Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Araştırma makalesi
Bu çalışma, prostatit tedavisinde Yougui Hapı'nın potansiyel etkilerini araştırmak için ağ farmakolojisi ve in vivo deneyleri birleştirmektedir. Ağ farmakoloji analizi ve fare prostatiti modelinde YGP tedavisi, YGP'nin terapötik etkilerinin inflamatuar yanıtların düzenlenmesiyle ilişkili olabileceğini ve YGP'nin prostatitte anti-enflamatuar etkiler gösterdiğini göstermiştir.
Prostatit, sınırlı tedavi seçenekleri olan yaygın bir ürolojik bozukluktur. Yougui Hapı (YGP), özellikle iltihapla ilişkili durumlarda potansiyel terapötik değer göstermiştir. Bu çalışma, etkilerini değerlendirmeyi ve olası altta yatan mekanizmaları incelemeyi amaçladı. YGP'nin aktif bileşenleri, TCMSP'den oral biyoerişilebilirlik (OB ≥% %30) ve ilaç benzerliği (DL ≥ 0.18) kriterleri kullanılarak taranmış ve ilgili hedefler toplanmıştır. Prostatitle ilgili hedefler GeneCard'lardan alındı ve örtüşen hedefler protein-protein etkileşimi (PPI) ağları ile Kyoto genler ve genomlar ansiklopedisi (KEGG) zenginleştirmesi kullanılarak analiz edildi. Toplam 126 aktif bileşik ve 208 potansiyel hedef tespit edildi; 180 örtüşen prostatit ile ilişkili hedef tespit edildi. PPI analizi TP53, IL6, AKT1, TNF ve IL1B'yi temel merkez genleri olarak belirledi. KEGG zenginleştirmesi, IL-17, TNF, MAPK ve PI3K-Akt sinyal yolları dahil olmak üzere iltihapla ilgili yolların da dahil olduğunu göstermiştir. Prostatitin fare modeli, intraprostat enjeksiyonu ile karragenan oluşturuldu. Terapötik etkileri değerlendirmek için tümör nekroz faktör-alfa (TNF-α) ve interlökin-6 (IL-6) histolojik inceleme ve ölçümü yapıldı. YGP tedavisi prostat histopatolojisini iyileştirdi ve hem protein hem de mRNA seviyelerinde TNF-α ve IL-6 seviyelerini azalttı. Bu bulgular, YGP'nin prostatitte anti-inflamatuar etkiler yarattığını, spesifik moleküler mekanizmaların ise daha fazla doğrulanmadığını göstermektedir.
Prostatit, prostat bezinin şişlik ve tahriş ile iltihaplandığıbir durumdur 1. Küresel ürolojik klinik karşılaşmaların yaklaşık %25'ini oluşturur2. Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) prostatiti dört sınıflandırmaya ayırmıştır: akut bakteriyel, kronik bakteriyel, kronik prostatit/kronik pelvik ağrı sendromu (CP/CPPS) ve asemptomatikprostatit 3. Bunlar arasında CP/CPPS en yaygın formdur ve kalıcı iltihaplanma ile bağışıklık düzensizliğiyle yakından ilişkilidir. Prostatitin inflamatuar doğasının anlaşılmasında ilerlemelere rağmen, mevcut terapötik stratejiler özellikle bakteriyel olmayanalt tipler 4,5 için sınırlı kalmaktadır. Antibiyotikler klinik uygulamada yaygın olarak kullanılır; Ancak, bakteriyel olmayan prostatitte etkileri oldukça tartışmalıdır6. Diğer tedaviler, α blokerlerden steroid olmayan anti-inflamatuar ilaçlara (NSAID) kadar uzanır; öncelikle semptomların hafifletmesini hedefler ancak genellikle optimal olmayan sonuçlar gösterir; gastrointestinal bozukluklar, ortostatik hipotansiyon gibi riskler göz ardı edilemez; 7,8,9,10. Bu sınırlamalar, prostatitte iltihabı etkili şekilde modüle edebilen alternatif terapötik yaklaşımlara olan ihtiyacı ortaya koymaktadır.
