Drosophila bileşik gözlerinin yüksek çözünürlüklü z-stack görüntülemesi için bant montaj protokolü

Summary

Bu protokolün temel amacı, Drosophila bileşik gözlerinin yıkıcı olmayan görüntülemesi ve nicel analizini mümkün kılmaktır. Bant montaj stratejisini, stereomikroskopik Z-yığını alımı ve Genişletilmiş Odak Derinliği yeniden yapılandırmasıyla birleştirerek yüksek çözünürlüklü, artefaktsız görüntüler üretir.

Abstract

Burada, Drosophila bileşik gözünün yüksek çözünürlüklü fenotipik analizi için yıkıcı olmayan montaj ve görüntüleme protokolü sunuyoruz. Drosophila bileşik gözünün doğru fenotiplenmesi, genellikle konveks geometrisi ve kullanım sırasında mekanik kırılganlığı nedeniyle sınırlıdır. Bunu ele almak için, birden fazla açıdan yüksek çözünürlüklü görselleştirme imkanı sağlayan, çok yönlü, invaziv olmayan bir görüntüleme iş akışını detaylandırıyoruz. Protokol, ters bant platformunda özel bir yapışkan montaj stratejisi kullanır; sinekleri gövde ve kanatlardan sabitlerken, başı tamamen dokunulmadan bırakır. Önemli olarak, bu esnek konfigürasyon belirgin montaj yönelimlerini destekler: bireysel gözlerin tam dışbükey konumunu yakalamak için lateral pozisyon ve tüm baş simetrisini değerlendirmek için ön pozisyon. Bu yöntem aynı zamanda yüksek yoğunluklu dizilerin düzenlenmesini kolaylaştırır ve seans başına 20–30 örnek hızlı işlenmesini sağlar. Yansıtılan ışık stereomikroskopisini Z-stack alımı ve Genişletilmiş Odak Derinliği (EDF) yeniden yapılandırmasıyla entegre ederek, iş akışı eşit derecede keskin, yarı-3D bileşik görüntüler üretir. Bu yaklaşım, doğal pigmentasyonu korur ve organ ölçeğinde nicel fenotipik analizine uygun yüksek isabetli, kontrast açısından zengin görüntüler üretir.

Introduction

Drosophila melanogaster bileşik gözü, organ büyümesi, desenlenmesi ve gelişim sırasında sağlamlığını incelemek için klasik ve güçlü bir modeldir. Yaklaşık 800 yüksek sıralı ommatidiyden oluşan sinek gözü, proliferasyon, farklılaşma ve doku organizasyonunu etkileyen genetik bozulmaların hassas ve ölçülebilir bir okumasını^{sağlar 1,2,3}. Göz gelişiminin genetik manipülasyonu, korunan sinyal yolları hakkında temel içgörüler sağlamıştır. Seminal çalışmalar, transkripsiyon faktörü eyeless'in ektopik ekspresyonunun retina dışı dokularda göz oluşumunu tetiklemek için yeterli olduğunu gösterdi ve bu da gözü organ spesifikasyonu ve plastisitesi için bir paradigma olarak^{belirledi 4}. Sonraki çalışmalar, D. melanogaster Hippo sinyal yolunun proliferasyon ve apoptozun koordineli kontrolü yoluyla göz boyutu ve hücre sayısının merkezi^{düzenleyicisi olarak tanımlanmıştır 5,6}. Paralel olarak, Hedgehog ve BMP sinyalizasyonunun gelişen retina ^7,8 içinde morfogenetik ilerlemesi, büyüme hassasiyeti ve mekansal desenleşmeyi düzenlediği gösterilmiştir.

