Yumurtalık kanser hücrelerinde homolog rekombinasyon onarımının bir belirteci olarak nükleer RAD51 odaklarının tespiti için immünoflüoresans tabanlı test

Özet

RAD51 nükleer odakları, homolog rekombinasyon (HR) aktivitesinin bir göstergesidir. Bu makale, bu odakları kanser hücrelerinde tespit etmek için basit bir immünofloresans yöntemini tanımlar; bu yöntem, HR fonksiyonunun değerlendirilmesini ve DNA'ya zarar veren ajanlara yanıtların preklinik incelemesini desteklemeyi sağlar.

Özet

RAD51, homolog rekombinasyon (HR) yolunda merkezi bir proteindir ve DNA çift iplik kırıklarının (DSB) doğru onarımı için gereklidir. DSB oluşumunun ardından, DNA uç rezeksiyonu, hasar noktalarında RAD51 nükleoprotein filamentlerinin toplanmasını ve montajını kolaylaştıran tek zincirli DNA substratları oluşturur. Bu süreç, HR etkinliğinin yaygın olarak kabul gören fonksiyonel bir göstergesi ve HR yeterliliğinin vekili işaretçisi olarak hizmet eden ayrık nükleer RAD51 odaklarının oluşmasına yol açar. HR kusurları özellikle yumurtalık ve meme kanserleri olmak üzere çeşitli malignitelerde yaygın olduğundan, RAD51 odak oluşumunun değerlendirilmesi, DNA onarım kapasitesini değerlendirmek ve platin bileşikler ve poli(ADP-riboz) polimeraz (PARP) inhibitörleri dahil olmak üzere DNA'ya zarar veren tedavilere yanıtın öngörülmesi için önemli bir yaklaşım olarak ortaya çıkmıştır; bu tedavilerin etkinliği HR onarım durumuna büyük ölçüde bağlıdır. Bu el yazması, kültürlenmiş yumurtalık kanseri hücrelerinde RAD51 nükleer odaklarının tespit edilmesi ve nicelendirilmesi için basit, güvenilir ve tekrarlanabilir immünoflüoresans tabanlı bir protokolü tanımlar. Bu yöntem, DNA hasarının ionlaştırıcı radyasyon (IR) ile indüksiyonunu, ardından fiksasyon, RAD51 ve γH2AX'e karşı antikorlarla immünboyama, konfokal mikroskopi ve RAD51/γH2AX ortak lokasyonlu odaklarının manuel nicel analizini içerir. Protokol, temel koşullarda veya genetik ve farmakolojik bozulmalardan sonra HR fonksiyonuna etkilerini belirlemek için uygulanabilir. Temsilci sonuçlar, DNA hasarı sonrası HR yetkinliğine sahip yumurtalık kanseri hücrelerinde RAD51 odaklarının güçlü bir şekilde indüklenmesini gösterirken, RAD51 tükenmesi, DSB seviyelerine rağmen odak oluşumunu belirgin şekilde azaltır ve test özgüllüğünü doğrular. Genel olarak, bu protokol HR yetkinliğini değerlendirmek için sağlam ve tekrarlanabilir bir fonksiyonel test sağlar; preklinik ve potansiyel olarak translasyonel kanser araştırmalarında geniş uygulamalara sahiptir.

Giriş

DNA çift zincirli kırıntılar (DSB'ler), yanlış onarım genom kararlılığını tehlikeye atabilir ve tümör gelişimine veya hücre ölümüne katkıda bulunabildiği için DNA hasarının en şiddetli türlerinden^{biridir 1,2,3}. Bu tehditlere karşı koymak için hücreler, DSB'leri onarmak için en doğru mekanizma olarak kabul edilen homolog rekombinasyon (HR) dahil olmak üzere birkaç DNA onarım yolu^{kullanır 2,4,5}. Hata eğilimli onarım yollarının aksine, HR hasar görmüş b....

Protokol

Bu protokolde kullanılan tüm malzemeler ve reaktifler, üretici bilgileri, katalog numaraları ve antikor seyreltmeleri dahil olmak üzere Malzeme Tablosu'nda listelenmiştir. Protokolün genel bir özeti Şekil 1'de gösterilmiştir.

NOT: Yumurtalık kanseri hücre hatları OVCAR-8 ve ABT^R2 bu protokolde kullanılmakta olup daha önce 15,16,17,18,19,20 olarak tanımlanmıştır.

Sonuçlar

IR, OVCAR-8 hücrelerindeki DNA DSB'lerinde RAD51 odak oluşumunu tetikler
HR aktivitesini fonksiyonel olarak değerlendirmek için, IR tarafından DNA DSB'lerinin indüklenmesinden sonra HR yetkili OVCAR-8 yumurtalık kanser hücrelerinde RAD51 odak oluşumu incelendi. Analiz özgüllüğünü belirlemek ve gözlemlenen odakların gerçek RAD51 bağımlı HR olaylarını temsil ettiğini doğrulamak için, hücreler ya hedefsiz kontrol lusiferaz siRNA (siLUC) ya da RAD51<.......

Tartışma

Burada tanımlanan nükleer RAD51 odaklarının immünoflüoresans tabanlı tespiti, kültürlenmiş yumurtalık kanseri hücrelerinde HR aktivitesini değerlendirmek için güvenilir ve işlevsel bir yaklaşım sunar. HR durumunu dolaylı olarak çıkaran genomik veya transkriptomik analizlerin aksine, RAD51 odak oluşumu hücrenin DNA DSB'lerinin bulunduğu bölgelerde çekirdek HR mekanizmasını aday ve birleştirme yeteneğini doğrudan yansıtır. Bu nedenle, bu test, DNA hasarı sonrası İK yetkinliğinin hassas bir.......

