Kemodirençli Hücrelerde Epigenom Genelinde CRISPR-Cas9 Tabanlı Knockout Screen'ler

Özet

Burada, doz yükseltme yaklaşımıyla kemodirençli hücreler üretmek için bir protokol sunuyoruz; ardından edinilmiş kemodirenç düzenleyicilerini belirlemek için epigenetik modifikatörleri hedefleyen odaklı bir sgRNA kütüphanesi kullanılarak CRISPR/Cas9 tabanlı bir ekran sunuluyor. Protokol ayrıca, kemodirençli hücre modellerine uyarlanmış çoklu optimizasyon noktaları sunar ve direnç mekanizmalarını araştıran araştırmacılar için sağlam bir çerçeve sunar.

Özet

Kemoterapi direnci, kanser hücrelerinin adaptif özellikler kazanma, sinyal yollarını yeniden yapılandırma ve ilaç kaynaklı sitotoksisiteden kaçınmak için kromatin yapısını değiştirme yeteneği nedeniyle kanser tedavisinde büyük bir zorluk olmaya devam etmektedir. Bu süreçler kromatin organizasyonunu ve transkripsiyonel plastisiteyi düzenleyen epigenetik mekanizmalara büyük ölçüde dayandığı için, epigenetik düzenleyiciler kemoterapi direncine önemli katkı sağlayanlar olarak ortaya çıkmıştır. Üçlü negatif meme kanserinde (TNBC) en yaygın kullanılan kemoterapî ajanlardan biri olan paklitaksele karşı direnci araştırmak için, kromatin regülasyonuna dahil olan genleri sistematik olarak bozmak için tasarlanmış epigenom odaklı bir knockout kütüphanesi (EPIKOL) kullandık; bu kütüphane CRISPR-Cas9 tabanlı bir kütüphanedir. Kemodirençli hücre hatları, klinik olarak ilgili ilaç adaptasyonunu özetleyen adımlı doz-yükseltme protokolü ile oluşturuldu. Ancak, bu dirençli hücreler çoklu ilaç dirençli (MDR) fenotipi sergiler; bu da etkili viral iletimi ve kararlı hücre popülasyonlarının seçimi için önemli zorluklar yaratır. Bu çalışmada, kemodirençli TNBC modellerinde EPIKOL CRISPR ekranlarının başarılı şekilde uygulanmasını mümkün kılan yüksek verimli lentiviral transdüksiyon ve seçilme için temel metodolojik adımları tanımlıyoruz. Tarif edilen protokole uygun olarak, kemodirençli TNBC hücrelerinde epigenom genelinde bir CRISPR taraması yapıldı ve kemodirençli yeni epigenetik düzenleyiciler belirlendi. Bu protokol, CRISPR tabanlı fonksiyon kaybı yaklaşımıyla edinilen paklitaksel direncine katkıda bulunan epigenetik düzenleyicileri belirlemek için sağlam bir çerçeve sağlar.

Giriş

Üçlü negatif meme kanseri (TNBC), tüm meme kanserlerinin %12–17'sini oluşturan bir meme kanseri alt^{tipidir 1}. Östrojen reseptörü (ER), progesteron reseptörü (PR) ve insan epidermal büyüme faktörü reseptörü-2'nin (HER2) ifadesinin bozulmasıyla karakterize edilir; bu da hedefe yönelik tedavi seçeneklerinin erişimini ciddi şekilde sınırlar ve geleneksel kemoterapiyi birincil tedavi^{yöntemi olarak bırakır. 2}. Taksanlar ve antrasiklinler TNBC tedavisinde yaygın olarak kullanılır; ancak hastalar genellikle^{direnç 2,3} geliştirir. Kemodirenç edinimi, hem genetik, metabolik, transkripsiyonel hem de epigenetik adaptasyonları içeren karmaşık ve çok boyutlu bir^{süreçtir 2,4}. Epigenetik değişiklikler, hücresel plastikliğin merkezi düzenleyicileri olarak ortaya çıkmıştır ve kanser hücrelerinin kemoterapi kaynaklı toksisiteyi tolere etmesini sağlayan dinamik transkripsiyonel yeniden programlamayı^{kolaylaştırır 5}.

