Meme Kanseri Teşhisinde Plazma miR-362-3p'nin Doppler Ultrasonu ile Birleştirildiği Tanısal Etkinliği

Özet

Meme kanseri teşhis oranı nispeten düşüktür. Dört katlı tablo yöntemi, miR-362-3p'nin Doppler ultrason ile birlikte meme kanseri için tanısal değerini analiz etmek için kullanıldı. Doppler ultrasonu ve miR-362-3p kombinasyonu, tanı etkinliğini etkili bir şekilde artırarak meme kanseri teşhisi için umut vadeden bir yöntem sağladı.

Özet

Meme kanseri, dünyada en yaygın ikinci kötü huylu tümördür; kadınların hayatlarını ciddi şekilde tehdit ediyor ve büyük ekonomik yük oluşturuyor. Bu çalışma, meme kanseri teşhisinde miR-362-3p'nin Doppler ultrason ile birleşen değerini araştırmayı amaçlamaktadır. Bu çalışmaya toplam 182 meme kanseri hastası ve 147 iyi huylu meme hastalığı hastası dahil edilmiştir. Hastaların plazma miR-362-3p seviyeleri, Gerçek zamanlı floresans niceliksel polimeraz zincir reaksiyonu (RT-qPCR) kullanılarak ölçüldü. Ki-kare testi, iki hasta grubu arasındaki Doppler ultrason parametrelerindeki farkları analiz etmek için kullanıldı. Alıcı operatör karakteristik (ROC) eğrisi, miR-362-3p'nin tanısal etkinliği, Direnç İndeksi (RI) ve Pulsatilite Index (PI) değerlendirmek için kullanıldı. Meme kanserinde plazma miR-362-3p ile birleştirilen Doppler ultrasonunun tanısal etkinliği dört katlı tablo yöntemiyle analiz edildi. Meme kanseri hastalarında miR-362-3p seviyeleri belirgin şekilde azaldı. İki boyutlu ultrason parametrelerinde önemli farklılıklar vardı. miR-362-3p, RI ve PI meme kanseri için tanısal değere sahiptir. Üç faktörün birleşik tanı değeri daha yüksekti. Ultrason, miR-362-3p ile birleştiğinde, meme kanseri teşhisinde hassasiyet, doğruluk ve negatif öngörü değeri önemli ölçüde iyileştirmiştir. Doppler ultrasonu miR-362-3p ile birleşiminde meme kanserinin tanısal etkinliğini artırabilir; bu da meme kanseri için invaziv olmayan ve potansiyel olarak yardımcı bir tanı aracı sağlayabilir.

Giriş

Uluslararası Kanser Araştırma Ajansı'nın istatistiklerine göre, 2020 yılında meme kanseri sisidansı akciğer kanserinin oranını^{aşmıştır.} Meme kanseri, yaygın olarak ortaya çıkan ve kadınlarda kanserle ilişkili ölümlerin başlıca nedenlerinden biri olan kötü huylu bir tümördür^{. 1}. Meme kanserinin zamanında teşhisi hastaların prognozu için faydalıdır. Doku biyopsisi, meme kanseri teşhisinde altın standarttır. Ancak bu, bir tür invaziv tanıdır ve erken evre meme kanseri olan hastalar^{için geçerli değildir 2}.

Doppler ultrason, meme kanseri taraması ve yardımcı tanı için yaygın kullanılan bir görüntüleme^tekniğidir. Doppler ultrason, nodüllerin boyutunu, kan akışı sinyallerini ve lenf düğümü^{metastazının durumunu doğru şekilde değerlendirebilir 4}. Meme Doppler ultrasonu, iyonlaştırıcı radyasyon olmaması, güvenliği ve invaziv olmaması gibi avantajları, ayrıca tekrarlanabilir muayene yeteneği sayesinde, meme kanseri taraması ve teşhisinde en yaygın görüntüleme tekniklerinden biri haline^gelmiştir. Ancak, düşük yoğunluklu veya küçük hacimli meme kanserleri tespit edilirken Doppler ultrasonu doku arka planı tarafından etkilenmeye yatkındır; bu da tanısal hassasiyette önemli bir azalmaya ve erken teşhis için klinik ihtiyaçların karşılanmasını^{zorlaştırır.} Bu nedenle, Doppler ultrason teknolojisinin sınırlamalarını aşabilecek plazma biyobelirteçleri geliştirmek gereklidir. İki yöntemin birleşimi meme kanseri teşhisinin hassasiyetini artırabilirse, önemli klinik değer ve pratik öneme sahip olacaktır.

