Yöntem makalesi

Metastatik Yumurtalık Kanseri ve Fare Terapötik Yanıtını İncelemek İçin Klinik Olarak İlgili Nakil Tümör Modelleri

DOI:

10.3791/71138

⸱

19 Mayıs 2026

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, University of Maryland Baltimore County, 2University of Maryland Greenebaum Comprehensive Cancer Center

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, intraperitoneal ve intrabursal tümör modellerini oluşturmak için adım adım bir protokol sunuyoruz; bu protokol yumurtalık kanseri kanserinin ilerlemesi, metasatsi ve terapötik yanıt incelenmesidir. Ayrıca, bu modellerde tümör ilerlemesini izlemek için lusiferaz bazlı, invaziv olmayan in vivo görüntülemenin nasıl kullanılacağını açıklıyoruz.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metastatik yumurtalık kanseri, etkili tedavi seçenekleri olmayan son derece ölümcül bir jinekolojik kanserdir. Yumurtalık kanseri hastaları için klinik olarak çevrilebilir terapötik yaklaşımların geliştirilmesi, yumurtalık kanseri metastazını tetikleyen faktörlerin anlaşılmasına bağlıdır. Çoğu katı tümör hematojen metastaz gösterirken, yumurtalık kanseri hücreleri öncelikle intraperitoneal yol yoluyla yayılır. Bu süreç, kanser hücrelerinin birincil tümörden peritoneal boşluğa ayrılmasını ve dökülmesini içerir; bu hücreler anoiklere karşı direnç gösterip çok hücreli agregalar oluşturmasını sağlayan özellikler kazanır. Bu hücre agregaları daha sonra peritoneumun mezotelyal tabakasına bağlanır ve onu işgal eder ve metastatik lezyonlar oluşturur. Klinik açıdan önemli in vivo modeller, hücresel faktörlerin ve tümör mikroçevresinin metastatik sürecin farklı adımlarını nasıl etkilediğini anlamak ve yeni terapötik stratejileri test etmek için gereklidir. Yumurtalık kanseri metastazını ve terapötik yanıtı incelemek için yaygın olarak kullanılan iki nakledilebilir fare tümörü modeli intraperitoneal ve intrabursal modellerdir. Bu raporda, bu modellerin kurulması için adım adım metodolojiyi açıklıyor ve avantajlarını ve sınırlamalarını vurguluyoruz. Ayrıca, bu modeller kullanılarak tümör ilerlemesini invaziv olmayan şekilde izlemek için biyolüminesans görüntülemenin nasıl kullanılacağını açıklıyoruz.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yumurtalık kanseri ilerlemesini tetikleyen faktörlere dair önemli gelişmelere rağmen, yumurtalık kanseri Amerika Birleşik Devletleri'nde ikinci en ölümcül jinekolojik maligniteolmaya devam etmektedir 1. Belirgin semptomların eksikliği ve güvenilir erken tanı belirteçlerinin eksikliği nedeniyle, yumurtalık kanseri hastalarının %70'inden fazlası 2,3 tanısı sırasında ileri metastatik hastalığa sahiptir. Mevcut tedaviler metastatik yumurtalık kanserinin tedavisinde etkili değildir ve bu nedenle, ileri evre hastalığı olan hastalar için 5 yıllık sağlık oranları %30'un altındakalır. Terapötik başarının eksikliğinin başlıca nedeni, kemodirenç5'in ortaya çıkmasıdır. Bu nedenle, yumurtalık kanseri metastazını ve kemodirenç yaratan faktörlerin belirlenmesi acil bir ihtiyaç vardır. Bu bilgi açığını gidermek, bu hastalığı hedeflemek için daha etkili terapötik stratejiler geliştirmek için kritik olacaktır. Bu hedeflere ulaşmak için, yumurtalık kanseri ilerlemesinin temel adımlarını doğru şekilde taklit eden in vivo modellere ihtiyacımız var.

Yumurtalık kanseri hücre hatları ve üç boyutlu in vitro modeller, metastaz ve terapötik yanıtı etkileyen faktörleri anlamamıza büyük katkı sağlamış olsa da, bu modellerin birkaç sınırlaması vardır 6,7,8. Örneğin, bu modeller tümör mikroçevresinin bir parçası olan farklı kanser olmayan hücreleri hesaba katmaz ve tümör mikroçevresinde gerçekleşen karmaşık etkileşimleri yakalamaz 6,7,8. Ayrıca, sistemik faktörleri ve bunların tümör ilerlemesi ile ilaç yanıtı üzerindeki etkilerini in vitro modeller 6,7,8 kullanarak incelemek son derece zordur. In vitro modellerin bu sınırlamaları, yumurtalık kanseri metastazının çeşitli adımlarını doğru şekilde taklit eden in vivo modellere olan ihtiyacı ortaya koymaktadır; bunlar arasında mikro ortamdaki diğer hücre tipleri ve faktörlerle karmaşık etkileşimler de dahildir.

Genetik olarak tasarlanmış fare modelleri (GEM'ler), tümörlerin doğal bir mikro ortamda, sağlam bir bağışıklık sistemiyle kendiliğinden ortaya çıktığı in vivo bir platformsunar 9. Ancak,10 tane üretip bakımı zaman alıcı, zorlayıcı ve maliyetlidir. Yumurtalık kanseri GEMM'lerinin çoğu tümör gelişimi için uzun gecikme süresine sahiptir, bu da tümör oluşumu zamanı zaman alıcı ve maliyetli hale getirir. Ksenograft ve allograft modelleri gibi nakil edilebilir modeller, biyolojik önem ile deneysel kolaylık arasında iyi bir denge sunar ve genellikle GEM11'e göre üretimi çok daha ucuzdur. GEMM'lere göre daha düşük gecikmeye sahip olmanın yanı sıra, tümör hücrelerinin in vitro genetik olarak değiştirilebilme kolaylığı, bu modelleri farklı genetik faktörlerin tümör ilerlemesini nasıl etkilediğini incelemek için pratik ve uygunkılar. Bu faydalar nedeniyle, nakil edilebilir tümör modelleri yumurtalık kanserinde hem temel hem de translasyonel araştırmalar için değerli araçlar olarak ortaya çıkmıştır.

