Yumurtalık kanser hücrelerinde homolog rekombinasyon onarımının bir belirteci olarak nükleer RAD51 odaklarının tespiti için immünoflüoresans tabanlı test

Özet

RAD51 nükleer odakları, homolog rekombinasyon (HR) aktivitesinin bir göstergesidir. Bu makale, bu odakları kanser hücrelerinde tespit etmek için basit bir immünofloresans yöntemini tanımlar; bu yöntem, HR fonksiyonunun değerlendirilmesini ve DNA'ya zarar veren ajanlara yanıtların preklinik incelemesini desteklemeyi sağlar.

Özet

RAD51, homolog rekombinasyon (HR) yolunda merkezi bir proteindir ve DNA çift iplik kırıklarının (DSB) doğru onarımı için gereklidir. DSB oluşumunun ardından, DNA uç rezeksiyonu, hasar noktalarında RAD51 nükleoprotein filamentlerinin toplanmasını ve montajını kolaylaştıran tek zincirli DNA substratları oluşturur. Bu süreç, HR etkinliğinin yaygın olarak kabul gören fonksiyonel bir göstergesi ve HR yeterliliğinin vekili işaretçisi olarak hizmet eden ayrık nükleer RAD51 odaklarının oluşmasına yol açar. HR kusurları özellikle yumurtalık ve meme kanserleri olmak üzere çeşitli malignitelerde yaygın olduğundan, RAD51 odak oluşumunun değerlendirilmesi, DNA onarım kapasitesini değerlendirmek ve platin bileşikler ve poli(ADP-riboz) polimeraz (PARP) inhibitörleri dahil olmak üzere DNA'ya zarar veren tedavilere yanıtın öngörülmesi için önemli bir yaklaşım olarak ortaya çıkmıştır; bu tedavilerin etkinliği HR onarım durumuna büyük ölçüde bağlıdır. Bu el yazması, kültürlenmiş yumurtalık kanseri hücrelerinde RAD51 nükleer odaklarının tespit edilmesi ve nicelendirilmesi için basit, güvenilir ve tekrarlanabilir immünoflüoresans tabanlı bir protokolü tanımlar. Bu yöntem, DNA hasarının ionlaştırıcı radyasyon (IR) ile indüksiyonunu, ardından fiksasyon, RAD51 ve γH2AX'e karşı antikorlarla immünboyama, konfokal mikroskopi ve RAD51/γH2AX ortak lokasyonlu odaklarının manuel nicel analizini içerir. Protokol, temel koşullarda veya genetik ve farmakolojik bozulmalardan sonra HR fonksiyonuna etkilerini belirlemek için uygulanabilir. Temsilci sonuçlar, DNA hasarı sonrası HR yetkinliğine sahip yumurtalık kanseri hücrelerinde RAD51 odaklarının güçlü bir şekilde indüklenmesini gösterirken, RAD51 tükenmesi, DSB seviyelerine rağmen odak oluşumunu belirgin şekilde azaltır ve test özgüllüğünü doğrular. Genel olarak, bu protokol HR yetkinliğini değerlendirmek için sağlam ve tekrarlanabilir bir fonksiyonel test sağlar; preklinik ve potansiyel olarak translasyonel kanser araştırmalarında geniş uygulamalara sahiptir.

Giriş

DNA çift zincirli kırıntılar (DSB'ler), yanlış onarım genom kararlılığını tehlikeye atabilir ve tümör gelişimine veya hücre ölümüne katkıda bulunabildiği için DNA hasarının en şiddetli türlerinden^{biridir 1,2,3}. Bu tehditlere karşı koymak için hücreler, DSB'leri onarmak için en doğru mekanizma olarak kabul edilen homolog rekombinasyon (HR) dahil olmak üzere birkaç DNA onarım yolu^{kullanır 2,4,5}. Hata eğilimli onarım yollarının aksine, HR hasar görmüş bölgedeki genetik bilgiyi geri kazanmak için homolog bir DNA dizisi şablon olarak kullanır. Sonuç olarak, HR ağırlıklı olarak hücre döngüsünün S ve G2 aşamalarında, kardeş kromatidlerin onarım^{şablonları olarak kullanıldığı zamanlarda çalışır 2,5}. Özellikle, HR, çoğaltma stresi gibi endogen kaynaklardan kaynaklanan DSB'lerin doğru onarımı ve iyonlaştırıcı radyasyon (IR) ve DNA'ya zarar veren kemoterapötik^{ajanlar 2,5} gibi dışsal zararlar için gereklidir.

