Cam Lamel Üzerindeki Adherent İki Boyutlu Hücre Kültürlerinde Mono- ve Multiplex İmmünofloresan İçin Maliyet Etkin Bir İş Akışı

Özet

Bu protokol, uygun maliyetli cam lameller, standart 24 kuyucuklu plakalar ve antikor tüketimini minimize eden düşük hacimli boyama koşulları aracılığıyla deneysel maliyetleri azaltan, aynı zamanda standart floresan mikroskobu ile protein lokalizasyonu için temsili bir yaklaşım sunan, yapışkan iki boyutlu hücre kültürlerinin mono- ve multipleks immünofloresan (IF) analizi için maliyet etkin bir iş akışını tanımlamaktadır.

Özet

İmmünofloresan (IF) mikroskopi, hücresel morfolojiyi ve hücre altı organizasyonu korurken, protein lokalizasyonunu ve ko-dağılımını tek hücre çözünürlüğünde görselleştirmek için yaygın olarak kullanılan bir tekniktir. Bu protokolün amacı, standart laboratuvar malzemelerini kullanarak adherent 2D hücre kültürlerinin mono- ve multipleks immünofloresan boyaması için pratik ve düşük maliyetli bir iş akışı sunmaktır. Yöntem, hücrelerin geleneksel 24 kuyucuklu plakalara yerleştirilmiş ucuz cam lameller üzerinde kültüre edilmesine dayanmaktadır; multipleksleme ise primer antikorların konakçı tür ayrımı, spektral olarak farklı floroforlar ve multipleks IF'in yorumlanabilirliğini sağlamak için primer antikorsuz, antikorsuz, tekli boyama ve çapraz etkileşim (crosstalk) kontrollerini içeren güçlü kontrol koşulları aracılığıyla gerçekleştirilmektedir. Sinyal kalitesinden ödün vermeden reaktif ve antikor tüketimini azaltmak için düşük hacimli boyama adımları uygulanmaktadır. Bu iş akışı, özel görüntüleme plakalarına veya odacıklarına olan ihtiyacı ortadan kaldırır ve rutin geniş alan veya konfokal floresan mikroskopi ile uyumludur. Genel olarak bu protokol, adherent hücre kültürlerinde protein lokalizasyonunun ve ko-dağılımının temsili değerlendirmesi için erişilebilir ve pratik bir immünofloresan iş akışı sağlar. Diğer hücre tiplerine veya antikor panellerine adaptasyon; antikor doğrulaması, fiksasyon ve permeabilizasyon koşulları, florofor seçimi ile mikroskop ve filtre setleriyle uyumluluk dahil olmak üzere hedefe özgü optimizasyon gerektirir.

Giriş

İmmünofloresan (IF) mikroskopi, fikse edilmiş hücrelerde proteinlerin hücre altı lokalizasyonunu, bağıl bolluğunu ve kolokalizasyonunu görselleştirmek için yaygın olarak kullanılır; böylece moleküler markörleri hücresel morfoloji ve hücre altı bağlamla ilişkilendirir^1,2. Toplu okumaların (örneğin, immünoblotlama) veya disosyatif tek hücreli analizlerin (örneğin, akış sitometrisi) aksine, IF hücresel uzamsal organizasyonu korur ve özellikle hücreden hücreye fenotipik heterojenliğin ve hücre altı protein dağılımındaki değişikliklerin tek hücre çözünürlüğünde değerlendirilmesi için kullanışlıdır^3,4,5. Deneysel sorular giderek daha fazla birden fazla markörün eş zamanlı değerlendirilmesini gerektirdiğinden, multipleks IF, genellikle farklı konak türlerinde üretilmiş primer antikorların spektral olarak farklı floroforlarla birleştirilmesiyle, aynı örnek içerisinde iki veya daha fazla hedefin eş zamanlı tespit edilmesine olanak tanır⁶ (Şekil 1), bunu doğrudan ve/veya dolaylı tespit stratejileri kullanarak yapar (Şekil 2). Ancak multipleksleme, özellikle dikkatli panel tasarımı ve titiz kontrol koşullarıyla ele alınmadığı sürece yorumlanabilirliği tehlikeye atabilecek olan antikor çapraz reaktivitesi ve spektral crosstalk gibi temel teknik zorlukları beraberinde getirir^7,8.

Bu yöntemin genel amacı, immünofloresans ile doğrulanmış antikorlar için geniş kapsamlı uygulanabilen ve adherent 2D kültürlerin rutin görüntülemesi için optimize edilmiş, pratik ve düşük maliyetli bir iş akışı sağlamaktır. Multipleksleme; konakçı tür ayrımı, spektral olarak farklı floroforlar ve arka plan seviyeleri ile boyama performansını doğrulayan kontrol grupları aracılığıyla gerçekleştirilir^9,10. Özel odacıklı lamlar yerine standart 24 kuyucuklu plaklarda 12 mm'lik cam lamlar kullanılarak, bu iş akışı yüksek maliyetli özel sarf malzemeleri yerine çoğu hücre kültürü laboratuvarında standart stokta bulunan malzemeleri tercih eder. İş akışı ayrıca, birim büyüme alanı başına, tipik olarak 300–500 µL/cm² gerektiren benzer odacıklı lam formatlarına^11,12 kıyasla önemli ölçüde daha az boyama çözeltisi (≈1.13 cm² için 150 µL veya ≈133 µL/cm²) kullanır; bu da alan başına antikor ve reaktif tüketiminde yaklaşık 2 ila 4 katlık bir azalmaya karşılık gelir. Buna göre protokol; standart geniş alan veya konfokal mikroskoplar ile sitoiskelet ve nükleer karşı boyamaları kullanarak, marker lokalizasyonunun ve ko-distribüsyonunun kalitatif çoklu hedef değerlendirmesini destekler. Bu iş akışı, konakçı tür ayrımı ve spektral farklılığa dayalı geleneksel fikse edilmiş hücre multipleks IF için tasarlanmıştır; iteratif veya yüksek boyutlu multipleks yaklaşımlar için tasarlanmamıştır.

Protokol

Bu çalışma insan katılımcılar veya hayvan denekler içermemiştir. Tüm deneyler, halka açık bir hücre bankasından (Banco de Células do Rio de Janeiro, Kat. No. 0276) temin edilen yerleşik bir hücre hattı olan D17 köpek osteosarkom hücre hattı kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Bu nedenle herhangi bir etik onay gerekmemiştir.

1. Hücre hattının sürdürülmesi

1. Yapışkan hücreleri, kullanılan hücre hattı için uygun tamamlayıcı ortam kullanarak standart kültür koşullarında (37 °C, %5 CO₂, nemlendirilmiş inkübatör) sürdürün.
   NOT: Temsili bir örnek olarak, D17 köpek osteosarkom hücreleri (Banco de Células do Rio de Janeiro [BCRJ], Kat. No. 0276), %10 fetal bovine serum (FBS) ve %1 antibiyotik-antimikotik ile desteklenmiş Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) içinde sürdürülmekte, trypsin-EDTA (etilendiamintetraasetik asit) kullanılarak %70–80 konfluansta alt kültüre alınmakta ve doğrulanmış pasaj aralığında (örneğin, pasaj 5–20) kullanılmaktadır.
2. Deneylerden önce, doğrulanmış bir mikoplazma tespit testi kullanarak mikoplazma-negatif durumunu onaylayın.

2. 24 kuyucuklu plakanın ve cam lamellerin hazırlanması

NOT: Lamel yüzeyleri, aşağıda açıklanan yöntemlerden herhangi biriyle sterilize edilmeden önce %70 etanol içinde daldırarak (5 dk, 3× tekrarlanır) temizlenmelidir; sterilizasyon sonrası lameller, kullanıma kadar oda sıcaklığında kapalı bir kapta saklanmalıdır.

