Donmuş doku kesitlerinde transkriptom ve epigenomik hedeflerin mekansal çözülmüş, entegre tek hücreli multiomik profillenmesi

Summary

Bu çalışma, bir doku kesitinin doğrudan uzamsal barkodlamasını tek hücreli çoklu analiz ile birleştiren bir uzamsal Trekker–CUT&Tag çoklu protokolü sunmaktadır. Bu yaklaşım, gen ekspresyonunun ve histon H3K27ac modifikasyonunun aynı anda mekansal olarak çözülen tek hücreli profillenmesini sağlar ve doku mikroanatomisi bağlamında gen düzenlemesine mekanik içgörüler sunar.

Abstract

Mekânsal multiomik teknolojiler ve tek hücreli profilleme, karmaşık dokuların moleküler ve hücresel mimarisini aydınlatmak için eşi benzeri görülmemiş fırsatlar sunar. Çekirdeklerin mekansal barkodlarını, optimal kesme sıcaklığı (OCT) dondurma ortamında yerleştirilmiş doku bloklarından hazırlanan bireysel kriyoseksiyonlarda tek hücreli multiomik testlerle basit ve verimli bir iş akışında birleştirmek, doku tiplerindeki hücrelerin notalanmasını ve mekânsal olarak çözülen moleküler analizini kolaylaştırabilir. Bu çalışma, hedefler ve etiketleme (CUT&Tag) çoklu yaklaşımı altında mekânsal bölünme raporu veriyor; bu yaklaşım, histon H3K27ac modifikasyonunu ve gen ifadesini tek bir donmuş beyin bölümünde aynı anda profilliyor. Mekansal barkodlamadan sonra, tek çekirdekler izole edilir ve CUT&Tag ile tabi tutulur; bu etiketlenmiş DNA, RNA ve mekansal barkodların birleşik yakalanması, kütüphane hazırlığı ve dizileme işlemlerine tabi tutulur. İş akışı, aynı çekirdeklerden mekânsal olarak notasyonlu epigenomik ve transkriptomik profiller üretir ve multiomik bilginin anatomik koordinatlara atamasını sağlar. Epigenomik bilginin mekansal transkriptomik verilerle entegre edilmesi, hücre tipi tanımlamanın doğruluğunu artırır ve sağlam dokular içindeki mekansal olarak düzenlenmiş düzenleyici programları ve hücre-hücre etkileşimlerini ortaya çıkarır.

Introduction

Mekânsal biyoloji, moleküllerin, hücrelerin ve dokuların doğal ortamlarındaki konumunu, organizasyonunu ve etkileşimlerini haritalayan hızla gelişen bir alandır ^1,2,3. Doku ayrışmasını gerektiren ve konumsal bilgi kaybına yol açan toplu veya geleneksel tek hücreli yöntemlerin aksine, mekansal yaklaşımlar analitlerin veya hücrelerin/çekirdeklerin fiziksel koordinatlarını korur ve doku mimarisinin hücre kimliği, hücrelerarası iletişim ve biyolojik işlevi nasıl etkilediğinin doğrudan^{incelenmesini sağlar} 4,5,6,7 . Mekânsal transkriptomik ve mekansal proteomikler şu anda en yaygın benimsenen modaliteler olsa da, alan hızla uzamsal çoklu omik profilleme ^3,8,9 yönünde genişlemektedir. Aynı doku içinde gen ifadesi ve epigenomik durumların birlikte profillenmesi özellikle güçlüdür; çünkü transkripsiyon çıktısını gen aktivitesini yöneten ve mekânsal alanlarda değiştiği bilinen kromatin erişilebilirliği ve histon modifikasyonları gibi düzenleyici mekanizmalarla doğrudan^{ilişkilendirir} 10,11,12 . Bu nedenle, entegre uzamsal epigenom ve transkriptom analizi, düzenleyici programların hücresel kimlik ve doku organizasyonunu nasıl şekillendirdiğine dair kritik içgörüler sağlayacaktır.

Eşzamanlı epigenomik ve transkriptomik profilleme mümkün olmak için birkaç mekânsal multiomik strateji geliştirilmiştir. Deterministik barkodlama, doku dizilemesinde (DBiT-seq), mikrofluidik kanallar kullanarak mekânsal barkodları doğrudan veya dolaylı olarak, jel levhalarla damgalamayarak doku kesitlerine ileterek analizlerin mekânsal açıklamasına olanak tanır. Bu yaklaşım, epigenomik ve transkriptomik özelliklerin mekânsal olarak çözülen ortak^{profillenmesini kolaylaştırır} 12,13,14,15. Takara Trekker platformu olarak ticarileştirilen Slide-tag yöntemi, dissosiyasyondan önce doğrudan uzamsal barkodları sağlam dokuya yerleştirerek, mekânsal indeksli çekirdeklerin standart tek hücreli iş akışlarıyla işlenmesine ve hesaplamalı olarak orijinal doku koordinatlarına geri yansıtılmasına^{olanak tanır 16}. Buna karşılık, erişilebilir kromatin, hücre kökenleri ve dizileme ile gen ifadesi için mekansal test (SPACE-seq), poli(A) kuyruğu epigenetik hedefler ve mRNA'ların uzamsal transkriptomik¹⁷ ile poli-dT yakalama dizisinde yakalandığı bir hedef-çıkış stratejisi kullanır.

Hedefler altında bölünme ve etiketleme (CUT&Tag), DNA ile histon veya histon olmayan proteinler arasındaki etkileşimleri çok düşük girdili örneklerden haritalamak için güçlü bir^{araçtır 18}. CUT&Tag, Tn5 transpozaz aracılı kromatin parçalanması ve DNA etiketlemesine (etiketleme) dayanır; lokus-spesifik bölünme ve moleküler etiketleme için antikor rehberli, protein A-konjuge Tn5 kullanır. Geleneksel CUT&Tag testi birden fazla kuluçka ve yıkama adımını içerirken, basitleştirilmiş ve akıcı bir CUT&Tag iş akışı kullanılarak CUT&Tag verimliliği artırıldı ve sonraki tek hücreli çoklu bilgisayar^{uygulamalarında 19}.

