüllüğünü, analitik çözünürlük, hassasiyet, nicel yetkinlik ve enstrümantasyon gereksinimlerini özetlemektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

İnceleme ve perspektif

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Doğrudan onarım (DR)

Doğrudan onarım (DR), DNA onarımının en basit biçimidir ve hasarlı DNA'nın bazlar veya nükleotidler çıkarılmadan doğrudan restorasyonu^{anlamına gelir 7}. DR öncelikle iki ana DNA lezyonu türünü onarır. İlki, ultraviyole (UV) ışını tarafından indüklenen siklobutan pirimidin dimer (CPD) hasarıdır. Birçok organizmada fotoliaz pirimidin dimerlerini tanır ve bağlar. Görünür ışığa maruz kaldığında, fotoliaz aktive olur, DNA hasarını doğrudan tersine çevirir ve ardından DNA molekülünden ayrılır. Bu fotoreaktivasyon mekanizması özellikle bitkilerde ve alt organizmalarda önemlidir. Ancak, insanlar da dahil olmak üzere plasentalı memeliler fonksiyonel fotoliaza eksikliğine sahip olduğundan fotoreaktivasyon gerçekleştiremezler. Sonuç olarak, insan hücrelerinde UV kaynaklı CPD hasarı esas olarak nükleotid eksizyon onarımı (NER)⁸ ile onarılır.

DR ile onarılan ikinci büyük hasar türü, alkilasyon kaynaklı baz hasarıdır. Onarım, O 6-alkilguanin-DNA alkiltransferaz (AGT) ile sağlanır; bu da O^{6-metilguanin-DNA} metiltransferaz (MGMT) olarak da bilinir. Bu enzim, guanin kalıntılarının O⁶ konumundan alkil grupları kendine aktarır ve böylece hasar görmüş DNA bazını doğrudan geri kazanır.

DR verimliliğini tespit etme yöntemleri

Ultraviyole (UV) radyasyonu tarafından indüklenen CPD hasarının onarım verimliliğinin tespiti
1. CPD içeriğindeki değişiklikleri tespit etmek için Western Blot (WB) testi
  CPD'lere özgü antikorlar kullanarak, araştırmacılar UV ışınlamasından sonra CPD bolluğundaki değişiklikleri tespit edebilir ve kalıntı hasar seviyesinden onarım verimliliği çıkarabilirler. Daha yüksek onarım verimliliği, CPD'nin daha hızlı kaldırılmasına karşılık gelir. WB tabanlı CPD tespiti, DNA onarım aktivitesini değerlendirmek için klasik ve etkili bir yaklaşımdır; Ancak, birkaç sınırlama vardır. İlk olarak, test hücre popülasyonları arasında ortalama hasar seviyelerini ölçer ve bu nedenle tek hücre çözünürlüğüne sahip değildir. İkincisi ve daha da önemlisi, test onarım yollarını ayırt edemez. İnsan hücrelerindeki CPD'ler öncelikle NER ile onarıldığından, WB analizi tek başına gözlemlenen onarım aktivitesinin fotoliaz aracılı onarım mı yoksa NER aktivitesini mi yansıttığını ek deneysel bağlam olmadan ayırt edemez.
2. İmmünofluoresans (IF) konumlandırması CPD odak dinamik değişiklikleri
  UV ışınına ve fotoonarım tedavisine maruz kalan hücreler, CPD'ye özgü antikorlarla boyanabilir ve nükleer CPD odaklarındaki değişiklikler floresan mikroskopisiyle görselleştirilebilir. CPD odak oluşumu ve temizlenmesinin nicel analizi, hem popülasyon hem de tek hücre seviyelerinde DNA onarım kapasitesinin değerlendirilmesini sağlar. CPD odaklarının kaybolma oranı doğrudan onarım verimliliğini yansıtır. IF, bireysel hücreler içindeki onarım dinamiklerinin mekansal ve zamansal görselleştirilmesini sağlar ve hücreden hücreye heterojenliğin tespit edilmesini sağlar. Ancak, floresan sinyalleri söndürülmeye hassastır ve nicel analiz genellikle manuel saymaya dayanır, bu da öznellik getirir. Fotoreaktivasyon aktivitesi olmayan memeli hücrelerinde, bu yöntem öncelikle NER aracılı onarım verimliliğini yansıtır.
3. Nicel CPD analizi için yüksek performanslı sıvı kromatografi-kütle spektrometrisi (HPLC-MS/MS)
  Çıkarılan DNA, enzimatik olarak nükleozitlere dönüştürülür; ardından CPD'ler normal nükleozidlerden yüksek performanslı sıvı kromatografi (HPLC) ile ayrılır. Nicel analiz daha sonra tandem kütle spektrometrisi (MS/MS) kullanılarak yapılır. Onarım verimliliği, onarım öncesi ve sonrası CPD bolluğunun^{karşılaştırılmasıyla belirlenir 9}. HPLC-MS/MS son derece yüksek özgüllük ve pikomolar seviyesinde hassasiyet sağlar; ancak yöntem pahalı enstrümantasyon, karmaşık örnek hazırlama gerektirir ve sağlam hücrelerin yerinde onarım durumunu yansıtmaz. İnsan hücre örneklerinde, ölçülen onarım sonucu ağırlıklı olarak NER aktivitesini yansıtır.
Alkilasyon ajanlarıyla indüklenen DNA baz hasarının onarımının etkinliği
1. MGMT Enzim Aktivite Testi
  Alkilasyon ajanları tarafından indüklenen DNA hasarının onarım etkinliği genellikle MGMT^{aktivite 10} ölçülmesiyle değerlendirilir. Radyoaktif olarak etiketlenmiş metilen DNA substratları, metil gruplarının hasarlı DNA'dan MGMT proteinine transferini izlemek için kullanılır ve böylece onarım verimliliğinin nicel olarak değerlendirilmesini mümkün kılar.
2. O^6-meG onarım verimliliğini tespit etmek için raporlama gen testi
  O 6-metilguanin (O^6-meG) lezyonlarını içeren raporlayıcı plazmidler onarım verimliliğini değerlendirmek için oluşturulabilir. Tanıtılan lezyon, raporlayıcı gen ifadesini bastırır, ta ki MGMT aracılı onarım raporlayıcı aktivitesini yeniden sağlayana kadar. Onarım verimliliği, raporlayıcı gen ifade seviyeleri ölçülerek daha sonra nicelendirilir. Raporlayıcı gen testleri, canlı hücrelerdeki onarım aktivitesinin sezgisel ve nicel değerlendirmesini^{sağlar 11}. Ancak, bu testler lezyona özgü vektörlerin inşasını gerektirir ve nispeten uzun deneysel döngüler^{içerir 12}.
Zincir kırılmasının tespitiyle hasar onarım verimliliği
1. Kuyruklu Yıldız Testi
  Comet testi, tek hücreli jel elektroforezi (SCGE) olarak da bilinir, tek hücre seviyesinde DNA ipliği kopmalarını tespit etmek için hassas bir yöntemdir. Hasar görmüş DNA parçaları elektroforez sırasında çekirdekten göç eder ve kuyruklu yıldız benzeri kuyruklar oluştururken, sağlam DNA nükleer bölgede yoğunlaşmış kalır. Kuyruklu yıldız kuyruğu uzunluğu, kuyruk DNA içeriği ve kuyruk momenti gibi parametreler, floresan mikroskopisi ve görüntü analiz yazılımı kullanılarak nicelendirilebilir. Bu metrikler, DNA zinciri kırılma şiddetinin nicel olarak değerlendirilmesini sağlar. DNA hasarı indüksiyonundan hemen sonra kuyruklu yıldız profilleriyle onarım sonrası elde edilenlerle karşılaştırıldığında, onarım verimliliği¹³ olarak tahmin edilebilir.
  Comet testi, basit işlem, nispeten düşük maliyet, yüksek hassasiyet ve tek hücre çözünürlüğü gibi çeşitli avantajlar sunar. Bu yöntemin daha da geliştirilmesi, enzimle modifiye edilmiş varyantların ve BER ile NER aktivitelerini değerlendirmek için kullanılabilen kometle ilgili in vitro DNA onarım testlerinin geliştirilmesine yol açmıştır.