1. Temiz 12 mm yuvarlak cam lamelleri bir cam Petri kabına (veya lamel tutucuya) yerleştirin ve otoklavlayın. Bir çift ince uçlu metal penseti de otoklavlayın.
2. Alternatif: Lamelleri ve pensetleri %70 etanol ile temizleyin, havada kurumaya bırakın ve kullanmadan önce bir biyogüvenlik kabini içinde ultraviyole (UV) ışınlamaya (30 dk) maruz bırakarak yüzey dekontaminasyonu yapın. Sterilize edilmiş lamelleri kullanıma kadar oda sıcaklığında kapalı bir kapta saklayın.
3. Bir biyogüvenlik kabini içinde, steril pensetleri kullanarak 24 kuyucuklu bir doku kültürü plağındaki deney grupları için belirlenen her bir kuyucuğa bir adet steril lamel yerleştirin.
4. Opsiyonel: Kullanılan hücre tipi için gerekliyse, üretici talimatlarını veya yerleşik laboratuvar kılavuzlarını izleyerek lamelleri adezyon artırıcı kaplamalarla kaplayın.
   NOT: Kaplama seçenekleri (poli-L-lizin, kollajen I veya fibronektin) ve çalışma konsantrasyonları Materyal Tablosunda listelenmiştir. Cam üzerinde kültüre edilen çoğu adherent hücre hattı için kaplanmamış, sterilize edilmiş lameller yeterlidir; kaplama bileşenleri antijenik olabilir, bu nedenle seçilen kaplama paneldeki herhangi bir antikorla çapraz reaksiyona girmemelidir.
5. Lameller kaplandıysa, fazla kaplama solüsyonunu aspire edin, steril fosfat tamponlu salin (PBS) ile bir kez durulayın ve hücre ekimi öncesinde lamellerin biyogüvenlik kabininde havada kurumasını bekleyin.

3. Deneysel gruplar

1. Multiplex tasarıma uygun bir kontrol paneli ekleyin.
   NOT: Antikor içermeyen bir kontrol (ne birincil ne de ikincil antikor), içsel otofloresansı ortaya çıkarır ve birincil antikor içermeyen bir kontrol (birincil antikor olmaksızın ikincil antikor kokteyli), tüm kanallar genelindeki spesifik olmayan ikincil bağlanmayı ve arka planı eş zamanlı olarak değerlendirir; bu protokol kesin olarak spektral olarak farklı ikincil antikorlar kullandığından, bu tek kontrol, her bir ikincil antikoru kendi kanalı içinde bağımsız olarak değerlendirir ve florofor başına ikincil-yalnızca kontrol ile aynı amaca hizmet eder. Her bir birincil-ikincil çiftinin ayrı ayrı uygulandığı tekli boyama kontrolleri, multiplex kombinasyondan önce her bir antikorun performansını doğrular ve multiplex durumla karşılaştırılarak her bir florofor çifti için spektral çapraz etkileşimin değerlendirilmesine olanak tanır. Mümkün olduğunca, assay performansını onaylamak için hedef antijeni eksprese eden bir pozitif kontrol kullanılır.

4. Lamel üzerine hücre ekimi (plaklama)

1. Bir biyogüvenlik kabini içerisinde, hücreleri tripsin (veya uygun başka bir disosiasyon yöntemi) kullanarak ayırın, nötralize edin ve komple kültür ortamında yeniden süspande edin.
2. Hücreleri otomatik bir hücre sayıcı veya hemositometre kullanarak sayın.
3. Hücreleri 6 × 10⁴–1 × 10⁵ hücre/mL olacak şekilde dilüe edin.
4. Her kuyuya 0,5 mL hücre süspansiyonu ekleyin (final: 3 × 10⁴–5 × 10⁴ hücre/kuyu).
   NOT: Gerektiğinde, çizilmelere dikkat ederek lamelin kuyunun tabanına düzgünce yerleştiğinden emin olmak için steril bir pipet ucu kullanılabilir.
5. Hücreler yapışana ve istenen konfluens düzeyine ulaşana veya deney zaman noktasına gelene kadar hücreleri standart koşullarda (37 °C, %5 CO₂) inkübe edin.

5. Hücre işlemi (Opsiyonel)

1. Deneysel tasarıma göre işlem zamanlamasını seçin. İşlem, uygun olduğu üzere farmakolojik tedavi, sitokin stimülasyonu, hedef gen ekspresyonunu indüklemek veya nakavt etmek için genetik manipülasyon veya diğer deneysel müdahaleleri içerebilir.
2. Kontrol ve işlem görmüş grupları belirlemek için kuyucukları etiketleyin.
3. Gerekli zaman noktaları boyunca inkübe edin; aşırı büyüme arka planı artırdığı ve morfolojiyi bozduğu için aşırı konfluensden kaçının.
   NOT: Tasarım, ekimden hemen sonra fiksasyon gerektirmediği sürece, hücreler fiksasyondan önce lameline yapışmış olmalıdır.
4. Hızla salgılanan hedefler için (örneğin sitokinler), fiksasyondan önce kültür ortamına 1–10 µg/mL (genellikle 5 µg/mL) son konsantrasyonda brefeldin A (BFA) ekleyin ve 37 °C, %5 CO₂'de 4–6 saat inkübe edin.
5. BFA içeren ortamı uzaklaştırın ve derhal Fiksasyon aşamasına geçin.

6. İmmünofloresan boyama

NOT: Sabitlemeden itibaren steril tekniğe gerek yoktur; boyama işlemi, DİKKAT gerektiren bir reaktifle çalışılırken kimyasal çeker ocak kullanılarak tezgah üzerinde gerçekleştirilebilir. Örnekler hiçbir aşamada kurumamalıdır; aspirasyon sırasında ince bir tampon tabakası bırakılmalı ve bir sonraki solüsyon hemen eklenmelidir.