Şekil 1: Mekânsal Trekker–CUT&Tag çoklu ome testinin iş akışı ve kalite kontrol genel özeti. (A) Mekânsal Trekker–CUT&Tag çoklu çalışma akışının şematik diyagramı. Taze donmuş fare beyin dokusunun koronal kesiti bir Trekker mekânsal karosuna monte edilir ve mekânsal barkodlama ile tabi tutulur. Doku lizisinden sonra, çekirdekler izole edilir ve verim ile kalite açısından değerlendirilir. H3K27ac CUT&Tag için yaklaşık 50.000 çekirdek kullanılır ve etiketlenmiş çekirdekler saymadan sonra 10x Genomics Chromium Multiome jel boncukları kullanılarak tek hücreli barkodlama ile tabi tutulur. Tek hücreli barkodlu DNA önceden amplifikasyona alınır ve iki fraksiyona bölünür. Indeksli CUT&Tag kütüphanesi doğrudan indeks PCR ile oluşturulur. Gen ifadesi ve mekânsal barkod kütüphaneleri için, önceden amplifikasyon edilmiş DNA daha da amplifikasyon ve boyut seçimi yapılır. Tipik cDNA boyutlarına uygun parçalar gen ifade kütüphanesi hazırlığı için kullanılırken, daha kısa DNA parçaları mekânsal barkod kütüphanesi oluşturmak için kullanılır. Kütüphaneler, 10x Genomics ve Curio Trekker yönergelerine göre sıralanır ve haritalanır. Beklenen deneysel zaman çizelgesi solda gösterilmiştir. (B) Temel kalite kontrol (QC) kontrol noktaları ve iş akışı boyunca kritik hususlar. Çekirdeklerin kalite kontrolü, verim, bütünlük, toplanma ve döküntü içeriğinin değerlendirilmesini içerir. Ön dizileme kalite kontrolü, tüm kütüphaneler için DNA boyut dağılımlarının ve primer dimer kirlenmesinin değerlendirilmesini içerir. CUT&Tag kütüphanesi özgüllüğü, hedef genomik bölgelerin arka plan üzerinde zenginleşmesini ölçen nicel PCR (qPCR) ile değerlendirilir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Bu çalışma, aktif cis-düzenleyici unsurlarla ilişkili histon H3K27ac modifikasyonunu ve taze donmuş doku kesitlerinde gen ifadesini aynı anda profilleyen bir uzamsal Trekker CUT&Tag çoklu analiz sunmaktadır. Bu protokol, Takara Trekker mekânsal barkodlama, doku ayrımı ve çekirdek izolasyonu, çekirdek sayımı ve kalite kontrolü, H3K27ac modifikasyonunun düşük girdili CUT&Tag profili, 10x Genomics tek hücreli Multiome jel boncuklarında moleküler hedeflerin yakalanması ve kütüphane hazırlığı için adım adım prosedürler sunar. İş akışı, fare beyin dokusunun koronal kesitiyle gösterildi. Standart 10x Genomics Multiome iş akışının aksine, kromatin erişilebilirliği, yüksek verimli dizileme (ATAC-seq) ile transpozaza erişilebilir kromatin testi ile ölçülürken, bu protokol ATAC parçalarını CUT&Tag kökenli DNA parçalarını değiştirerek tek hücre çözünürlükte histon modifikasyon manzaralarının doğrudan sorgulanmasını mümkün kılar. Trekker mekânsal barkodlarını 10x Genomics tek hücreli barkodlarla bağlamak için, poli(A) kuyruğu uzamsal barkodlar ve mRNA transkriptleri Multiome jel boncuklarının poli-dT dizileriyle yakalanırken, CUT&Tag DNA parçaları ise aralıq dizileriyle yakalanır. Bu çift yakalama stratejisi, aynı tek çekirdekten epigenomik, transkriptomik ve mekansal bilgilerin eşzamanlı olarak geri kazanılmasını sağlar. Bildiğimiz kadarıyla, bu, barkod içindeki Trekker mekânsal açıklamasını tek hücreli çoklu yorum testiyle doğrudan entegre eden ilk uzamsal multiomik iş akışıdır ve histon işaretinin genom genom çapındaki dağılımını ve transkriptomu birlikte profil eder. H3K27ac doluluk ve gen ifade verilerini entegre eden mekânsal olarak çözülen çoklu peyzajlar, tek hücre profillerinin orijinal doku koordinatlarına geri projeksiyonunu sağlar ve epigenomik düzenleyici mekanizmalar ile transkripsiyon programları arasında sağlam doku mimarisiyle doğrudan bağlantı sağlar.

Protocol

Yetişkin fareler, doku hasadı öncesinde CO₂ solumasıyla (IACUC #: A48315-15-R24) ötenazi edildi. Sagittal kraniotomi ve yarıya bölünmüş kalvaria çıkarıldıktan sonra beyinler tamamen çıkarıldı. Reaktifler ve kullanılan ekipmanlar Malzeme Tablosu'nda listelenmiştir.

1. Mekânsal barkodlama için Trekker barkod karosuna bir doku bölümü monte etmek

1. Başlamadan önce aşağıdakileri hazırlayın.
   1. Kesitlemeden önce kriostatta optimal kesme sıcaklığı (OCT) gömülü doku bloğunu dengeleyin. UV bölünme, doku ayrışması ve çekirdek izolasyonu için tamponları hazırlayın.
      NOT: Kesitleme için optimal sıcaklık doku tipine bağlı olarak değişebilir.
   2. Çekirdek izolasyonu için, santrifüjü 1.5 mL tüpler için salıncak kovalarla 4 °C'ye kadar önceden soğutun. 12 kuyuyla bir tabağı buz üzerinde Trekker O-ringi ile önceden soğutun.
   3. UV ölçerini maksimum akım sınırına (1.2 A) ve maksimum güce ayarlayın.
2. Kullanılacak Trekker karosunun uzamsal barkod kart kimliğini (örneğin U0001_001) kaydedin.
   NOT: Her Trekker karosu benzersiz barkod koordinatları içerir. Tile ID, dizileme verilerinin uzamsal barkod eşlemesi için doğru dosyayı almak için gereklidir.
3. Dokuyu kesitleyin. 25 μm kalınlığında bregma -1 mm konumunda koronal kesim işlemi −18 °C'de gerçekleştirilmiştir (Şekil 1A).
   NOT: Düşük hücresel dokularla çalışırken kalınlık 30 μm'ye çıkarılabilir.
4. Bölümü (veya ilgi alanını) uzaysal karoya yerleştirin ve sürüş camının altına nazikçe parmak koyarak eritin.
   DIKKAT: Gerekirse, Trekker eğitim karosu kullanılarak çekirdek kalite kontrol ölçümleriyle prosedürleri kontrol edin.
5. Şeffaf yapıştırıcıdan karoyu çıkarmak için cımbız kullanın ve Trekker O-Ring'in üzerine 12 delikli doku kültürü plakasının bir kuyusuna yerleştirin. Hemen 30 μL Trekker UV bölünme tamponunu karoya pipetleyin, tüm dokunun tamponla kaplı olduğundan emin olun.
6. UV lambayı (1.2 A ayarı) kuyunun hemen üzerindeki plakaya yerleştirin. Barkodları serbest bırakmak için 1 dakika ışık tutun ve her şey buzda kalsın.
   DIKKAT: UV lambayla çalışırken koruyucu UV gözlüğü takın.
7. UV lambayı kapatın ve fayansları 7,5 dakika boyunca buzda kuluçka yapın. Kuluçka sırasında, bir Trekker 10 x 10 yıkama odası çıkarın ve 1 ve 2 numaralı odaları 400 μL soğuk Trekker çekirdek yıkama tamponu ile doldurarak buz üzerinde örnek alın.
8. Boncuklara dokunmadan cımbızla fayansları dikkatlice kaldırın ve fayansları 1. odada 5 saniye yıka. Fayansları 2. odada 5 saniye yıka. Fayansları dikkatlice 12 kuyruklu plakanın buz üzerindeki bir kuyuya yerleştirin. Doku bölümü mavi boyanmalı ve kolayca görülebilir.