Bu raporda, metastatik yumurtalık kanserini incelemek için yaygın olarak kullanılan iki farklı nakil fare tümörü modelinin oluşturulması protokolünü açıklıyoruz: (1) intraperitoneal model ve (2) ortotopik veya intrabursal model. Her iki model de ksenograft veya allogreft modelleri olarak belirlenebilir. İntraperitoneal modelde, kanser hücreleri farelerin periton boşluğuna enjekte edilir. Yumurtalık kanser hücrelerinin intraperitoneal boşluğa getirilmesi, metastatik yumurtalık kanseri hücrelerinin birincil tümörden peritoneal boşluğa döküldüğü yumurtalık kanseri metastazının evresini yansıtır. İnsanlardaki metastatik süreçte benzer şekilde, nakil edilen bu yumurtalık kanser hücreleri, düşmanca peritoneal mikro ortama uyum sağlamak, periton boşluğunu kaplayan mezotelyal tabakaya bağlanmak ve istila etmek ve omentum, mezenteri, karaciğer ve diyafram gibi intraperitoneal organlar ve dokularda metastatik lezyonlar oluşturması gerekecektir. İntraperitoneal modeli oluşturmak için kullanılan kanser hücre hattına bağlı olarak, metastatik tümörler insanlarda geç evre hastalıkta gözlemlendiği gibi asitlerle birlikte olabilir. Bu nedenle, intraperitoneal model, yumurtalık kanseri metastazını ve bunların geç evre hastalığına ilerlemesini sağlayan faktörleri anlamak için yaygın olarakkullanılmıştır 12. Bu modeller ayrıca metastatik yumurtalık kanseri için yeni terapötik stratejilerin etkinliğini belirlemedede faydalıdır 12. İntrabursal veya ortotopik modelde, kanser hücreleri fare yumurtalığını çevreleyen membranöz bir yapı olan bursaya yerleştirilir. Bu model, yumurtalık tümörjenezisi ve metastazın erken evrelerini taklit eder. Bu aşamada kanser hücreleri hâlâ fallop tüpü ve yumurtalıkta sınırlıdır. Kanser hücreleri bu bölgelerden periton boşluğuna dökülür ve nihayetinde diğer organlara metastaz yapar. Bu nedenle, intrabursal model, hem yumurtalık tümörgenezinin erken evrelerini hem de peritonboşluğu 12 üzerinden transkoelomik metastazlarına yol açan olayları incelemede faydalıdır.

Bu nedenle, hem intraperitoneal hem de intrabursal modeller, yumurtalık kanseri metastazını ve terapötik yanıtı incelemek için mükemmel araçlar olsa da, taklit ettikleri metastaz sürecinin belirli aşamasında farklılık gösterirler. Intrabursal modeller, yumurtalık kanserinin metastaz sürecinin erken evrelerinden ilerleyen aşamalarına doğru ilerlemesini taklit edebilse de, bu süreçle ilişkili gecikme nedeniyle genellikle yumurtalık kanseri metastazı dönemindeki erken olayları incelemek için kullanılırlar. Yumurtalık kanseri metastazının sonraki evrelerine odaklanan çalışmalar için intraperitoneal model daha uygundur. Ayrıca, intrabursal model, intraperitonealmodel 12'ye kıyasla teknik olarak daha zordur. İntrabursal modelin kurulması, yumurtalık bursasına kanser hücrelerinin hassas enjekte edilmesini sağlayacak mikrocerrahi ekipmanlarla donatılmış cerrahi bir siye erişim gerektirir. Kanser hücrelerinin tümör oluşturma yeteneği ("alım hızı" veya "naklet oranı") da intrabursal modellerde intraperitoneal modellere kıyasla genellikle daha düşüktür. Ayrıca, tümörler ortotopik veya intraperitoneal enjeksiyonlardan sonra kolayca gözlemlenemediğinden, tümör ilerlemesini izlemek için genellikle invaziv olmayan biyolüminesans görüntüleme tekniği kullanılır. Bu nedenle, hem intraperitoneal hem de intrabursal modeller, tümörlerin invaziv olmayan görüntülemesine olanak tanıyacak ek ekipmangerektirir 12. Sonuç olarak, deneysel hedefler, kaynakların erişilebilirliği ve teknik beceri seti, her çalışma için model seçimini belirleyecektir.

Bu rapor, insan yumurtalık kanseri hücre hatları kullanılarak intraperitoneal ve intrabursal fare ksenograft modellerinin adım adım oluşturulmasını açıklar. Bu modeller, hücrelerin NSG (NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ) veya Foxn1 nude (B6. Cg-Foxn1 nu/J). Aynı yöntem allograft (senjenik) modeller oluşturmak için de uyarlanabilir. Allograft modelleri oluşturulurken, fare yumurtalık kanseri hücreleri aynı genetik arka plana sahip immünokompetent farelere yerleştirilir. Allograft modelleri immünokompetetent fareler kullanılarak geliştirildiğinden, farklı faktörlerin yumurtalık tümörü mikroçevresini nasıl düzenlediğini, bağışıklık sisteminin yumurtalık kanseri ilerlemesinde rolünü ve immünoterapinin etkinliğini incelemek için faydalıdır. İntraperitoneal ve intrabursal xenograft fare modellerinin kurulmasının yanı sıra, bu rapor aynı zamanda bu modellerde tümör ilerlemesini invaziv olmayan şekilde izlemek için biyolüminesans görüntülemenin nasıl kullanılacağını da açıklamaktadır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokolde tanımlanan tüm hayvan prosedürleri, Maryland Üniversitesi, Baltimore County Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır (Baş Araştırmacı - Achuth Padmanabhan; Protokol numarası - 1947).  Bu protokolte kullanılan malzeme ve ekipmanların tam listesi ile katalog numaraları Materyaller Tablosu'nda sunulmaktadır.