Geleneksel Çin tıbbı (TCM), daha avantajlı bir güvenlik ve tolere edilebilirlik profiliyle daha geniş bir terapötik fayda yelpazesisunabilir. 11. Jingyue Quanshu'da belgelenen klasik bir formül olan Yougui Hapı (YGP), yüzyıllardır böbrek-yang'ı yenilemek ve ilgili hastalıkları hafifletmek için ampirik olarakkullanılmıştır 12. Önceki çalışmalar, bazı bileşenlerinin anti-inflamatuar aktivitelere sahip olduğunubildirmiştir 13,14,15,16. Klinik kanıtlar, YGP'nin prostatit semptomlarını etkili bir şekilde hafifletebileceğini göstermektedir, ancak temel mekanizma belirsizdir17. Ağ farmakolojisi, sistem biyolojisi ve farmakolojiyi birleştirerek geleneksel tıbbın karmaşık mekanizmalarını ortaya çıkaran güçlü ve bütünleştirici bir yaklaşımolarak hizmet eder 18. YGP'nin birden fazla hedefi ve iltihapla ilgili yolları modüle ederek anti-inflamatuar etkiler gösterebileceği varsayılmıştır. Bu tahminler, prostatitin karragen enjeksiyonu ile indüklendiği in vivo prostatit modeli kullanılarak daha da değerlendirildi. Model oluşturulmasının ardından hayvanlar YGP ile tedavi edildi. Prostat dokuları, hematoksilin ve eozin (HE) boyama yoluyla histopatolojik inceleme ve enzim bağlantılı immünosorbent testi (ELISA) ile kantitatif olarak inflamatuar belirteçlerin nicel değerlendirmesi ve gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (qRT-PCR) ile toplandı.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tüm hayvan deneyleri, Pekin Çin Tıp Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (BUCM-2024110107-4103) tarafından onaylandı.
Aktif bileşenlerin ve hedeflerin toplanması
YGP, Rehmannia glutinosa, Aconitum carmichaelii, Cinnamomum cassia, Dioscorea opposita, Cornus officinalis, Cuscuta chinensis, Angelica sinensis, Eucommia ulmoides, Cervi Cornus Colla ve Lycium barbarum'dan oluşur. Bu bitki isimleri, bileşiklerini almak için geleneksel Çin tıp sistemleri farmakoloji veritabanı ve analiz platformuna (TCMSP) girildi. Aktif bileşikler oral biyoyararlanış (OB ≥% %30) ve ilaç benzerliği (DL ≥ 0.18)kriterleri 19,20,21 kullanılarak tarandı. Her bileşiğin karşılık gelen hedefleri TCMSP'den alındı ve UniProt veritabanı kullanılarak gen sembollerine standartlaştırıldı. Prostatitle ilgili hedefler, anahtar kelime olarak "prostatit" kullanılarak GeneCards veritabanından alındı ve ortalamadan yüksek alaka puanı olan genler çalışmaya dahil edildi.
YGP'nin prostatite karşı düzenleyici ağının inşası
YGP ile prostatitle ilişkili hedefler arasındaki kesişim, potansiyel terapötik hedefler seti olarak tanımlandı ve tanımlandı. Bu hedefler, bileşik hedef-hastalık ağı oluşturmak için Cytoscape'e (sürüm 3.9.1) ithal edildi. Ağ topolojisi analizi CytoHubba eklentisi kullanılarak yapıldı ve ana bileşenler maksimum klique merkeziyeti (MCC)değerleri 22 üzerinden belirlendi.
Protein-protein etkileşimi (PPI) ağ analizi
Örtüşen hedefler STRING veritabanına (sürüm 11.5) içe aktarıldı ve organizma Homo sapiens olarak ayarlandı. Minimum gerekli etkileşim puanı ≥ 0.7 olarak ayarlandı ve bağlantısı kopukdüğümler 23 olarak gizlendi. Etkileşim verileri TSV formatında dışa aktarıldı ve Cytoscape'te görselleştirildi. Hub genleri, derece merkeziyetine dayalı olarak CytoHubba eklentisi kullanılarak ayrıca tanımlandı.
KEGG Yolu ve GO zenginleştirme analizi
Paylaşılan hedefler, Kyoto genler ve genomlar ansiklopedisi (KEGG) yol analizi için Metascape platformuna yüklendi. Giriş ve analiz türleri Homo sapiens olarak ayarlandı. KEGG yolu zenginleştirme analizi yapıldı. Yollar, yayımlanmış literatür ve veritabanı açıklamalarıyla prostatitle ilgilerine göre daha fazla filtrelendi. Kalan yollar ise Log P değerlerine göre sıralanmıştı. En üst zenginleştirilmiş KEGG yolları balon grafikleri kullanılarak görselleştirildi.