1. Fiksasyon (birini seçin):
   NOT: Fiksatif, hedef lokalizasyonuna ve epitop hassasiyetine göre seçilir (Tartışma bölümüne bakınız): Paraformaldehit (PFA) (paraformaldehitten hazırlanan formaldehit) çoğu hedefe uygundur ve falloidin ile uyumludur; metanol bazı nükleer/fosfo-epitoplara yardımcı olabilir ancak F-aktin boyamasını bozar.
   1. PFA fiksasyonu (çoğu hedef için önerilen):
      1. Besiyerini aspire edin ve Tris tamponlu salyandaki (TBS) ile bir kez nazikçe durulayın (0,5 mL/kuyu).
      2. PBS (fosfat tamponlu salyan) içinde %4 PFA ekleyin (0,5 mL/kuyu) ve oda sıcaklığında (≈25 °C) 10 dk inkübe edin.
      3. PFA'yı aspire edin ve TBS ile 3× yıkayın (hızlıca aspire edin; kuyuların kurumasına izin vermeyin).
         NOT: DİKKAT: PFA toksiktir ve potansiyel bir kanserojendir. PFA solüsyonlarını, uygun kişisel koruyucu ekipman (laboratuvar önlüğü, eldiven ve göz koruması) giyerek sertifikalı bir kimyasal çeker ocakta kullanın. Solumaktan ve ciltle temastan kaçının ve atıkları kurumsal kimyasal güvenlik yönergelerine uygun olarak bertaraf edin.
2. Alternatif olarak, Metanol fiksasyonu (bazı nükleer antijenler ve belirli fosfo-epitoplar için faydalıdır):
   1. %100 metanolü −20 °C'ye kadar ön soğutun.
   2. Buz gibi soğuk metanolü doğrudan hücrelere ekleyin (0,5 mL/kuyu) ve −20 °C'de 5 dk inkübe edin.
   3. TBS ile 3× yıkayın (hızlıca aspire edin; kuyuların kurumasına izin vermeyin).
      NOT: Metanol fiksasyonundan sonra ek permeabilizasyon gerekmeyebilir ve antikor/epitopa göre optimize edilmelidir. Metanol fiksasyonu membran epitoplarına zarar verebilir ve florofor-konjuge falloidin/F-aktin boyamasını bozabilir. DİKKAT: Metanol toksik, uçucu ve yüksek derecede yanıcıdır. İyi havalandırılan bir alanda veya kimyasal çeker ocakta kullanın; uygun kişisel koruyucu ekipman giyin ve açık alevlerden ve ısı kaynaklarından uzak tutun. OPSİYONEL DURAKLAMA NOKTASI: Fiksasyondan sonra, örnekleri düşük konsantrasyonlu fiksatif içeren (%0,1 PFA içeren PBS gibi) PBS içinde 4 °C'de bir haftaya kadar saklayın; saklama süresini her antijen için doğrulayın.
3. Aldehit söndürme (Opsiyonel)
   1. TBS içinde 50 mM glisin ile (0,5 mL/kuyu) oda sıcaklığında (≈25 °C) 5 dk inkübe edin.
   2. TBS + %0,05 polisorbate 20 ile 3× yıkayın.
      NOT: Glisin, PFA fiksasyonundan sonra kalan serbest aldehit gruplarını nötralize ederek fiksasyon kaynaklı otofloresansı azaltır ve antikor boyama spesifisitesini artırır.
4. Permeabilizasyon
   1. Membran proteinleri hedefleniyorsa, permeabilizasyonu atlayın ve adım 6.5.1'e geçin.
   2. Hücre içi veya nükleer proteinler hedefleniyorsa, TBS içinde %0,1–0,3 non-iyonik deterjan (0,5 mL/kuyu) ile oda sıcaklığında (≈25 °C) 5–10 dk permeabilize edin.
   3. TBS + %0,05 polisorbate 20 (TBST) ile 3× yıkayın.
      NOT: Oktilfenol etoksilat non-iyonik deterjan konsantrasyonu ve süresi hedefe göre optimize edilir; yeterlilik, doğru kompartman sinyali, korunmuş morfoloji, belirgin F-aktin ve düşük arka plan ile değerlendirilir (Tartışma bölümüne bakınız). Saponin kullanılıyorsa, sonraki tüm antikor ve yıkama tamponlarında korunur. DİKKAT: Oktilfenol etoksilat non-iyonik deterjan solunduğunda veya ciltle temas ettiğinde zararlıdır ve göz tahrişine neden olabilir. Eldivenle kullanın ve aerosol oluşumundan kaçının.
5. Bloklama
   1. Kuyu başına 0,5 mL bloklama solüsyonu (TBS içinde %5 sığır serum albümini (BSA) ) ekleyin ve oda sıcaklığında (≈25 °C) 30 dk inkübe edin.
   2. Bloklama tamponunu aspire edin.
   3. Doğrudan primer antikor inkübasyonuna geçin (yıkamayın).
6. Primer antikor inkübasyonu
   NOT: Primer ve sekonder antikor dilüsyonları titrasyon yoluyla ampirik olarak belirlenir (Tartışma bölümüne bakınız).
   1. %0,05 polisorbate 20 ve %1 BSA içeren Tris tamponlu salyanda (TBST-BSA %1), her hedef için önceden optimize edilmiş antikor konsantrasyonlarını kullanarak tekli veya multipleks primer antikor panelleri hazırlayın.
   2. Multipleks immünofloresan için, farklı konak türlerinden gelen farklı antijenlere yönelik tüm konjuge edilmemiş primer antikorları (örneğin, fare anti-interferon-β (IFN-β) + tavşan anti-p14ARF + keçi anti-aktin) tek bir antikor kokteylinde birleştirin.
   3. Kuyu başına 150 µL ekleyin, tüm lamın antikor solüsyonu ile tamamen kaplandığından emin olun.
      NOT: Düşük hacimlerde buharlaşmayı önlemek için plaka, nemlendirilmiş bir bölmede (örneğin, nemli peçete içeren sızdırmaz bir kutu) inkübe edilir.
   4. Oda sıcaklığında (≈25 °C) 1,5 sa veya 4 °C'de 12–16 sa inkübe edin.
   5. Oda sıcaklığında (≈25 °C) her biri 3 dk olmak üzere TBST ile 3× yıkayın; her yıkamadan sonra hızla aspire edin.
7. Sekonder antikor inkübasyonu (ve uygun olduğunda doğrudan konjuge primerler)
   NOT: Bu adımdan itibaren, fotobeyazlamayı önlemek için örnekler ışıktan korunur. Çapraz etkileşimi (crosstalk) minimize etmek için sekonder antikorlar ve doğrudan konjuge primerler arasında spektral olarak farklı floroforlar kullanılır; kognat olmayan primer antikorlara bağlanmayı minimize etmek için türe özgü, yüksek derecede çapraz adsorbe edilmiş sekonder antikorlar kullanılır. Nükleer vele sitoskeletal markerları içeren florofor panel tasarımı ve mikroskop eksitasyon/emisyon uyumluluğu Tartışma bölümünde ele alınmıştır.
   1. Sekonder antikorları, önceden optimize edilmiş konsantrasyonları kullanarak TBST-BSA %1 solüsyonunda dilüye edin. Multipleks deteksiyon için, kullanılan primer antikorların konak türlerine karşılık gelen tüm sekonder antikorları (her konak türü için bir sekonder) tek bir kokteylde birleştirin.
   2. Tüm lamın tamamen kapandığından emin olarak kuyu başına 150 µL ekleyin.
   3. Oda sıcaklığında (≈25 °C) 1 sa inkübe edin.
      NOT: Eğer panel bir veya daha fazla doğrudan konjuge primer antikor içeriyorsa, bunları sekonder antikor kokteyli ile birlikte ekleyin ve inkübasyonu oda sıcaklığında (yaklaşık 25 °C) 1,5 saate uzatın.
   4. Oda sıcaklığında (≈25 °C) her biri 3 dk olmak üzere TBST ile 3× yıkayın; her yıkamadan sonra hızla aspire edin.

7. Nükleer karşıt boyama ve f-aktin boyama

1. TBS içinde seyreltilmiş Hoechst 33342 (1:5000) çekirdek karşı boyasını ekleyin ve ışıktan koruyarak oda sıcaklığında (≈25 °C) 15 dk inkübe edin. F-aktin, anti-aktin antikoru yerine faloidin ile etiketlenecekse, aynı çözeltiye faloidin (1:400) ekleyin.
2. TBST ile 3× yıkayın ve her yıkamanın ardından sıvıyı hemen aspire edin (kuyucukların kurumasına izin vermeyin).
3. Lam örtülerinin geri alınmasına/montajına kadar batık kalmasını sağlamak için her kuyucuğa 0,5 mL TBS ekleyin.

8. Lamel geri kazanımı ve lam montajı

1. Lamlar TBS içinde batmış durumdayken, ince bir iğne veya bisturi ucunu lamın kenarının altına yerleştirin ve bir kenarı kısmen kalkana kadar nazikçe yukarı doğru kaldırın. İnce bir penset kullanarak lamı kavrayın ve kuyucuktan çıkarın.
   NOT: Lamın batırılmamış olduğu durumlarda çıkarılması, yüzey gerilimi nedeniyle kuyucuk tabanına sıkıca yapışmasına yol açabilir ve kırılma riskini artırabilir.
2. Lamı pensetle tutarken, fazla TBS'yi bir vakum aspiratörü veya emici kağıt kullanarak kenarlardan dikkatlice çekin. Hücrelerle kaplı yüzeye dokunmaktan kaçının.
   NOT: Artık sıvıların kalmasından kaçınılmalıdır, çünkü bu durum montaj medyumunu seyreltebilir, görüntü netliğini ve kontrastını bozabilir.
3. Lamı, küçük bir damla (≈3 µL) montaj medyumu içeren temiz bir cam slayt üzerine hücreli yüzeyi aşağı gelecek şekilde yerleştirin.
   NOT: Ticari bir kendi kendine kürlenen antifade medyumu veya %80 gliserol/fosfat tamponlu salin (PBS) bazlı ev yapımı bir medyum kullanılabilir; gliserol bazlı montajlar şeffaf oje ile mühürlenir ve nükleer boya içermeyen medyumlar karşı boyama işleminden sonra seçilir. Saklama sınırları ve florofor stabilitesi ile ilgili kılavuz Tartışma bölümünde verilmiştir.
4. Görüntüleme işleminden önce, slaytların ışıktan korunarak yatay konumda ≈24 saat boyunca kürlenmesini sağlayın.