1. Farede nakil için yumurtalık kanseri hücre hatlarının hazırlanması

Not: Bu protokolde tanımlanan tüm in vivo modeller için, yumurtalık kanseri hücreleri fareye nakil için hazırlanmalıdır. Yumurtalık kanseri hücreleri, aşağıda tarif edildiği gibi oda sıcaklığında laminar akış dokusu kültür kapüşonunda hazırlanmalıdır, belirtilmedikçe:

  1. Literatürde önerilen standart ortam kullanılarak %5CO2 oranında tutulan su örtülü birCO2 kuluçka makinesinde 37 oC'de yumurtalık kanseri hücreleri yetiştirmek. Tümörün invaziv olmayan in vivo görüntülemesi isteniyorsa, yumurtalık kanseri hücreleri nakil öncesinde lusiferazı istikrarlı şekilde ifade edecek şekilde tasarlanmalıdır.
  2. Hücreler yaklaşık %80–%85 birleşimine ulaştığında, aşağıda açıklandığı gibi steril koşullarda hasat edilir:
    1. Doku kültür plakasından aspirasyon ortamı kullanın.
    2. Yapışkan hücreleri kalsiyum ve magnezyum içermeyen steril 1X Fosfat-Tamponlu Salin (PBS) ile iki kez yıkayın. PBS'de Kalsiyum ve Magnezyum varlığı tripsin aktivitesini etkileyebilir ve hücre yapışmasını teşvik eder. PBS'yi doku kültür plakasından aspire edin.
    3. Doku kültür plakasına %0,05 Tripsin-EDTA ekleyin. Kullanılacak tripsin miktarı, doku kültür plakasının boyutuna ve üzerinde çalışılan hücre hattı ile bağlıdır. 100 mm bir plaka üzerinde büyüyen çoğu hücre hattı için %0,05 Tripsin-EDTA 1 mL kullanın. OVCA420 gibi güçlü yapışkan yumurtalık kanseri hücre hatları için, %0,25 Tripsin-EDTA içeren 1 mL önerilmektedir.
    4. Hücrelerle birlikte plakayı, doku kültürü için kullanılan 37 oC su kaplamalıCO2 kuluçka makinesine geri aktarın ve 1–5 dakika kuluçka yapın. Kesin kuluçka süresi hücre hattına bağlıdır. TYK-Nu ve HEYA8 gibi bazı hücre hatları çok hızlı ayrılır (1–2 dakika), diğerleri, örneğin OVCA420, daha uzun sürer (4–5 dakika).
    5. Hücreler ayrıldıktan sonra, tripsin etkisini durdurmak için FBS içeren ortam ekleyin. Her 1 mL tripsin başına 6 mL FBS içeren ortam ekleyin. Hücreleri doku kültür plakasından uzaklaştırmak ve onları tek hücreli süspansiyona ayırmak için nazikçe yukarı ve aşağı pipetleyin.
      Not: Parlak alanlı ters mikroskop altında incelendiğinde, ayrılmış hücreler yuvarlak (düz/uzun değil) görünür ve plakanın altına yapışmak yerine serbestçe yüzür.
    6. Hücreleri konik bir tüpte toplayıp 400 x g sıcaklıkta, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca santrifüj yapın.
    7. Tripsin içeren süpernatantı çıkarın ve hücre pelletini taze FBS içeren hücre kültür ortamında yeniden süspansiyona alın.
  3. Hücreleri, trypan blue gibi hücre canlılık boyası ve hemositometre kullanarak sayın. Alternatif olarak, otomatik hücre sayacı hücreleri saymak için kullanılabilir.
  4. Hücreler, istenen hücre konsantrasyonu elde edilecek şekilde steril 1X PBS (pH 7.4) hacminde tanımlanmış bir hacimde yeniden oluşturulur. Yaygın kullanılan insan yumurtalık kanseri hücre hatları için enjekte edilmesi önerilen hücre sayısı Tablo 113'te gösterilmiştir.
    Not: Farelere güvenli bir şekilde enjekte edilebilecek maksimum hacim modele bağlıdır. İntraperitoneal model için önerilen maksimum hacim 500 μL'dir (bkz. bölüm 2.1). Bursal içi model için önerilen maksimum hacim 5 μL'dir (bkz. bölüm 2.2).
  5. Hücre süspansiyonunu farelere enjekte edilene kadar buzda tutun. Hücreleri mümkün olan en kısa sürede, tercihen hücreler hazırlandıktan sonra 30–45 dakika içinde farelere enjekte edin.