Taxol (paklitaksel), mikrotubul dinamiklerini bozarak hücre ölümüne neden olan taksan sınıfının bir üyesidir ve antimitotik olarak^{işlev görür 6}. TNBC hastaları başlangıçta Taxol dahil kemoterapi rejimlerine yanıt verse de, direnç genellikle zamanla^{gelişir 2}. Edinilmiş Taxol direnci, genellikle ATP bağlayıcı kaset (ABC) taşıyıcılarının, özellikle ABCB1 (MDR1, P-glikoprotein) aşırı ekspresyonuyla ilişkilidir; bu taşıyıcılar, Taxol'ün ilaç akışını aracı olarak gösterir ve bu da hücre içi ilaç toksisitesinin^{azalmasına yol açar.} Bu ABC taşıyıcılarının substratları olan çok çeşitli kemoterapötik ajanlar olduğundan, bu ilaçların yukarı regulasyonu diğer kemoterapötik ilaçların kullanımını sınırlar ve çok ilaçlı direnç fenotipine (MDR)⁸ yol açar. ABC taşıyıcılarının inhibisyonu, klinik ortamlarda çoklu ilaç direncini aşmak için büyük ölçüde başarısız olmuştur; bunun başlıca nedeni, yaygın ekspresyonları ve geniş bir yelpazede endojen ve dışsal substratların taşınmasında önemli rolleri^{nedeni 9}. Verapamil, birinci nesil ABCB1 inhibitörü olarak, klinik faydası sınırlı veya hiç olmamış ve klinik denemelerde önemli toksisiteyle^{ilişkilendirilmiş olsa da}, MDR'nin in vitro modellerinde seçim verimliliğini artırmak için değerli bir deneysel araç olmaya devam etmektedir.

MDR fenotipi, çoğunlukla stres koşullarında ortaya çıkan dinamik ve uyarlanabilir^{bir süreçtir 2}. ABC taşıyıcı ekspresyonu ağırlıklı olarak transkripsiyonel ve epigenetik düzenleyici mekanizmalar tarafından kontrol edilir, mutasyonel olaylarla^{değil 5,11}. ABC taşıyıcılarını doğrudan hedeflemenin sınırlaması, bu proteinlerin üst akış regülatörlerinin dirençli hücrelere özgü bir açıklık olarak tanımlanması gerekliliğini ortaya koyuyor. Bu nedenle, epigenetik faktörlerin sistematik sorgulanması, kemoterapi direncinin yeni düzenleyicilerini belirlemek ve bu açıklıkları hedefleyen kombinasyon tedavileri geliştirmek için önemli bir strateji haline gelmiştir.

CRISPR-Cas9 tabanlı fonksiyonel nakavt ekranları, genom^{ölçeği 12'de} kanserde gen kaybının etkilerini incelemek için tarafsız, sistematik genom çapında bozulmalar sağlar. Ancak, genom çapındaki CRISPR kütüphaneleri, gen başına sınırlı tek rehber RNA (sgRNA) temsili sunar; bu da odaklı kütüphanelere kıyasla hassasiyeti azaltır¹³. Önemli olarak, sağlam bir ekran sadece bozulmaların kalitesine değil, aynı zamanda uygun bir model ve optimize edilmiş deneysel protokole de bağlıdır. Bu bağlamda, ilaç direnci gibi dinamik ve karmaşık bir sürecin incelenmesi, özel bir protokol¹³ içeren odaklanmış bir kütüphaneden fayda sağlayabilir. Önceki bir çalışmada, kromatin regülatörlerini hedeflemek için epigenom odaklı bir CRISPR-Cas9 knockout kütüphanesi^{oluşturduk 14}. Diğer halka açık epigenom odaklı CRISPR kütüphanelerine kıyasla, epigenetik knockout kütüphanesi (EPIKOL) kromatin okuyucuları, yazarlar, silgiciler ve ilişkili proteinlerden oluşan 779 gen içerir; her biri 10 sgRNA ile hedeflenir; böylece gen başına derinlik artırılır ve kromatin odaklı fonksiyonel ekranların sağlamlığını ve tekrarlanabilirliğini artırır¹⁴. EPIKOL, Cas9'un farklı bir vektörden ifade edildiği LentiGuide sisteminde ve hücre hattına bağlı olarak esneklik sağlayan Cas9'u içeren LentiCRISPR sisteminde mevcuttur. EPIKOL için yeterli kütüphane kapsamına ulaşmak, yani sgRNA başına ortalama hücre sayısı olarak tanımlanır (örneğin 500×–1000×), genom çapındaki kütüphanelere kıyasla daha kolaydır ve yavaş büyüyen kemodirençli hücre hatlarını çalışırken avantaj sağlar.