Sonuçlar

Bu protokol, cam lamlar üzerinde kültüre edilmiş adherent köpek tümör hücrelerinin mono- ve multipleks immunofloresan boyamasını destekleyerek, hücresel morfolojiyi korurken nükleer, sitoplazmik ve sitoiskelet belirteçlerinin aynı anda görselleştirilmesine olanak tanır. Temsili sonuçlar Şekil 3. içerisinde gösterilmiştir.

Başarılı deneylerde, genetik manipülasyonla (Bölüm 5.1) köpek p14ARF ve köpek IFN-β eksprese edecek şekilde düzenlenmiş D17 köpek osteosarkom hücreleri, düşük arka plan ve minimum spesifik olmayan boyama ile birlikte güçlü, mekansal olarak uygun floresan sinyaller göstermiştir. p14ARF eksprese eden hücreler için (Şekil 3A), immünofloresan boyama, p14ARF'nin bilinen hücre altı dağılımıyla tutarlı olarak ağırlıklı olarak nükleer bir lokalizasyon ortaya çıkarmıştır. %0,3 oktilfenol etoksilat non-iyonik deterjan permeabilizasyonunun kullanımı, net nükleer karşıt boyama ve bir anti-aktin antikoru (turuncu yayan florofor) ile görselleştirilen aktin yapılarıyla doğrulandığı üzere, nükleer morfolojiyi ve sitoiskelet bütünlüğünü korurken antikorların nükleer epitoplara etkili bir şekilde erişmesini sağlamıştır.

IFN-β eksprese eden hücreler için (Şekil 3A), protein sekresyonunu bloke etmek amacıyla BFA ile inkübasyonun ardından, bu çözünür sitokinin hücre içi birikimini ve tespitini sağlayan sitoplazmik bir sinyal gözlemlenmiştir. Bu koşullar altında, sitoplazmik içeriklerin aşırı ekstraksiyonu gerçekleşmeden antikor penetrasyonuna izin vermek için daha hafif bir permeabilizasyon yeterli olmuştur. Başarılı boyama; noktasal-diffüz sitoplazmik floresans, minimal nükleer çapraz etkileşim ve korunmuş aktin mimarisi ile karakterize edilmiştir.

Temel parametreler uygun şekilde optimize edilmediğinde suboptimal sonuçlar gözlemlenmiştir. Permeabilizasyonun yetersiz olması, permeabilize edilmemiş durum için gösterildiği üzere (0% oktilfenol etoksilat noniyonik deterjan; Şekil 3B ve Ek Şekil 1), zayıf veya yok denecek kadar az nükleer p14ARF sinyali ile sonuçlanmıştır. Buna karşılık, aşırı permeabilizasyon (≥0.5% oktilfenol etoksilat noniyonik deterjan veya uzatılmış inkübasyon süreleri), sitoskeletal boyamanın kısmi kaybına, artmış arka plan floresanına ve bozulmuş hücresel morfolojiye yol açabilir. Hızla salgılanan proteinlerle (ör. IFN-β) yapılan deneylerde, BFA'nın atlanması, protokol hatasından ziyade hızlı salgılanmayı yansıtan daha zayıf bir hücre içi sinyal üretmiştir.

Tekli boyama kontrolleri (Ek Şekil 2), yalnızca her bir hedefe karşılık gelen kanalda sinyal göstermiş ve gözlemlenen immünofloresan boyamanın özgüllüğünü desteklemiştir. Primer antikor içermeyen ve antikor içermeyen kontrolleri kapsayan negatif kontrol koşulları (Ek Şekil 2), beklenen nükleer boyamayı göstermiş; antikora bağımlı kanallarda ise sinyal ihmal edilebilir düzeyde kalmıştır, bu da düşük otofloresans ve sekonder antikorda minimum spesifik olmayan bağlanma olduğunu göstermektedir.

Birlikte değerlendirildiğinde, bu temsili sonuçlar; fiksasyon, permeabilizasyon gücü ve hedefe bağlı spesifik stratejilerin (örneğin, sekresyon blokajı) hedef biyolojisine uygun şekilde seçilmesi durumunda, protokolün farklı subselüler lokalizasyonlara sahip proteinlerin tespitini desteklediğini göstermektedir. Doğru optimizasyon, düşük arka plan gürültüsü ve korunan hücresel morfoloji ile birlikte güçlü, spesifik floresan sinyalleriyle sonuçlanırken, optimal olmayan koşullar daha zayıf veya gürültülü sinyallere ve değişmiş hücresel yapıya yol açmaktadır.

Şekil 1: Mono- ve multipleks immünofloresans iş akışının genel şeması. Hücre kültürü bakımından görüntü elde etme aşamasına kadar olan temel adımlar; hedef odaklı seçim gerektiren iki karar noktası olan fiksasyon yöntemi (PFA'ya karşı metanol) ve permeabilizasyon (hedefin hücre içi lokalizasyonuna bağlı olarak) dahil edilmiştir. Hızla salgılanan hedefler için brefeldin A (BFA) ön işlemi içeren isteğe bağlı deneysel işlem, fiksasyon öncesindeki bir dal olarak belirtilmiştir. Netlik adına gösterilmeyen isteğe bağlı adımlar (örneğin, aldehit söndürme), tam Protokol'de açıklanmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Antikor tabanlı floresan tespit stratejilerinin şematik gösterimi. Doğrudan tespit, florofor konjuge primer antikorlar kullanırken; dolaylı tespit, bu protokol boyunca benimsenen strateji olan, konjuge olmayan primer antikorların florofor konjuge sekonder antikorlarla eşleştirilmesini kullanır. Multiplex uygulamalar için dolaylı tespit, farklı konak türlerinde üretilmiş konjuge olmayan primer antikorlar gerektirir; böylece her sekonder antikor, çapraz reaksiyon olmadan ilgili primer antikoru seçici olarak tanıyabilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: D17 köpek osteosarcoma hücrelerinin multipleks immünofloresansı.D17 hücreleri (5 × 10⁴), 24 kuyucuklu plakalar içindeki cam lameller üzerine ekilmiş ve 25 °C'de 10 dk boyunca %4 paraformaldehit (PFA) ile fikse edilmiştir. Hücreler; anti-p14ARF (1:200; yeşil ışımalı floroforlar), anti-aktin (1:200; turuncu ışımalı floroforlar) ve anti-interferon-β (IFN-β) (1:200; uzak-kırmızı ışımalı floroforlar) primer antikorları ve bunlara karşılık gelen 1:500 oranındaki sekonder antikorlar kullanılarak multipleks immünofloresansa tabi tutulmuştur. Çekirdekler karşı boyanmıştır. IFN-β tespitinden önce, protein salınımını engellemek için hücreler BFA (5 µg/mL, 4 sa) ilele işleme tabi tutulmuştur. (A) Hücreler, 25 °C'de 10 dk boyunca %0,3 non-iyonik deterjan ile permeabilize edilmiştir. (B) Hücreler permeabilizasyon yapılmadan ( %0 non-iyonik deterjan) işlem görmüştür. Her biri 2 teknik tekrarda gerçekleştirilen 2 bağımsız biyolojik tekrardan alınan temsilci görüntüler yer almaktadır. Bu şekildete yalnızca birleştirilmiş kanallar gösterilmektedir; münferit kanallar Ek Şekil 1'de sunulmuştur. Koşullar arasında, özellikle intranükleer bir hedef olan p14ARF (A; oklar) için işaretleme farklılıkları gözlemlenebilmektedir; bu sinyal permeabilize edilmemiş grupta (B) mevcut değildir. A ve B panelleri aynı ayarlar kullanılarak elde edilmiş ve işlenmiştir (Ek Tablo 1). Bu panele karşılık gelen negatif ve tekli boyama kontrolleri Ek Şekil 2'de gösterilmektedir. Ölçek çubuğu: 100 µm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 1: Şekil 3'e karşılık gelen, permeabilize edilmiş (sol sütun) ve permeabilize edilmemiş (sağ sütun) olarak markerlara göre düzenlenmiş bireysel floresan kanalları. Yan yana gösterilen koşullar: Hoechst 33342 (A, B), p14ARF (C, D; yeşil yayan floroforlar), aktin (E, F; turuncu yayan florofor) ve IFN-β (G, H; uzak-kırmızı yayan floroforlar) ile sırasıyla Şekil 3A ve 3B'ye karşılık gelen birleştirilmiş paneller (I, J). Oklar temsili p14ARF nükleer boyamayı; elipsler sırasıyla temsili aktin (E) ve IFN-β (G) boyamasını göstermektedir. Permebilize edilmemiş koşullar altında p14ARF nükleer sinyal kaybı ile birlikte IFN-β ve aktinin suboptimal etiketlenmesi belirgindir. (D; yıldız işareti) kısmında gözlenen kalıntı sinyal, karşılık gelen tekli boyama ve yalnızca sekonder kontrollerde (Ek Şekil 2) bulunmadığıyla doğrulanan, birlikte mevcut olan floroforlardan kaynaklanan spektral çapraz etkileşimi yansıtmaktadır. Ölçek çubuğu: 100 µm. Lütfen bu dosyayı indirmek için buraya tıklayın.