2. Taban eksizyon onarımı (BER)

Baz eksizyon onarımı (BER), öncelikle oksidasyon, alkilasyon ve deaminasyon¹⁴ ile oluşan küçük baz lezyonlarını ortadan kaldıran, yüksek koruma altında bir DNA onarım yoludur. BER, tek zincirli kırılma onarımı (SSBR) ile önemli mekanik örtüşme paylaşır ve bazı SSBR olayları BER'in uzantısı olarak kabul edilir. Tamir yaması uzunluğuna göre, BER kısa yamalı BER (SP-BER) ve uzun yamalı BER (LP-BER) olarak sınıflandırılır.

BER, baz ile deoksiriboz arasındaki N-glikosidik bağını keserek hasarlı bazları tanıyan ve çıkaran DNA glikozilazları tarafından başlatılır; böylece apurinik/apirimidinik (AP)¹⁵ bölgeleri oluşturur. AP endonükleaz 1 (APE1), ardından AP bölgesinin 5′ tarafında DNA omurgasını yararak 3′-OH ve 5′-deoksiriboz fosfat (dRP) terminalleri üretir. SP-BER sırasında dRP grubu çıkarılır, DNA polimeraz β (Polβ) tek nükleotid boşluğunu doldurur ve DNA ligaz III (LigIII) ligasyonu tamamlar.

3′-bloklu terminleri içeren alkilasyon kaynaklı tek zincirli kırılmaların onarımı benzer bir mekanizmayı izler, ancak ek uç işlem gerektirir. Polinükleotid kinaz 3′-fosfataz (PNKP) önce anormal 3' uçlarını çıkararak uygun bir 3′-OH grubu oluşturur. Polβ daha sonra eksik nükleotidi doldurur ve LigIII onarımı tamamlamak için çentiği mühürler.