2. Doku ayrışması ve çekirdeklerin izolasyonu

1. Dokunun hedefinde 175 μL Invent Minute tamponu A dağıtın. Toplamda 700 μL elde etmek için 3 kez daha tekrarlayın. Her dağıtımda, tüm dokuyu fayanslardan ayırmak için fayansın farklı bölümlerine odaklanın.
   NOT: Fayansın çizilmesiyle veya boncukların düşmesinden kaynaklanan boncuk kirlemesini önleyin.
2. Tamponu kuyunun kenarından aspire ederek dokuyu fayansdan ayırmaya devam edin; plakayı mümkün olduğunca buz üzerinde tutarak tamponu doku ile kaplı bölgelere dağıtın. Kafeste doku kalmayana kadar tekrarlayın. Tüm dokular fayanstan çıkarıldıktan sonra, karoyu dikkatlice cımbızla boş bir kuyuya aktarın.
3. Aynı kuyrukta tekrarlanan triturasyonla çekirdekleri mekanik olarak ayırmak için P1000 pipeti kullanın. Görünür doku parçaları kalmayana kadar tekrarlayın.
4. Çekirdek süspansiyonunu, nöron dokuları/hücreleri için Invent Minute tek çekirdekli izolasyon kitinden bir toplama tüpü olan filtre kartuşuna dikkatlice aktarın. Tüpü kapağı açık şekilde –20 °C'de 10 dakika boyunca kuluçka yapın. Filtre kartuşunu kapalı kapatın ve hemen 13.000 x g ile 30 saniye boyunca soğutmalı mikrosantrifüjde santrifüj yapın.
5. Filtre kartuşunu atın ve peleti 10–20 kez nazikçe pipetleyerek tekrar askıya alın. Tüpü önceden soğutulan santrifüjde 600 x g sıcaklıkta salıncak kovalarla 5 dakika boyunca döndürün. Süpernatantı dikkatlice çıkarın ve pelleti 200 μL Trekker tamponu C ile tekrar askıya alın.
6. 1.5 mL düşük bağlayıcı Eppendorf tüpüne 1 mL soğuk Invent Minute tampon B ekleyin ve katmanların karışmasını önlemek için tüpün duvarına yavaşça fırlatarak Minute buffer B'nin üzerine dikkatlice 200 μL çekirdek süspansiyonu yerleştirin. Tüpü önceden soğutulan santrifüjde 500 x g g'de salıncak kovalarla 10 dakika boyunca döndürün. Sütlü tabakayı ve üst tabakayı dikkatlice çıkarın.
7. Çekirdekleri 24 μL Trekker tampon C ile nazikçe yeniden askıya alın ve izole çekirdeklerin kalite kontrol ölçümlerine geçin.

Şekil 2: İzole çekirdeklerin kalite kontrol değerlendirmesi. Fare beyin dokusundan izole edilmiş çekirdeklerin temsilci parlak alan görüntüleri. Çekirdekler %0,4 Trypan mavisiyle boyanmış ve nükleer bütünlük ile enkaz varlığını değerlendirmek için 40x büyütmede görüntülenmiştir. Solda gösterilen çekirdek hazırlığı, aşağı akış testleri için uygun yüksek kaliteli, sağlam çekirdekler gösterirken, sağda gösterilen hazırlık, kısmen lizlenmiş doku agregaları olan düşük kaliteli çekirdekleri gösterir. Hasar görmüş veya yırtılmış çekirdekler doldurulmuş ok uçlarıyla gösterilir. Ölçek çubuğu 100 μm'dir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

3. İzole çekirdeklerin sayımı ve kalite kontrol ölçümleri

1. Çekirdek sayımı için, çekirdek süspansiyonundan 2 μL alın, 8 μL Trekker tamponu C'ye alın. 10 μL seyreltilmiş çekirdek süspansiyonunu 10 μL AO/PI boyama çözeltisi ile karıştırın. Çekirdekleri üreticinin talimatlarına göre say.
2. İzole çekirdeklerin kalitesini değerlendirmek için, çekirdek süspansiyonundan 2 μL %4 tripan mavisi çözeltisi olan 8 μL ile seyreltilmiştir. Çekirdekleri floresan mikroskobu altında 40X büyütmede inceleyin, nükleer zar ve nükleer olmayan kalıntı içeriğinin sağlam morfolojisini kontrol edin (Şekil 2).
3. Hemen tek çekirdekli CUT&Tag multiome (H3K27ac + gen ekspresyonunda CUT&Tag) testine geçin.
   DIKKAT: En az 30.000 yüksek kaliteli çekirdek kurtarılırsa sonraki adımlara geçin.

4. İzole çekirdeklerde CUT&Tag etiketleme

1. CUT&Tag kuluçka tamponu I'i hazırlayın. Buz üzerine koyun.
2. Birincil antikor ve yönlendirme (TAG) enzim konjugatı ile aktive edilen transpozazı hazırlayın.
   1. PCR tüpüne buz üzerinde 46,23 μL CUT&Tag kuluçka tamponu I ve 1,33 μL TAG enzimi ekleyin. Tüpe optimize edilmiş miktarda birincil antikor ekleyin. Yavaşça pipetle 10 kez karıştırın.
      NOT: Reaksiyona 2,43 μL anti-H3K27ac antikor eklendi. Antikor partisi toplu ve yerinde CUT&Tag testleri için doğrulandı. TAG enzim konjugasyonu için antikor miktarını toplu test ile optimize edin. Optimal antikor, pozitif ve negatif hedef lokuslarda qPCR ile belirlenen maksimum sinyal-gürültü oranına ulaşan en düşük konsantrasyon olarak tanımlandı.
   2. Kısa bir süre döndürün ve tüpü 18 rpm'lik bir döner cihazın üzerine yerleştirin. Oda sıcaklığında 1 saat kuluçka yapın. Ortaya çıkan karışım önceden hazırlanıp buzun üzerinde 5 saate kadar konabilir.
      NOT: Antikor-TAG kuluçkası, çekirdek izolasyonu ile eşzamanlı veya öncesinde yapılabilir.
3. İzole çekirdeklerin antikor-TAG enzim konjugat ile kuluçkası.
   1. İzole çekirdeklerin tüpünü (Adım 2.7) önceden soğutulan santrifüjde salıncak kovalarıyla 500 x g g'de 10 dakika boyunca döndürün. Süpernatantı pelleti rahatsız etmeden çıkarın ve geride ~5 μL süpernatant bırakın.
   2. 25 μL CUT&Tag kuluçka tamponu I (Adım 4.1) ekleyin ve 10 kez nazikçe pipetle tekrar süzülün. Çekirdekleri, aynı pipet ucu kullanarak antikor-TAG konjugatı içeren tüpe (Adım 4.2.2) aktarın. 10 kez pipetle nazikçe karıştırın ve tüpü nazik bir rotatora yerleştirin.
   3. 4 °C'de gece boyunca kuluçka yapın.
4. Ertesi gün (2. gün), 1X CUT&Tag çekirdek tamponu hazırlayın ve buzun üzerine koyun.
5. CUT&Tag etiketleme
   1. Reaksiyon tüpünü (Adım 4.3.3) rotatordan alın. 5 μL CUT&Tag aktivatörü ekleyin ve karışımı yeni bir 1.5 mL tüpe aktarın. Termomikserde 37 °C'de 550 rpm'de 1 saat kuluçka yapın.
   2. Tüpü alın, 20 μL CUT&Tag soğutma tamponu ekleyin ve reaksiyonu 10 kez pipetleyerek nazikçe karıştırın. Tüpü önceden soğutulan santrifüjde 500 x g sıcaklıkta salıncak kovalarla 10 dakika boyunca santrifüjleyin. Çekirdek pelletini rahatsız etmeden süpernatantı çıkarın, tüpün tabanında ~5 μL süpernatant bırakın.
   3. 100 μL 1X CUT&Tag çekirdek tamponu ekleyin ve çekirdekleri 10 kez nazikçe pipetleyerek yeniden askıya alın. Tüpü önceden soğutulan santrifüjde 500 x g g'de salıncak kovalarla 10 dakika boyunca döndürün. Üst yüzeyden 85 μL çıkarın, geride ~15 μL kalın. Çekirdekleri nazikçe ve yavaş 10 kez pipetle yeniden süspansiyona alın.
6. Etiketlenmiş çekirdeklerin sayılması ve hedef sayısının belirlenmesi
   1. Etiketlenmiş çekirdek süspansiyonundan 1 μL 9 μL fosfatla tamponlanmış tuzlu suyla eklenir ve 10 μL AO/PI boyama çözeltisi ile karıştırılır. Etiketlenmiş çekirdekleri Adım 3.1'de tarif edildiği gibi sayın.
   2. Tek hücreli GEM üretimi için hedef çekirdek sayısının 1,6 katı kullanılarak istenen yakalanan çekirdek sayısını elde edin.
   3. Tüpü önceden soğutulan santrifüjde 500 x g g'de salıncak kovalarla 10 dakika boyunca döndürün ve süpernatantı dikkatlice çıkarın, böylece son hacim 8 μL kalın.