MikroRNA'lar (miRNA'lar), yaklaşık 20 ila 24 nükleotid uzunluğuna sahip kodlamayan RNA molekülleri^{sınıfıdır 7,8}. miRNA'ların özelliklerinden biri, evrimsel süreçte yüksek bir koruma derecesidir. miRNA'lar geniş bir doku dağılımına sahiptir; bu dağılım sadece çeşitli insan dokusu hücrelerinde spesifik olarak ifade edilmez, aynı zamanda kan ve tükürük gibi birden fazla vücut sıvısında da istikrarlı şekilde var^{olabilir 9}. Bu dağılım özellikleri, invaziv olmayan tanı belirteçlerinin geliştirilmesinde avantajlar sağlar. Fonksiyonel olarak, miRNA'lar mRNA'yı 3' Çeviri Edilmemiş Bölgeye (UTR)^10,11 tamamlayıcı bağlanarak bozur ve hücresel iltihap yanıtları, oksidatif stres, apoptoz ve proliferasyon ile farklılaşma gibi bir dizi önemli patolojik ve fizyolojik süreçte yer^{alır 12}. Çok sayıda çalışma, miRNA ekspresyon profillerindeki anormal değişikliklerin meme kanserinin oluşumu ve gelişimiyle yakından ilişkili olduğunu^{doğrulamıştır 13,14}. MiRNA ekspresyonunun düzensizliği, onkogenlerin veya tümör baskılayıcı genlerin ifade ağlarını düzenleyerek meme epitel hücrelerinin kötü niyetli dönüşümünü teşvik edebilir. miR-362-3p, tümör ilerlemesini engelleyen tipik bir faktördür. Birçok rapor, miR-362-3p'nin meme kanserinin ilerlemesini inhibe^{ettiğini buldu} 15,16,17. Assiri ve ark. miR-362-3p'nin düşük ekspresyonunun meme kanseri hastalarında kötü prognoz ve daha kısa genel hayatta kalma ile yakından ilişkili^{olduğunu bildirdi 15}. Mekanik olarak, miR-362-3p meme kanserinde anti-tümör etkisi yaratarak DEAD-box helicase 5 (DDX5) hedefleyerek kanser hücrelerinin çoğalması, istilası ve göçünü^{teşvik etti 16}. Ayrıca, Kang liderliğindeki ekip, miR-362-3p'nin meme kanseri dokularında önemli ölçüde aşağı regülasyonda olduğunu ve miR-362-3p ekspresyonunun hedefli düzenlemesinin meme kanseri yönetimi için yeni potansiyel bir terapötik strateji olarak hizmet edebileceğini^buldu. Ancak, miR-362-3p'nin meme kanseri için erken tanı belirtisi olup olmadığına dair bir rapor bulunmamıştır.

Bu çalışma, plazmadaki miR-362-3p'nin ifade seviyesini ölçtü ve aynı anda meme kanseri hastalarında Doppler ultrasonunun temel görüntü parametrelerini analiz etti. Çalışma, plazma miR-362-3p ifade seviyeleri ile Doppler ultrason görüntü parametrelerinin birleşik uygulama değerini kapsamlı şekilde inceledi ve bu birleşik tanısal yaklaşımın meme kanseri taramasında ve iyi huylu ve kötü huylu meme hastalıkları arasındaki ayırt edici tanıda etkinliğini açıkça gösterdi.