BER verimliliğini tespit etme yöntemleri

Enzimle modifiye edilmiş kuyruklu yıldız testi
Enzimle modifiye edilmiş Comet testi, standart Comet testini lezyon-spesifik onarım enzimleri dahil ederek genişletir. Bu enzimler, hasarlı bazları tanır ve parçalar, aksi takdirde tespit edilemeyen lezyonları tespit edilebilir iplik kopuklarına dönüştürür. Ortaya çıkan kuyruklu yıldız kuyruğu yoğunluğu, DNA hasar^{seviyesini 16}˒¹⁷ yansıtır.
BER verimliliğini değerlendirmek için, formamidoprimidin DNA glikozilaz (FPG) veya memeli homologu 8-oksoguanin DNA glikozilaz (OGG1), oksitlenmiş baz lezyonlarını tek zincirli kırılmalara dönüştürmek için kullanılır ve bu lezonlar daha sonra Comet testi¹⁸ kullanılarak analiz edilir.
İnsisiyon testi
Kesi testi, BER aktivitesini değerlendirmek için temel in vitro yaklaşımdır. AP bölgelerini içeren DNA substratları, saflaştırılmış enzimler veya hücresel özlerle kuluçka yapılır ve bölünmüş DNA substratlarının oranı nicelenir. Bu test, APE1 aracılı kesi aktivitesini doğrudan yansıtır ve hücre içi ortamdan gelen paraziti en aza indirirken yüksek özgüllük ve hassasiyet sağlar¹⁹.
Ancak, kesi testi, lezyon tanıma, baz eksizyonu, AP bölgesi bölünmesi, DNA sentezi ve ligasyon²⁰ dahil olmak üzere tüm onarım sürecinin dinamik düzenlemesini değerlendiremediği için canlı hücrelerdeki BER aktivitesini tam olarak yansıtmaz.
Yeniden kurulmuş onarım sistemi
Yeniden oluşturulmuş onarım sistemi, saflaştırılmış onarım proteinleri kullanarak DNA onarım yollarını yeniden inşa eden in vitro deneysel bir platformdur. Bu sistem, bireysel onarım proteinlerinin moleküler fonksiyonları ve etkileşimlerinin ayrıntılı analizini sağlar ve mekanistik çalışmalar ile ilaç taraması için yaygın olarak kullanılır.
BER verimliliğini değerlendirmek için, saflaştırılmış glikozilazlar, AP endonükleazlar, DNA polimerazlar ve ligazlar hasarlı DNA substratlarıyla sıralı olarak inkübe edilip, lezyon tanıma, eksizyon, sentez ve ligasyon yeniden oluşturulur. Onarım ürünleri, jel elektroforezi, floresan etiketleme veya kütle^{spektrometrisi 21} ile analiz edilir. Bu yaklaşım yüksek kontrollü mekanik çalışmaları mümkün kılsa da, kromatin yapısını veya onarım aktivitesinin küresel hücresel^{düzenlemesini hesaba katmaz.}
Plazmid bazlı onarım testi
Plazmid bazlı onarım testleri, tanımlı DNA lezyonlarını içeren plazmidlerin konak hücrelere getirilmesini veya onarım enzimleri içeren hücresel ekstraktlarla kuluçka geçirilmesini içerir; ardından raporlayıcı testler, akış sitometrisi veya koloni oluşumu analiziyle onarım verimliliğinin^{değerlendirilmesini içerir 23}.
BER verimliliğini değerlendirmek için, oksidatif DNA hasarı içeren plazmidler hücresel özlerle inkübe edilir ve ardından Escherichia coli gibi onarım eksikliği olan bakteriyel suşlara dönüştürülür. Onarım verimliliği daha sonra koloni oluşum oranlarından tahmin edilir.
Reporter gen testi
Raporlayıcı gen testleri, raporlayıcı gen ifadesinin restorasyonunu ölçerek dolaylı olarak DNA onarım etkinliğini veya gen düzenleyici^{aktivitesini değerlendirir.} Bu testlerde, DNA lezyonları veya düzenleyici unsurlar raporlayıcı yapılarına dahil edilir ve onarım verimliliği, onarım sonrası raporlayıcı aktivitesindeki değişikliklerle ölçülür.
BER analizi için, bir lusiferaz raporlayıcı geninin kodlama bölgesine 8-oksoG lezyonu yerleştirilebilir. Lezyon onarılmazsa terle bozulur; Başarılı tamir, tam boy reporter protein ifadesini geri kazanır. Hasar görmedik plazmidler, örneğin pRL-TK Renilla lusiferaz vektörleri genellikle iç kontrol olarak kullanılır.
Konak hücre yeniden aktivasyonu (HCR)
Konak hücre yeniden aktivasyonu (HCR), DNA onarım verimliliğini dolaylı olarak değerlendiren klasik bir testtir ve konak hücrelerin hasarlı raporlayıcı plazmidlerden ifadeyi geri kazanma^{yeteneğini ölçer. 25}. UV kaynaklı pirimidin dimerler veya kimyasal olarak indüklenen çapraz bağlantılar gibi tanımlanmış lezyonlar taşıyan plazmidler, konak hücrelere aktarılır. Onarım verimliliği, raporlayıcı gen ekspresyonunun ölçülmesiyle daha sonra nicelendirilir.
HCR testleri yüksek hassasiyet sağlar ve belirli lezyon tiplerine yönelik onarım aktivitesinin değerlendirilmesine olanak tanır. Ancak, yüksek kaliteli hasarlı plazmidlerin verimli transfeksiyonu ve hazırlanması gereklidir. Geleneksel HCR'nin büyük sınırlamalarından biri, plazmidlerin DNA'ya zarar veren ajanlarla tedavisinin plazmid genelinde heterojen lezyon popülasyonları oluşturmasıdır ve bu da mekanistik yorumu^{karmaşıklaştırır26}.
Bu sınırlamaları gidermek için, site özel, tek lezyon plazmidleri kullanılarak akış sitometrisine dayalı konak hücre yeniden aktivasyonu (FM-HCR) testleri geliştirilmiştir. FM-HCR, canlı hücrelerde onarım aktivitesinin hızlı nicel analizini sağlar, ancak test özel enstrümantasyon gerektirir ve birden fazla BER yolunun eşzamanlı mekanik analizi^{için sınırlamalar taşır. 27}.
Lezyona özgü BER substratlarına dayalı plak konak hücre yeniden aktivasyonu (PL-HCR) testleri de canlı hücrelerde BER mekanizmalarını incelemek için geliştirilmiştir (Şekil 1)²⁸. Bu yaklaşımda, memeli hücrelerine tek bir 1,N 6-etenenoadenin (εA) lezyonu içeren plazmidler getirilir. Onarım sonrası plazmid DNA'sı geri kazanılır, krestriksiyon enzimleriyle sindirilir, E. coli'ye dönüştürülür ve plak oluşumu analiziyle nicelendirilir. Tamamen onarılmış plazmidler, kısıtlama sindiriminden sonra doğrusal hale gelir ve plak üretemezken, onarılmamış veya eksik onarılmış plazmidler dairesel kalır ve plak oluşturur. Bu nedenle BER verimliliği plak nicelendirmesiyle belirlenir.
Onarım destekli hasar tespiti
Onarım destekli hasar tespiti (RADD), DNA hasarını tespit etmek ve nicelendirmek için tek moleküllü bir^{yöntemdir 29}. Bu yaklaşımda, lezyona özgü onarım enzimleri hasarlı bazları tanır ve çıkarır; ardından DNA polimerazlar, ortaya çıkan boşluklara floresan olarak işaretlenmiş nükleotidler dahil eder. DNA molekülleri daha sonra floresan mikroskopisi ile görselleştirilir ve böylece DNA lezyonlarının doğrudan tespit edilmesi ve nicelendirilmesi mümkün olur (Şekil 2)³⁰.
RADD, tek molekül düzeyinde DNA hasarının son derece hassas niteliksel ve nicel analizini sağlar. Ancak, yöntem öncelikle DNA hasar yükünü ölçer, hücre popülasyonlarında onarım kinetiği veya genel onarım verimliliğini doğrudan değerlendirmek yerine yapılır.