5. Etiketlenmiş çekirdeklerin tek hücreli barkodlaması ve barkodlu DNA'ların ön amplifikasyonu

1. Deneyiniz için beklenen hedefleme çekirdek sayısıyla etiketlenmiş çekirdeklerin 8 μL'sine 7 μL ATAC tamponu B ekleyin.
   NOT: Chromium Next GEM Single-Cell Multiome ATAC + Gen İfadesi Kiti Kullanıcı Rehberi'nin "GEM Generation & Barcoding" protokolünde Chromium X enstrümanının reaksiyon kurulumları ve çalışma hakkındaki daha fazla detayı (CG000338 Rev G) için görebilirsiniz.
2. Chromium X enstrümanı kullanılarak GEM üretimi ve barkodlama.
   1. Etiketlenmiş çekirdekler içeren tüpe 60 μL GEM master karışımı ekleyin. Pipetle nazikçe karıştırın ve Chromium Next GEM çipi J'nin 1. sırasına yükleyin.
   2. Tek hücreli Multiome jel boncukları hazırlayın ve 2. sıraya 50 μL Jel boncuk yükleyin. 3. sıradaki kuylara 45 μL bölme petrolü dağıtın.
   3. Montaj edilmiş çip J'yi contayla birlikte Chromium X enstrümanının tepsisine yerleştirin ve enstrümanı çalıştırın.
   4. Üst sıradaki geri kazanım kuyuslarının en düşük noktalarından yavaşça 100 μL GEM aspirasyon yapın 3. GEM'leri pipet uçları kuyunun yan duvarlarına yaslanarak buz üzerinde yeni PCR tüpüne yavaşça dağıtın.
   5. Toplanan GEM'leri termal döngücü içinde (kapak sıcaklığı 50°C) şu protokolle kuluçka edin: bir döngü 37 °C'de 45 dakika, bir döngü 25 °C'de 30 dakika ve 4 °C bekleme için.
   6. 5 μL söndürme maddesi ekleyin ve pipetle 10 kez yavaşça karıştırın.
3. GEM sonrası kuluçka ve DNA arıtmalarının temizlenmesi
   NOT: Daha fazla detayı Chromium Next GEM Single-Cell Multiome ATAC + Gen İfadesi Kiti Kullanıcı Rehberi'nin (CG000338 Rev G) "Post GEM Inkubasyon Temizliği" protokolünde bulabilirsiniz.
   1. Oda sıcaklığında tüpe 125 μL pembe renkli geri kazandırıcı madde ekleyin ve tüpü nazikçe 10 kez ters çevirin. Kısa bir süreliğine santrifüj. Tüpün tabanından 125 μL geri kazanma ajanı/bölme yağını (pembe) yavaşça çıkarıp at.
   2. Tüpe 200 μL Dynabeads temizlik karışımı ekleyin ve 10 kez pipetle karıştırın. Oda sıcaklığında 10 dakika kuluçka yapın. Tüpü manyetik standın üzerine koyun, çözelti temizlenene kadar. Üst yüzeyi çıkarın.
   3. Pellete 300 μL taze hazırlanmış %80 etanol ekleyin. 30 saniye kuluçka yapın ve süpernatantı çıkarın. Pellete 200 μL %80 etanol ekleyin, 30 saniye kuluçka yapın ve üst yüzeyi çıkarın. Tüpü kısa bir süre döndürün ve mıknatısın üzerine yerleştirin. Kalan üst yüzeyi çıkarın.
   4. Tüpü mıknatıstan çıkarın. Hemen 50,5 μL elülasyon çözeltisi I ekleyin. Pipotle karıştırın ve oda sıcaklığında 1 dakika kuluçka yapın. Kısa bir süre döndürün ve çözelti temizlenene kadar tüpü mıknatısın üzerine yerleştirin. 50 μL temizlenmiş çözeltiyi yeni bir tüpe aktarın.
   5. Paramanyetik boncuklarla DNA arındırması
      1. Her numuneye 90 μL paramanyetik boncuk (1.8X) ekleyin ve pipetle iyice karıştırın. Oda sıcaklığında 5 dakika kuluçka yapın. Kısa bir süre döndürün ve çözelti temizlenene kadar tüpü mıknatısın üzerine yerleştirin. Üst yüzeyi çıkarın.
      2. Pellete 200 μL %80 etanol ekleyin. 30 saniye kuluçka yapın. Etanolü çıkar. Bunu bir kez daha tekrarlayın.
      3. Kısa bir süre döndürün ve tüpü mıknatısın üzerine yerleştirin. Kalan üst yüzeyi çıkarın.
      4. Tüpü mıknatıstan çıkarın. 46,5 μL tampon EB ekleyin ve pipetle karıştırın. Oda sıcaklığında 2 dakika kuluçka yapın. Döndürün ve çözelti temizlenene kadar mıknatısın üzerine yerleştirin.
      5. 46 μL saflaştırılmış DNA'yı yeni bir tüpe aktarın.
4. Barkodlu DNA'ların ön amplifikasyonu.
   1. Her numuneye 54 μL ön amplifikasyon karışımı ekleyin. Kısa bir süre pipet karıştırıp santrifüj yapın.
   2. Termal döngülü (kapak sıcaklığı 105 °C) içinde şu protokolle kuluçka yapın: 5 dakika boyunca 72 °C bir döngü; 3 dakika boyunca 98 °C bir döngü; toplam 7 döngü 98 °C 20 saniye, 63 °C 30 saniye, 72 °C 1 dakika için; 1 dakika boyunca 72 °C bir döngü; ve 4 °C'de bir tutma var. Gece boyunca 4 °C'de sakla.
   3. Ertesi gün (3. Gün), önceden amplifikasyonlu DNA'ları paramanyetik boncuklarla (1.6X) Adım 5.3.5'te tarif edildiği şekilde arındırın. Tüpe 80,5 μL tampon EB ekleyin ve pipetleme ile karıştırın. 22 °C'de (oda sıcaklığında) 2 dakika kuluçka yapın. Kısa bir süre döndürün ve çözelti temizlenene kadar tüpü mıknatısın üzerine yerleştirin.
   4. 80 μL önceden amplifikasyonlu DNA'yı yeni bir tüpe aktarın. CUT&Tag kütüphanesini oluşturmak için 40 μL kullanın. Kalan önceden amplifikasyona edilmiş DNA'ları 4 °C'de depolayın.
      NOT: Kalan önceden amplifikasyona sahip DNA'ların 40 μL'si daha sonra gen ifadesi ve mekansal barkod kütüphaneleri için kullanılacaktır.