RAD51, HR yolunun merkezi bir etkisini taşır ve DSB ^2,5'in HR aracılı onarımında homoloji arama ve iplik istilasında kritik bir rol oynar. DSB oluşumundan sonra, DNA uçları rezeksiyona geçer; bu, MRE11–RAD50–NBS1 (MRN) kompleksi ve ilişkili faktörler tarafından başlatılan ve 3′ tek zincirli DNA çıkıntıları oluşturan bir süreçtir. Bu tek zincirli bölgeler başlangıçta ikincil yapı oluşumunu önleyen ve onarım^{aralığını 4,5,6} stabilize eden replikasyon proteini A (RPA) ile kaplanır. HR, daha sonra BRCA1, PALB2 ve BRCA2'nin koordineli etkileriyle başlatılır; bu etkiler, RAD51'in rezeksiyona alınmasını ve yüklenmesini kolaylaştırır, RPA'yı yerinden eder ve RAD51 içeren nükleoprotein^filamentleri 4,5,6'nın oluşumunu teşvik eder. Bir araya getirildikten sonra, bu filamentler kardeş kromatid içinde homolog DNA dizilerini arar ve zincir değişimini katalize eder; böylece hasar görmüş^DNA 4,5,6'nın sadık bir şekilde restorasyonu sağlanır. DSB bölgelerinde RAD51'in birikmesi, mikroskobik olarak nokta nükleer odaklar olarak görülür ve bu noktalar immünofluoresans 7,8,9,10 ile tespit edilebilir. Bu odakların oluşumu, HR makinelerinin başarılı bir şekilde kullanılmasını yansıttığından, RAD51 odak analizi, 7,8,9,10 hücrelerinde HR kapasitesi ve DNA onarım yeterliliğini değerlendirmek için yaygın kullanılan bir fonksiyonel yaklaşım haline gelmiştir. Önemli olarak, bu test, hücrelerin DNA hasarından sonra HR yanıtı gerçekleştirme yeteneğini ölçer; yalnızca HR ile ilişkili genlerin veya proteinlerin ifade seviyelerine dayanmak yerine.

HR kusurları, özellikle BRCA1, BRCA2, RAD51 paralogları veya HR'de yer alan diğer genlerde değişiklikler barındıran tümörlerde sıklıkla görülür ve özellikle yumurtalık ve meme^{kanserlerinde} 4,11,12,13,14 yaygındır. HR eksikliği, sentetik^{öldürücülük} prensibi 4,11,12,13,14,15 yoluyla platin tedavisi gibi DNA'ya zarar veren ajanlara ve poli(ADP-riboz) polimeraz (PARP) inhibitörlerine karşı yüksek hassasiyet sağladığı için önemli terapötik sonuçlar taşır . Sonuç olarak, İK faaliyetini değerlendirmek için güvenilir fonksiyonel testler hem mekanik çalışmalar hem de translasyonel araştırmalar için kritik öneme sahiptir.

Bu protokol, yumurtalık kanser hücrelerinde DNA hasarı sonrası nükleer RAD51 odaklarının tespit edilmesi ve nicelendirilmesi için immünoflüoresans tabanlı bir testi tanımlar. İş akışı, IR kullanılarak DNA DSB'lerinin indüklenmesini, ardından RAD51 ve γH2AX'in immünofluoresan tespitini ve konfokal mikroskopi ile birlikte lokalize edilmiş nükleer odakların nicelendirilmesini içerir. Protokol, HR yetkinliğine sahip OVCAR-8 hücreleri ve edinilmiş PARP inhibitörüne dirençli ABT^R2 hücreleri kullanılarak gösterilmiştir ve DSB oluşumundan sonra HR aktivitesini değerlendirmek için tekrarlanabilir fonksiyonel bir yaklaşım sağlar. RAD51 odak analizi, HR aktivitesinin fonksiyonel ölçütü olarak yaygın olarak kullanılsa da, mevcut yöntemler genellikle belirli deneysel ortamlara odaklanır ve kontrollü DNA hasar indüksiyonu, DNA DBS oluşumunun onayı, test doğrulama kontrolleri ve standartlaştırılmış görüntü tabanlı niceliklendirme konusunda ayrıntılı rehberlikten yoksundur. Ayrıca, genomik yara izi testleri, mutasyonel imzalar ve gen veya protein ifade analizleri gibi HR fonksiyonunu değerlendirmek için alternatif yaklaşımlar, HR durumunu dolaylı olarak ölçer ve RAD51'i DNA hasarı bölgelerine gönderme hücresel kapasitesini doğrudan değerlendirmez. DR-GFP gibi raporlayıcı tabanlı testler, HR aktivitesinin doğrudan ölçümlerini sunar ancak kararlı genetik mühendislik gerektirir ve birçok deneysel modele kolayca uygulanamaz. Bu nedenle, burada anlatılan iş akışı, IR kaynaklı DNA hasarını çift RAD51/γH2AX immünfloresan boyama ile birleştirerek DSB oluşumunu aynı anda doğrular ve RAD51 kazanımını hasarlı kromatine nicelikle ölçür. Bu yaklaşım, kültürlenmiş kanser hücrelerinde İK yetkinliğinin doğrudan fonksiyonel değerlendirmesi için uygulamak, biyolojik olarak ilgili ve geniş çapta uygulanabilir bir yöntem sunarken, analiz kontrolleri, doğrulama adımları ve standartlaştırılmış odak nicel uygulama prosedürlerini içermektedir.