Ancak, yetişkin bileşik gözün yüksek isabetli görüntülerini yakalamak, dışbükey ve yarımküre geometrisi nedeniyle önemli optik zorluklar teşkilatıyor. Standart parlak alan mikroskopisi, sığ alan derinliği ile sınırlıdır; bu da tek bir pozlamada aynı anda göz en dorsal noktasına (kutup) ve marjinal kenarlarına (ekvator) odaklanmayı imkansız^{kılar 9}. Bu sınırlama genellikle retina yüzeyinin önemli bölümlerinin bulanık olduğu görüntülere yol açar ve bu da çeşitlilikli fenotipleri nicelendirmek için tasarlanmış yüksek çözünürlüklü görüntü analizi ve makine öğrenimi araçlarının uygulanmasını engeller. Retina yüzeyini tam olarak karakterize etmek için, tüm eğrilik optik artefaktlar olmadan görselleştirilmelidir. Bu nedenle, doğal göz morfolojisini koruyan ve tüm kavisli retina yüzeyinin yüksek çözünürlüklü görselleştirilmesini sağlayan bir görüntüleme yöntemi gereklidir.

Ayrıca, mikroskopi için geleneksel örnek hazırlama yöntemleri genellikle sinek başının yapısal bütünlüğünü tehlikeye atar. Geleneksel montaj teknikleri genellikle yüzey detaylarını gizleyebilen veya başlık kapsülüne baskı uygulayan cımbızla fiziksel manipülasyon gerektiren yapıştırıcılara dayanır. Retinal morfogenez çalışmalarında belirtildiği gibi, gözün yapısal bütünlüğü çok önemlidir. Doğrudan basınç veya delme hemolimf sızıntısına neden olur, bu da iç basınç kaybına ve göz yüzeyinin çökmesine veya "ezilmegine" yol açar. Bu mekanik eserler, nörodejeneratif fenotipleri veya genetik kusurları taklit edebilir ve büyük ölçekli ekranlarda yanlış pozitif sonuçlar verebilir. Bu protokolün amacı, sağlam Drosophila bileşik gözlerinin yüksek çözünürlüklü görselleştirmesi için yıkıcı olmayan montaj ve görüntüleme iş akışı sağlamaktır.

Burada, sağlam Drosophila bileşik gözlerinin ve tüm kafa morfolojisinin doğrudan baş teması olmadan yüksek çözünürlüklü görselleştirmesini mümkün kılan hızlı ve tekrarlanabilir bir görüntüleme iş akışı sunuyoruz. Bu yöntemde, yetişkin sinekler, vücut ve kanatları sabitleyen esnek bir yapışkan montaj stratejisiyle hareketsiz hale getirilir; böylece ya yanal bir konumda—tek bir gözün tam eğriliğini yakalamak için—ya da frontal bir yönde konumlandırılarak tüm baş simetrisi ve gözler arası özellikleri değerlendirilir. Bu çok yönlü montaj stratejisi, mekanik hasarı en aza indirir ve doğal göz geometrisini üç boyutta korur. Yansıtılmış ışık stereomikroskopisi, Z-yığını alımı ve genişletilmiş odak derinliği yeniden yapılandırma⁹ ile birleştiğinde, bu yaklaşım birden fazla perspektiften eşit derecede keskin, yüksek kaliteli görüntüler üretir ve hem nitel inceleme hem de nicel fenotipik analiz için uygundur. Bu yöntem, özellikle Drosophila'da genetik bozulmalar, gelişimsel fenotipler ve yüksek verimli göz morfolojisi taraması çalışmaları için uygundur.

Protocol

1. Örnek toplama ve senkronizasyon

NOT: Deneysel karşılaştırılabilirliği sağlamak için, eklozyon zamanlamasının sıkı kontrolü gereklidir. Standart kültür koşulları altında, 25 °C sıcaklıkta, eklozyon genellikle yumurta bırakıldıktan 10 ila 12 gün sonra gerçekleşir. Bu dönemde pupalar yakından izlenmelidir, çünkü pupa kılıfının kararması yakın zamanda eklosyona işaret eder.