CRISPR taraması, kemodirenç mekanizmalarını incelemek için güçlü bir yaklaşım sunsa da, standart havuzlu tarama akışları, aktif ilaç akışı olan kemodirençli hücreler için optimize edilmemiştir. Lentiviral CRISPR sistemlerinde yaygın olarak kullanılan bir seçici antibiyotik olan Puromycin, dirençli hücrelerden özellikle ABCB1 olmak üzere ABC taşıyıcıları tarafından pompalanabilir ve transdüksiyon edilen hücrelerin başarılı seçimini engeller^15,16. Bu sınırlama, heterojen hücre popülasyonlarına yol açabilir, arka plan gürültüsünü artırabilir ve nihayetinde veri kalitesinin tehlikeye girmesine yol açabilir. Bu zorluğu çözmek için, ABC aracılı ilaç akışını verapamil ile geçici olarak inhibre ederek puromisin seçim adımını optimize ettik; böylece sgRNA enfekte hücrelerin verimli zenginleştirilmesini sağladık. Bu stratejiyi kullanarak, TNBC^17'de ABCB1 ekspresyonunun ve Taxol direncinin düzenleyicisi olarak Bromodomain ve PHD Finger Containing 1 (BRPF1) tanımlandı. BRPF1 inhibisyonu, genetik veya farmakolojik olarak, dirençli hücrelerde Taxol hassasiyetini geri kazandırmış ve bu optimize edilmiş protokolün kemodirenç^17'de uygulanabilir hedefleri belirlemede faydasını göstermiştir.

Burada, kemodirençli modellerde negatif seçim CRISPR taramasının temel adımlarını özetlemekte, özellikle çoğu kemodirenç veya CRISPR tarama protokolünde sıklıkla göz ardı edilen teknik zorluklara odaklanıyoruz. Protokol önce kemodirençli hücrelerin üretimi için adım adım doz yükseltme yöntemini gösterir ve ardından ABC taşıyıcı aracılı ilaç akışını aşmak için viral teslimat ve seçim koşullarını optimize eder. Bu optimizasyonlar birlikte, CRISPR taramaları sırasında sgRNA pozitif hücrelerin verimli zenginleşmesini sağlarken, transdüksiyon yapılmamış hücreleri etkili bir şekilde ortadan kaldırır ve böylece kemodirençli TNBC hücrelerinde transdüksiyon ve seçim için sağlam ve verimli bir strateji sağlar. Son olarak, protokol CRISPR tarama sonuçlarını yeni nesil dizileme ve biyoinformatik analiz yoluyla belirlemenin temellerini vurgular.  Bu protokol birlikte, direnç 17,18,19'u aşmak için potansiyel terapötik hedefleri belirlemek amacıyla EPIKOL tarama platformunun etkili bir şekilde uygulanmasını sağlar.

Protokol

Bu çalışmada kullanılan tüm reaktifler ve ekipmanlar Malzeme Tablosu'nda yer almaktadır.