figure-protocol-1
Şekil 1: Plak konak hücre yeniden aktivasyonu (PL-HCR). M13mp18, tanımlanmış bir lezyon içeren dairesel tek zincirli DNA, yetkin hücrelere aktarılır. Transfeksiyondan sonra, hücreler agar plakalarında kültürlenerek plak oluşumuna olanak tanır. Replikatif form M13 DNA'sı daha sonra plaklardan izole edilir, kısıtlayıcı enzimlerle sindirilir ve mutant ve yabani tip ürünleri ayırt etmek ve lezyon onarımının olup olmadığını belirlemek için jel elektroforezi ile analiz edilir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-protocol-2
Şekil 2: Onarım destekli hasar tespiti (RADD). DNA onarımı sırasında oluşan tek zincirli boşluklar, biotin etiketli nükleotidlerle doldurulur. Floresan olarak etiketlenmiş avidin veya streptavidin daha sonra entegre nükleotitleri tespit etmek için kullanılır ve böylece floresan analiziyle DNA hasar seviyelerinin nicel olarak değerlendirilmesini sağlar. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

3. Nukleotid eksizyon onarımı (NER)

Nükleotid eksizyon onarımı (NER), DNA çift^{sarmalını bozan} hacimli DNA lezyonlarını çıkarmaktan sorumlu başlıca bir DNA onarım yoludur 31. NER substratları arasında UV ile indüklenen siklobutan pirimidin dimerler (CPD'ler), 6-4 pirimidin-pirimidon fotoürünleri (6-4PP), oksidatif pürin lezyonları, hacimli kimyasal adduktlar ve sisplatin kaynaklı iplik içi çapraz^{bağlantılar 32} bulunur. NER'deki kusurlar, aşırı UV hassasiyeti ve yüksek kanser yatkınlığı ile karakterize edilen xeroderma pigmentosum gibi bozukluklarla ilişkilidir.

NER, iki ana alt yoldan oluşur: küresel genom NER (GG-NER⁾³³ ve transkripsiyona bağlı NER (TC-NER⁾³⁴. GG-NER, genomun tamamını heliks-bozucu lezyonlar için inceler, böylece mutagenez ve kanserogenezi baskılar. Buna karşılık, TC-NER aktif olarak transkripsiyon edilen genlerden transkripsiyon bloklayıcı lezyonları seçici olarak çıkarır ve transkripsiyon bütünlüğünü korumak için gereklidir. TC-NER'deki kusurlar, Cockayne sendromu ve UV-duyarlı sendrom³⁵ gibi bozukluklara katkıda bulunur.

NER verimliliğini tespit etme yöntemleri

İnsisiyon testi
Kesi testi, onarım proteinleriyle DNA hasar noktalarına getirilen iplik kesilerini tespit ederek NER verimliliğini değerlendirir. Bu testte, UV ışınlı DNA gibi hasarlı DNA substratları, CPD içeren onarım proteinleri veya hücresel özlerle kuluçka edilir ve kesi ürünleri daha sonra tespit^{edilir 36}.
Radyo etiketleme veya floresan etiketleme, hassasiyeti artırmak ve kesi^{aktivitesinin hassas izlenmesine olanak sağlamak için kullanılabilir 37}. Test, hasar tanıma ve eksizyondan sorumlu anahtar NER proteinlerinin aktivitesini doğrudan ölçür. Ancak, başarılı uygulama için yüksek kaliteli hasarlı substratlar ve aktif protein özleri hazırlanmalıdır.
Enzim onarım kuyruklu yıldızı testi
NER verimliliği ayrıca enzimle modifiye edilmiş Comet testleriyle de değerlendirilebilir. Bu yaklaşımda, T4 endonükleaz V, hasarlı hücrelerle kuluçka edilip pirimidin dimerlerini tespit edilebilir tek zincirli kırılmalara dönüştürür ve daha sonra Comet testi³⁸ kullanılarak analiz edilir.
Gerçek zamanlı floresans nicel PCR (qPCR)
Gerçek zamanlı nicel PCR (qPCR), DNA lezyonlarının PCR amplifikasyonu üzerindeki inhibitör etkilerini ölçerek dolaylı olarak DNA onarım^{etkinliğini değerlendirir 39}. NER analizi sırasında, pirimidin dimerlerini indüklemek için UV ışını ilk olarak kullanılır. Bu lezyonlar DNA polimeraz ilerlemesini engeller ve amplifikasyon verimliliğini azaltır; bu da döngü eşiği (CT) değerlerinin artmasına yol açar. NER yolu ile onarımdan sonra DNA bütünlüğü geri kazanılır ve amplifikasyon verimliliği artar, bu da daha düşük CT değerlerine yol açar. Bu nedenle, onarım verimliliği, hasarsız bir iç kontrol bölgesi^40'a göre onarım öncesi ve sonrası amplifikasyonun karşılaştırılmasıyla nicelendirilebilir.
Buna ek olarak, qPCR, ATM, ATR, BRCA1, CDKN1A ve XPC dahil olmak üzere DNA hasar sinyal ve onarım yollarında yer alan genlerin ifade seviyelerini değerlendirmek için kullanılabilir; böylece dolaylı olarak DNA onarım kapasitesi^41'i yansıtır.
Akış sitometrisine dayalı konak hücre yeniden aktivasyonu (FM-HCR)
FM-HCR testleri, konak hücrelere aktarılan siteye özgü lezyon içeren plazmitleri kullanır ve floresan yoğunluğu ve floresan hücrelerin oranının akış sitometrik analiziyle onarım verimliliğini nicelikle ölçür (Şekil 3)⁴²^˒43. Artan floresans yoğunluğu genellikle daha yüksek DNA onarım^{kapasitesini 44}^˒45'i yansıtır.
Eksizyon onarım dizilemesi (XR-dizi)
Eksizyon onarım dizileme (XR-dizi), tek nükleotid çözünürlükte NER aktivitesini haritalamak için genom çapında bir tekniktir. Bu yöntem, NER sırasında çıkarılan hasar içeren oligonukleotidleri seçici olarak zenginleştirir ve diziler; böylece genom boyunca onarım aktivitesinin yüksek çözünürlüklü haritaları oluşturulur. XR-dizi, hem GG-NER hem de TC-NER yolları ile ilişkili onarım verimliliği ve dağılım desenlerinin nicel analizini sağlar ve NER araştırmalarında önemli bir teknolojik ilerlemeyi temsil eder.
NER, mekaniksel olarak birbirinden ayrılan iki alt yoldan oluştuğu ve çok sayıda onarım proteini içerdiği için,⁴⁶^˒47 onarım aktivitesinin kapsamlı değerlendirmesi için birden fazla tamamlayıcı yöntem gereklidir. Yukarıda açıklanan yöntemlere ek olarak, NER verimliliği Western blotting, immünoflüoresans testleri, plazmid bazlı onarım testleri ve raporlayıcı gen testleri kullanılarak da değerlendirilebilir.