Protokol

Bu protokolde kullanılan tüm malzemeler ve reaktifler, üretici bilgileri, katalog numaraları ve antikor seyreltmeleri dahil olmak üzere Malzeme Tablosu'nda listelenmiştir. Protokolün genel bir özeti Şekil 1'de gösterilmiştir.

NOT: Yumurtalık kanseri hücre hatları OVCAR-8 ve ABT^R2 bu protokolde kullanılmakta olup daha önce 15,16,17,18,19,20 olarak tanımlanmıştır. OVCAR-8 hücreleri, ilk olarak Dr. Dominic Scudiero'dan (National Cancer Institute, NIH) alan Dr. Larry Karnitz (Mayo Clinic) tarafından nazikçe sağlandı. ABT^R2 hücreleri Dr. Scott Kaufmann (Mayo Clinic) tarafından nazikçe sağlanmıştır^. ABT^{R 2,} BRCA2'nin PARPi'ye dirençli bir türevidir.-BRCA2 ekspresyonunun restorasyonu yoluyla direnç kazanan mutasyona sahip yumurtalık kanseri hücre hattı PEO1. BRCA2 restorasyonu RAD51 yük ve kalp atım aktivitesini yeniden sağladığı için, ABT^R2 hücreleri temsil eden HR yetkinliği modeli olarak hizmet vermektedir. Hücre hattı kimliği, kaynak kökenine ve 15,16,17,18,19,20 literaturasında bildirilen belirlenmiş özelliklere dayanarak doğrulandı. Deneyler, eridikten sonra kültürde en fazla 1 ay tutulan düşük geçişli hücreler (3–12 pasajları) kullanılarak gerçekleştirildi. Hücre hatları, mycoplasma tespit kiti kullanılarak her 6 ayda bir rutin olarak mycoplasma kontaminasyonu açısından test edildi ve bu çalışmada kullanılan tüm kültürlerin mycoplasmasız olduğu doğrulandı.

DIKKAT: Paraformaldehit zehirlidir ve uygun kişisel koruyucu ekipman takılırken sertifikalı kimyasal bir duman davlumonunda hazırlanıp tutulmalıdır. İnsan kaynaklı hücre hatları, kurumsal biyogüvenlik prosedürlerine uygun ve uygun muhafaza uygulamaları kullanılarak ele alınmalıdır. Triton X-100, montaj malzemeleri ve oje üreticinin güvenlik önerilerine göre kullanılmalıdır. IR yalnızca eğitimli personel tarafından ve kurumsal radyasyon güvenliği politikalarına uygun olarak uygulanmalıdır. Kimyasal, biyolojik ve radyasyonla ilişkili atıkları yerel kurumsal ve düzenleyici gereksinimlere göre bertaraf etmelidir.