1. Taxol'a dirençli üçlü negatif meme kanseri hücre hatlarının oluşturulması

1. Hücrelerin ilaç hassasiyetini belirlemek için, SUM159PT yapışkan hücrelerin hücre yoğunluğunu, 96 delikli siyah şeffaf taban plakalarında Ham F12 besin karışımı ile %5 fetal sığır serumu (FBS), %1 Penisillin-Streptomisin, 5 μg/mL insülin, 10 mM HEPES ve 1 μL/mL hidrokortizon ile takviye edilen bir hücre kültürü karışımı ile 96 kuyu başına 2 × 10-3 hücreye ayarlayın ve hücreleri 37 °C'de %5_{CO 2} ile 16 saat boyunca kübe edin.
2. Taxol stokunu dimetil sülfoksitte (DMSO) çözünmüş hale getirin. Hücreleri tedavi etmek için, kültür ortamında seri olarak Taxol seyreltmeleri hazırlayın; bunlar 0.3 nM ile 10 μM arasında değişir (örneğin, 0.3 nM, 1 nM, 3 nM, 3 nM, 10 nM, 100 nM, 100 nM, 1μM, 10 μM) ve araç kontrolü olarak yalnızca DMSO kullanılır.
3. Hücreleri 200 μL artan dozda Taxol (adım 1.2'de hazırlanmış) üçlü olarak tedavi edin ve plakayı 72 saat boyunca hücre kültüründe 37 °C'de %5_{CO2 ile bırakın.}
4. 72 saat süren ilaç tedavisinden sonra, hücre yaşamlılığını lüminesans bazlı adenozin trifosfat (ATP) hücre canlılık ölçmesiyle ölçün. Lüminesansı ölçmek ve değerleri DMSO kontrollerine normalleştirmek için mikroplaka okuyucu kullanın. %10 inhibitör konsantrasyon (IC10) ve IC50 değerlerini, uygun bir istatistiksel yazılımda dört parametreli lojistik doz-yanıt modeli kullanılarak doğrusal olmayan regresyon ile hesaplayın.
5. Kemodirençli hücreler üretmeye başlamak için, 6 kuyu plakalarında her kuyu başına 2 ×^10-5 SUM159PT hücre tohumlayın. Gece boyunca %5_CO2 ile 37 °C'de kuluçka yapın.
6. Ertesi gün, 72 saat boyunca 2 mL kültür ortamında IC10 veya IC50 Taxol değerleri olan hücreleri başlangıç konsantrasyonları olarak tedavi edin.
7. Hücreler mevcut ilaç konsantrasyonunu tolere ediyorsa, onları iki kuyuya ayırın. Bir kuyunu yedek kontrol olarak taze ortamda tutun ve ikinci kuyunun yerine önceki Taxol konsantrasyonunun iki katı olan ortamı kullanın.
   NOT: Eğer hücreler anormal hücresel projeksiyonlar, yoğun yuvarlatma ve ayrılma veya proliferasyonda belirgin azalma gibi stres kaynaklı morfolojik değişiklikler nedeniyle iyileşmeye ihtiyaç duyarsa, hücreleri ilaçsız ortamda tutun ve hücreler sağlıklı ve birleşene kadar bekle. Sonra 1.7. adımdan itibaren adımları tekrarlayın.
8. Dirençli hücreler oluştururken, ebeveyn hücreleri DMSO içeren ortamı kontrol olarak taşır. DMSO hacmini, ilgili Taxol tedavisinde bulunan DMSO miktarına göre ayarlayın.
9. Hücre canlılığı her 3–4 haftada bir 1.2–1.4 adımlarında ölçülür ve uygulanan ilaca bağlı olarak IC50 değerleri arasında önemli bir fark (p < uygulanan ilaca bağlı olarak 10–50 kat) elde edilene kadar devam edilir. Doz artırma işlemi genellikle kullanılan ilaca bağlı olarak 6–9 ay sürer.
10. Stabil dirençli hücreler elde edildikten sonra, dirençli fenotipi korumak için kültür yaparken ilacın bakım dozunda (son uygulanan doz) tutulmaları sağlanır.
    NOT: Doz yükseltme yöntemiyle kemodirençli hücre üretimi zaman alıcı bir süreçtir ve süre, hücre hattı, içsel büyüme hızı ve kullanılan özel kemoterapi ajanı dahil olmak üzere çeşitli faktörlere bağlıdır. Genellikle klinik olarak geçerli direnç seviyesine bağlı olarak 6–9 ay sürer. Dirençli seviyelerdeki anlamlı farkları belirlemek için alternatif bir yaklaşım, dirençli hücrelerin hayatta kaldığı ancak ebeveyn hücrelerin hayatta kaldığı minimum ilaç konsantrasyonunu değerlendirmektir.
11. Dirençli hücrelerin karakterizasyonu: Dirençli hücre fenotipini karakterize etmek için RNA dizileme, western blotlama, nicel polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) ve hücre canlılığı testleri ile ilaç tedavisi (örneğin koloni oluşumu testi) gerçekleştirilir. Birkaç geçişten sonra dirençli fenotipi yeniden değerlendirdiğinizden emin olun; böylece yükselmiş IC50 fenotipinin zamanla stabil olduğunu gösterin.