Ek Şekil 2: Şekil 3'teki multipleks panele karşılık gelen kombine immunofloresans kontrolleri. Her kontrol grubu için, bireysel kanallar (Hoechst 33342, yeşil ışık yayan floroforlar, turuncu ışık yayan florofor ve uzak-kırmızı ışık yayan floroforlar), birleştirilmiş görüntü (beşinci sütun) ile birlikte gösterilmiştir. (A–E) Antikorsuz kontrol: primer veya sekonder antikorlar olmadan işlenen hücreler. (F–J) Sadece sekonder kontrol: primer antikorlar yokluğunda sekonder antikor kokteyli ile inkübe edilen hücreler. (K–O) p14ARF tekli boyama kontrolü (yeşil ışık yayan floroforlar). (P–T) Aktin tekli boyama kontrolü (turuncu ışık yayan florofor). (U–Y) IFN-β tekli boyama kontrolü (uzak-kırmızı ışık yayan floroforlar). Görüntüleme ve işleme ayarları Şekil 3'te kullanılanlarla aynıdır (Ek Tablo 1). Ölçek çubuğu: 100 µm. Lütfen bu dosyayı indirmek için buraya tıklayın.

Ek Tablo 1: Floresans filtre küpü spesifikasyonları ve görüntüleme sırası. Görüntüler, Şekil 3, Ek Şekil 1 ve Ek Şekil 2'de görüntülenen her alan için, aşağıda listelenen filtre küpleri kullanılarak, gösterilen sırayla bir ters geniş alan floresans mikroskobunda (40×/0.80 objektif) ardışık olarak elde edilmiştir. Görüntüler tekil optik düzlemler olarak alınmıştır (z-yığınlama yapılmamıştır).Eksitasyon yoğunluğu, belirtilen seviyelerde floresans yoğunluk kontrolü kullanılarak ayarlanmış ve tüm kanallar için gelen ışık alan diyaframı 6. konumda tutulmuştur. Kamera ayarları (8-bit dijitalleştirme, 3072×2048 format, gama 1.0) ve sabit dijital keskinleştirme ayarı, Ek Şekil 2'deki kontrol görüntüleri dahil olmak üzere tüm kanallar ve paneller için aynıdır. Görüntüleme için tüm kanallara ve panellere aynı şekilde tek bir doğrusal parlaklık/kontrast ayarı uygulanmıştır. Görüntüler TIFF olarak dışa aktarılmıştır. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Tablo 2: İmmünofloresan iş akışındaki yaygın teknik sorunlar için sorun giderme kılavuzu. Protokol boyunca karşılaşılan yaygın sorunlar, olası nedenler ve düzeltici işlemler.Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayınız.

Tartışma

Bu lamel tabanlı immünofloresan iş akışının tutarlı bir şekilde gerçekleştirilmesi için birkaç adım kritik öneme sahiptir. Tüm prosedürler, işlemleri basitleştiren, örnek manipülasyonunu sınırlayan ve düşük reaktif hacimleri kullanarak lamelin tamamen kaplanmasını sağlayan 24 kuyucuklu bir kültür kuyusunun kısıtlı ortamında gerçekleştirilir; bu sayede deney başına antikor tüketimi azaltılır. Bu düşük hacimli çözeltiler buharlaşmaya meyilli olduğundan, inkübasyonların nemlendirilmiş bir bölmede yapılması en iyisidir ve örneklerin kurumasına asla izin verilmemelidir: kısa süreli kurumalar bile arka plan floresansını artırır ve hücresel morfolojiyi bozar. Aspirasyon yapılırken lamel üzerinde ince bir tampon tabakası bırakılır ve bir sonraki çözelti hemen eklenir.

Aşırı büyüme arka planı artırdığı ve hücresel mimariyi bozduğu için, arka planı sınırlamak ve morfolojiyi korumak adına uygun hücre ekim yoğunluğu ve fiksasyon anındaki kontrollü konfluensle kritik öneme sahiptir. Benzer şekilde, her ikisi de fiksasyon verimliliğini, antikor bağlanmasını ve arka plan sinyalini etkilediğinden, tüm süreç boyunca inkübasyon süresinin ve sıcaklığın hassas kontrolü gereklidir^5,13. Ortam koşulları dalgalandığında, 25 °C'ye ayarlanmış sıcaklık kontrollü bir inkübatör veya kuru fırın kullanımı, tekrarlar arasında tutarlı inkübasyon zamanlaması ile birleştirildiğinde tekrarlanabilirliği artırır.

Fiksasyon, antijen korunumu ve hücresel yapıyı belirlediği için ilk belirleyici adımdır⁵ ve fiksatif, hedef lokalizasyonuna ve epitop hassasiyetine göre seçilir. Mimariyi koruduğu, antijen dağılımını sürdürdüğü ve faloidin tabanlı F-aktin boyamasıyla uyumlu olduğu için çoğu membrana ilişkili, sitoplazmik, nükleer velele cytoskeletal hedefler için PFA önerilir. Çapraz bağlayıcı fiksasyondan sonra kötü tespit edilen belirli nükleer antijenler, özellikle fosfo-epitoplar veya aldehit duyarlı epitoplar için metanol tercih edilebilir; ancak metanol membran bütünlüğünü bozar, çözünür proteinleri ekstre eder ve faloidin/F-aktin boyamasını engeller; her hedef için uyumluluk doğrulanmalıdır ^13,14,15,16. Çözünür sitokinler ve diğer hızla salgılanan proteinler için, PFA fiksasyonuna eklenen BFA ön işlemi, fiksasyon öncesinde hücre içi sinyali korur: BFA, protein transportunu endoplazmik retikulumdan Golgi aygıtına doğru engeller, salgılanan proteinlerin hücre içinde birikmesini sağlar ve immunofloresan ile tespit edilmelerine olanak tanır. Çelişen fiksasyon gereksinimleri olan hedeflerin aynı anda tespit edilmesi gerektiğinde, ampirik optimizasyon gereklidir. Küçük bir dialdehit olan gliyoksal; daha hızlı çapraz bağlanma, geliştirilmiş antijen korunumu ve immunofloresan ile süper-çözünürlüklü mikroskopi ile uyumluluk özellikleri nedeniyle PFA'ya alternatif olarak rapor edilmiştir; gliyoksal fiksasyonu ile doğrudan deneyimimiz yoktur ve bunu literatür destekli bir seçenek olarak sunmaktayız^17,18.