1. Hücre kültürü ve bakımı

1. Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 büyüme ortamında kültür hücreleri, %8 fetal sığır serumu ile desteklenmiş, nemlendirilmiş bir kuluçka makinesinde, 37 °C'de, %5 CO₂ ile desteklenmiştir.
   NOT: Bu kültür koşulları, OVCAR-8 ve ABT^R2^hücreleri 15,16,17,18,19 üzerinde önceki çalışmalarımızda kullanılanlarla tutarlıdır. Bu koşullar altında, her iki hücre hattı da sağlam büyüme ve tekrarlanabilir DNA hasar yanıtı fenotipleri sergiler.
2. İstenerseniz, optimize edilmiş deneysel koşullar ^15,17'yi takip ederek pertürbasyonlar (örneğin gen knockdown/knockout) gerçekleştirin.
   NOT: Bu protokolde, RAD51'in siRNA aracılı etkisi ile yok edilmesi, immünoflüoresans analizinden önce gen bozulmasının temsilci bir örneği olarak sunulmaktadır.
   1. 180 μL RPMI-1640 ortamında %8 fetal sığır serumu ile takviye edilmiş 5 × 10⁶ hücre hazırlayın.
   2. 20 μL 20 μM siRNA çözeltisi (transfeksiyon başına 2 μM siRNA) ekleyin ve nazikçe karıştırın.
      NOT: Aşağıdaki siRNA'ları kullanın: Hedefsiz kontrol lusiferaz siRNA (siLUC): 5′-CUUACGCUGAGUACUACUGA-3′; RAD51 siRNA (siRAD51.): 5′-GGGAUUUGUGAAGCCAAA-3′. Tüm siRNA'lar Horizon Discovery'den satın alındı.
   3. Hücre süspansiyonunu 4 mm elektroporasyon küvetine aktarın.
   4. Elektroporat hücreleri, 280 V'da iki adet 10 ms darbeli BTX ECM 830 elektroporatör kullanır.
   5. Hücreleri tam büyüme ortamına aktarın ve standart kültür koşullarında 10 cm'lik bir çanakta 24 saat kuluçka yapın.
   6. SiRNA elektroporasyonu, Adımlar 1.2.1–1.2.4'te açıklanan aynı koşullarla tekrarlayın.
   7. Hücreleri standart kültür koşullarında 15 cm'lik bir çanakta ek 48 saat kuluçka edin.
   8. Immünoflüoresans testi için hücrelerin bir kısmını tohumlayın, Adım 2'de tarif edildiği gibi. Kalan hücreleri RAD51 etkisini azaltmak için immünoblotlama ile ayırın.
   9. RAD51'in etkisini immunoblotting ile doğrulayın
      1. Buz gibi soğuk liz tamponu içindeki liz hücreleri; bunlar 50 mM HEPES (pH 7.6), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, %1 Triton X-100, 10 mM NaF, 30 mM sodyum pirofosfat, 1 mM Na₃VO₄, 10 mM β-gliserofosfat ve proteaz inhibitörü kokteyli (10 mL liz tamponu başına 1 tablet) içerir.
      2. Lizatları 18.800 × g. sıcaklıkta 4 °C'de 5 dakika boyunca santrifüjle aydınlaştırın. Süpernatantı taze bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve uygun bir protein testi kullanarak protein konsantrasyonunu belirleyin.
      3. Uygun miktarda protein lizatını 4× Laemmli örnek tamponu ile karıştırarak nihai 1× konsantrasyonu elde edin.
      4. %20'lik nihai konsantrasyona β-merkaptoetanol ekleyin ve SDS-PAGE'den önce örnekleri 95 °C'de 12 dakika ısıtın.
      5. SDS-PAGE ile eşit miktarda proteini ayırın ve proteinleri uygun bir zara aktarın ve immünoblot analizi için.
      6. Membranı %5 sütle oda sıcaklığında 30 dakika boyunca çalkalayarak tıkayın.
      7. Membranı üç kez (her biri 5 dakika) 1× tris-tamponlu tuzlu suyla oda sıcaklığında tween 20 (TBST) ile çalkalayarak yıkayın.
      8. Zarı, tavşan poliklonal anti-RAD51 antikoru (1:1.000 seyreltme) veya anti-ACTIN antikoru (1:1000 seyreltme) ile 4 °C'de 16–18 saat boyunca sallayarak inkübe edin.
      9. Membranı oda sıcaklığında 1× çay kaşığı (her biri 5 dakika) ile çalkalayarak yıkayın.
      10. Zarı, yaban turpu peroksidaz (HRP) ile konjuge edilmiş anti-tavşan veya anti-fare IgG ikincil antikoru (1:10.000 seyreltme) ile oda sıcaklığında 1 saat boyunca çalkalayarak inkübe edin.
      11. Zarı oda sıcaklığında 1× TBST (her biri 5 dakika) ile sallayarak yıkayın, uygun kemimilüminesans tespit yöntemiyle immünoreaktif bantları tespit edin ve hedefsiz kontrol siRNA ile transfekte edilen hücrelere göre RAD51 tükenmesini doğrulayın.