Protokol

Bu çalışma, Helsinki Bildirgesi'nin ilkelerine uygun şekilde gerçekleştirilmiştir. Onay, Shandong İkinci Tıp Üniversitesi Bağlı Hastanesi, Klinik Tıp Fakültesi, Shandong İkinci Tıp Üniversitesi Etik Komitesi tarafından kabul edildi (onay numarası: wyfy-2023-ky-124). Çalışmaya katılan tüm deneklerden bilgilendirilmiş onay alındı. Reaktifler ve kullanılan ekipmanlar Malzeme Tablosu'nda listelenmiştir.

1. Deneysel denekler

Örneklem büyüklüğü hesaplaması, bağımsız bir örneklem t-testine dayalı olarak G*Power 3.1 yazılımı kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Orta etki boyutu (Cohen'in d = 0.5, klinik gözlem çalışmalarında yaygın olarak kullanılan), iki kuyruklu test, α = 0.05 ve güç (1 − β) = 0.95 belirlendi. Hesaplama, her grup için en az 105 katılımcı zorunlu olduğunu gösterdi. Son olarak, 182 meme kanseri hastası ve 147 iyi huylu meme lezyonları olan hasta kaydedildi ve her iki grubun gerçek örneklem büyüklüğü gereken minimum örneklem büyüklüğünü çok aştı; bu da çalışma sonuçlarını desteklemek için yeterli istatistiksel gücü sağladı ve tip II hata riskini kabul edilebilir bir aralıkta kontrol etti. Tüm katılımcılar, birleşik dahil etme ve dışlama kriterlerine göre kesin ve ardışık olarak kayıt oldu.

2023'ten 2024'e kadar tüm hastalar Shandong İkinci Tıp Üniversitesi Bağlı Hastanesi, Klinik Tıp Fakültesi, Shandong İkinci Tıp Üniversitesi'nde kayıtlı oldu. İyi huylu lezyonlar: Kötü huylu olmayan lezyonlar patoloji tarafından doğrulandı. Meme kanseri: kötü huylu tümörler patoloji tarafından doğrulandı. Gece oruçundan sonra tüm katılımcılardan venöz kan örnekleri alındı. Venöz kan örnekleri antikoagülasyon ve santrifüjlenerek plazmayı ayırmak için standart prosedürlere sıkı şekilde uyulmuş, ardından uzun süreli depolama için −80 °C'ye transfer edilmiş, bu sıcaklıklar daha sonra miRNA ekstraksiyonu için kullanılmıştır. Tüm plazma örnekleri, miRNA bozulmasını önlemek için RNA çıkarımından önce en fazla iki donma-erime döngüsünü kesin olarak sınırlandırdı. Tüm hastalar çalışma protokolü hakkında tam bilgilendirildi ve kayıt öncesinde gönüllü olarak yazılı bilgilendirilmiş onay verdiler.

Meme kanseri hastaları için dahil etme kriterleri: (1) Patolojik olarak doğrulanmış birincil meme kanseri olan hastalar. (2) Kayıttan önce cerrahi tedavi yapılmaz. (3) Numune toplamadan önce radyoterapi veya kemoterapi tedavisi almamış.

İyi huylu meme hastalığı hastaları için dahil etme kriterleri: (1) Patolojik olarak doğrulanmış iyi huylu meme lezyonları. (2) Başka sistemik kötü huylu tümör veya önkanser lezyonları olmadan. (3) Hamile olmayan ve emzirmeyen kişiler. (4) Şiddetli akut enfeksiyon veya kronik iltihap hastalığı yoktur.

Meme kanseri ve iyi huylu meme lezyonu hastaları için dışlama kriterleri: (1) Şiddetli meme enfeksiyonu veya akut kritik hastalık. (2) Şiddetli karaciğer veya böbrek işlev bozukluğu veya otoimmün hastalık. (3) 6 ay içinde hormon tedavisi gören hastalar.