1. Doğrudan dokunma yöntemi (Standart yöntem)
   1. Standart 24 x 95 mm plastik Drosophila kültür şişesine (köpük tıpla kapatılmış) yumuşak bir pede hafifçe vurarak yetişkin sinekleri dipten çıkarır.
   2. Tıkaçı hızla çıkarın ve taze toplama şişesinin ağzını kültür şişesiyle hizalasın.
   3. Kurulumu ters çevir, böylece kültür şişesi üst kısımda olsun. Sinekleri toplama şişesine aktarmak için duvarlara hafifçe dokun.
      NOT: Standart mısır unu-agar gıda ortamı nemliyse bu yöntem önerilmez çünkü yeni kapanmış sinekler kolayca yakalanıp öldürülür. Ölümcüllüğü en aza indirmek için, sinekleri önce boş bir 24 x 95 mm şişeye toplayın. Anesteziden (Adım 3) sonra, sinekleri taze gıda ortamı içeren 24 x 95 mm ölçümlüğünde bir şişenin iç duvarına aktarın.
2. Negatif jeotaksis transfer yöntemi (Anti-yapışma yöntemi)
   1. Taze toplama şişesinden tıkaçını çıkarın ve masanın üstüne ters çevirerek başıboş sineklerin girmesini engelleyin.
   2. Kültür şişesini açıklığı aşağıya bakacak şekilde tutun. Sinekler, açıklıktan uzak, yiyecek tarafına doğru yukarı tırmanır.
   3. Açıklık sineklerden temizlendikten sonra, kültür şişesini hızla açın ve tezgah üzerindeki ters 24 x 95 mm toplama şişesine hizalayın.
   4. Bağlantı noktasını tezgaha hafifçe vurarak sinekleri toplama şişesine bırakın.
      NOT: Bu yöntem, gıda yapışmasından kaynaklanan ölümleri önemli ölçüde azaltır ancak doğrudan tıklatmaya göre daha fazla zaman alıcıdır.
3. CO₂ anestezi yöntemi (Yüksek verimlilik yöntemi)
   1. Kültür şişesini ters çevirin ki tıp aşağıya baksın.
   2. CO₂ anestezi tabancasının iğnesini dikkatlice tıkaç ile şişe duvarı arasına sok.
   3. Ayak pedalını ve el valfini nazikçe takarak %100 CO₂'yi düşük ve hafif bir akış hızında serbest bırakın.
   4. Sinekler anestezi edilip tıkaç üzerine düştükten sonra, kültür şişesini yatay olarak yerleştirin. Tıkaçı çıkarın, boş bir toplama şişesiyle hizalayın ve anestezi edilmiş sinekleri toplama şişesine aktarmak için kültür şişesine nazikçe dokunun.
      NOT: Aşırı hava akışı sinekleri yiyecek yüzeyine savuşturabilir, bu yapışmaya ve ölüme neden olabilir; Sineklerin fiziksel olarak yerinden edilmeden anestezi edecek kadar hafif bir_CO2 akışı sıkı sıkı şekilde korun. Kanat ve bacakların hafif seğirmesi veya hareketi gibi erken iyileşme belirtileri için sinekleri yakından izleyin.
4. Etiketleme ve bakım
   1. Koleksiyon şişesine cinsiyet, toplama tarihi, eklonsiyon tarihi, genotip ve kültür koşulları ile etiketleyin.
   2. Cinsiyet Ayrımı: Görüntüleme 10 günden daha büyük sineklerse, çiftleşmeyi ve deneysel ortamı etkileyebilecek F2 neslinin ortaya çıkmasını önlemek için erkek ve dişileri farklı gıda içeren kültür şişelerine ayırın.
      NOT: Sinekler, bu yiyecek içeren şişelerde önceden kültür koşullarında (örneğin 25 °C) istenen görüntüleme yaşasına ulaşana kadar tutulabilir.

2. Montaj plakasının hazırlanması

1. Temiz standart cam mikroskop slaytı edinin.
2. Slayttan yaklaşık 2 cm daha uzun beyaz kağıt maskeleme bandı şeridi kesin.
3. Bandı slayta yapıştırıcı tarafı yukarı bakacak şekilde (yapışkan olmayan taraf cama karşı olsun) yerleştirin. Bantın her iki ucundan da yaklaşık 1 cm sarktığından emin olun.
4. Sarkma uçlarını, sürgü arkasına iki ek ~5 mm bant şeridi sıkıca sararak sabitleyin.
5. Yapışkan yüzeyin düz, gergin ve kırışıklıktan arınmış olduğundan emin olun.
6. Etiketleme: Bantın yapışmaz uçlarına yön göstergeleri (örneğin, "Üst/Yukarı" ve "Alt/Aşağı") veya örnek tanımlayıcıları işaretleyin, böylece mikroskop altında yönlendirme ve örnek takibi kolaylaştırılabilir.
   NOT: Görüntüleme için sinek seçerken, vücut boyutu farklılıkları yüksek olan bireyleri seçmekten kaçının. Aynı büyütme olsa bile, vücut boyutu farklılıkları karşılaştırılamayan bileşik göz yüzey alanlarına yol açabilir.