2. Farelerde nakil edilebilir yumurtalık kanseri modelleri oluşturmak

  1. Yumurtalık kanserinin intraperitoneal modelinin oluşturulması
    Not: Bu süreçte, lusiferazı istikrarlı şekilde ifade eden yumurtalık kanseri hücreleri, yetişkin dişi farenin periton boşluğuna enjekte edilir. Lusiferazı stabil şekilde ifade eden hücrelerin kullanılması, In Vivo Görüntüleme Sistemi (IVIS) ile tümör ilerlemesinin uzunlamasına ve invaziv olmayan bir şekilde izlenmesini mümkün kılacaktır.
    1. Hücreleri bölüm 1'de tarif edildiği gibi hazırlayın. Hücreleri 1000 μL mikropipet kullanarak nazikçe yeniden süzülün ve hücrelerin ayrık kalmasını sağlasın.
      Not: Kümelerin yerinden çıkmaması iğnelerin tıkanmasına neden olur.
    2. 500 μL hücre süspansiyonunu 1 mL bir şırıngaya çekin ve 21G X 1 inç iğne takın. Şırıngada hava kabarcıkları olmadığından emin olun.
      Not: Yetişkin dişi fareye intraperitoneal enjekte edilebilecek maksimum hacim (25–30 g) 500 μL'dir. Bu nedenle, hücreleri gerekli hücre sayısının maksimum 500 μL hacmde tutulacağı bir hacimde yeniden askıya alın. Yaygın kullanılan insan yumurtalık kanseri hücre hatları için enjekte edilmesi önerilen hücre sayısı Tablo 113'te gösterilmiştir.
      Not: Fare 20–25 g arasında ise, daha küçük hacim (400 μL'den az) enjekte edilmesi önerilir.
    3. Hayvanı kafesten çıkarıp pürüzlü veya telli bir yüzeye koyarak onu tutun.
    4. Şekil 1A'da gösterildiği gibi, baskın olmayan elinizle boynun tabanındaki gevşek deriyi nazikçe kaşarak fareyi tutun.
    5. Fareyi nazikçe kaldırın ve ventral tarafı yukarıya bakacak şekilde çevirin. Hayvanın kuyruğunu parmaklarınızla sabitleyin, Şekil 1B'de gösterildiği gibi.
    6. Karın bölgesinin ortasına hayali bir çizgi çiz. Enjeksiyon yerini bulmak için, orta hat ile sağ alt kuyrektteki iki meme ucu arasında bir üçgen hayal edin. Enjeksiyon yerinin bu hayali üçgenin ortasında olduğundan emin olun. Şekil 1B'ye bakınız.
    7. Farenin başını hafifçe yere doğru eğin, arka ucundan daha aşağıya düşsün. Bu pozisyonda fareyi kısıtlamak, karın içeriğinin kafatası şeklinde hareket etmesine yardımcı olur. Bu, enjeksiyon sırasında iç organların delinme riskini azaltır.
    8. Enjeksiyon bölgesini temizlemek için steril alkol sürüntü kullanın.
    9. Baskın eli kullanarak iğneyi enjeksiyon yerine 45° veya daha düşük açı ile sokun. Sadece 0,5 inç ilerleyin ve iğnenin uzunluğunun yarısından fazla olmamalıdır. İğnenin stabil kaldığından emin olun, çünkü karın boşluğundaki hareket iç organlarda hasara yol açabilir.
    10. Hücreleri farenin karın boşluğuna yavaş ve düzenli bir şekilde dağıtın.
    11. İğneyi farenin içinden aynı yerleştirme açısıyla çekin. Sızıntıyı önlemek için enjeksiyon bölgesinin üzerine hemen sterilize edilmiş bir gösterge yerleştirin.
    12. İğneyi ve şırıngayı uygun keskin kaba atın.
    13. Faresi kafese koymadan önce, tercih edilen bir yöntemle kulak etiketi takın. Kulak etiketleme, enjekte edilen farenin daha sonra tanımlanmasını sağlar.
  2. Yumurtalık kanserinin intrabursal modelinin oluşturulması
    Not: Bursal içi modelde, lusiferazı stabil şekilde ifade eden yumurtalık kanser hücreleri doğrudan yetişkin dişi farenin yumurtalık bursasına enjekte edilir. Bursa, fare yumurtalıklarını çevreleyen membran şeklinde bir kesedir. Yumurtalık kanseri hücrelerinde stabil lusiferaz ekspresyonu, IVIS kullanılarak tümör ilerlemesinin invaziv olmayan uzunlamasına izlenmesini sağlar.
    1. 1. Gün – Bursal içi nakil ameliyatı için ekipman ve farenin hazırlanması
      1. Ameliyat için gereken aletleri otoklav edin. Enstrümanlar listesi (Şekil 2A) şöyledir:
        İnce uçlu makas, 5 inç kavisli ince uçlu forset, Mayo-Heger iğne tutucu, Diseksik mücevheri mikroforsetleri, ince uç, İnce uçlu pensleri diseksiyon aletleri
      2. Ameliyat öncesi karprofen (15 mg/kg) analjezisini her 24 saatte bir feye deri altı enjeksiyonla uygulanır.
        Not: Analjezik karprofeni ameliyattan 1 gün önce her 24 saatte bir deri altı olarak verin, ameliyattan sonra 3 gün devam eder.
    2. 2. Gün – Bir farede yumurtalık kanser hücrelerinin intrabursal nakli
      1. Bölüm I'de tarif edildiği gibi yumurtalık kanseri hücrelerini enjeksiyon için hazırlayın. Bir farede intrabursal olarak güvenli şekilde enjekte edilebilecek maksimum hacim 5 μL'dir. Bu nedenle, hücrelerin 104 hücre/μL konsantrasyonunda olması tercih edilir. Bu, 5 x 104 hücre nakliyle yapılmasına olanak tanır.
        Not: Yaygın kullanılan insan yumurtalık kanseri hücre hatları için enjekte edilmesi önerilen hücre sayısı Tablo 113'te gösterilmiştir.
      2. Hücreleri kullanana kadar buzda tutun. Hasat edildikten sonra, hücrelerin mümkün olan en kısa sürede, tercihen 30–45 dakika içinde enjekte edilmesi önerilir.
      3. Anestezi indük ederek fareyi %4 izofluran akış hızı ve 3,5 L/dakika oksijen akış hızına sahip bir izofluran odasına yerleştirin. Faresin anestezi altına alındığını immobilizasyon ve parmak sıkıştırma refleksinin yokluğunu kontrol ederek doğrulayın.
      4. Anestezi edilmiş fareyi, 37 °C sıcaklıkta tutulan bir kemirgen ısıtma pedinin üzerine yerleştirilen steril cerrahi bir perdeyin üzerine aktarın. Burun konisini hızlıca yerleştirin ve %1,5 izofluran ile %98,5 oksijen içeren anestezi sürdürün. Faresi anestezi altına alındığından emin olun ve parmak sıkıştırma refleksinin olmadığını doğrulayın.