2. Doppler ultrason muayenesi

Hastanın çift taraflı göğüsleri Doppler ultrasonu ile dört dörtlü bölgede kapsamlı şekilde incelendi. İki boyutlu ultrason taraması kullanılarak lezyon özellikleri, sınırlar, şekil, iç yankı, arka yankı dalgaları ve lezyonun en-boy oranı kaydedildi. Renk Doppler akış görüntülemesi, direnç indeksi (RI), nabız indeksi (PI) ve maksimum kan akışı hızı (V_max) dahil olmak üzere lezyonun kan akışı parametrelerini değerlendirmek için uygulandı. Kan akışı sinyalleri, daha önce bildirilen bir sınıflandırma^{sistemine göre derecelendirildi 18}: Derece 0: Kan akışı sinyali yok; Grade I: minimum kan akışı sinyali; Derece II: Kan akışı sinyalinin uzunluğu lezyon çapının yarısını aşar; Derece III: Bol kan akışı sinyali.

3. Meme kanseri ultrason tanısı için pozitif tanım

Bunlar arasında (1) belirsiz sınırlar; (2) Düzensiz şekil; (3) Düzensiz iç yankı; (4) Zayıflamış arka yankı; (5) En-boy oranı >1; (6) RI > 0.70; (7) PI > 1.50; (8) Maksimum kan akış hızı (Vmax)> 18,00 cm/s; (9) Kan akışı sinyali ≥ derece II. Yukarıdaki şüpheli kriterlerden herhangi birini karşılayan herhangi bir lezyon ultrason pozitif olarak sınıflandırılırken, şüpheli özellikleri olmayanlar ultrason negatif olarak sınıflandırılır.

4. Gerçek zamanlı floresans niceliksel polimeraz zincir reaksiyonu (RT-qPCR)

Plazma miRNA'ları özel bir miRNA çıkarma kiti kullanılarak çıkarıldı. Başarılı şekilde çıkarılan RNA örnekleri, özel miRNA ters transkripsiyon kitleri kullanılarak cDNA sentezi için kullanıldı. miR-362-3p için ters transkripsiyon reaksiyonu koşulları: Bu reaksiyonun toplam hacmi 20 μL idi. PCR reaksiyon prosedürü şöyleydi: (1) Karışım 37 °C'de 15 dakika kuluçka edildi, (2) Ters transkripsiyon reaksiyonu 42 °C'de 50 dakika boyunca gerçekleştirildi, (3) Enzim 95 °C'de 5 dakika inaktive edildi. Ürün 4 °C'de depolanıyordu. qPCR reaksiyon koşulları: Reaksiyon sisteminin toplam hacmi 20 μL idi. Amplifikasyon koşulları şu şekilde gerçekleştirildi: (1) cDNA önceden denatüre edildi ve DNA polimeraz 95 °C'de 2 dakika boyunca aktive edildi. (2) DNA zincirleri 60 °C'de 30 saniye boyunca annelenip uzaydı. Yukarıdaki iki adım toplamda 40 döngü boyunca gerçekleştirildi. Gen ile ilgili ifade formülü 2^-(ΔΔCt) ile hesaplandı. miR-362-3p göreli ifadesi U6 tarafından kalibre edildi. U6'nın endogen kontrol olarak kullanılmasını haklı çıkarmak için, plazma kohortunda U6'nın kararlılığı BestKeeper algoritması kullanılarak değerlendirildi. Tüm örneklerde U6 Ct değerlerinin varyasyon katsayısı (CV) %2'nin altındaydı, bu da yüksek ifade kararlılığını gösterir. Bu nedenle, U6 doğrulandı ve bu çalışmada miR-362-3p ekspresyonunun normalizasyonu için referans gen olarak seçildi. Astarların sonraki akış dizisi kit tarafından sağlanıyordu. Giriş dizileri şu şekildeydi:

miR-362-3p: GCCGAGAACACACCTATTCA.

U6: CTCGCTTCGGCAGCAGCAKATAKTI.