6. CUT&Tag, gen ifadesi ve mekansal barkodlar için kütüphane hazırlığı

1. scCUT&Tag kütüphanesinin hazırlanması
   1. 40 μL önceden amplifikasyonlu DNA yeni bir tüpe aktarın ve 60 μL örnek indeksli PCR karışımı ekleyin. Pipotle karıştırın ve kısa bir süre çevirin.
   2. Termal döngülü (kapak sıcaklığı 105 °C) içinde şu protokolle kuluçka yapın: 45 saniye boyunca 98 °C bir döngü; toplamda 12 döngü 98 °C 20 saniye, 67 °C 30 saniye, 72 °C 20 saniye; 1 dakika boyunca 72 °C bir döngü; Beklemek için 4 °C).
      NOT: Optimal döngü sayısı, çekirdeklerin başlangıç sayısına ve profillenen histon işaretine bağlıdır. Deneyde H3K27ac işareti için on iki amplifikasyon döngüsü kullanıldı.
   3. Paramanyetik boncuklarla çift boyut seçimi ve DNA arındırması (0.6X, 1.55X)
      1. Her numuneye 60 μL paramanyetik boncuk (0.6X) ekleyin ve pipetle iyice karıştırın. Oda sıcaklığında 5 dakika kuluçka yapın. Kısa bir süre döndürün ve çözelti temizlenene kadar tüpü mıknatısın üzerine yerleştirin.
      2. 150 μL süpernatantı yeni bir tüpe aktarın. Her örnekte (süpernatant) 95 μL paramanyetik boncuk (1.55X) eklenir ve pipetleme ile karıştırılır. Oda sıcaklığında 5 dakika kuluçka yapın. Tüpü mıknatısın üzerine yerleştirin, çözelti temizlenene kadar. Üst yüzeyi çıkarın.
      3. Pellete %80 etanol 300 μL ekleyin. 30 saniye bekle. Etanolü çıkar. Bir kez daha tekrarlayın. Kısa bir süre döndürün ve tüpü mıknatısın üzerine yerleştirin. Kalan üst yüzeyi çıkarın.
      4. Tüpü mıknatıstan çıkarın. Tüpe 20,5 μL tampon EB ekleyin ve pipetle karıştırın. Oda sıcaklığında 2 dakika kuluçka yapın. Döndürün ve çözelti temizlenene kadar mıknatısın üzerine yerleştirin.
      5. 20 μL arındırılmış ve indekslenmiş CUT&Tag kütüphanelerini yeni tüplere aktarın.
2. CUT&Tag kütüphanesi için kalite kontrol
   1. Kütüphanedeki DNA boyut dağılımı analizi
      1. 1 μL arındırılmış kütüphane DNA'sı ile 1 μL düşük TE tamponu karıştırın.
      2. Sulandırılmış DNA'yı Fragment Analyzer çalışma tamponu ile karıştırın ve yüksek hassasiyetli HS NGS Fragment Kit (1-6000bp) ile cihazda çalıştırın (Şekil 3A).
   2. H3K27ac-pozitif genomik lokusun zenginleşmesini dizileme ve haritalamadan önce değerlendirin.
      1. 1 μL arındırılmış kütüphane DNA'sı ile 4 μL nukleazsız su karıştırın. Üç genomik lokus için qPCR ölçümleri için 1 μL seyreltilmiş kütüphane DNA'sı kullanın.
         NOT: H3K27ac CUT&Tag için pozitif primer Actb-TSS lokusundan tasarlanmışken, T1-TSS ve intergenik lokusu hedefleyen primerler negatif^{kontrol 20} olarak hizmet vermiştir (Tablo 1). PCR verimliliğini normalleştirmek için fare genomik DNA'sı giriş kontrolü olarak kullanılmıştır (Şekil 3B).
      2. Reaksiyon karışımından toplam 20 μL şu şekilde hazırlanır: 1 μL seyreltilmiş kütüphane DNA'sı, 2 μL 10 μM primer karışımı, 10 μL 2X SYBR Green Master Mix ve 7 μL nukleazsız su.
      3. Hazırlanan qPCR plakasını CFX Opus Real-Time PCR Sistemi'nde uygun döngü programı kullanarak SYBR Green tespiti için çalıştırın.
3. cDNA'ların ve uzamsal barkod DNA'larının amplifikasyonu.
   1. 35 μL önceden amplifikasyonlu DNA (Adım 5.4.4) yeni bir tüpe aktarın ve 65 μL cDNA amplifikasyon reaksiyon karışımı ekleyin. Pipotle karıştırın ve kısa bir süre çevirin. cDNA ve mekânsal barkod DNA amplifikasyonu için kullanılan primer, Feature cDNA Primers 2'dir.
   2. Termal döngülü (kapak sıcaklığı 105 °C) içinde şu protokolle kuluçka yapın: 45 saniye boyunca 98 °C bir döngü; toplamda 8 döngü: 98 °C 20 saniye, 63 °C 30 saniye, 72 °C 1 dakika; 1 dakika boyunca 72 °C bir döngü; Beklemek için 4 °C.
      NOT: Optimal döngü sayısı hücre tipi, RNA içeriği ve çekirdeklerin başlangıç sayısına göre belirlenmelidir. Bu deneyde 8 amplifikasyon döngüsü gerçekleştirildi.
   3. Amplifikasyonlu cDNA'ların Arıtılması
      1. Çift boyut seçimi ve paramanyetik boncuklarla (0.6X, 2.0X) DNA arındırması, Adım 6.1.3'te açıklandığı gibi. Her sample'a 60 μL paramanyetik boncuk (0.6X) ekleyip pipetle karıştırılır. Oda sıcaklığında 5 dakika kuluçka yapın. Mıknatısı çözeltinin üzerine yerleştirin, ta ki temizlenene kadar.
      2. 75 μL süpernatantı yeni bir tüpte aktarın ve pelleti rahatsız etmeden tasarruf edin. Oda sıcaklığında tutun.
         DIKKAT: Süpernatantı atmayın, çünkü bu parça, uzamsal barkod kütüphanesi oluşturmak için kullanılacak kısa parçalar için zenginleştirilmiş DNA içerir.
      3. Pelletten kalan üst yüzeyi çıkarın. Adım 6.1.3'te açıklandığı gibi %80 etanol ile iki kez yıkayın.
      4. Tüpe 40,5 μL tampon EB ekleyin ve pipetle karıştırın. Oda sıcaklığında 2 dakika kuluçka yapın. Kısa bir süreliğine döndürün ve çözelti temizlenene kadar mıknatısın üzerine koyun.
      5. 40 μL amplifikasyon cDNA'yı yeni bir tüpe aktarın. Indekslenmiş gen ifade kütüphanesi hazırlamak için buzda sakla.
         NOT: Bu fraksiyon, tipik cDNA boyutu için DNA'ları zenginleştirir.
   4. Amplifikasyonlu uzamsal barkod DNA'larının arındırılması
      1. Daha önce kaydedilen süpernatantın 75 μL'sine 70 uL paramanyetik boncuk (2.0X) eklenin (Adım 6.3.3.2. Pipotle karıştırın ve kısa bir süre çevirin. Oda sıcaklığında 5 dakika kuluçka yapın. Tüpü mıknatısın üzerine yerleştirin, çözelti temizlenene kadar. Üst yüzeyi çıkarın.
      2. Adım 6.1.3'te açıklandığı gibi %80 etanol ile iki kez yıkayın.
      3. Tüpe 40,5 μL tampon EB ekleyin ve pipetle karıştırın. Oda sıcaklığında 2 dakika kuluçka yapın. Kısa bir süreliğine döndürün ve çözelti temizlenene kadar mıknatısın üzerine koyun.
      4. 40 μL amplifikasyon ve arındırılmış uzamsal barkod DNA'larını yeni bir tüpe aktarın. Indeksli uzamsal barkod kütüphanesinin sonraki nesli için −20 °C'de saklanın.
   5. Fragment Analyzer tarafından cDNA boyutlarının analizi. 1 μL amplifikasyon cDNA'ları 1 μL düşük TE tamponu ile karıştırın. Sulandırılmış DNA'ları Parça Analizörü ile Adım 6.2.1'de açıklandığı şekilde çalıştırın.
   6. İndeksli gen ifade kütüphanesinin hazırlanması
      1. 10 μL amplifikasyonlu cDNA (Adım 6.3.3.5) yeni bir tüpe aktarın. 25 μL tampon EB ve 15 μL parçalanma karışımı ekleyin. Buz üzerinde pipetle karıştırın. Kısa bir süre döndürün ve tüpü 4 °C'de önceden soğutmalı termal döngüye aktarın.
      2. Termal döngücü içinde (kapak sıcaklığı 65 °C) şu protokolü başlatarak kuluçka edin: 5 dakika boyunca 32 °C bir döngü; 30 dakika boyunca 65 °C sıcaklıkta bir döngü; Beklemek için 4 °C.
      3. Çift boyut seçimi ve paramanyetik boncuklarla (0.6X, 0.8X) DNA arındırma, Adım 6.1.3'te açıklandığı gibi. 50,5 μL tampon EB ekleyin ve pipetle karıştırın. Oda sıcaklığında 2 dakika kuluçka yapın. Kısa bir süreliğine döndürün ve çözelti temizlenene kadar mıknatısın üzerine koyun.
      4. 50 μL numuneyi yeni bir tüpe aktarın. 50 μL adaptör ligasyon karışımı ekleyip pipetle karıştırın. Kısa bir süre dön. Termal döngülü bir cihazda (kapak sıcaklığı 30 °C) şu protokolle kuluçka yapın: bir döngü 20 °C'de 15 dakika ve 4 °C bekleme için.
      5. Paramanyetik boncuklarla (0.8X) DNA arıtma, Adım 5.3.5'te açıklandığı gibi. 30,5 μL tampon EB ekleyin ve pipetle karıştırın. Oda sıcaklığında 2 dakika kuluçka yapın. Kısa bir süreliğine döndürün ve çözelti temizlenene kadar mıknatısın üzerine koyun. Numunenin 30 μL kısmını yeni bir tüpe aktarın.
      6. Gen ifade kütüphanesinin PCR indeksi. Her sample'a 50 μL amplifikatör karışımı eklenir ve her sample'a 20 μL ayrı çift indeksli TT seti A eklenir.
      7. Termal döngülü (kapak sıcaklığı 105 °C) içinde şu protokolle kuluçka yapın: 45 saniye boyunca 98 °C bir döngü; toplamda 11 döngü 98 °C (20 saniye), 54 °C (30 saniye), 72 °C (20 saniye); 1 dakika boyunca 72 °C bir döngü; Beklemek için 4 °C.
         NOT: Optimal döngü sayısı hücre tipi, RNA içeriği ve çekirdeklerin başlangıç sayısına göre belirlenmelidir. Bu deneyde toplamda 11 amplifikasyon döngüsü kullanıldı.
      8. Çift boyut seçimi ve paramanyetik boncuklarla (0.6X, 0.8X) DNA arındırma, Adım 6.1.3'te açıklandığı gibi. Tüpe 35,5 μL tampon EB ekleyin ve pipetle karıştırın. Oda sıcaklığında 2 dakika kuluçka yapın. Kısa bir süreliğine döndürün ve çözelti temizlenene kadar mıknatısın üzerine koyun.
      9. 35 μL arındırılmış ve indekslenmiş gen ifade kütüphanesini yeni bir tüpe aktarın.
4. Gen ifade kütüphanesinde DNA boyut dağılımı analizi. 1 μL kütüphane DNA'sı ile 1 μL düşük TE tamponu karıştırın. Seyreltilmiş DNA'ları Adım 6.2.1'de tarif edildiği gibi çalıştırın. (Şekil 3A).
5. İndekslenmiş mekânsal barkod kütüphanesinin hazırlanması
   1. Örnek indeksli PCR karışımından toplamda 100 μL aşağıdaki şekilde hazırlanın: 50 μL Amp Karışımı (GEM-X Tek Hücreli 3' Özellik Barkod Kiti'nden), 25 μL Tampon EB, 20 μL Çift İndeksli Plaka TT Set A'dan primer ve 1 μL saflaştırılmış uzamsal barkod DNA'ları (Adım 6.3.4.4) 4 μL EB tamponunda seyreltilmiş.
   2. Termal döngülü (kapak sıcaklığı 105 °C) içinde şu protokolle kuluçka yapın: 45 saniye boyunca 98 °C bir döngü; toplam 7 döngü 98 °C (20 saniye), 54 °C (30 saniye), 72 °C (20 saniye); 1 dakika 72 °C; Beklemek için 4 °C.
   3. Paramanyetik boncuklarla (1.2X) DNA arıtma, Adım 5.3.5'te açıklandığı gibi. Tüpe 35,5 μL EB tamponu ekleyin ve pipetle karıştırın. Oda sıcaklığında 2 dakika kuluçka yapın. Tüpü mıknatısın üzerine yerleştirin, çözelti berrak olana kadar.
   4. 35 μL arındırılmış ve indekslenmiş mekânsal barkod kütüphanesi DNA'larını yeni bir tüpe aktarın. 4 °C'de 72 saate kadar veya uzun süreli depolama için −20 °C'de depolayın.
6. İndeksli uzamsal barkod kütüphanesinde DNA boyutlarının dağılımını kontrol edin. 1 μL arındırılmış kütüphane DNA'sı ile 1 μL düşük TE tamponu karıştırın. Sulandırılmış DNA'ları Parça Analizörü ile Adım 6.2.1'de (Şekil 3A) açıklandığı şekilde çalıştırın.