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
10% Polyacylamide gel recipe (Lower gel buffer 20 ml,ddH2O 33.4 mL, 30% Acrylamide/Bis-acrylamide (29:1) 26.6 mL. 10% APS (fresh) 200 µL  TEMED 70 µL)	Ev yapımı	NA	SDS-PAGE için çözücü jel
10% Polyacylamide gel recipe (Upper gel buffer 10 mL, ddH2O 23.6 mL, 30% Acrylamide/Bis-acrylamide (29:1) 6.4 mL 10% APS (fresh) 160 µL  TEMED 40 µL)	Ev yapımı	NA	SDS-PAGE için yığın jel
100 mL Trypsin EDTA 1X, 0.25% Trypsin/2.21 mM EDTA in Sodium Bicarbonate	Corning	25-053-C1	Routine passajlama ve hücre ekimi öncesi yapışkan hücreleri çıkarmak için kullanılır.
10x Phosphate Buffered Saline (PBS)	Bio-Rad	1610780	Yıkama adımları, blokaj çözeltisi, antikor seyreltmeleri, fiksasyon ve geçirgenleştirme için 1x olarak seyreltilir.
10X Running buffer (6 L) Tris 181.8 g +Glycene 864.0 g+SDS 60 g	Ev yapımı	NA	Jelde protein örneği çalıştır
10X Transfer (6 L) Tris 181.8 g+ Glycene 864 g	Ev yapımı	NA	Proteini jelden membrana aktarma
10x Tris Buffered saline	Bio-Rad	1706435	tampon
30%  (w/v)Acrylamide ;0.8(w/v)/Bis-acrylamide stock solution (37.5:1)	Ultrapure EC-890	EC-890	SDS-PAGE için
ABTR2 hücreleri	Mayo clinic	NA	edinildi PARPi-dirençli over kanseri hücre hattı
AKT Lysis Buffer Recipe (50 mM HEPES (pH 7.6), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Triton X-100, 10 mM NaF, 30 mM sodium pyrophosphate, 1 mM Na3VO4, 10 mM 2-glycerophosphate, 10 μg/mL leupeptin, 5 μg/mL aprotinin, 5 μg/mL pepstatin, and 20 mM microcystin-LR.)	Ev yapımı	NA	Hücre lizis tamponu
Ammonium Persulfate	Bio-Rad	16107000	Moleküler biyoloji, jeller için polimerizasyon, oksitleyici bir madde olarak serbest radikal başlatıcı olarak kullanılır
Anti-phospho-Histone H2A.X (Ser139) Antibody, clone JBW301	Sigma-Aldrich	05-636	γH2AX fokuslarını tespit etmek için kullanılan birincil antikor. 1:1000 seyreltilmiş haliyle kullanılır
Anti-Rad51 (Ab-1) Rabbit pAb	Sigma-Aldrich	PC130	Homologous rekombinasyon aktivitesinin bir belirteci olarak RAD51 nükleer fokuslarını tespit etmek için kullanılan birincil antikor. 1:1000 seyreltilmiş haliyle kullanılır
Bovine serum albumin Protease free	GoldBio	A-420-250	İmmünofloresan boyama sırasında spesifik olmayan antikor bağlanmasını azaltmak için kullanılır (PBS'de %5 BSA).
ChemiDoc Imaging System	Bio-Rad	12003154	Görüntüleme sistemi
Confocal Laser Scanning Microscope	ZEISS	Zeiss LSM 780	İmmünofloresan görüntüleme, γH2AX fokusları analizi, RAD51 fokusları kantifikasyonu, protein ko-lokalizasyonu ve 3D görüntü elde etme
Countess II FL Automated Cell Counter	Life Technologies	AMQAF1000	Otomatik Hücre Sayacı
Cover slips	Cardinal Health	M6045-10A	Boyanmış hücreleri korumak ve yüksek çözünürlüklü görüntüleme sağlamak için monte edilmiş örneklerin üzerine yerleştirilir.
ECM 830 Square Wave Electroporation System	Hbio-BTX	45-2052	Memeli hücrelerde gen tesliminde uygulamalar için uygun elektroporasyon sistemi
Fetal Bovine Serum	Corning	35-010-CV	Hücre büyümesini ve canlılığını desteklemek için RPMI-1640'a (%8 olarak) eklenir.
Glycine	Thermo Fisher Scientific	A13816.0C	tampon
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor™ 594	Thermo Fisher Scientific	A-11032	γH2AX birincil antikorunun tespit edilmesi için kullanılan ikincil antikor. 1:350 seyreltilmiş haliyle kullanılır
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor™ 488	Thermo Fisher Scientific	A-11034	RAD51 birincil antikorunun tespit edilmesi için kullanılan ikincil antikor. 1:350 seyreltilmiş haliyle kullanılır
GraphPad Prism	GraphPad Software	version 10.6.1	İstatistiksel analiz, grafik oluşturma ve veri görselleştirme.
HEPES 1M	Corning	25060-C1	pH 7.2-7.6 aralığında pH bakım tamponu
Hoechst 33342 solution (20 mM, 5 mL)	Thermo Fisher Scientific	62249	çekirdek boyaması için kullanılmıştır
Horseradish peroxidase-conjugated anti-mouse immunoglobulin G	Cell Signaling Technology	7076S	Western blotting'de fare (β-aktin) birincil antikorunun tespiti için kullanılan ikincil antikor.
Horseradish peroxidase-conjugated anti-rabbitimmunoglobulin G	Cell Signaling Technology	7074S	Western blotting'de tavşan birincil antikorunun (RAD51) tespiti için kullanılan ikincil antikor.
Instant non-fat dry milk	Hyvee