2. Hücre tohumlaması

1. Hücreler logaritmik büyüme aşamasına (yaklaşık %70–80 birleşme) ulaştığında, kültür ortamını aspire edin ve hücreleri steril fosfat-tamponlu tuzlu (PBS) ile nazikçe yıkarak kalıntı serumu çıkarır.
2. Hücre monotabakasını kapsayacak kadar %0,25 tripsin–EDTA çözeltisi ekleyin (örneğin, T175 şişesi başına 1–2 mL) ve 37 °C'de 2–5 dakika boyunca inkübe yapın, hücre ayrılmasını mikroskop altında izleyin.
3. Hücreler ayrıldıktan sonra, FBS içeren tam kültür ortamı ekleyerek tripsini hemen nötralize edin.
4. Hücre süspansiyonunu 15 mL'lik konik bir tüpe içine topla
5. Tohumlamadan önce trypan blue dışlanması ve hemositometre veya otomatik hücre sayacı kullanarak hücre canlılığını ve konsantrasyonunu belirleyin.
6. Tam büyüme ortamında 4 ×^{10 4} hücre/mL konsantrasyonda tek hücreli bir süspansiyon hazırlanır.
7. Hücre süspansiyonundan 200 μL süspansiyon 8 delikli cam oda sürgüsünün her kuyusuna tohumlanarak her kuyu başına 8.000 hücre yoğun olur.
8. Hücre tutunması için oda kaydırmalarını 37 °C'de %5 CO₂ ile 24 saat kuluçka edin.
   NOT: Tohumlanacak hücre sayısı hücre tipine göre değişebilir. Pipetleme değişkenliğini hesaba katmak için en az bir ek kuyu için yeterli fazla hücre süspansiyonu hazırlayın. Tekrarlanabilirliği sağlamak için her durumu çift veya daha fazla kez ekleyin. Eğer HR'nin farmakolojik modülasyonu isteniyorsa, hücreler gece boyunca (tohumlama sonrası 12–16 saat sonra) bağlandıktan sonra tedavi edilmelidir. Tohumlama yoğunluğu, tedavi ve sonraki analiz sırasında hücrelerin uygun birleşme noktasına ulaşmasını sağlamak için gerektiği gibi ayarlanmalıdır; farmakolojik ettanın hücre çoğalması veya canlılığı üzerindeki beklenen etkileri dikkate alınmalıdır. HR ağırlıklı olarak hücre döngüsünün S ve G2 fazlarında meydana geldiği için, kültürleri logaritmik büyümede koruyun ve aşırı birleşmeyi önleyin. Hücre döngüsü ilerlemesini değiştirebilecek tedaviler içeren deneyler için, RAD51 odak sonuçlarının yorumlanmasını kolaylaştırmak amacıyla EdU entegrasyonu, DNA içeriği analizi veya diğer hücre döngüsü ölçümleri yapılabilir. Her deneyde tedavi edilmemiş (–IR) ve radyasyonlu (+IR) kontrolleri dahil ederek sırasıyla bazal ve DNA hasarı kaynaklı RAD51 odak oluşumunu kurun. SiRNA aracılı pertürbasyonlar yapılırken, hedefsiz kontrol siRNA'sı (örneğin, siLUC) ve hedefe özgü siRNA koşulları (ör. siRAD51) dahil edin. Antikor optimizasyonu sırasında spesifik olmayan boyama ve arka plan floresansı değerlendirmek için primer antikor ve ikincil antikor içermeyen kontroller önerilir.

3. IR ile DNA hasarının indüklenmesi

1. Odadaki hücreler, 6 Gy²¹ dozunda IR'ye maruz bırakarak DNA DSB'lerini indüke eder.
2. Slaytları hemen %5 CO₂ içeren 37 °C'deki nemlendirilmiş kuluçka makinesine geri getirin.
3. Hücreleri IR sonrası 6 saat kuluçka edin.
   NOT: IR, 160 kV ve 25.0 mA (raf pozisyonu 5) ile çalışan RS-2000 Biyolojik Radyatör kullanılarak teslim edildi. Hücreler, oda sıcaklığında tek bir 6 Gy doz (yaklaşık 4,8 Gy/dakika) ile ışınlandı ve hemen %5 CO₂ içeren 37 °C inkübatöre geri gönderildi. Radyatör, üretici önerilerine göre rutin olarak kalibre edildi ve tüm prosedürler kurumsal radyasyon güvenliği yönergelerine uygun olarak gerçekleştirildi. IR sonrası 6 saat kuluçka aşaması^{daha önce} 15,17,22 yılında kurulmuştur. Optimal zamanlama hücre tiplerine göre değişebilir ve her hücre hattı için optimize edilmelidir.

4. Sabitleme ve permeabilizasyon

1. Kuyulardan kültür ortamını dikkatlice aspire ederek hücreleri rahatsız etmeden alın.
2. Hücreleri, oda sıcaklığında 12 dakika boyunca 1× PBS içinde taze hazırlanmış %3 paraformaldehit ile sabitleyin.
3. Fiksörü nazikçe aspire edin ve kuyuları 500 μL ile 1× PBS başına üç kez yıkayın.
4. Oda sıcaklığında 12 dakika boyunca %0,2 Triton X-100 ile 1× PBS ile hücreleri permeabilize edin.
5. Kuyları 1× PBS ile üç kez yıkayın.
   NOT: Hücre ayrılmasını en aza indirmek için her kuyunun duvarına çözelti ekleyip çıkararak fiksasyon, geçirimlilik ve yıkama adımlarını nazikçe gerçekleştirin. Aksi belirtilmedikçe, her yıkamada 500 μL 1× PBS kullanın.