      5. Fareşin işlem boyunca anestezi altında kaldığından emin olun ve her 15 dakikada bir parmak sıkıştırma refleksinin olmadığını doğrulayın. Anestezi sırasında farenin solunum hızını takip ederek yavaş ve düzgün olduğundan emin olun. Solunum hızı değişirse, izofluran dozunu ayarlayın. Fare zorlanan nefes alma veya nefes nefese zorlanıyorsa, dozu azaltın. Buna karşılık, farede solunum hızı artarsa, izofluran dozunu biraz artırın.
        Not: Faresi 40 dakikadan fazla anestezi altında tutmaktan kaçının. Bunu başarmak için, cerrahi işlem sırasında verimli ve hızlı olmak önemlidir.
      6. Fareyi, yumurtalık kanser hücrelerinin bursal olarak nakledileceği tarafı, Şekil 2B'de gösterildiği gibi yukarıya bakacak şekilde konumlandırın.
      7. Farenin her iki gözüne de kurumaktan (kornea kuruması) korumak için göz merhemi uygulayın.
      8. Farenin kürkü varsa, farenin alt yarısındaki tüyleri yukarı bakan tarafta tıraş edin. Tıraş edilen alanı düzgünce temizleyin ve fareyi yeni steril bir pedin üzerine yerleştirin. Foxn1 çıplak (B6. Cg-Foxn1 nu/J) fare suşu, bu adımı atlayın.
      9. Fareyi öyle bir şekilde kapatmak için steril cerrahi bir örtü kullanın ki sadece fare vücudunun alt kısmı ortaya çıksın.
      10. Ameliyat başlamadan önce ellerinizi sabunla düzgünce yıkayın ve yeni steril cerrahi eldiven takın. Cerrahi eldiven taktıktan sonra steril olmayan alanlara veya nesnelere dokunmaktan kaçının.
      11. Steril pamuk uçlu aplikatör kullanarak ameliyat alanına iç taraftan dışa saat yönünde dairesel hareketlerle betadin sıvısı uygulayın. Sonra, aynı alanı benzer şekilde temizlemek için steril bir alkol sürüntü kullanın. Bu işlemi iki kez daha tekrarlayın.
        Not: Cerrahi işlem sırasında steril olmayan eşyalara veya bölgelere dokunmayın. Steril olmayan bir yüzeyle temas olursa eldivenleri hemen değiştirin. İntrabursal enjeksiyon yaparken başka bir kişinin yardımcı olması şiddetle tavsiye edilir. Bu kişi, ameliyat sırasında steril olmayan ürünlerle ilgilenmeye yardımcı olabilir.
      12. Alkolün kurumasını 1 dakika bekleyin.
      13. Figür 2B'de gösterildiği gibi, farenin arka bacağından yaklaşık 1,5 cm yukarıda ve kaburga kafesinden 5 mm uzaklıkta olan yeri konumlandırın. Bu noktada deriyi kıvrımlı forsepsle kaldırın, ardından ince uçlu makasla 5 mm dikey bir kesi yapın.
        Not: Kesi yapmadan önce, farenin tamamen anestezi etkisi altında olduğundan emin olun ve parmak sıkıştırma refleksinin olmadığını doğrulayın.
      14. Deriyi ince uçlu mikroforseps ile bir taraftan tutun ve aynı bölgedeki deri altı dokuda bir kesi yapın.
      15. Bu noktada, deri altı dokusunun altındaki periton tabakası görünür hale gelir. Periton tabakasını tutmak için ince uçlu, kavisli, dişli bir forseps kullanın ve ince uçlu makasla yaklaşık 2,5 mm uzunluğunda bir kesi yapın.
      16. Periton kesi kapağının yanını dişli forsepsle tutun ve ince forsepsle yumurtalık yağ pedini konumlandırın. Yumurtalık, yağ yastığının altında yer alır.
      17. Yumurtalık yağ yastığını ve yumurtalığı kesiden nazikçe çekin.
      18. Diseksiye forsepsini kullanarak yağ pedini öyle tutun ki yumurtalık yukarı bakacak ve hareketsiz olsun.
        Not: Yumurtalığı pensasla tutmayın. Yağ pedini tutmak için her zaman dişli penseps kullanın çünkü doku kaygandır.
      19. Yardım eden kişiden hücre süspansiyonunu içeren şırıngayı hazır hale getirmesini iste. 0.3 mL insülin şırıngası kullanılması önerilir.
      20. İğneyi, fıstığı yukarıya bakacak şekilde yumru tüpü ve yumurtalığın birleşim noktasından yumurtalık bursasına nazikçe sokun. Pistona basmadan önce tüm eğimin bursa içine girdiğinden emin olun.
        Not: Yerleştirme yerinin karşı ucunda bursa delinmemeye dikkat edin.
      21. Pistonu nazikçe itin ve şırınganın içeriğini yumurtalık bursasına aktarın. İğneyi hızlıca çıkarın.
      22. Yumurtalığın çevresindeki bursa şişmesi, hücrelerin başarılı bir aşılandığını gösterir.
      23. 5 saniye bekleyin ve yumurtalığı nazikçe peritoneal boşluğa geri yerleştirin.
      24. Peritonu 6-0 emilebilir monofilament dikişi ile kapatın; bir veya iki basit kesintili cerrahi dikiş ile kullanın.
      25. Deri kesisini, 6-0 emilenebilir monofilament dikişi ile basit bir koşu cerrahi stichle kapatın. Kesi bölgesinden kanama olmadığından emin olun.
      26. Kesi bölgesini kapattıktan sonra üçlü antibiyotik merhem (Bacitracin, Neomisin ve Polimiksin B) uygulayın.
      27. Ağrı gidermek için fareye deri altı olarak 15 mg/kg Karprofen verin.
      28. Tercih edilen bir yöntemle fareyi kulak etiketi ile işaretleyin. Kulak etiketleme, enjekte edilen farenin daha sonra tanımlanmasını sağlar.
      29. Fareyi yeni bir kafese aktarın. Bu kafesi yarım ile birlikte en az 60 dakika boyunca bir ısı pedine koyun. Bu zamana kadar anestezi etkisinin tamamen geçtiğinden ve farenin uyanık ve aktif olduğundan emin olun.
        Not: Fareler anestezi altında hipotermiye yatkındır. Bu nedenle, vücut sıcaklığını düzenlemek için dış ısı sağlamak önemlidir.
      30. Ameliyattan 4-5 saat sonra fareleri, kesik bölgesinden kanama veya başka bir rahatsızlık belirtisi olup olmadığını kontrol edin.
      31. Farelere sonraki 3 gün boyunca her 24 saatte bir deri altı olarak 15 mg/kg karprofen verin.
      32. Aşılanan hücreler lusiferazı stabil şekilde ifade edecek şekilde genetik olarak mühendislik edilirse, tümör yükü enjeksiyon sonrası 1. günden itibaren IVIS ile ölçülebilir; bu da bölüm 3'te açıklandığı gibi.