figure-protocol-3
Şekil 3: Akış sitometrisine dayalı konak hücre yeniden aktivasyonu (FM-HCR) tespit prensibi. Dört farklı DNA hasarı türü içeren plazmidler, kültürlenmiş memeli hücrelerine birlikte aktarılır. DNA onarım kapasitesi (DRC), raporlayıcı floresans yoğunluğuna dayalı akış sitometrisiyle daha sonra nicelenir. DRC, DNA onarım kapasitesi. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

4. Uyumsuzluk onarımı (MMR)

Uyumsuzluk onarımı (MMR), G-T ve A-C uyumsuzlukları gibi temel uyumsuzlukları ve DNA replikasyonu sırasında oluşan küçük yerleştirme-silinme döngülerini onarmaktan sorumlu postreplikatif bir hata düzeltme yoludur⁴⁸. MMR, MutS uyumsuz bazları tanıdığında başlatılır, ardından MutL, onarım^{sürecini aktive etmek} için aşağı akım onarım faktörleri ve ekzonükleazları kullanır 49. MMR'de kritik bir adım, ebeveyn ve yeni sentezlenen DNA zincirleri arasındaki ayrımdır^.

Prokaryotlarda, iplik ayrımcılığı ebeveyn zincirini işaretleyen DNA metilasyonu yoluyla sağlanır. Ökaryotlarda, iplik kimliği yeni sentezlenen DNA'daki geçici kesikler ve çoğalan hücre nükleer antijeni (PCNA) ile etkileşimler yoluyla belirlenir. MMR, replikasyon saettikliğini önemli ölçüde artırır ve genomik kararlılığın korunmasında hayati bir rol^{oynar 51}. MMR'deki kusurlar, Lynch sendromu dahil olmak üzere birden fazla kanserle güçlü şekilde ilişkilidir.

MMR'nin verimliliğini değerlendirmek için yöntemler

Mikro uydu kararsızlık testi
Arızalı MMR, mikrouydu lokuslarında replikasyon kayması hatalarının düzeltilmemesine yol açar ve mikrouydu kararsızlığına (MSI) yol açar. MSI testi, temsil mikro satellit belirteçlerinin PCR amplifikasyonunu ve ardından kapiller elektroforez tabanlı parça analizini içerir. Birden fazla lokustaki kararsızlık MMR aktivitesinin bozulduğunu gösterirken, stabil mikro uydu profilleri sağlam MMR fonksiyonunu gösterir. MSI testi, MMR eksikliğini tespit etmek için yüksek hassasiyet ve özgüllük sağlar; ancak MMR fonksiyonunun dolaylı bir ölçütü olarak kalır ve onarım verimliliğini nicel olarak değerlendirmez.
Tanımlanmış uyumsuzluklar veya yerleştirme-silinme döngüleri içeren raporlayıcı plazmidler, raporlayıcı gen testleriyle MMR verimliliğini değerlendirmek için de kullanılabilir. Ayrıca, MMR ile ilişkili proteinleri hedefleyen Western blotting ve immünoflüoresans testleri, yol aktivitesinin dolaylı olarak değerlendirilmesini sağlayabilir.

5. Çift telli kırma (DSB) onarımı

Çift iplik kırıkları (DSB'ler), DNA hasarının en sitotoksik formlarından biridir. DSB'lerin doğru şekilde onarılmaması mutasyonlara, kromozomal delesyonlara, translokasyonlara, genomik istikrarsızlıklara ve tümörjeneziye yol açabilir. DSB onarımı öncelikle hücre döngüsünün farklı aşamalarında tercihli olarak çalışan homolog rekombinasyon (HR) ve homolog olmayan uç birleştirme (NHEJ) yoluyla^{gerçekleşir.}

DSB onarımının verimliliğini değerlendirmek için yöntemler

gamma-H2AX odak testi
γ-H2AX odak testi, DSB'leri dolaylı olarak tespit etmek için en yaygın kullanılan yöntemlerden biridir. DSB oluşumunun ardından, histon H2AX Ser139'da hızla fosforile edilip γ-H2AX odakları oluşturulur. γ-H2AX odak sayısı, DSB oluşumunun kapsamıyla ilişkilidir ve onarım verimliliği, immünoflüoresans mikroskopisi kullanılarak odakların kaybolma oranının zamanla izlenmesiyle çıkarılabilir.
Bu test, yüksek hassasiyet, tek hücre çözünürlüğü ve yerleşik deneysel protokoller gibi çeşitli avantajlar sunar; bu da onu DNA hasar yanıtı (DDR) araştırmalarında merkezi bir yöntem haline getirir.
KUTSAL ve MUTLULUK
BLESS (Breaks Labeling, Enrichment on Streptavidin ve Sequencing) ve BLISS (Breaks Labeling In Situ and Sequencing), in situ etiketleme ve yüksek verimli dizileme temelli genom çapında DSB haritalama yöntemleridir. Her iki yaklaşım da, dizileme adaptörlerinin kırılmış DNA uçlarına doğrudan bağlanmasıyla DSB noktalarını tanımlar; böylece DSB'lerin genom genelinde hassas lokalizasyonu ve nicelenmesi mümkün olur. Bu yöntemler ayrıca genel DSB onarım kinetiklerini değerlendirmek için de kullanılabilir.
Ayrıca, DSB'ye özgü raporlayıcı gen testleri, DSB onarım etkinliğini nicel olarak değerlendirebilir ve İK aracılı onarımı NHEJ aracılı onarımdan ayırt edebilir (Şekil 4). Ancak, γ-H2AX testleri, BLESS ve BLISS küresel DSB yükünü ve onarım kinetiklerini etkili bir şekilde ölçse de, onarımın özellikle İK veya NHEJ yolları üzerinden gerçekleşip gerçekleşmediğini belirleyemezler.