5. Engelleme

1. %5 (w/v) sığır serum albümini (BSA) 1× PBS'de çözerek bir blokaj çözeltisi hazırlayın.
2. Hücreleri, spesifik olmayan antikor bağlanmasını azaltmak için oda sıcaklığında bloklayıcı çözeltide 60 dakika kuluçka yapın.

6. Birincil antikor kuluçka

1. Bloklayıcı çözeltiyi çıkarın ve hücreleri 1× PBS ile üç kez yıkayın.
2. Blok çözeltisinde uygun seyreltmelerle primer antikorlar hazırlayın. Tavşan poliklonal anti-RAD51 (1:1000) ve fare monoklonal anti-fosfos-Histon H2AX (γH2AX) (1:1000) antikorları kullanılır; γH2AX ise DSB^23,24 için bir işaretleyici olarak kullanılır.
3. Her kuyuya 100 μL seyreltilmiş primer antikor çözeltisi ekleyin.
4. Buharlaşmanı önlemek için slaytları oda sıcaklığında nemli bir odada 16–18 saat kuluçka edin.
   NOT: İki ana antikor aynı çözelti ile eşzamanlı boyama için birleştirilebilir.

7. İkincil antikor kuluçka

1. Blok çözeltisinde uygun seyreltmelerde ikincil antikorlar hazırlanır. RAD51'i tespit etmek için Alexa Fluor 488 ile konjuge edilmiş keçi anti-tavşan IgG (1:350) kullanılır ve γH2AX tespit etmek için Alexa Fluor 594 ile bağlanmış keçi anti-fare IgG (1:350) kullanılır.
2. Birincil antikor çözeltisini aspire edin ve hücreleri 1× PBS ile üç kez yıkayın.
3. Her kuyuya 100 μL seyreltilmiş ikincil antikor çözeltisi ekleyin.
4. Slaytları oda sıcaklığında karanlıkta 1 saat kuluçka edin.
   NOT: İki ikincil antikor eşzamanlı tespit için birleştirilebilir. Bu bölümden itibaren, foto ağartmayı en aza indirmek için tüm adımları ışığı korumalı bir alanda gerçekleştirin.

8. Nükleer karşı boyama ve montaj

1. Hoechst 33342 çözeltisini 1:1.000 seyreltme ile 1× PBS ile hazırlayarak çekirdekleri boyamaya çalışın.
2. İkincil antikor çözeltisini aspire edin ve hücreleri 1× PBS ile bir kez yıkayın.
3. Hücreleri oda sıcaklığında 90 saniye boyunca seyreltilmiş Hoechst 33342 çözeltisiyle kuluçka yapın.
4. Hoechst 33342 çözeltisini aspire edin ve hücreleri 1× PBS ile üç kez yıkayın.
5. 1× PBS'yi çıkarın ve üst hazneyi cam kaydırlardan ayırın, her kuyuya yaklaşık 25 μL antiifade montaj maddesi ekleyin.
6. Monte edilmiş hücrelerin üzerine cam kapak kapakları yerleştirin, böylece montaj malzemesi ile eşit temas sağlanın.
7. Hava kabarcıklarını nazikçe çıkarın ve kenarları oje ile kapatın.
   NOT: Nükleer karşı boyama, çekirdekler için bir referans sağlar; nükleer RAD51 ve γH2AX odaklarının doğru lokalizasyonu ve nicelendirilmesini kolaylaştırır.