Fiksasyonu takiben, uygun permeabilizasyon, yapısal bütünlüğü korurken antikorların hücre içi ve nükleer epitoplara erişimini sağlar⁵. Yetersiz permeabilizasyon, morfoloji bozulmasa dahi tipik olarak zayıf veya yok denecek kadar az sinyal verir ve bu durum antikor erişiminin kısıtlı olduğunu gösterir; buna karşılık aşırı permeabilizasyon, çözünür proteinlerin ekstraksiyonuna yol açar, membranları bozar, hücre iskeleti boyamasında kayba neden olur ve arka plan gürültüsünü artırır. Bu nedenle deterjan tipi, konsantrasyonu ve inkübasyon süresi hedefe göre optimize edilir. Yeterli permeabilizasyon dört kritere göre değerlendirilebilir: (i) beklenen subcellular bölmede spesifik sinyal; (ii) sırasıyla Hoechst 33342 ve faloidin ile çözümlenen sağlam nükleer ve sitoplazmik sınırlar ile korunan morfoloji; (iii) yaygın veya kaybolmuş hücre iskeleti sinyali aşırı permeabilizasyonu gösterdiğinden, belirgin F-aktin boyaması; ve (iv) negatif kontrollerde düşük arka plan. Bu kriterler karşılanmadığında, noniyonik deterjan olan oktilfenol etoksilat konsantrasyonu ve/veya inkübasyon süresi ampirik olarak ayarlanır. Membranla ilişkili ve hücre içi antijenler tek bir panelde birleştirildiğinde, daha hafif koşullar (daha düşük deterjan konsantrasyonu, daha kısa inkübasyon) hücre içi erişime izin verirken membran epitoplarını korur ve 5 dakikadan başlayıp kademeli olarak artan bir zaman serisi faydalıdır. Bunun yerine saponin kullanılırsa, permeabilizasyon etkisi geri döndürülebilir olduğu için sonraki tüm antikor ve yıkama tamponlarında mevcut olması gerekir.

Antikor konsantrasyonları, genel önerilerle benimsenmek yerine titrasyon yoluyla ampirik olarak belirlenir. Pratik bir yaklaşım, üreticinin önerdiği dilüsyonun (örneğin, önerilen 1:200 için 1:50, 1:100, 1:200 ve 1:400) hem altında hem üstünde en az 3–4 konsantrasyonu kapsayan ve özdeş koşullar altında replika lamel (coverslip)lere uygulanan bir seri dilüsyon serisidir. Her dilüsyon; beklenen kompartmandaki spesifik sinyal yoğunluğu, boyalı örneklerin ilgili birincil antikor içermeyen kontrolle ve ikincil arka planın antikor içermeyen kontrolle karşılaştırıldığı sinyal-arka plan oranı ve morfolojinin korunumu açısından değerlendirilir. Minimum arka planla birlikte güçlü ve spesifik sinyal veren en düşük konsantrasyon seçilir. Kalıcı yüksek arka plan genellikle daha fazla titrasyon, uzatılmış bloklama veya artırılmış yıkama sertliği ile giderilirken; zayıf sinyal aşırı fiksasyonu, suboptimal antikor konsantrasyonunu, birincil antikorun hedef epitopu tanıyamamasını, ikincil antikor ile birincilin konakçı türü arasındaki uyumsuzluğu (örneğin, fare konakçılı bir birincil antikora uygulanan anti-tavşan ikincil antikor) veya özellikle tekrarlayan ışık maruziyeti nedeniyle meydana gelen son kullanma tarihi veya uygunsuz saklama kaynaklı ikincil antikor bozunması sonucu florofor sinyali kaybını yansıtabilir. Tüm dilüsyonlarda sinyal yoksa, birincil inkübasyon süresini uzatmak veya 4 °C'de gece boyu bekletmeye geçmek, hücre hattındaki antijen ekspresyonunu doğrulamak, antikorun fiksasyon ve permeabilizasyon koşullarıyla uyumluluğunu doğrulamak, birincil ve ikincil antikorların lotunu, saklama koşullarını ve son kullanma tarihini kontrol etmek, mikroskobun florofor için uygun eksitasyon ve emisyon filtrelerine sahip olduğunu doğrulamak ve sorun devam ederse alternatif bir klonu test etmek faydalıdır. Çalışma çözeltileri hazırlanırken, gerekli kokteyl hacmi, kuyu sayısı ile 150 µL'nin çarpımı artı pipetleme kaybını telafi etmek için yaklaşık %10 fazlalıktır; her bir antikorun stok hacmi, bu toplamın dilüsyon faktörüne bölünmesine eşittir (örneğin, 1:200 dilüsyonu için 825 µL ÷ 200 = 4,13 µL) ve geri kalan kısım %1 TBST–BSA ile tamamlanır. Aynı hesaplama, ilgili dilüsyon faktörü ikame edilerek ikincil kokteyl için de uygulanır.

Çoklu boyama (multiplexing) performansı nihayetinde florofor panel tasarımına bağlıdır. Birincil hedeflere, nükleer karşıt boyaya vele hücre iskeleti belirtecine atanan floroforlar, spektral çakışmayı veya sinyal tekrarlanmasını önlemek için koordine edilmeli ve görüntüleme sistemi, seçilen her bir floroforun eksitasyonunu ve deteksiyonunu desteklemelidir^9,10; her bir filtre küpü için eksitasyon ve emisyon aralıkları, panel genelindeki spektral uyumluluğun doğrudan karşılaştırılmasına olanak sağlayacak şekilde Ek Tablo 1'de verilmiştir. Bu paneli diğer floroforlara uyarlayan kullanıcıların, mümkün olduğunca komşu kanal çakışması minimum olan kombinasyonları seçmeleri ve burada yapıldığı gibi, hedefler birleştirilmeden önce tekli boyama kontrollerinde çapraz etkileşim (crosstalk) olmadığını doğrulamaları önerilir. Çoklu boyama panelinde elde edilen tüm kanallarda, birlikte bulunan floroforlara bağlı kalıntı sinyal gözlemlenmiş (Ek Şekil 1), ancak karşılık gelen tekli boyama ve yalnızca sekonder kontrolerinde bu sinyal görülmemiştir (Ek Şekil 2); bu durum, geniş alan (widefield) görüntülemede kullanılan geniş bantlı filtre setlerinden kaynaklanan spektral çapraz etkileşime işaret etmektedir (bu durum potansiyel olarak konfokal, lazer tabanlı eksitasyon ile azaltılabilir). p14ARF'nin nükleol lokalizasyonu ile aktin ve IFN-β'nın filamentöz/sitoplazmik dağılımı arasındaki mekansal ayrım göz önüne alındığında, bu çapraz etkileşim, çoklu boyama panelindeki p14ARF lokalizasyonunun yorumlanmasını bozmamaktadır. Bu iş akışı, eş zamanlı olarak çözümlenebilen hedef sayısının mevcut antikor konakçı türleri ve spektral olarak farklı floroforlar tarafından kısıtlandığı geleneksel florofor tabanlı çoklu boyamaya dayanmaktadır. Daha yüksek dereceli çoklu boyama, sırasıyla iteratif boyama/beyazlatma veya çakışan floroforların lineer ayrıştırmasına (unmixing) izin veren döngüsel immünofloresan veya spektral görüntüleme yoluyla gerçekleştirilebilir, ancak bunlar burada ele alınmayan özel ekipman ve yazılımlar gerektirir^19,20.

Kapatma medyumu hem görüntü kalitesini hem de sinyal kalıcılığını etkiler. Ticari bir kendi kendine kürlenen antifade medyumu veya ev yapımı bir alternatif olarak PBS içinde %80 gliserol (antifade içermez, kendi kendine kürlenmez) kullanılabilir; ev yapımı gliserol bazlı kapatmalar, kurumayı ve lamelleme hareketini önlemek için şeffaf oje ile mühürlenir ve çekirdek karşı boyaması yapıldıktan sonra çekirdek boyası içermeyen medyumlara karar verilir. Görüntüler, kürlenmeden hemen sonra alınırsa en iyi sonuçlar elde edilir. Anında görüntüleme mümkün olmadığında, kürlenmiş lamlar karanlık bir kutuda 4 °C'de 2–4 hafta veya −20 °C'de 6 aya kadar saklanabilir; ancak yüksek derecede fotolabil floroforların (örneğin, yeşil ışık yayan floroforlar) optimal saklama koşulları altında bile zamanla sinyal kaybına uğradığı unutulmamalıdır. Ticari antifade medyumlari, ev yapımı gliserol bazlı medyumlara kıyasla florofor stabilitesini önemli ölçüde artırır; ev yapımı medyumlarda görüntülemenin 24–48 saat içinde yapılması şiddetle önerilir. Şeffaf oje, çoğu florofor ile uyumludur ve saklamadan önce en az 30 dakikalık karanlıkta kürlenmeye izin verildiği sürece sinyal korunmasını belirgin bir şekilde etkilemez.