5. Alıcı Çalışma Karakteristikası (ROC) eğrisi

Youden indeksi, meme kanseri teşhisinde miR-362-3p için optimal kesme değerini belirlemek için ROC eğrisinin hassasiyet ve özgüllük değerleri hesaplanarak kullanıldı. Birleşik tanı modeli, SPSS'de ikili lojistik regresyon kullanılarak oluşturulmuştur; miR-362-3p, RI ve PI bağımsız değişkenler olarak girilmiştir. Her denek için birleşik tanının tahmin edilen olasılık değerini oluşturmak amacıyla Enter yöntemiyle değişkenler dahil edildi. Tahmin olasılığı (PRE) formülü: . ROC eğrileri PRE'ye göre çizildi. Delong testi, farklı ROC eğrileri arasındaki Alan Altı Eğri (AUC) değerlerindeki farkları karşılaştırmak için kullanıldı.

6. Sonuç parametrelerinin tanımı

Birincil sonuç parametresi, meme kanseri için plazma miR-362-3p ve Doppler ultrasonunun birleşik modelinin genel tanısal etkinliğiydi ve patolojik tanı altın standart olarak kullanıldı. İkincil sonuç parametreleri arasında yalnızca Doppler ultrasonunun tanısal performansı ve plazma miR-362-3p tek başına yer aldı.

7. Veri istatistikleri

miR-362-3p ifade seviyeleri ve iki hasta grubunun ROC eğrileri istatistiksel ve grafik yazılımı kullanılarak analiz edildi. T-testi , iki grup arasındaki sürekli değişkenlerdeki farkları karşılaştırmak için kullanıldı. Ki-kare testi ve dört katlı tablo yöntemi SPSS 26.0 kullanılarak analiz edildi. Ki-kare testi, kategorik değişkenlerin istatistiksel farklılıklarını değerlendirmek için kullanıldı; iki indeksli kombinasyon (miR-362-3p + Doppler ultrason) birincil analiz olarak kabul edildi ve klinik uygulamada rutin niteliksel tanı sonucunu temsil etti; Meme görüntüleme raporlama ve veri sistemi (BI-RADS) sınıflandırmasından türetilen şüpheli özellikler varsa, lezyon pozitif olarak tanımlandı; Doppler ultrasonu ve miR-362-3p'nin birleşik tanısının özgüllüğü, pozitif tahmin değeri, negatif öngörü değeri ve doğruluğu hesaplamak için dört katlı tablo yöntemi kullanıldı. Doppler ultrasonu ile miR-362-3p arasındaki tanı sonuçları arasında gerçek pozitif (a), yanlış pozitif (b), yanlış negatif (c) ve gerçek negatif (d) bulunuyordu. Hesaplama formülü: Hassasiyet = a / (a + c); Spesifiklik = d / (d + b); Pozitif Tahmin Değeri = a / (a + b); Negatif Öngörücü Değer = d / (d + c); Doğruluk = (a + d) / (a + b + c + d). Üç tanı yöntemi (miR-362-3p, ultrason ve birleşik tanı), R×C acil durum tabloları için Pearson χ² testi kullanılarak gerçekleştirildi. P < 0.05 istatistiksel olarak anlamlı olarak kabul edildi.

Sonuçlar

Meme kanseri hastalarında miR-362-3p seviyesi anlamlı şekilde azalmıştı

182 meme kanseri hastası ve 147 iyi huylu meme lezyonu olan hastanın klinik başlangıç bilgileri ve klinik patolojik özellikleri karşılaştırıldı. Detaylı veriler Tablo 1'de özetlenmiştir. RT-qPCR, iki hasta grubunda plazma miR-362-3p seviyelerini ölçmek için kullanıldı. Sonuçlar, meme kanseri hastalarında dolaşımdaki miR-362-3p ekspresyonunun, iyi huylu mem...