Şekil 3: Indekslenmiş kütüphanelerin kalite kontrol değerlendirmeleri. (A) Amplifikasyon DNA'larda ve indekslenmiş kütüphanelerde boyut profilleri. DNA, DNA kalitesi ve boyut dağılımını değerlendirmek için bir Parça Analizörü tarafından analiz edilir. Gösterilen, indekslenmiş CUT&Tag kütüphanesi için temsilci profiller, gen ifadesi ve mekansal barkod kütüphanesi hazırlanmasında kullanılan amplifikasyonlu DNA, indeksli gen ifade kütüphanesi ve indekslenmiş mekânsal barkod kütüphanesi yer almaktadır. (B) CUT&Tag kütüphanesi, H3K27ac-negatif arka plan sinyali (yani T1 ve bir intergenik lokus) üzerinde H3K27ac-pozitif genomik bölgenin (yani ACTB) zenginleşmesini değerlendirmek için qPCR ile analiz edilir. Pozitif/negatif bölgeler arasındaki katlama farkı^{zenginleştirme 21} olarak hesaplanır. 10'dan büyük bir katlama zenginleştirmesi bu^{test 20'de} ideal olarak kabul edilir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

7. Kütüphanelerin sıralanması

1. Trekker mekânsal barkod kütüphanesini, yakalanan çekirdek başına 5.000 okunma çifti derinlikte sıralayın.
2. H3K27ac CUT&Tag kütüphanesini, yakalanan çekirdek başına 25.000 okunma çifti derinlikte sıralayın.
3. Gen ifade kütüphanesini, yakalanan çekirdek başına en az 20.000 okunma çifti derinlikte dizileyin.