3. Ötenazi ve montaj

1. Ötenazi
   1. Sinekleri mühürlü ve boş bir toplama şişesine aktarın.
   2. Kapalı şişeyi -80 °C dondurucuya 15–20 dakika koyun.
      DIKKAT: İnce cımbızların keskin uçlarıyla sinekliği asla delmeyin veya sıkmayın. Küçük hemolif sızıntıları bile iç hidrostatik basınçta hızlı bir düşüşe yol açar, bu da bileşik gözde anında ezilme ve geri dönüş edilemez çökmeye yol açar ve görüntüleme kalitesini bozur.
2. Yan görüş için montaj (Tek bileşik göz)
   1. Konumlandırma: Standart bir stereomikroskop altında (örneğin, Nikon SMZ745), ötenaz edilen sineği yan yatan (yan yatmış) pozisyona getirmek için ince uçlu cımbızlar kullanın.
   2. Transfer: İnce uçlu cımbız kullanarak, sineği kanatından nazikçe tutun (yan duruşunu koruyarak) ve hazırlanmış yapışkan montaj plakasına aktarın.
   3. Takıntı: Sineğin vücudunun bir tarafını yapışkan banta yapıştırın. Kanatları açın ve banta düz yapışarak stabiliteyi artırın.
   4. Uzvluk Yönetimi: Montaj sırasında bacakların bileşik gözü tıkamadığından emin olun. Ön bacaklar görüş alanını engelliyorsa, cımbız kullanarak onları dikkatlice gözden uzaklaştırın ve banta sıkıca yapıştırın (örneğin, aşağı doğru uzatmak veya göğsün altına yerleştirmek).
   5. Emniyet: Cimbizleri eğip ucunun yanını (keskin ucu değil) kullanarak gövdeyi banda hafifçe bastırarak sağlam bir bağ sağlanır.
   6. İnce Ayar: Başın yatay olup olmadığını kontrol edin. Göz tek bir odak düzleminde değilse, vücut açısını mikro-ayarlamak için cımbız kullanın.
3. Ön görüş için montaj (Tüm baş)
   1. Pozisyon Verme: Anestezi pedinde, sineği ventral yüzü aşağı (yabu) pozisyona getirin.
   2. Transfer: Bir kanadı cımbızla tutun ve sineği kaldırın. Yapıştırıcı montaj plakasına aktarın.
   3. İlk Sabitleme: Her iki kanadı nazikçe dışa doğru (sol ve sağ) açın ve yapışkan yüzeye sıkıca bastırarak sineği sabitleyin.
   4. Vücut Stabilizasyonu: Yapıştırıcı plakayla tam temas sağlamak için göğüs üzerine nazikçe bastırın. Cimbizle arka karın (kuyruğu) hafifçe tutun ve vücut eksenini düzleştirmek için hafifçe çekin, ardından karın bantına yapıştırın.
   5. Baş Yönelimi: Başın açısını ince cımbızlarla ayarlayarak ön düzlemin (yüzün) yapışkan yüzeye paralel olmasını sağlar. Her iki bileşik göz da aynı odak düzleminde aynı seviyede ve görünür olmalıdır.
4. Düzenleme
   1. Yapışkan yüzeye paralel sıralar veya ızgara şeklinde bir dizi halinde birden fazla sinek monte edin. Z-yığını parazitini önlemek için bireysel sineklerin üst üste bindirmediğinden emin olun, ancak yakından paketleme verimliliği maksimize etmek için izin verilir (örneğin, her slayt başına 20–30 sinek). Tüm sinekleri başları aynı yöne bakacak şekilde hizalayarak (2.6. adımdaki etiketlerde belirtildiği gibi) sistematik görüntülemeyi kolaylaştırın.
   2. Aynı kohorttan farklı ötenazi sinek setleri kullanılarak lateral ve frontal görüntüleme için ayrı örnek dizileri hazırlayın. Bir sinek banda tutturulduktan sonra, numuneye ciddi mekanik zarar vermeden güvenli şekilde çıkarılamaz veya yeniden konumlandırılamaz; bu nedenle, aynı bireyden birden fazla görünüm ardışık olarak görüntülenemez.
      NOT: Doku kurumasını önlemek için ötenazi ve montajdan hemen sonra örneklerin görüntülenmesi şiddetle tavsiye edilir.