figure-protocol-4
Şekil 4: Çift iplik kırılması (DSB) onarımı için raporlayıcı gen testi. DSB raporlayıcı plazmidleri hedef hücrelere aktarılır. Transfeksiyon sonrası uygun bir onarım süresinin ardından, raporlayıcı gen floresansı floresans mikroskopisi kullanılarak DSB onarım verimliliği değerlendirilir. DSB, çift telli kırma. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

6. Homolog rekombinasyon onarımı (HR)

Homolog rekombinasyon (HR), esas olarak hücre döngüsünün S ve G2 fazlarında, hasarsız bir kardeş kromatidin onarım^{şablonu 53} olarak bulunduğunda işlev gören yüksek isabetli bir DNA onarım yoludur. DSB oluşumunun ardından, MRE11-RAD50-NBS1 (MRN) kompleksi DNA uçlarını tanır ve CtIP⁵⁴ ile iş birliği içinde DNA uç rezeksiyonunu başlatır. Bu süreç, 3′ tek zincirli DNA (ssDNA) çıkıntıları oluşturur.

Ortaya çıkan ssDNA başlangıçta nükleaz bozulmasından koruyan ve ikincil yapıların oluşmasını engelleyen replikasyon proteini A (RPA) ile^{kaplanır 55}. Sonrasında, BRCA2, RPA'nın RAD51 rekombinazıyla değiştirilmesini sağlar ve bu da RAD51 nükleoprotein^{filamenti 56'nın} oluşmasına yol açar. Bu filament, kardeş kromatidde homolog DNA dizilerini arar ve homolog dupleks DNA şablonuna iplik invaziyasını teşvik eder; böylece⁵⁷^˒58 bir yer değiştirme döngüsü (D-döngüsü) yapısı oluşturur. DNA sentezi ve iplik değişimi tamamlanmış onarıma devam eder.

İK verimliliği, raporlayıcı gen testlerinde DR-GFP raporlayıcı sistemleri kullanılarak nicel olarak değerlendirilebilir. Alternatif olarak, dolaylı değerlendirme Western blotting veya HR ile ilişkili proteinleri hedefleyen imbünülofloresan testleri kullanılarak yapılabilir.

7. Homolog olmayan DNA uç birleşimi (NHEJ)

Homolog olmayan uç birleştirme (NHEJ), DSB'leri onarır ve DNA^{uçları 59} arasında kapsamlı bir dizi homolojisi gerektirmez. Bunun yerine, kırık DNA uçları doğrudan işlenir ve bağlanır, bu da NHEJ'yi doğası gereği hataya meyilli bir onarım yolu yapar. DNA uçları bağlanmadan önce bozulmaya uğrayabileceği ve ilişkisiz DSB'lerden gelen uçlar birleşebildiği için, NHEJ mutasyonlara, silinmelere ve kromozomal yeniden düzenlemelere^{yol açabilir 60}.

Homolog olmayan onarımın üç ana formu tanınır: klasik NHEJ, tek zincirli tavlama (SSA) ve mikrohomoloji aracılı uç birleştirme (MMEJ).

Klasik NHEJ
Klasik NHEJ, hücre döngüsü boyunca çalışır. Ku70/Ku80 heterodimerleri önce DSB^{uçları 61'i} tanır ve bağlar. Bu kompleks, DNA'ya bağlı protein kinaz katalitik alt birimi (DNA-PKc) işe alır; bu da kinaz sinyalinin aktivasyonuna ve NHEJ'nin başlamasına yol açar. Nukleazlar ve fosfatazlar dahil olmak üzere son işlem enzimleri, XRCC4-DNA ligaz IV kompleksi DNA uçlarının bağlanmasını aracılık etmeden önce hasarlı DNA^{uçlarını işler ve 62}. Terminal işleme sıklıkla nukleotid kaybı veya yanlış yeniden birleşme ile sonuçlandığı için, NHEJ mutagenik bir onarım^{yolu olarak kabul edilir 63}^˒64.
Tek zincirli tavlama (SSA)
Tek zincirli tavlama (SSA), tekrarlanan homolog diziler arasında oluşan DSB'leri onarır. DSB oluşumunun ardından, nukleazlar 5′ DNA uçlarını rezektiye yapar ve genişletilmiş 3′ ssDNA çıkıntıları oluşturur. RAD52, tamamlayıcı homolog^{tekrarlar 65} arasında tavlama aracılığı yapar. Daha sonra, XPF-ERCC1 endonükleaz kompleksi eşleşmemiş DNA flaplarını çıkarır ve SLX1-SLX4 kompleksi de son işlemede yer alabilir. DNA ligaz kalan boşlukları kapatır. Homolog tekrarlar arasındaki dizileri onarım sırasında silindiği için, SSA hızlı ama doğası gereği mutajenik bir onarım^{mekanizması olarak kabul edilir 66}.
Mikrohomoloji aracılı uç birleştirme (MMEJ)
Mikrohomoloji aracılı uç birleştirme (MMEJ), alternatif NHEJ (Alt-NHEJ) olarak da adlandırılır, hataya meyilli bir diğer DSB onarım^{yolu 67'dir}. MMEJ'de, DNA kırık uçlarına yakın kısa mikrohomolog diziler, kırık DNA uçlarını onarımdan önce hizalamak için kullanılır. Bu mikrohomolog bölgelerin tanınmasından sonra, DNA uçları rekombinasyon benzeri bir^{süreçle birleştirilir 68}. MMEJ çok kısa homolog dizilere dayandığı için, onarım sırasında silinme ve genomik yeniden düzenlemeler genellikle gerçekleşir.
NHEJ verimliliği EJ5-GFP raporlayıcı sistemleri kullanılarak raporlayıcı gen testlerinde nicel olarak değerlendirilebilir. Alternatif olarak, onarım aktivitesi NHEJ ile ilişkili proteinlerin Western blotting ve immünoflüoresans analiziyle dolaylı olarak değerlendirilebilir.