Moleküler kenetleme
Ana hedefler, derecenin merkeziliğine göre PPI ağından seçildi ve aktif bileşikler, sonraki kenetlenme analizi için MCC değerlerine dayanarak YGP-prostatit düzenleyici ağından belirlendi. Protein yapıları PDB formatında AlphaFold Protein Yapı Veritabanı'ndan alındı ve ligand yapıları TCMSP'den mol2formatında 24 indirildi. Moleküler kenetlenme CB-Dock2 çevrimiçiplatformu 25 kullanılarak gerçekleştirildi. Daketlenmeden önce, protein yapıları su moleküllerinin çıkarılması, hidrojen atomlarının eklenmesi ve eksik kalıntıların tamamlanması ile otomatik olarak ön işlenirdi. Bağlanma eğilimleri kaydedildi ve GraphPad Prism (sürüm 10.1.2) kullanılarak ısı haritaları oluşturuldu. Ligand-protein komplekslerinin en düşük Vina skorlarına sahip üç boyutlu yapıları ChimeraX kullanılarak görselleştirildi ve LigPlus kullanılarak iki boyutlu etkileşim diyagramları oluşturuldu.
YGP sulu ekstrakt hazırlığı
YGP'nin bitkisel bileşenleri geleneksel formülasyon oranına göre hazırlandı; bunlar arasında 24 g işlenmiş Rehmannia glutinosa kökü (Shudihuang), 6 g işlenmiş yan kök Aconitum carmichaelii (Fuzi), 6 g Cinnamomum cassia (Rougui) kabuğu, 12 g Dioscorea (Shanyao) köksapı, 9 g Cornus officinalis (Shanzhuyu) meyvesi. 12 g Cuscuta chinensis (Tusizi) tohumu, 12 g Cervi Cornus Colla (Lujiaojiao) işlenmiş boynuz jelatini, 12 g Lycium barbarum (Gouqi) meyvesi, 9 g Angelica sinensis (Danggui) kökü ve 12 g Eucommia ulmoides (Duzhong) kabuğu. Aconitum carmichaelii ve Cervi Cornus Colla hariç tüm otlar, toplam ağırlığının 6 katı olan damıtılmış suda 30 dakika boyunca islanmış, Aconitum carmichaelii ise kendi ağırlığının 6 katı damıtılmış suda ayrı olarak islanmıştır. Aconitum carmichaelii önce elektrikli ısıtma cihazı kullanılarak 1 saat boyunca dekokokülü yapıldı, ardından Cervi Cornus Colla hariç kalan bitkiler eklenip her döngüde 1 saat boyunca iki kez dekoküldü. Cervi Cornus Colla daha sonra 60–70 °C sıcaklıkta bir su banyosunda eritilerek tamamen çözünerek ekstrakta dahil edilmişti. Soğuduktan sonra, karışım çift katmanlı gazlı bezden süzülür, alikotlanmış, -20 °C'de 48 saat dondurulur ve toz halindeki özet elde edilmek üzere liyofilize edilir.
Hayvan modeli ve deneysel tasarım
Erkek Sprague-Dawley fareleri (8 haftalık, 200–220 g) belirli patojensiz koşullarda, 12 saatlik ışık/karanlık döngü ve ücretsiz yiyecek ile suya erişimle beslenmiştir. 1 haftalık aklimatizasyondan sonra, fareler rastgele üç gruba (n = 6 grup) ayrıldı: kontrol, model ve YGP grupları. Kronik prostatit, %3 karragençözeltisi 26 intraprostat enjeksiyonuyla indük edilmiştir. Kısa süreliğine, fareler izofluran ile anestezi edildi (indüksiyon için %3–4 ve bakım için %1,5–2) ve prostatı açığa çıkarmak için orta hat karın kesisi yapıldı. Prostatın her ventral lobuna toplam 25 μL %3 karragen solüsyeni enjekte edildi. Kontrol grubuna sadece normal salin (fizyolojik tuzlu çözelti madde) intraprostat enjeksiyonu yapıldı. Ameliyat sonrası penisilin (2.5 × 105 U/kg) 3 gün boyunca kas içi uygulandı.