4. Görüntü Edinimi

1. Motorlu stereomikroskop görüntüleme sistemi başlatma ve başlatma
   1. PC, monitör ve mikroskop ünitesini sırayla açın.
   2. LAS X yazılımını başlatın.
   3. "Başlat/Kendini test et" uyarısı göründüğünde, hedefin altındaki alanın engellerden temiz olduğundan emin olun ve Onayla' tuşuna tıklayın. Mikroskobun tam Z ekseni kalibrasyon hareketini tamamlamasına izin verin.
      NOT: Aşağıdaki adımlar, LAS X yazılım sistemiyle Stereomikroskop için optimize edilmiştir.
2. Örnek yerleştirme ve aydınlatma
   1. Hazırlanan montaj plakasını motorlu stereomikroskopun taban platformuna aktarın, dijital kameranın hedefi altında dizide ilk örneği ortalayacak şekilde manuel olarak konumlandırın.
   2. İletilen Işık (taban) ve Gelen Işık (üst) kaynaklarını açın. Bileşik göz görüntülemesi için öncelikle Yansıtılan Işığı kullanın. Diyaframı ayarlayarak eşit aydınlatmayı sağlayın.
3. Yazılım yapılandırması
   1. Edinme modunu Z-stack olarak ayarlayın. Proje ayarlarında, motor sürücünün sürekli ve stabil çalışmasını sağlamak için çok boyutlu hareket önceliğini 'Z-first' olarak ayarlayın.
   2. Görüntüleme modunu Yansıtılan Işık'a ayarlayın.
   3. Tam odaklanmış bir görüntünün sentezini sağlamak için Genişletilmiş Odak Derinliği (EDF) etkinleştirin.
   4. Görüntü Gelişmiş Ayarlarında, Yüksek Dinamik Aralık (HDR) etkinleştirin. Bu, bileşik gözün yüksek yansıtıcı, kitinli yüzeyinden kaynaklanan speküler ışıkları ve aşırı pozlamayı azaltmak için şiddetle tavsiye edilir.
4. Konumlandırma ve beyaz denge
   1. Büyütme düğmesini uygun seviyeye ayarlayın (örneğin, yan tek göz görünümü için 16x, ön tüm baş görünümü için 12,5x zoom faktörü), böylece ilgi alanının görüş alanının 1/2 ila 2/3 kısmını kapladığından emin olun.
   2. Montaj plakasını manuel olarak konumlandırarak sineğin göğsün görüş alanının merkezine getirin.
   3. Renk sıcaklığını düzeltmek için toraks kullanarak beyaz denge kalibrasyonu yapın.
5. Pozlama ve görüntüleme parametreleri (Referans değerler)
   Pozlama: 60–80 ms.
   Kazanç: 0–5 (Gürültüyü en aza indirmek için düşük tutun).
   Yoğunluk: %60–%80.
   Z-Stack Adım Boyutu: Standart: 8–12 μm.
   NOT: Pürüzsüz, sağlıklı bileşik gözler için (örneğin, w¹¹¹⁸ × GMR-GAL4), sürekli ve düzenli eğrilik daha az optik kesit gerektirdiğinden, 15 μm'ye kadar basamak yeterli olabilir. Ancak, ani topolojik değişikliklerle karakterize edilen kaba veya düzensiz göz fenotiplerinde, ince yapısal detayları yakalamak ve EDF yeniden yapılandırma doğruluğunu önemli ölçüde artırmak için daha küçük basamak boyutları (5 μm kadar düşük) gereklidir.
6. Z-Stack tanımı ve yakalama
   1. Yansal Görünüm için: Z-yığını aralığını orbital kenardan (Start) orta ommatidiyaya (End) 8–12 μm adım boyutuyla ayarlayın.
   2. Ön Görüş için: Odak düğmesini bileşik gözlerin dış konturu tam odakta olana kadar ayarlayın (Start). Odaklanmayı ters yöne ayarlayın, başın üstündeki merkezi ocelli (sarı basit gözler) tam odakta olana kadar (Son). Set End seçeneğine tıklayın.
   3. Önizlemeyi dondurmak için Stop Live'a tıklayın.
   4. Satın alma başlatma seçeneğine tıklayın. Sistem, tanımlanmış odak düzlemlerini otomatik olarak yakalayacak ve yüksek çözünürlüklü, tam odaklı bir görüntü sentezler.
7. Dosya kaydetme:
   1. EDF yeniden yapılandırması tamamlandıktan sonra, yazılım arayüzünde Kaydet simgesine tıklayın (veya Dosya > Kaydet Olarak Kaydet) seçeneğine gidin.
   2. Hedef dizini seçin, belirlenen dosya adını girin ve Kaydet'e tıklayın.
   3. Her edinimin üç farklı görüntü dosyası oluşturduğunu unutmayın: a. Ham kanal görüntüsü (gri tonlama);b. Renkli önizleme görseli; c. EDF bileşik görüntü ("_Composite" eki ile)
      NOT: Hem ham/kanal görüntüsü hem de EDF bileşik görüntü analiz ve dokümantasyon için tutulmalıdır