Tartışma

Meme kanseri, en yaygın kötü huylu tümör türlerinden biridir ve insan sağlığını tehdit eden büyük bir halk sağlığı sorunu^{haline gelir 19,20}. Yüksek olay ve ölüm oranları, hastaların ailelerine ciddi psikolojik travma yaşatmakla kalmıyor, aynı zamanda toplum ve ekonomi üzerinde büyük bir yük oluşturuyor. Çoğu meme kanseri hastası, tanı konduğunda yerel istila veya uzak metastaz yaşamıştır^21,22

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
BD Vacutainer K2EDTA Kan Alma Tüpü (mor kapaklı)	USA	367861	Venöz kan alımı ve miRNA analizi için plazma hazırlama içindir.
CFX96 Touch Gerçek Zamanlı PCR Algılama Sistemi	Bio-Rad Laboratories	1855195	Optik fiber iletim ve soğuk CCD görüntüleme kullanan, her kuyudaki gecikmesiz eşzamanlı floresan toplama ile 6 kanallı 96 kuyulu floresan kantitatif PCR cihazıdır. Dinamik aralık 10 büyüklük derecesine ulaşır ve hem geleneksel qPCR hem de yüksek çözünürlüklü erime eğrisi (HRM) analizi ile uyumludur. Yazılım RDML formatında dışa aktarma destekler, hem araştırma hem de klinik testlerle uyumludur ve gen ifade kantifikasyonu, SNP tiplemesi ve metilasyon analizi gibi deneylerde yaygın olarak kullanılır.
Kirgen 0,1 mL PCR Tüpleri (veya 8 Şeritli PCR Tüpleri), Steril	Shanghai, China	KG0811	qPCR reaksiyonlarının hazırlanması ve gerçekleştirilmesi için kullanılır.
Kirgen 1,5 mL Mikrosantrifüj Tüpleri, Steril	Kirgen Biotech Co., Ltd.	KG2911	miRNA ekstraksiyonu ve ters transkripsiyonu sırasında numune depolama, reaktif hazırlama ve santrifüjleme için kullanılır.
miRcute miRNA İzolasyon Kiti (Spin Kolon)	Beijing, China	DP501	Spin kolon tabanlı teknoloji kullanarak insan plazma örneklerinden miRNA dahil toplam RNA'nın izolasyonu ve saflaştırılması içindir.
miRcute Plus miRNA Birinci-Tepkime cDNA Kiti	Beijing, China	KR211	Poli(A) kuyruklama yöntemi ile saflaştırılmış miRNA'nın birinci-tepkimeli cDNA'ya ters transkripsiyonu içindir.
miRcute Plus miRNA qPCR Kiti (SYBR Green)	Beijing, China	FP411	SYBR Green I tabanlı kimyaya dayalı miRNA'nın kantitatif gerçek zamanlı PCR tespiti içindir.
Roche LightCycler 480 Çok Kuyulu Plaka 96, Beyaz	Mannheim, Germany	4729692001	Roche LightCycler 480 cihazında kuantitatif gerçek zamanlı PCR analizleri için kullanılır.
Siemens Acuson 14L5 / 14L5 SP Lineer Dizi Probu	Siemens Healthineers	10041226	Meme ve tiroid gibi yüzeyel organların muayenesi için özel olarak tasarlanmış, 5–14 MHz frekans aralığına sahip, yüksek frekanslı lineer dizi probu. Yüksek çözünürlük ve mükemmel doku kontrastı özelliklerine sahiptir ve elastografik ve otomatik meme hacmi taramayı destekler.
Siemens Acuson S2000/S3000/S1000 Ultrason Sistemi	Siemens Healthineers	/	Gerçek zamanlı 3D/4D görüntüleme ve elastografi fonksiyonlarını destekleyen renk Doppler ultrason tanı sistemi, karın, kardiyovasküler, jinekoloji ve obstetrik ve meme gibi birçok bölümde yaygın olarak kullanılır.
Veriti 96-Kuyulu Termal Çevrimli	Thermo Fisher Scientific	4375786	96 kanallı gradyan PCR cihazıdır, gradyan sıcaklık optimizasyonunu destekler; yüksek sıcaklık kontrol doğruluğuna sahiptir; cDNA sentezi ve geleneksel PCR amplifikasyonu için kullanılır.