3. In Vivo Görüntüleme Sistemi (IVIS) kullanılarak fare tümörünün invaziv olmayan görüntülemesi

Bu raporda tanımlanan nakil tümör modellerini kullanan birkaç çalışmada önemli bir hedef, tümör ilerlemesi hakkında uzunlamasına veriler elde etmektir. Subkutan tümörlerin hacmi vernier kaliper ile tahmin edilebilirken, intraperitoneal ve intrabursal modellerle oluşturulan tümörler için bu geçerli bir seçenek değildir. Bu zorluğun üstesinden gelmek ve intraperitoneal tümör yükünü belirlemek için çoğu laboratuvar luciferaz bazlı, invaziv olmayan biyolüminesans görüntüleme kullanır. Bunu mümkün kılmak için, nakil edilen kanser hücreleri, substrat D-luciferin uygulandığında biyolüminesans üreten lusiferazı istikrarlı şekilde ifade edecek şekilde tasarlanmıştır. Biyolüminesans, In Vivo Görüntüleme Sistemi (IVIS) kullanılarak invaziv olmayan şekilde tespit edilir. Bu sinyal daha sonra tümör yükünü takip etmek ve metastaz ile ilaç tedavisinin etkinliği hakkında bilgi ortaya koymak için nicelendirilir. Aşağıda, farelerde IVIS ile lusiferaz bazlı, invaziv olmayan biyolüminesans görüntüleme yoluyla tümör yükünü takip etme protokolünü açıklıyoruz.