9. DSB'lerde RAD51 odaklarının görüntülemesi ve nicelendirilmesi

1. Görüntü hemen slaytlar veya analiz yapılana kadar karanlıkta bir slayt kutusunda 4 °C'de saklanın.
   NOT: Sinyal bozulması ve foto ağartmayı en aza indirmek için, görüntüleri mümkün olan en kısa sürede, tercihen montajdan sonraki 1 hafta içinde alın.
2. Uygun lazer çizgileri ve filtre setleriyle konfokal mikroskop kullanarak görüntü alın: çekirdekler için Hoechst 33342 (405 nm), RAD51 için Alexa Fluor 488 (488 nm) ve γH2AX için Alexa Fluor 594 (561/594 nm).
3. Hücrealtı yapıları çözmek için uygun yüksek büyütme hedefiyle konfokal görüntüleme yapın.
4. γH2AX ile birlikte lokalize olan ayrık nükleer odakları sayarak RAD51 odaklarını manuel olarak nicelikle; γH2AX ile birlikte lokalize olmayan odaklar hariç tutulur.
   NOT: Kontrol hücrelerinde IR kaynaklı RAD51 ve γH2AX nükleer odaklarını doğrulayarak ve RAD51 siRNA tedavisinden sonra azaltılmış RAD51 sinyalini doğrulayarak nicel analizden önce antikor performansını doğrulamak. Yalnızca γH2AX ile birlikte lokalize olan ve sağlam morfolojiye ve net boyama desenlerine sahip çekirdeklerde ayrık nükleer RAD51 odaklarını nicelikle ölçülür; yayılan veya nükleer olmayan boyalanma, kolokalize olmayan RAD51 sinyalleri, örtüşen veya çok çekirdekli hücreler, mitotik hücreler ve apoptotik hücreler hariç tutulur. Her deneyde aynı görüntüleme ayarlarını koruyun ve tüm koşullar için tutarlı manuel puanlama kriterleri uygulayın. Her biyolojik çoğaltma için birden fazla görüş alanından her koşul başına ~50 çekirdek analiz edin ve en az üç bağımsız biyolojik kopyalama gerçekleştirin. Çekirdek başına RAD51/γH2AX ortak lokal odak sayısını uygun istatistiksel analiz kullanarak raporlayın.

10. İstatistiksel analiz

1. RAD51/γH2AX kolokalize odaklarını yaklaşık 50 çekirdekten her koşul başına nicelikle ölçün.
2. Verileri en az üç bağımsız biyolojik kopyadan ortalama ± SD olarak sunun.
3. Uygun istatistiksel bir test kullanarak istatistiksel karşılaştırmalar yapmak (örneğin, çiftsiz iki kuyruklu Öğrenci t-testi iki grup karşılaştırmaları için veya çoklu grup karşılaştırmaları için tek yönlü ANOVA)
4. S. < 0.05 istatistiksel olarak anlamlıdır.
5. GraphPad Prism (sürüm 10.6.1) kullanarak istatistiksel analizler ve grafik oluşturma işlemleri gerçekleştirin.

Sonuçlar

IR, OVCAR-8 hücrelerindeki DNA DSB'lerinde RAD51 odak oluşumunu tetikler
HR aktivitesini fonksiyonel olarak değerlendirmek için, IR tarafından DNA DSB'lerinin indüklenmesinden sonra HR yetkili OVCAR-8 yumurtalık kanser hücrelerinde RAD51 odak oluşumu incelendi. Analiz özgüllüğünü belirlemek ve gözlemlenen odakların gerçek RAD51 bağımlı HR olaylarını temsil ettiğini doğrulamak için, hücreler ya hedefsiz kontrol lusiferaz siRNA (siLUC) ya da RAD51<...