Fiksasyon aşamasından itibaren steril tekniğe artık gerek yoktur ve boyama işlemi tezgah üzerinde gerçekleştirilebilir; sertifikalı bir kimyasal çeker ocak ise üzerinde CAUTION etiketi bulunan herhangi bir reaktif için ayrılmalıdır. D17 ve diğer tümör türevli hücre hatları, duruma göre risk grubu 1 veya 2 materyaller için geçerli olan kurumsal biyogüvenlik kılavuzlarına uygun olarak yönetilir. Kültürlenmiş hücrelerle, lamellerle, uçlarla, besiyeriyle temas eden tüm materyaller ve sıvı atıklar imhadan önce dekontamine edilir: sıvı atıklar %10'luk nihai konsantrasyonla çamaşır suyu kullanılarak en az 30 dk boyunca inaktive edilir ve katı atıklar uygun biyolojik atık konteynerlerine atılır. PFA, metanol veya oktilfenol etoksilat noniyonik deterjan içeren kimyasal atıklar ayrıştırılır ve kurumsal kimyasal güvenlik düzenlemelerine uygun olarak imha edilir.

Geniş kapsamlı kullanım için tasarlanmış olsa da, bu iş akışı katı ve evrensel bir prosedürden ziyade hedefe bağlı adaptasyona uygun bir yöntem olarak değerlendirilmelidir; başarılı uygulama, araştırmacının her bir antijenin lokalizasyonu, çözünürlüğü, epitop erişilebilirliği ile fiksasyona ve permeabilizasyona karşı duyarlılığı konusundaki bilgisine bağlıdır. İki kısıtlamanın altı çizilmelidir. Birincisi, buradaki boyama değerlendirmesi, formal bir sinyal-arka plan kantifikasyonundan ziyade, negatif kontrollerle ve beklenen subcellular lokalizasyonla yapılan karşılaştırmaya dayalı olarak kalitatif düzeydedir; buna bağlı olarak, burada rapor edilen tutarlılık, kantitatif olarak doğrulanmış bir performansı değil, tekrarlanan lamlar ve kontrol koşulları genelinde tekrarlanabilir kalitatif boyamayı yansıtmaktadır. Yaygın sorunları, olası nedenleri ve düzeltici önlemleri özetleyen konsolide bir sorun giderme kılavuzu Supplementary Table 2'de sunulmuştur. Kantitatif okumalar gerektiren laboratuvarlar; ortalama yoğunluk ölçümü, arka plan çıkarma, İlgi Alanı (ROI) tabanlı kantifikasyon ve yoğunluk profilleme için açık kaynaklı görüntü analiz yazılımları kullanabilirler²¹. İkincisi, temsilci veriler tek bir adherent köpek tümör hattından (D17) elde edilmiştir, bu nedenle diğer hücre tiplerine, türlere veya antijen kombinasyonlarına genişletme; fiksasyon, permeabilizasyon ve antikor koşullarının hedefe özel olarak yeniden optimizasyonunu gerektirecektir.