8. Biyoinformatik ve veri analizi

1. Cell Ranger ARC v2.0.2 ile gen ifadesi ve CUT&Tag okumalarını işlem, --min-atac-count=1000 ve --min-gex-count=1000 ile yapılır. Cell Ranger ARC çıktılarını, Trekker pipeline v1.3.0 kullanarak varsayılan parametrelerle mekansal konumları atanarak Trekker barkod bilgisiyle entegre edin.
2. Signac kullanarak kalite kontrolü yapın. Aşağıdaki kriterlerden herhangi birini karşılayan hücreler aşağı akış analizinden çıkarıldı: CUT&Tag için toplam parça sayısı 1.000.000 veya 100≤ ≥ ve TSS zenginleştirmesi 2≤ için; gen ekspresyonunda ise toplam UMI sayısı 100.000 veya 1.000 ≤ ≥ ve toplam tespit edilen gen sayısı 10.284 veya 200 ≤ ≥ vardır.
3. Gen ekspresyonu için scDblFinder ve CUT&Tag için AMULET kullanarak çiftleri çıkarın. Aşağıdaki kriterlerden herhangi birini karşılayan hücreler dublet olarak sınıflandırıldı: (1) scDblFinder puanı ≥ 0.6; (2) scDblFinder puanı ≥ 0.3 ve AMULET ≤ 0.01; ve (3) yüksek dublet oranına sahip kümelerde.
4. LogNormalize ile gen ifade verilerini normalize edin ve TF-IDF ile CUT&Tag verilerini normalize edin. Kromatin modalitesi için LSI boyutları 2–50 kullanılarak PCA ve CUT&Tag LSI gömütmelerini hesaplayın. FindMultiModalNeighbors kullanarak ağırlıklı bir en yakın komşu grafiği oluşturun ve multimodal komşu grafiğine dayalı UMAP gömülmeleri oluşturun.
5. FindTransferAnchors ve varsayılan parametrelerle PCA projeksiyon haritalama stratejisine dayalı Seurat etiket transferi kullanarak kalite sonrası Trekker verilerini nota edin. ABC Atlas'tan (20230630. sürüm) scRNA-seq verileri referans olarak kullanıldı. Bilinen doku anatomisiyle tutarsız hücre tipi tahminleri manuel kürleme sırasında kaldırıldı.
   NOT: Biyoinformatik analiz için scriptler GitHub'da mevcut: https://github.com/Liuy12/Mouse_Brain_Trekker_Multiome_Cuttag

Results

Taze donmuş fare beyin dokusunun koronal kesiti (25 μm kalınlığı, yaklaşık %70 kapsam oranı 10 × 10 mm uzamsal karo) kullanarak, burada tanımlanan iş akışı tutarlı bir şekilde 50.100 yüksek kaliteli çekirdek (SD = 12.200, n = 8) üretmiştir; bu da aşağı akış tek hücreli multiomik profilleme için yeterli olmuştur (Şekil 1). Trekker doku kesitinin mekansal barkodlamasının ardından, çekirdekler hafif doku ayrıştırmasıyla izole edildi ve Invent tek çekirdekli izolasyon kiti ile daha da saflaştırıldı. Bu prosedür, minimum döküntü ve düşük düzeyde nükleer agregasyon ile sonuçlanarak, tek hücreli testler için uygun çekirdek preparatları üretti. İzole çekirdeklerin temsilci görüntüleri Şekil 2'de gösterilmiştir.

Aşağı akış tek çekirdekli testlerde, CUT&Tag çoklu profilleme (CUT&Tag + gen ekspresyonu) dahil, burada genellikle yaklaşık 50.000 çekirdek işlenmiştir. Nükleer geri kazanımı maksimize etmek için, doğrudan antikor–pA/Tn5 hedefleme ve etiketleme kullanılarak basitleştirilmiş ve aktuallaştırılmış bir CUT&Tag protokolü uygulandı; böylece kuluçka süreleri ve yıkama^{adımları en aza indirildi 19}. Bu yaklaşımla, ortalama %48,3 verimle yaklaşık 25.000 etiketlenmiş çekirdek geri kazanıldı (SD = 6,1, n = 3). Bu çekirdekler daha sonra 10x Genomics Chromium Multiome jel boncuklarıyla tek hücreli barkodlama için kullanıldı. GEM üretimi için, kaliteli filtreleme sonrası ~10.000 mekansal indeksli çekirdeğin geri kazanılması beklentisiyle yaklaşık 15.000 çekirdek hedef alındı. Trekker mekânsal barkod kod çözme yöntemine göre, tek hücreli veri setindeki çekirdeklerin %81,3'ü (SD = 9, n = 3) kart içindeki mekansal konumlara güvenle atanabiliyordu.

Mekânsal Trekker–CUT&Tag çoklu bilgisayar iş akışı üç indeksli kütüphane oluşturur: CUT&Tag, gen ifadesi ve mekansal barkod kütüphaneleri. Önceden amplifikasyona sahip barkodlu DNA, jel boncuklardaki hedeflerin yakalama kimyası nedeniyle kütüphane hazırlığı için kullanılan iki fraksiyona ayrıldı. CUT&Tag kütüphaneleri, önceden amplifikasyonlu DNA'dan doğrudan amplifikasyon yapıldı ve nükleozomsuz ve nükleozomal DNA'lara karşılık gelen CUT&Tag etiketlemesinin karakteristik parça boyut dağılımlarını gösterdi (Şekil 3A). Kütüphane, H3K27ac-negatif genomik^{lokuslar 20,21} üzerinde H3K27ac-pozitif Actb lokusunun iyi bir zenginleşmesini gösterdi (yani, 68 kat fark, H3K27ac²⁰ için kromatin immünopresipitasyon-dizileme analizi için belirlenen 10 kat kesme sınırını aşıyor) (Şekil 3B). Gen ifadesi ve mekansal barkod kütüphaneleri için, önceden amplifikasyonlu DNA önce 10x Genomics cDNA amplifikasyon protokolü ile amplifikasyon yapıldı ve ardından paramanyetik boncuk arıtımı kullanılarak parça boyutuna göre iki fraksiyona ayrıldı. İndeksli uzamsal barkod kütüphanesi, daha kısa parçalar için zenginleştirilmiş fraksiyondan hazırlanmış ve beklenen parça boyutunda keskin bir zirve göstermiştir. Gen ifade kütüphaneleri, amplifikasyonlu cDNA parçalarının etrafında merkezlenmiş karakteristik bir boyut dağılımı göstermiştir (Şekil 3A).

Şekil 4: Fare beyin dokusunda mekansal Trekker–CUT&Tag çoklu analiz testinin tek hücreli ve mekansal temsili. (A) Tek hücre analiziyle hücre tiplerinin tanımlanması. Uniform manifold yaklaşım ve projeksiyon (UMAP) grafikleri, yalnızca H3K27ac CUT&Tag, sadece gen ifadesi ve entegre çoklu ome veri setinden (CUT&Tag + gen ekspresyonu) türetilen annotasyonlu hücre popülasyonlarını gösterir. (B) Mekânsal Trekker–CUT&Tag çoklu ome verilerinin mekânsal temsili. Entegre çoklu veri setinden çekirdekler, Trekker barkodları kullanılarak mekansal koordinatlara atanır ve fare beyin dokusu bölümünde hücre tiplerinin anatomik olarak düzenlenmiş dağılımlarını ortaya çıkarır. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