Tartışma

Burada tanımlanan nükleer RAD51 odaklarının immünoflüoresans tabanlı tespiti, kültürlenmiş yumurtalık kanseri hücrelerinde HR aktivitesini değerlendirmek için güvenilir ve işlevsel bir yaklaşım sunar. HR durumunu dolaylı olarak çıkaran genomik veya transkriptomik analizlerin aksine, RAD51 odak oluşumu hücrenin DNA DSB'lerinin bulunduğu bölgelerde çekirdek HR mekanizmasını aday ve birleştirme yeteneğini doğrudan yansıtır. Bu nedenle, bu test, DNA hasarı sonrası İK yetkinliğinin hassas bir...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
10% Polyacylamide gel recipe (Lower gel buffer 20 ml,ddH2O 33.4 mL, 30% Acrylamide/Bis-acrylamide (29:1) 26.6 mL. 10% APS (fresh) 200 µL  TEMED 70 µL)	Ev yapımı	NA	SDS-PAGE için çözücü jel
10% Polyacylamide gel recipe (Upper gel buffer 10 mL, ddH2O 23.6 mL, 30% Acrylamide/Bis-acrylamide (29:1) 6.4 mL 10% APS (fresh) 160 µL  TEMED 40 µL)	Ev yapımı	NA	SDS-PAGE için yığın jel
100 mL Trypsin EDTA 1X, 0.25% Trypsin/2.21 mM EDTA in Sodium Bicarbonate	Corning	25-053-C1	Routine passajlama ve hücre ekimi öncesi yapışkan hücreleri çıkarmak için kullanılır.
10x Phosphate Buffered Saline (PBS)	Bio-Rad	1610780	Yıkama adımları, blokaj çözeltisi, antikor seyreltmeleri, fiksasyon ve geçirgenleştirme için 1x olarak seyreltilir.
10X Running buffer (6 L) Tris 181.8 g +Glycene 864.0 g+SDS 60 g	Ev yapımı	NA	Jelde protein örneği çalıştır
10X Transfer (6 L) Tris 181.8 g+ Glycene 864 g	Ev yapımı	NA	Proteini jelden membrana aktarma
10x Tris Buffered saline	Bio-Rad	1706435	tampon
30%  (w/v)Acrylamide ;0.8(w/v)/Bis-acrylamide stock solution (37.5:1)	Ultrapure EC-890	EC-890	SDS-PAGE için
ABTR2 hücreleri	Mayo clinic	NA	edinildi PARPi-dirençli over kanseri hücre hattı
AKT Lysis Buffer Recipe (50 mM HEPES (pH 7.6), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Triton X-100, 10 mM NaF, 30 mM sodium pyrophosphate, 1 mM Na3VO4, 10 mM 2-glycerophosphate, 10 μg/mL leupeptin, 5 μg/mL aprotinin, 5 μg/mL pepstatin, and 20 mM microcystin-LR.)	Ev yapımı	NA	Hücre lizis tamponu
Ammonium Persulfate	Bio-Rad	16107000	Moleküler biyoloji, jeller için polimerizasyon, oksitleyici bir madde olarak serbest radikal başlatıcı olarak kullanılır
Anti-phospho-Histone H2A.X (Ser139) Antibody, clone JBW301	Sigma-Aldrich	05-636	γH2AX fokuslarını tespit etmek için kullanılan birincil antikor. 1:1000 seyreltilmiş haliyle kullanılır
Anti-Rad51 (Ab-1) Rabbit pAb	Sigma-Aldrich	PC130	Homologous rekombinasyon aktivitesinin bir belirteci olarak RAD51 nükleer fokuslarını tespit etmek için kullanılan birincil antikor. 1:1000 seyreltilmiş haliyle kullanılır
Bovine serum albumin Protease free	GoldBio	A-420-250	İmmünofloresan boyama sırasında spesifik olmayan antikor bağlanmasını azaltmak için kullanılır (PBS'de %5 BSA).
ChemiDoc Imaging System	Bio-Rad	12003154	Görüntüleme sistemi
Confocal Laser Scanning Microscope	ZEISS	Zeiss LSM 780	İmmünofloresan görüntüleme, γH2AX fokusları analizi, RAD51 fokusları kantifikasyonu, protein ko-lokalizasyonu ve 3D görüntü elde etme
Countess II FL Automated Cell Counter	Life Technologies	AMQAF1000	Otomatik Hücre Sayacı
Cover slips	Cardinal Health	M6045-10A	Boyanmış hücreleri korumak ve yüksek çözünürlüklü görüntüleme sağlamak için monte edilmiş örneklerin üzerine yerleştirilir.
ECM 830 Square Wave Electroporation System	Hbio-BTX	45-2052	Memeli hücrelerde gen tesliminde uygulamalar için uygun elektroporasyon sistemi
Fetal Bovine Serum	Corning	35-010-CV	Hücre büyümesini ve canlılığını desteklemek için RPMI-1640'a (%8 olarak) eklenir.
Glycine	Thermo Fisher Scientific	A13816.0C	tampon
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor™ 594	Thermo Fisher Scientific	A-11032	γH2AX birincil antikorunun tespit edilmesi için kullanılan ikincil antikor. 1:350 seyreltilmiş haliyle kullanılır
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor™ 488	Thermo Fisher Scientific	A-11034	RAD51 birincil antikorunun tespit edilmesi için kullanılan ikincil antikor. 1:350 seyreltilmiş haliyle kullanılır
GraphPad Prism	GraphPad Software	version 10.6.1	İstatistiksel analiz, grafik oluşturma ve veri görselleştirme.
HEPES 1M	Corning	25060-C1	pH 7.2-7.6 aralığında pH bakım tamponu
Hoechst 33342 solution (20 mM, 5 mL)	Thermo Fisher Scientific	62249	çekirdek boyaması için kullanılmıştır
Horseradish peroxidase-conjugated anti-mouse immunoglobulin G	Cell Signaling Technology	7076S	Western blotting'de fare (β-aktin) birincil antikorunun tespiti için kullanılan ikincil antikor.
Horseradish peroxidase-conjugated anti-rabbitimmunoglobulin G	Cell Signaling Technology	7074S	Western blotting'de tavşan birincil antikorunun (RAD51) tespiti için kullanılan ikincil antikor.
Instant non-fat dry milk	Hyvee