Özetle bu protokol, standart laboratuvar ekipmanları kullanılarak düşük reaktif tüketimi ile tutarlı boyama performansını birleştiren ve hedefe bağlı bilinçli adaptasyonlara olanak tanıyan, adherent 2D kültürlerde mono- ve multipleks immünofloresan için esnek ve maliyet etkin bir iş akışı sunmaktadır.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
24 kuyucuklu doku kültürü plakaları	Corning	3524	Lamel ekimi ve boyama
Antibiyotik-Antimikotik	Gibco	15240062	Hücre kültüründe bakteriyel ve fungal kontaminasyonu önlemek için kullanılır.
Antikor seyreltme çözeltisi (TBST-BSA %1)	Kurum içi hazırlanmış	—	10 mL için: 2 mL %5'lik BSA bloklama çözeltisi + 5 µL Tween-20 + 7,995 mL 1x TBS (çalışma çözeltisi) ile toplam 10 mL hacme tamamlayın (son konsantrasyon: TBS içinde %1 BSA, %0,05 Tween-20; pH 7,6). Taze olarak hazırlayın; saklanacaksa şu sıcaklıkta tutun: 4 °C kontaminasyondan korunmalı ve 1 hafta içinde kullanılmalıdır.
Bloke etme çözeltisi	Kurum içinde hazırlanmıştır	—	10 mL için: 10 mL 1x TBS'de (1 mL 10x TBS stok + 9 mL distile su) çözünmüş 0,5 g BSA; pH 7,6. 30 dk inkübasyon süresi 25 °C; taze hazırlayın.
(TBS içinde %5 BSA)
Brefeldin A	Sigma-Aldrich	B7651	5 µg/mLsitokin tespiti öncesinde protein salınımını bloke etmek için 4 saatlik ön işlem.
BSA (sığır serum albümini)	Sigma-Aldrich	A7906	Bloklama için TBS içerisinde %5; antikor seyreltici için TBS + %0,05 Tween-20 içerisinde %1.
Kolajen bazlı reaktif (lamel kaplama, isteğe bağlı)	Corning	354231	Sığır dermisinden türetilmiş tip I kolajen; şu konsantrasyona seyreltilmiş: 50 µg/mL 0,01 N HCl içinde; 5'te uygulanan–10 µg/cm² (≈100 µL/well); oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin (≈25°C); hücre ekimi öncesinde aspire edin ve PBS ile durulayın.
Lameller, cam, 12 mm yuvarlak	Knittel Camı	100013	Adheran hücre kültürü ve boyama için substrat.
D17 köpek osteosarkom hücre hattı	Banco de céRio de Janeiro mürekkep balıkları	276	Temsili hücre modeli; %10 FBS ve antibiyotik-antimikotik eklenmiş DMEM içerisinde tutulmuştur; şunlarda muhafaza edin: 37 °C%5 CO2.
(BCRJ)
Deiyonize/distile su	Kurum bünyesinde hazırlanmış	—	Tampon hazırlama.
DMEM (Dulbecco Modifiyeli Eagle Besiyeri)	Gibco	12100-046	Hücre kültürü için tam besi ortamı.
Etanol	Supelco	1.00983	Lamella/pens dekontaminasyonu.
Fetal Bovine Serum	Sigma-Aldrich	F7524	Hücre kültürü besiyerine ekleme.
(FBS)
Fibronectin	Gibco	33016015	Hücre dışı matris glikoproteini; hücre kültür ortamında 0,0125 mg/mL'ye seyreltilmiştir; şu konsantrasyonda uygulanmıştır: 100 µL/well ve oda sıcaklığında 1 saat boyunca inkübe edildi (≈25°C) hücre ekimi öncesinde.
İnce uçlu metal pens	Çeşitli	—	Lamelle kullanımı.
Floresan mikroskobu	Leica Microsystems	DMi8	DMi8 geniş alan floresan mikroskobu (Leica Microsystems), HC PL FLUOTAR 40×/0,80 DRY objektifi; paneldeki floroforlarla (AF488, AF555, AF647, Hoechst) uyumludur.
Cam mikroskop lamları	Biyoslayt	—	Görüntüleme için boyanmış lamellerin kapatılması.
Cam Petri kabı veya lamel tutucu	Çeşitli	—	Lamel otoklavlama/saklama.
Glisin	Sigma-Aldrich	8,16E+09	10 mL 50 mM çözelti için: 37,5 mg glisin, 10 mL 1x TBS içerisinde çözülür; pH 7,6. 5 dakika boyunca 25 °C; fiksasyon sonrası, permeabilizasyon öncesi isteğe bağlı aldehit söndürme adımı; taze hazırlayın.
Hoechst 33342	Invitrogen	H3570	10 mL çalışma çözeltisi için: stok çözeltiyi TBS içinde 1:5000 oranında seyreltin. Nükleer karşıt boyama; ışıktan korunarak inkübe edin; taze hazırlayın.
Nemlendirilmiş hazne	Çeşitli/Kendi bünyesinde hazırlanmış	—	Antikor inkübasyonu için; alternatif olarak, nemlendirilmiş emici kağıt içeren kapalı plastik bir kutu ile düzenlenmiş.
ImageJ	Açık kaynak (NIH)	—	Görüntü elde edildikten sonra yapılacak analizler için kullanılır.
Görüntü elde etme yazılımı	Leica Microsystems	LAS X 3.7.3	Leica DMi8 üzerinde görüntüleme için kullanılmıştır.
Metanol	Merck	1.06009	Alternatif fiksasyon (nükleer antijenler/fosfo-epitoplar); önceden soğutulmuş −20 °C, 5 dk inkübasyon; falloidin/F-aktin boyamasını bozabilir.
Kapatma medyumu	Sigma-Aldrich	G2289	10 mL için: 8 mL gliserol + 2 mL PBS, pH 7,6, iyice karıştırın. Antifade (solma önleyici) özellikleri yoktur ve kendi kendine kürlenmez. Kurumayı/kaymayı önlemek için lamel kenarlarını oje ile mühürleyin, lamları şurada saklayın: 4 °C ışıktan koruyun ve fotobeyazlamayı en aza indirmek için görüntülemeyi gecikmeden gerçekleştirin.
(Gliserol tabanlı)
Kapatma medyumu (ProLongTM Cam)	Invitrogen	P36984	Antisolma reaktifleri içerir ve oda sıcaklığında, ışıktan korunmuş şekilde yaklaşık 24 saat içinde kendi kendine kürlenir (sertleşir), böylece kalıcı bir montaj oluşturur (oje ile mühürleme gerektirmez). Lamları 2°C'de saklayın.–8 °Cgörüntüleme yapılana kadar ışıktan korunacak şekilde,
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888	TBS tamponunun iyonik bileşeni; yıkama ve antikor inkübasyon basamakları sırasında hücre ve doku morfolojisini korumak için fizyolojik osmolalitenin sürdürülmesini sağlar.
İğne (ince ayar, örn. 25–27G)	Çeşitli	—	Hücre tek tabakasına zarar vermeden, lamelliği kuyucuk tabanından nazikçe kaldırmak/ayırmak için bir kaldıraç olarak kullanılır.
Paraformaldehit (PFA)	Sigma-Aldrich	158127	10 mL için: 8 mL PBS içinde çözülmüş 0,4 g paraformaldehit tozu, 60°C'ye ısıtılır–65 °C berraklaşana kadar birkaç damla 1N NaOH ile, soğutulmuş, pH'ı 7,4'e ayarlanmış ve PBS ile 10 mL'ye tamamlanmış; bir ... üzerinden süzün 0.2 µm kullanmadan önce filtreleyin. Taze hazırlayın veya alikotlayarak şurada saklayın −20 °Ctekrarlanan dondurma-çözme döngülerinden kaçınarak.
Florofor konjuge phalloidin.	Invitrogen	Seçilen floresansa bağlı olarak.	10 mL çalışma çözeltisi için: üreticinin belirttiği şekilde, stok çözeltiyi TBS, pH 7,6 içinde 1:400 oranında seyrelttirin. Alternatif hücre iskeleti/F-aktin etiketi; taze hazırlayın, ışıktan koruyun.
Fosfat tamponlu salin	Sigma-Aldrich	P4474-1L	İzotonik fosfat tamponu (pH 7.4); fiksasyon ve yıkama basamakları sırasında hücresel morfolojiyi korumak için fizyolojik osmolariteyi sağlar.
(PBS)
Poli-L-lizin (lamel kaplama, isteğe bağlı)	Sigma-Aldrich	P8920	Elektrostatik hücre yapışmasını artıran sentetik polikatyonik kaplama reaktifi; distile su içinde 0,1 mg/mL konsantrasyonda kullanılır; lamel yüzeyini kaplamaya yetecek hacimde; 30 dk boyunca inkübe edin 25 °C hücre ekimi öncesinde.
Birincil antikor, anti-aktin (keçi konakçı)	Santa Cruz Biotechnology	SC-1615	Anti-aktin antikoru; poliklonal, konjuge edilmemiş, anti-keçi sekonder antikor ile tespit edildi. 1:200 çalışma dilüsyonunda kullanıldı.
Primer antikor, anti-IFN-β (fare konakçı)	Aviva Systems Biology	OAPB00536	Anti-IFN-β antikor; poliklonal, konjuge edilmemiş, anti-fare sekonder antikor ile tespit edildi. 1:200 çalışma dilüsyonunda kullanıldı.
Primer antikor, anti-p14ARF (tavşan konakçı)	Calbiochem	PC409	Anti-p14ARF antikoru; poliklonal, konjuge edilmemiş, anti-tavşan sekonder antikor ile tespit edildi. Bu ürünün üretimi durdurulmuştur, bu hedef üzerinde çalışma planlanıyorsa yeni bir antikorun valide edilmesi gerekecektir. 1:200 çalışma dilüsyonunda kullanılmıştır.
Sekonder antikor, anti-tavşan, Alexa Fluor 488-konjuge	Thermo Fischer Scientific	A32731TR	Tavşan karşıtı AF488-konjuge antikor. 1:500 çalışma dilüsyonunda kullanılmıştır.
Sekonder antikor, anti-keçi, Alexa Fluor 555 konjuge	Thermo Fisher Scientific	A-21432	AF555 konjuge anti-keçi antikoru. 1:500 çalışma dilüsyonunda kullanılmıştır.
Sekonder antikor, anti-fare, Alexa Fluor 647 konjuge	Thermo Fisher Scientific	A-21235	Anti-mouse AF647-konjuge antikor. 1:500 çalışma dilüsyonunda kullanılmıştır.
Tris-tamponlu salin (TBS), 10x stok	Kurum içi hazırlanmış	—	100 mL için: 6,06 g Tris baz ve 8,77 g NaCl'yi 80 mL distile suda çözün; pH'ı konsantre HCl ile 7,6'ya ayarlayın; son hacmi 100 mL'ye tamamlayın; otoklavlayın. Çalışma solüsyonu (1x TBS) (final: 50 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7,6) için distile su ile 1:10 oranında seyreltin; oda sıcaklığında veya 4 °C 3 aya kadar.
TBST (TBS + %0,05 Tween-20)	Kurum içinde hazırlanmıştır	—	10 mL için: 1 mL TBS 10x stok + 8,995 mL distile su + 5 µL Tween-20 (%0,05 v/v); pH 7,6. Boyama basamakları arası yıkama tamponu; taze hazırlayın, ~1 hafta boyunca şu sıcaklıkta saklayın 4 °C.
Tris Bazı	Sigma-Aldrich	252859	TBS stok çözeltisinin hazırlanmasında kullanılan tamponlayıcı ajan; immünofloresan yıkama ve dilüsyon tamponları için fizyolojik aralıkta (pH 7,6) pH stabilitesini sağlar.
Triton X-100 (oktilfenol etoksilat noniyonik deterjan)	Sigma-Aldrich	X100	10 mL için: 10 µL TX100 %0,1 için 9,99 mL 1x TBS içinde Triton X-100; 30 µL %0,3 TX100 içeren 9,97 mL 1x TBS içerisinde (hedefe bağlı olarak; nükleer hedefler daha yüksek konsantrasyonlar gerektirir).
Tripsin-EDTA	Gibco	25200056	Hücrelerin ayrılması için kullanılır.
Tween-20	Sigma-Aldrich	P9416	Yıkama tamponu (TBST) ve antikor seyreltici (TBST-BSA %1) için TBS içerisinde kullanılır.