YGP liyofilize ekstrakt tozu deksiyondan hazırlanmış ve %0,9 steril normal salin içinde yeniden oluşturularak ağız gavajı için eşit bir süspansiyon elde edilmiştir (10,54 g/kg/gün). YGP grubundaki farelere YGP ekstraktı (10 mL/kg) oral olarak verildi, kontrol ve model gruplara ise %0,9 eşdeğer steril normal salin verildi. 4 hafta sonra, fareler pentobarbital sodyum (50 mg/kg, intraperitoneal enjeksiyon) ile anestezi edildi ve etik kurallara uygun olarak kurban edildikten sonra prostat dokuları toplandı.
Histopatolojik muayene
Prostat dokuları 24 saat boyunca %4 paraformaldehit ile sabitlenmiş, derecelendirilmiş etanol ile kurutulmuş (4 saat için %75 alkol, 2 saat %85 alkol, 2 saat %90 alkol, 1 saat %95 alkol, 1 saat mutlak etanol), ksilenle temizlenmiş ve parafine gömülmüştür. Bölümler (4–5 μm) daha sonra standartprosedürlere göre HE boyama ile uygulandı 27. Kısa süreliğine, bölümler deparafinize edildi, yeniden nemlendirildi, hematoksilin ile boyandı, farklılaştı ve eosin ile karşı boyandı. Susuz bırakıldıktan ve montaj edildikten sonra, kesitler histopatolojik değerlendirme için ışık mikroskobu altında gözlemlendi.
Histopatolojik iltihap, inflamatuar hücre infiltrasyonu, fibroblast proliferasyonu, asinar morfoloji ve salgı durumu temelli yarı nicel bir puanlama sistemi kullanılarak değerlendirildi. İltihap hücre infiltrasyonu 0 (infiltrasyon yok), 2 (hafif infiltrasyon), 4 (orta infiltrasyon) ve 6 (şiddetli infiltrasyon) olarak puanlandı. Fibroblast proliferasyonu 0 (yok), 1 (hafif), 2 (orta) ve 3 (şiddetli) olarak derecelendirildi. Asinar morfoloji, 0 (büyük asinar lümen), 1 (orta derecede azalmış lümen boyutu), 2 (belirgin şekilde azalmış lümen boyutu) ve 3 (asinar tıkanma veya kaybolma) olarak değerlendirildi. Salgı durumu 0 (bol salgı), 1 (orta derecede salgı), 2 (az salgı) ve 3 (salgı eksikliği) olarak puanlandı. Toplam histopatolojik skor, dört parametrin toplamı olarak hesaplandı; daha yüksek puanlar daha ciddi prostat dokusu hasarı veiltihaplanma 28 gösterdi.
ELISA
Prostat dokuları (100 mg) buz gibi fosfat tamponlu tuzlu (PBS) ile durulanmış ve proteaz inhibitörleriyle desteklenen liz tamponunda homojenleştirilmiştir. Homojenatlar 4 °C'de 30–120 dakika kuluçka altına alındı ve süpernatantlar toplanmak için 4 °C'de 15 dakika boyunca 5000 × g sıcaklıkta santrifüjlendi. TNF-α ve IL-6 protein seviyeleri, üreticinin talimatlarına göre ELISA kitleri kullanılarak ölçüldü. Standartlar ve örnekler 96 kuyu plakalarına eklenip 37 °C'de kuluçka yapıldı, ardından biyotinile edilmiş antikorlar ve enzim konjugatlarıyla ardışık kuluçka yapıldı. Yıkamadan sonra, renk gelişimi için substrat çözeltisi eklendi ve reaksiyon stop çözeltisi ile sonlandırıldı. Absorbans 450 nm olarak mikroplaka okuyucu kullanılarak ölçüldü. Sitokin konsantrasyonları standart eğrilere göre hesaplandı.
qRT-PCR
Toplam RNA, prostat dokularından kolon tabanlı bir yöntemle çıkarıldı ve 260 ve 280 nm soğurgunluk ölçülerek saflığı değerlendirildi. RNA örnekleri, ters transkripsiyon kiti kullanılarak 42 °C'de 15 dakika boyunca cDNA'ya ters transkribe edildi. qRT-PCR, termosikl kullanılarak şu koşullarda gerçekleştirildi: ilk denatürasyon işlemi 95 °C'de 3 dakika boyunca, ardından 40 döngü boyunca 95 °C'de 10 saniye ve 60 °C sıcaklıkta 30 saniye uygulandı. Bu çalışmada kullanılan primer dizileri, Ek Tablo 1'de listelenmiştir. Floresans sinyalleri tavlama/uzatma aşamasında toplanmıştır. TNF-α ve IL-6'nın ifade seviyeleri, iç referans geni GAPDH'ye normalize edildi. Göreli gen ifadesi 2−ΔΔCt yöntemiyle hesaplandı.