CUT&Tag ve gen ifade kütüphanelerinin sıralanması ve haritalanması Cell Ranger ARC v2.0.2 kullanılarak 10x Genomics yönergelerine uygun olarak gerçekleştirildi; mekânsal barkod kütüphaneleri ise Takara Trekker önerilerine göre Trekker v1.3.0 kullanılarak işlendi. Önerilen tek hücreli ATAC-seq eşleme seçenekleri CUT&Tag kütüphanelerine uygulandı. Tek çekirdekli veri setleri yalnızca CUT&Tag, sadece gen ekspresyonu ve birleşik çoklu (CUT&Tag + gen ekspresyonu) için oluşturuldu. CUT&Tag (1.000.000 ≥veya ≤ 100) veya gen ekspresyonu (100.000 veya ≤ 1000 ≥ toplam UMI'ye sahip hücreler, Signac²² kullanılarak filtrelendi. Dublet tahmini, gen ekspresyonu için scDblFinder²³ ve CUT&Tag için AMULET²⁴ kombinasyonu kullanılarak gerçekleştirildi. Aşağıdaki kriterlerden birini karşılayan hücreler kaldırıldı: 1) scDblFinder.score > 0.6; 2) scDblFinder.score 0.3 ile 0.6 arasında, amulet.score < 0.01. Hücre tipi açıklaması, Allen Brain Cell Atlas'ın referans^{verilerine 26} dayanarak Seurat'ın FindTransferAnchors²⁵ programı kullanılarak gerçekleştirildi. Bu çalışmadaki gen ifade kütüphanesi için hücre başına medyan UMI sayısı 15.378, hücre başına medyan gen sayısı ise 4.378 idi. CUT&Tag kütüphanesi için 11.860 hücre tespit edildi; hücre başına medyan 6.631 yüksek kaliteli parça ve TSS zenginleştirme puanı 7,66 idi. Trekker mekânsal barkod kütüphanesi için, çekirdeklerin %92,43'ü mekânsal konumlara, %51,54'ü ise tek bir uzaysal konuma atanmıştır. Ham dizileme verileri ve ikincil analizlerden elde edilen işlenmiş veriler, GEO aracılığıyla erişim numarası GSE327406 altında mevcuttur. Son kalite sonrası açıklamalı Seurat nesnesi Zenodo'da erişim numarası 19475899 altında mevcuttur. Hücre tipi açıklamalarla temsil eden UMAP gömmeleri Şekil 4A'da gösterilmiştir. Tek hücreli barkodlar mekânsal barkodlarla bağlanarak, bireysel çekirdekler doku içindeki mekansal konumlarına geri atanarak bir mekânsal harita oluşturuldu (Şekil 4B). Bu harita, bitişik bölümlerde gözlemlenen anatomik özelliklerle yakından eşleşir ve fare beyin anatomisi için standart bir referans olan Allen Beyin^{Atlası 27'deki} koronal beyin kesitiyle örtüşmektedir. Mekansal gen ekspresyonunun ve H3K27ac profillerinin tek hücre çözünürlükte ortak analizi, başlıca beyin hücresi tiplerinin tanımlanmasını mümkün kılmış ve doku kesitinde anatomik olarak organize edilmiş hücresel dağılımın desenlerini ortaya çıkarmıştır.

Discussion

Bu protokol, mekânsal barkodlama, H3K27ac'nin düşük girdili CUT&Tag profilini, 10x Genomics tek hücreli multiome jel boncuklarında birden fazla moleküler hedefin eşzamanlı yakalanmasını ve Illumina dizileme için aşağıya doğru kütüphane hazırlığını entegre eden bir mekansal Trekker–CUT&Tag çoklu çalışma akışını tanımlar. Mekansal indeksleme, tek hücreli epigenomik ve transkriptomik okumalarla birleştirerek, bu yaklaşım, doğal doku bağlamından yoksun olan geleneksel tek hücreli çoklu analiz testlerinin temel bir sınırlamasını ele alır. Bu çalışma, mekânsal CUT&Tag çoklu profillemenin (H3K27ac CUT&Tag + gen ifadesi) uygulanabilirliğini başarıyla göstermekte ve gen ifadesi ile histon işaretleri ile kromatinle ilişkili proteinler gibi düzenleyici hedeflerin mekânsal ortak profillenmesi için temel oluşturmaktadır.

Bu iş akışının başarılı uygulanması için iş akışının birden fazla aşamasında titiz kalite kontrolü gereklidir (Şekil 1). Burada anlatılan prosedür kesitleme sonrası adımlarla başlasa da, doku kesitinin kalitesi optimal sonuçlar için kritik öneme sahiptir. Kesit kalınlığı, doku tipine ve beklenen hücreselliğe göre ayarlanmalıdır. Doku ayrışması ve çekirdek izolasyonu sırasında, çekirdek verimini maksimize ederek nükleer bütünlüğü korumak, Trekker tabanlı tek hücreli çoklu analiz testlerinin genel performansı için kritik öneme sahiptir. Düşük çekirdek verimi, optimal olmayan doku ayrışması, verimsiz çekirdek izolasyonu veya yetersiz kesit kalınlığından kaynaklanabilir. Zayıf nükleer bütünlük, aşırı mekanik bozulmalardan, uzun işlem sürelerinden veya aşırı analiz nedeniyle ortaya çıkabilir. Çekirdek izolasyonu, Trekker tabanlı tek hücreli çoklu işletim akışının başarılı uygulanması için önemli bir sorun giderme noktasıdır. Bu nedenle, Trekker tabanlı tek hücreli çoklu analiz testine başlamadan önce çekirdek izolasyon protokolünün dokuya özgü optimizasyonu şiddetle tavsiye edilir. İzole çekirdekler nicel ve niteliksel olarak değerlendirilmelidir. Nükleer boyalarla çekirdek sayımı verim tahmini sağlarken, mikroskobik inceleme nükleer zar bütünlüğünü, toplanmasını ve nükleer olmayan kalıntıların varlığını değerlendirmeye olanak tanır. Kütüphane hazırlığından sonra, tüm kütüphaneler parça boyut dağılımları ve adaptör dimer eksikliği açısından değerlendirilmelidir. CUT&Tag kütüphaneleri için, hedef genomik bölgelerin arka plan üzerinde zenginleştirilmesi nicel PCR ile değerlendirilmelidir; böylece dizileme öncesi test özgülüğü ve genel kütüphane kalitesi hakkında erken bir gösterge sağlanmalıdır. Dizeleme sonrası kalite kontrolü, mekânsal çoklu verilerin doğru yorumlanması için eşit derecede önemlidir. Haritalama oranları, çekirdek başına parça sayıları, transkripsiyon başlangıç noktası zenginleşmesi, CUT&Tag için zirvede fragment puanları, gen karmaşıklığı ve hücre başına okuma derinliği gibi metrikler, 10x Genomics ve Takara Trekker'ın önerdiği yönergelere uygun olarak değerlendirilmelidir. Bu metriklerin hem epigenomik hem de transkriptomik modalitelerde ortak değerlendirilmesi, teknik artefaktların tanımlanmasını sağlar ve mekansal, epigenom ve transkripsiyonel bilgilerin güvenilir entegrasyonunu sağlar.

Bu çalışmada Trekker tabanlı barkod girişi yaklaşımının tek hücreli CUT&Tag çoklu analiz ile birleştirildiği gösterilse de, tarif edilen yaklaşımın da sınırlamaları vardır. Örneğin, yöntem şu anda taze donmuş dokularla sınırlıdır ve uygulanabilirliği yalnızca biyolojik kopyalar olmadan tek bir doku tipinde (fare beyni) tek bir histon modifikasyonunun (H3K27ac) profillenmesinde gösterilmiştir. Ayrıca, yaklaşım iki özel ticari platforma (Takara Trekker ve 10x Genomics Next GEM Chromium Single Cell Multiome) dayanır. Bu teknolojinin daha geniş uygulanabilirliği, performansı, genellenebilirliği ve tekrarlanabilirliğini değerlendirmek için çeşitli doku tipleri ve ek epigenetik işaretler üzerinde daha fazla değerlendirme gerekecektir.

Özetle, burada sunulan mekansal Trekker–CUT&Tag çoklu protokolü, epigenomik ve transkriptomik özelliklerin mekansal olarak çözülen tek hücreli ortak profilleme yeteneğini göstermektedir. Mekansal barkodlamayı yerleşik tek hücreli çoklu kimya ile birleştirerek, sağlam doku mimarisinde gen düzenlemesinin mekanik olarak incelenmesini mümkün kılar ve gelecekteki mekansal biyoloji uygulamaları için güçlü bir platform sunar. Dikkat çekici potansiyel kullanımlar arasında, belirli hücre tiplerinde gen ifadesinin epigenetik kontrolü üzerindeki çeşitli deneysel ve çevresel uyarıcıların etkisinin değerlendirilmesi yer alır—örneğin, sinir uyarılarının etkileri merkezi ve periferik sinir sistemlerindeki belirli nöron tiplerinde analiz edilebilir veya infiltrasyon yapan pro- ve anti-inflamatuar bağışıklık hücrelerinin yakındaki hücreler üzerindeki etkisi inflamatuar hastalıklar ve kanserlerde ortaya çıkabilir.