  1. D-luciferin substratının hazırlanması
    1. 1X PBS (pH 7.4) içinde steril koşullarda 15 mg/mL D-lusiferin çözeltisi hazırlayın.
    2. Çözeltiyi 0.22 μm filtre ile filtre sterilize edin.
    3. Çözeltiyi alüminyum folyoya sarıp, ışığın ışığından korunmasını sağlar ve kullanıma kadar kullanın.
  2. Görüntü alımı için IVIS görüntüleyicinin başlatılması
    1. IVIS görüntüleyiciye bağlı bilgisayardaki "yaşayan görüntü" yazılımını açın ve giriş yapın.
    2. Görüntü alımı için görüntüleyicinin başlatılması gerekir. Bu şu şekilde yapılır:
      1. Giriş yapıldığında, IVIS kontrol panelinin bir penceresi Şekil 3A'da gösterildiği gibi açılacaktır.
      2. Pencerenin sağ alt tarafında bulunan "başlat" düğmesine tıklayın (Şekil 3A). Sistemin başlatılması birkaç dakika sürecek.
        Not: Başlangıçta, pencerenin altındaki sıcaklık çubuğu kırmızıya döner ve bu, görüntüleme kamerasının hedef sıcaklığına -90 °C'ye ulaşma sürecinde olduğunu gösterir (Şekil 3B).
      3. Görüntüleme kamerası hedef sıcaklığa (-90 °C) ulaştığında, sıcaklık çubuğu yeşile döner ve sistem durumu "Kullanıma hazır" (Şekil 3C) yazacaktır. Şimdi görüntüleyici fareyi görüntülemeye hazır.
        Not: Pozlama süresi, binning ve f/stop kullanıcı gereksinimlerine göre ayarlanabilir.
  3. Faresi IVIS görüntülemeye hazırlamak
    Fare görüntülemeden önce, D-luciferin intraperitoneal olarak enjekte edilmelidir.
    1. Fareyi kafesten çıkarın ve pürüzlü veya kablolu bir yüzeye koyun. Fareleri nazikçe sıkıştırarak 2.1. bölümde açıklandığı gibi doğru şekilde tutun.
    2. Fareyi alıp ventral tarafı yukarıya bakacak şekilde çevirin.
      Not: Fare doğru şekilde sabitlenirse, Şekil 1B'de gösterildiği gibi kaldırma sırasında dört bacak da dışa doğru uzanır. İşlem sırasında kuyruğunu parmakları arasında tutarak ekstra bir kısıtlama gösterisi olarak kullanın.
    3. Enjeksiyon bölgesini temizlemek için steril alkol sürüntüsü kullanın, bölüm 2.1'deki intraperitoneal enjeksiyon protokolünde olduğu gibi.
    4. 1 ml TB şırıngası ve 30G, 1/2 inç iğne kullanarak stok çözeltiden uygun miktarda D-luciferin enjeksiyonu için 150 mg/Kg D-luciferin dozunu elde edin.
      Not: İntraperitoneal enjeksiyon prosedürü için bölüm 2.1'deki intraperitoneal enjeksiyon protokolüne bakınız. Eğer C57BL/6 fareleri (senjenik allogreft modelleri için) kullanılıyorsa, IVIS ile biyolüminesans görüntüleme yapılmadan önce tüylerin alınması şiddetle tavsiye edilir. Siyah tüy ve pigmentli deri, ışığı önemli ölçüde azaltarak sinyal yoğunluğunu azaltır.
    5. Fareyi nazikçe kafese geri koy. Kesin bekleme süresi ve maruz kalma süresi ampirik olarak belirlenmelidir. Bu şu şekilde belirlenebilir.
      1. D-luciferin enjeksiyonundan hemen sonra fareyi anestezi edin ve Bölüm 3.4'te açıklandığı şekilde her 2 dakikada bir 20 dakika boyunca görüntüleyin.
        Not: Bu deneyi ilk kez yaparken, D-luciferin verildikten sonra luciferaz sinyalinin zamanla nasıl değiştiğinin belirlenmesi önerilir. Bu, sonraki deneylerde D-luciferin uygulandıktan sonra farenin görüntülenmesi için en uygun zamanı belirlemeye yardımcı olacaktır. Biyolüminesans sinyal, hücre hattı, fare ksenograft modeli, lusiferaz ifadesi seviyesi gibi çeşitli faktörlere bağlı olarak değişebilir.
      2. Her aralıkta 5, 10 ve 15 saniyelik expsourlar alın.
      3. Bu verileri standart bir eğri çizmek için kullanın. Eğriye göre, sinyalin en yüksek yoğunluğu koruyarak bir platoya ulaştığı bekleme ve pozlama süresini seçin.
        Not: Genellikle bu süre 5–10 dakika arasındadır, ancak modele göre değişebilir.
  4. IVIS kullanılarak fare tümörlerinin invaziv olmayan görüntülemesi
    1. Bekleme süresinden sonra, fareyi %4 izofluran oranı ve 3,5 oksijen akış oranı olan bir izofluran odasına yerleştirin.
    2. Farenin anestezi altında olduğunu kontrol ederek parmak sıkıştırma refleksinin olmadığını kontrol edin.
    3. Fareyi IVIS görüntüleme cihazının içine sahneye yerleştirin ve görüntüleme sırasında anestezi bakımı için burnunu burun konisinin içine kaydırın. Kameranın odak çizgileri içinde kaldıklarından emin olun ve görüntüleyici kapısını kapatın.
      Not: Görüntüleyicinin içinde sahnede beş pozisyon olacak. Her pozisyonun ayrıca kendi anestezi burun konusları da olacaktır. Bu, aynı anda 5 farenin görüntülenmesini sağlar. Görüntülenecek fare sayısına bağlı olarak, kontrol paneli kutusundaki kamera görüş alanını "D"den (daha geniş alan) "A"ya (dar odak) ayarlayın. Fare, burunları görüntüleme boyunca anestezi burun konilerinin içinde tutulduğu sürece sahnenin herhangi bir yerine yerleştirilebilir. Farelerin önce dorsal taraflarında, sonra da ventral yanlarında sıralı olarak görüntülenmesi önerilir.
    4. Pozlama süresini ayarlayın ve kontrol panelinde "Acquire" tuşuna tıklayın (Şekil 3C).
      Not: Kontrol panelinde lüminesans, fotoğraf ve üst katmanın "AÇIK" olduğundan emin olun.
      Görüntü çekildikten sonra, lusiferaz sinyalli farenin görüntüsü ekranda görünür.
    5. Görüntüleyiciyi açın ve fareyi ventral tarafı yukarı bakacak şekilde çevirin, görüntüleyici kapısını kapattıktan sonra "Edin" seçeneğine tıklayın.
      Not: Görüntüleme sırasında anestezi sürdürülmesini sağlamak için farenin burnunun burun konisinin içinde olduğundan emin olun.
    6. Hem dorsal hem de ventral görüntüler alındıktan sonra, görüntüleyici kapısını açın ve fareyi tekrar kafesine yerleştirin.
    7. Farenin bilincini geri kazanması için 5-10 dakika bekleyin.
  5. Fareye tümör yükünü belirlemek için IVIS görüntüsünün analizi
    1. Görüntülerin renk ölçeğinin ayarlanması