İstatistiksel analiz
Tüm veriler ortalama ± standart sapma (SD) olarak sunulur. İstatistiksel analizler GraphPad Prism yazılımı (sürüm 10.1.2) kullanılarak gerçekleştirildi. Veri dağılımı analizden önce normallik açısından değerlendirildi. Birden fazla grup arasındaki farklar, tek yönlü varyans analizi (ANOVA) kullanılarak analiz edildi ve ardından Tukey'nin çoklu karşılaştırmalar için yaptığı post hoc testi yapıldı. p < 0.05 değeri istatistiksel olarak anlamlı olarak kabul edildi.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Biyoaktif bileşenlerin ve hedef genlerin tanımlanması
YGP'de kriterleri karşılayan toplam 126 biyoaktif bileşen (OB ≥ %30 ve DL ≥ 0.18) tespit edilmiştir. 208 tahmin edilen hedef gene karşılık gelir. GeneCards veritabanı prostatitle ilişkili 9.845 gen ortaya koydu. Venn analizi, YGP'nin öngörülen hedefleri ile prostatitle ilişkili genler arasında 180 örtüşen gen ortaya koymuştur; bu da bu ortak hedeflerin YGP'nin prostatite karşı terapötik etkilerini aracılık edebilec...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Prostatit, prostat parenkim veya mezenkim içinde artan inflamatuar hücrelerinvarlığıyla patolojik olarak tanımlanır 28,29. Kim ve ark. dokuz yıl boyunca takip edilen 5 milyondan fazla Koreli erkeğin üzerinde yapılan bir çalışmada, çok değişkenli analizlerle prostatitin prostat kanseri gelişme riskini önemli ölçüdeartırdığını doğruladı 30. Ancak, mevcut klinik yönetim sınırlı kalıyor, özellikle bakteriyel o...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yazarlar bu çalışmada çıkar çatışması belirtmemiştir.
Yazarlar, Merkezi Üniversiteler için Temel Araştırma Fonları (2022-JYB-JBZR-037) maddi desteği memnuniyetle takdir etmektedir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| %4 paraformaldehit | Beyotime | P0099-3L | |
| AlphaFold Protein Yapısı Veritabanı | AlphaFold Protein Yapısı Veritabanı | https://alphafold.ebi.ac.uk/ | |
| BeyoFast SYBR Yeşil qPCR Karışımı (2 X) | Beyotime | D7260 | |
| Biyoinformatik çevrimiçi platform | Biyoinformatik çevrimiçi platform | http://www.bioinformatics.com.cn/ | |
| Carrageenan | OriLeaf | S30559 | |
| CB-DOCK2 | CB-DOCK2 | http://183.56.231.194:8001/cb-dock2/php/blinddock.php | |
| Sitoscape | Sitoscape | https://cytoscape.org/ | |
| GeneCards | GeneCards | https://www.genecards.org/ | |
| Hematoksilin ve Eosin (H& E) Boyama Kiti | Beyotime | C0105S | |
| Metascape | Metascape | https://metascape.org/gp/index.html#/main/step1 | |
| Nötr Balsam | Servicebio | WG10004160 | |
| Parafin Mumu (gömmek için) | Servicebio | RP-15 | |
| Proteaz İnhibitörü Kokteyli (100X) | Epizyme | GRF101 | |
| Rat IL-6 ELISA Kiti | Beyotime | PI328 | |
| Rat TNF-α Forma | Pekin 4A Biotech Co., Ltd | CRE0003 | |
| RNAeasy Hayvan Uzun RNA İzolasyon Kiti ve Spin Column | Beyotime | R0026 | |
| STRING | STRING | https://string-db.org/ | |
| TCMSP | TCMSP | https://www.tcmsp-e.com/#/database | |
| Uniprot | Uniprot | https://www.uniprot.org/ |