Results

Örnek toplamadan görüntü edinimine kadar olan tüm deneysel ürün hattı Şekil 1'de özetlenmiştir. Değiştirilmiş protokolün verimliliği, yüksek yoğunluklu örnek dizilerinin oluşturulmasıyla gösterilmiştir. Şekil 2A'da gösterildiği gibi, 20–30 anestezi edilmiş sinek tek bir ters bant platformunda ızgara şeklinde bir desen şeklinde düzenlenebilir. Bantın yapışmaz uçlarına yazılan yön işaretleyicileri, tutarlı baş yönü sağlar; bu da m...

Discussion

Drosophila bileşik gözü, genetik tarama için güçlü bir fenotipik okuma görevi görür; burada göz boyutu, pürüzlülüğü veya ^{pigmentasyonda gözlemlenebilir değişiklikler 2,3,8} genellikle Hippo ^5,6 veya Hedgehog 7 gibi temel sinyal yollarındaki bozulmaları gösterir. Ancak, bu tür ekranların verimliliği uzun sü...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Karbondioksit (CO2) gaz silindiri	Yerel tedarikçi	Yok
CO2 anestezi üfleme tabancası	T& L	DG-08
Dijital mikroskop kamerası	Leica	DMC6200
İnce cımbızlar	VETUS	MOS-167B
Köpük tıplar	Dongpeng	Yok
Görüntü edinim yazılımı (LAS X)	Leica	3.7.1
Görüntü işleme yazılımı (FIJI/ImageJ)	NIH	Açık kaynak
LED Kubbe Aydınlatma Cihazı	Leica	LED5000 HDI
LED Gooseneck aydınlatma cihazı	Cossim	LG-10
Motorlu stereomikroskop	Leica	M205 FCA
Objektif lens	Leica	1.0x PlanApo NA0.2
Pnömatik ayak pedalı valfi	DELIXI	FV-320
Standart Drosophila kültür şişeleri	LAIBOER	2424951
Standart Drosophila yemek ortamı	Yok	Mısır unu-agar-pekmez
Standart cam mikroskop slaytları	Citotest	10127101P-G
Standart stereomikroskop	Nikon	SMZ745
Beyaz kağıt maskeleme bandı	UBWIN	25mm genişlik