8. Iplikler arası çapraz bağlantı (ICL) onarımı

Zincirler arası çapraz bağlantılar (ICL), DNA çift sarmalının iki zincirini kovalent olarak birbirine bağlayan ve böylece DNA çoğaltmasını ve transkripsiyonunu engelleyen son derece toksik DNA lezyonlarıdır. ICL onarımı mekanik olarak karmaşıktır ve esas olarak Fanconi anemisi (FA) yolu ile NEIL3 yolu^69'u içerir.

FA yolunda, FANCM ICL lezyonlarını tanır ve FANCI-FANCD2 kompleksinin monoubiquitinasyonunu teşvik eder, böylece aşağı akış onarım^{proteinlerini aktive eder 70}. Yapıya özgü nükleazlar, çapraz bağlantıya yakın DNA keserek iki DNA zincirini ayırır ve ortaya çıkan DSB'ler HR veya NHEJ yolları aracılığıyla onarılır.

NEIL3 yolunda, DNA glikozilaz NEIL3, ICL lezyonu ile ilişkili glikosidik bağları keserek AP siteleri oluşturur ve ardından translezyon sentezi (TLS)^{polimerazları 71} tarafından atlanır. ICL'ler, replikasyon ve transkripsiyon için gereken iplik ayrılmasını engellediğinden, bu lezyonlar yüksek derecede sitotoksiktir ve yaşlanmaya, nörodejenerasyona ve^{kansere katkıda bulunur 72}^˒73.

ICL onarım verimliliği, plazmid bazlı onarım testleri, raporlayıcı gen testleri, konak hücre yeniden aktivasyon testleri ve in vitro yeniden yapılandırılmış onarım sistemleri kullanılarak değerlendirilebilir.

9. Translezyon sentezi (TLS)

Translezyon sentezi (TLS), onarılmamış DNA lezyonlarında replikasyonun devam etmesini sağlayan bir DNA hasar toleransı^{mekanizmasıdır 74}. TLS öncelikle polimerazlar κ, η, ι ve ζ dahil olmak üzere özel DNA polimerazlarını içerir. DNA çoğaltımı hasarlı bölgelerde durduğunda, TLS polimerazlar lezyonu atlar ve çoğaltmanın ilerlemesine izin verir, böylece genom^{stabilitesini 75} korur.

BER, NER, MMR, HR ve NHEJ'nin aksine, bunlar doğrudan DNA lezyonlarını kaldırır veya onarır, TLS DNA hasarını ortadan kaldırmaz. Bunun yerine, DNA çoğaltımı sırasında onarılmamış lezyonları başar ve bu nedenle kanonik bir DNA onarım^{yolu 76} yerine hasar toleransı mekanizması olarak sınıflandırılır.

TLS, hatasız ve hata yapmaya açık bypass yollarına ayrılabilir. Hatasız TLS, doğru nükleotidi lezyonun karşısına yerleştirirken, hata eğilimli TLS sıklıkla yanlış nükleotidler oluşturur ve mutajeze katkıda bulunur. Hata eğilimli TLS, çevresel kanserojenlerin genomik mutasyonları indükte eden önemli bir mekanizması olarak kabul edilir. Sonuç olarak, hata eğilimli TLS yollarının modülasyonu, kanser önleme ve tedavi⁷⁷ için potansiyel bir strateji olabilir.

TLS'nin verimliliğini değerlendirme yöntemleri

Yeni DNA'da Proteinlerin İzolasyonu (iPOND)
Yeni başlayan DNA'da proteinlerin izolasyonu (iPOND), yeni sentezlenen DNA ile ilişkili proteinlerin durakmış replikasyon çatallarında analiz edilmesinde kullanılan bir tekniktir. TLS aktivitesi sıkça duran çatallarda gerçekleştiği için, iPOND, replikasyon stresi sırasında TLS polimerazlarının ve DNA hasar yanıtı (DDR) proteinlerinin toplama ve montajının dinamik analizini sağlar. Bu yöntem, TLS etkinliği ve replikasyonla bağlı onarım süreçlerini değerlendirmek için kullanılabilir.
TLS verimliliği, raporlayıcı gen testlerinde TLS-spesifik DNA lezyonları içeren reporter plazmidler kullanılarak da değerlendirilebilir. Ayrıca, TLS ile ilişkili proteinleri hedefleyen Western blotlama ve immünoflüoresans testleri, yol aktivitesinin dolaylı değerlendirmesini sağlayabilir.