      1. Ham görüntüleri "dosya" ve ardından "Kaydet" seçeneğine tıklayarak uygun klasöre kaydedin.
        Not: Görüntüleyici, sinyal yoğunluğuna göre renk ölçeğini otomatik olarak ayarlar. Deney boyunca çekilen tüm görüntülerde renk ölçeğinin sabit tutulması tavsiye edilir. Renk ölçeği, bu yazılımla ham görüntü açılarak daha sonra ayarlanabilir.
      2. Manuel ayarlama için, ekranın sağ üst köşesinde araç paletinin başka bir penceresi açılır (Şekil 3D), "Görüntü ayarlama"ya gidin ve ölçek için "manual"ı seçin. Ölçek değeri için istenen minimum ve maksimum sayıyı girin ve "Enter"e tıklayın (Şekil 3E).
        Not: Daha önce alınan bir görselin renk ölçeğini ayarlarken, önce ilgili klasörden kaydedilen raw infoclick.txt görüntü dosyasını "file" ve ardından "open" ile açın.
        3.5.1.3. Bu görseli ham görselden ayrı olarak uygun klasörde kaydedin.
    2. Fareye yönelik tümör yükünün analizi
      Not: Tümör yükünün nicel ölçümü için, tüm dönem boyunca çekilen görüntülerde her farenin sinyal yoğunluğunu ölçebilirsiniz. Bu değerleri istatistiksel analiz ve tümör ilerleyişinin çizgi grafikleri oluşturmak için Excel veya GraphPad Prism'e yerleştirebilirsiniz.
      1. İlgili klasörden kaydedilen ham infoclick.txt dosyasını açın.
      2. Araç paleti penceresinin sağ üst köşede açılan ROI (İlgi Bölgesi) bölümüne gidin (Şekil 3F).
      3. Her farenin ROI alanını manuel veya otomatik olarak "çiz" fonksiyonu yardımıyla size en uygun herhangi bir şekle çizin. Bunu manuel yapmak için, karşılaştırılan tüm farelerin tüm görüntüleri için alanı tutarlı tutun.
        Not: İntraperitoneal aşı için, farenin ventral görüntüsünde tüm göğüs ve karın için ROI'nin manuel seçimi en iyi şekilde çalışır. Bursal içi aşılama için, sinyal ile dorsal görüntü bölgesinde ROI'nin manuel seçimi en iyi şekilde işe yarar.
        Not: Otomatik ROI seçimi yalnızca daha yüksek görüntü sinyali yoğunluğuna sahip bölgeleri seçer.
      4. "ROI'yi ölç" (Şekil 3F) üzerine tıklayın. Bu, seçilen her yatırım getirisi için toplam ve ortalama sayımların bulunduğu yeni bir pencere açar.
      5. Bu dosyayı uygun klasöre kaydedin ki daha sonra erişilebilsin. Bu verileri kullanarak grafiği MS Excel veya GraphPad Prism'de çizebilirsiniz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Immün zayıf Foxn1 çıplak farelerde luciferase etiketli OVCAR8 hücreleri kullanılarak intraperitoneal yumurtalık kanseri modelinden elde edilen temsil veriler Şekil 4'te gösterilmiştir. Bu hücrelerdeki stabil lusiferaz ekspresyonu IVIS görüntüleme cihazı kullanılarak tümör ilerlemesinin uzunlamasına izlenmesini mümkün kılmıştır; bu görüntüleme bölüm III'te açıklanmıştır. Foxn1 çıplak farelere 5 milyon OVCAR8-luciferaz hücresinin intraperitoneal enjeksiyonu, p...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tümör hücreleri, mikro ortam ve sistemik faktörler arasındaki karmaşık etkileşimleri taklit edebilme yeteneği, fare modellerini yumurtalık kanseri ilerlemesini incelemek için mükemmel bir kaynakyapar 12. Yumurtalık kanseri ilerlemesini ve metastazını tetikleyen faktörleri anlamamızın yanı sıra, in vivo fare modelleri metastatik yumurtalık kanseri için küçük moleküllerin preklinik değerlendirmesinde ve tedavi stratejilerinde de önemli roloynar 12,...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların bildirecek hiçbir açıklaması yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A.P., Savunma Bakanlığı (HT9425-23-1-0351 ve HT9425-23-1-0232), Ulusal Sağlık Enstitüleri (R03CA282712), Greater Cincinnati Yumurtalık Kanseri İttifakı (PRIV0201 ve PRIV0219) fonları ve UMGCCC Amerikan Kanser Derneği Kurumsal Araştırma Bursu – IRG-18-160-16 tarafından desteklenmiştir. A.P, ayrıca Maryland Üniversitesi, Baltimore, Klinik ve Çeviri Araştırmalar Enstitüsü (ICTR) tarafından sağlanan hibelerle de desteklendi; bu hibe, kısmen Ulusal Çeviri Bilimleri İlerleme Merkezi (NCATS) Klinik Translasyonel Bilim Ödülü (CTSA), UM1TR004926 tarafından finanse edilmektedir. Bu makale ayrıca Ulusal Kanser Enstitüsü - Kanser Merkezi Destek Destek Hibesi (CCSG) – P30CA134274 aracılığıyla desteklenmiştir. A.O. kısmen NIH hibesi T32 GM158458 tarafından desteklendi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
0.22 um şırınga steril filtre, 33mmFisher Scientific09-720-004
1 ml TB şırıngaBD309659
21G, 1 inç iğneBD305167
30G, ½ inç iğneBD305106
5 inç kavisli ince nokta forsepsFisher Scientific1631
6-0 Emilebilir monofilament dikişMaxonTM  6532-11
Alkol sürüntü (%70 izoprolil alkol)Dukal Corp80003156
Betadin (%1 iyot çözeltisi)Purdue Ürünleri367618150085
Karprofen Inj, 50mg/mlLevafenRXLEVA50-20INJ
Santrifüj Eppendorf5702
D-luciferinSyd LabsMB000102-R70170
Kuyumcu mikroforsetlerini diseksiye etmek, ince uçFisher Scientific08-953E
Göz merhemiMedvet11897
İnce uçlu makasFisher Scientific8940
Isı pediGüneş Işığı731-500
İnce uçlu pensepleri diseksiye eden aletlerFisher ScientificS08096
İnsülin Şırıngası 3/10mlBD328438
İzofuranFlurisoFluriso250
IVISPerkin ElmerIVISLMIII
Mayo- Heger Düz İğne TutacağıFisher Scientific08-966
Kalsiyum ve Magnezyum içermeyen steril 1X PBSCorning21-040-CV
Steril pamuk uçlu aplikatörlerMckeesson24-106-1S
Steril GaugeKendall3033
Steril Ped/Havlu/Perde, PenceresizHenry-Schein100-9687
Üçlü Antibiyotik MerhemGlobe4006-4SL
Tripsin-EDTA (%0,25), fenol kırmızıGibco25200-056

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Fare T m r Modellerintraperitoneal Modelntrabursal ModelT m r MetastazBiyol minesans G r nt lemeT m r Mikro evresi
Video yakında

İlgili makaleler