10. Deneysel tasarımda kalite kontrolü ve tekrarlanabilirlik hususları

Biyolojik çoğaltma ve teknik çoğaltma
Biyolojik çoğaltmalar ile teknik kopyalar arasındaki net ayrım, DNA onarım çalışmalarında güvenilirlik ve tekrarlanabilirliği sağlamak için gereklidir. Genel olarak, her deney için en az üç bağımsız biyolojik replikat dahil edilmeli, teknik kopya sayısı ise tespit platformunun değişkenliğine göre belirlenmelidir.
Comet testi ve immünoflüoresans tabanlı odak analizi gibi tek hücreli testler için, örnekleme yanlılığını en aza indirmek için biyolojik replikasyon başına en az 50–100 hücre analiz edilmelidir. DR-GFP ve FM-HCR testleri dahil olmak üzere akış sitometrisine dayalı raporlayıcı testlerinde, istatistiksel sağlamlık sağlamak için örnek başına en az 10.000 canlı hücre olayı toplanmalıdır.
Standartlaştırma stratejisi
Farklı örnekler veya deneysel partiler arasında onarım verimliliğinin doğru nicel karşılaştırılması, transfeksiyon verimliliği, hücre yaşamı, örnek yüklemesi ve cihaz performansındaki farklılıklardan kaynaklanan sistematik değişimi en aza indirmek için titiz normalizasyon prosedürleri gerektirir. Yaygın normalleşme stratejileri şunlardır:
1. Normalizasyon plazmidlerinin birlikte transfeksiyonu
  HCR testlerinde, raporlayıcı tabanlı onarım testlerinde ve plazmid bazlı onarım testlerinde, DNA hasarından etkilenmeyen bir normalizasyon plazmidiyle birlikte transfeksiyon önerilir. Yaygın kullanılan kontroller arasında pRL-TK Renilla lusiferaz plazmidleri veya bileşen olarak eksprese edilen GFP vektörleri bulunur. Onarım verimliliği, deneysel raporlayıcı sinyali ile kontrol raporlayıcı sinyali arasındaki oranın hesaplanmasıyla normalleştirilir.
2. Normalizasyon ile temizlik proteinleri veya toplam protein boyama ile
  Western blot analizlerinde onarım protein ekspresyonu veya kalıntı CPD seviyeleri değerlendirilirken, normalleştirme GAPDH, β-aktin veya histon H3 gibi temizlik proteinleri kullanılarak veya Ponceau S veya REVERT boyama gibi toplam protein boyama yöntemleriyle yapılmalıdır.
3. Hasarsız kontroller
  qPCR tabanlı onarım testlerinde, zarar görmemiş genomik bölgeler iç kontroller olarak birlikte amplifikasyon edilmeli ve göreli hasar seviyeleri ΔCt yöntemiyle hesaplanmalıdır. Benzer şekilde, HCR testleri, maksimum raporlayıcı ekspresyonu temsil eden hasarsız plazmid kontrollerini içermelidir; böylece onarım verimliliği zarar görmemiş referans plazmidlere göre ifade edilebilir.
4. Hücre numarası normalizasyonu
  FM-HCR ve DR-GFP testleri dahil olmak üzere akış sitometrisine dayalı testlerde, örnekler arasında eşit sayıda canlı hücre analiz edilmelidir. Onarım verimliliği daha sonra pozitif hücrelerin yüzdesi veya floresan yoğunluğundaki göreceli değişiklikler olarak bildirilmelidir.
Onarım verimliliği ölçümünün kinetik boyutu
DNA onarımı dinamik bir süreçtir ve tek bir zaman noktasından elde edilen ölçümler, gecikmeli onarım ile tam yol eksikliği arasındaki ayrımı yapamayabilir. Bu nedenle, zaman kulturu deneysel tasarımlar şiddetle tavsiye edilir.
DNA hasarının indüklenmesinden sonra, hasar belirteçlerinin veya onarım ürünlerinin birikmesi ve temizlenmesi izlenmek için 0, 0.5, 1, 2, 4, 8, 12 ve 24 saat gibi ardışık zaman noktalarında örnekler alınmalıdır. Sinyal kaybolmasının kinetiği onarım hızı, yol bütünlüğü ve genel onarım verimliliği hakkında önemli bilgiler sağlar.
Çoklu hipotez testi düzeltmesi:
Yüksek verimli ve çoklu üretim yaklaşımları, çoklu onarım yollarının veya deneysel koşulların eşzamanlı analizini içerir; bu da çoklu istatistiksel karşılaştırmalar nedeniyle yanlış pozitif bulgu riskini artırır. Örnekler arasında FM-HCR testleriyle BER, NER, HR ve NHEJ faaliyetlerinin eşzamanlı değerlendirilmesi; BLESS veya BLISS kullanılarak genom çapında DSB analizi; ve DNA onarım gen ifadesinin qPCR dizisi tabanlı analizi.
Buna göre, çoklu hipotez testi için istatistiksel düzeltme yöntemleri deneysel tasarım sırasında önceden tanımlanmalıdır. Seçilen düzeltme yöntemleri ve ayarlanmış anlamlılık eşikleri, Malzemeler ve Yöntemler ile istatistiksel analiz bölümlerinde açıkça bildirilmelidir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

DNA hasar onarım süreçlerinin doğru tespiti ve nicel analizi, DNA onarımının altında yatan moleküler mekanizmaları anlamak, çevresel maruziyetlerin biyolojik etkilerini değerlendirmek ve terapötik yanıtları değerlendirmek için gereklidir⁷⁸. Bu nedenle, DNA hasar onarım yollarının ve onarım verimliliğinin derinlemesine incelenmesi, hem temel araştırmalarda hem de klinik uygulamalarda önemli^{öneme sahiptir 79}.

Birço...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, bu çalışmada bildirilen çalışmayı etkileyebilecek herhangi bir rekabet eden finansal çıkar veya kişisel ilişki belirtmemektedir.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Jiangsu Eyaleti Mühendislik Araştırma Merkezi, Kronik Hastalıkların Önleme ve Kontrolü için Ana Teknolojilerin Geliştirilmesi ve Çevirisi tarafından desteklendi; Jiangsu Yükseköğretim Kurumu Bilim ve Teknoloji Yenilikçi Araştırma Ekibi (2021); Jiangsu Meslek Koleji Mühendislik Teknolojisi Araştırma Merkezi Programı (2023); Çin Jiangsu Yükseköğretim Kurumları'nın Doğa Bilimleri Anahtar Vakfı (Hibe No. 24KJA310008); Suzhou Mesleki Sağlık Koleji'nin Ana Programı (Hibe No. szwzy202406); ve Soochow Üniversitesi Radyasyon Tıbbı ve Koruma Devlet Anahtar Laboratuvarı (Grant No. GZK1202506).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

DNA Onar m Yolaklar Genomik Stabilite Kanser Tedavisi Kemoterap tik la Geli tirme Fonksiyonel Aktivite De erlendirmesi Gen Fonksiyonu Do rulamas DNA Onar m Kapasitesi H cresel Transformasyon

DNA Hasar Onarım Verimlilik Değerlendirme Stratejilerinde Araştırma İlerlemesi

Bu makalede

Özet

Özet

Giriş

İnceleme ve perspektif

Sonuçlar

Açıklamalar

Teşekkürler

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

İlgili makaleler