2. Lentivirüs üretimi

1. 0. Gün: Tohum HEK293T hücreleri 100 mm'de 4 ×^{10-10 doku kültürü} kabı olarak Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM) ile %10 FBS, %1 Penisillin-Streptomisin takviyesi ile takviye edilerek ertesi gün %90 birleşme sağlanır.
2. 1. Gün: Her virüs için serumsuz DMEM (-/-) içinde polietilen (PEI) ve DNA karışımlarını ayrı ayrı hazırlayın. İstenilen viral verimiye göre PEI ve DNA hacmini ve konsantrasyonlarını ayarlamak için Tablo 1 ve Tablo 2'yi kullanın.
   NOT: PEI, toplam μg DNA'nın dört katı kullanılır (örneğin, 100 mm plakada 30 μL PEI kullanılarak toplam 7,5 μg DNA elde edilir). Bu protokolde 100 mm çanaklarda virüs üretimi uygulanır ve 5–10 100 mm çanaklardan alınan virüs sayesinde birden fazla ekran yapılabilir. Doğrulama deneyleri veya küçük ölçekli enfeksiyonlar için, tek bir 6 kuyu plaka veya 60 mm çanağı yeterlidir. Doğrusal polietilen hidroklorür toksik bir transfeksiyon ajanı olduğundan, transfeksiyon anında hücre birleşiminin %90 olduğundan emin olun.
   1. İyice karıştırdıktan sonra DNA karışımını PEI tüpüne ekleyin. İyi karıştırın ve PEI-DNA komplekslerini oda sıcaklığında 30 dakika bekletin.
   2. Sonra 600 μL PEI-DNA kompleksini HEK293T'ye damla olarak ekleyin. Plakaları 37 °C'de 16 saat boyunca %5 CO2 ile virüs kuluçka makinesine_{yerleştirin.}
3. 2. Gün: Enfekte hücrelerin ortamını, PEI ve virüs içeren ortamı aspire ederek ve her 100 mm doku kültürü kabı için 8 mL tam DMEM ekleyerek değiştirin. Hücreleri inkubasyon ederek viral üretime izin verin.
4. 3. Gün: Virüslerin ilk koleksiyonunu gerçekleştirin; 8 mL süpernatantı uygun boyutta bir santrifüj tüpüne nazikçe alıp 4 °C'de depolayın. Viral üretim için birden fazla plaka varsa, süpernatantları birleştirin. Sonra her tabağa 8 mL taze tam DMEM ekleyin ve tabakları virüs kuluçka makinesine geri döndürün.
5. 4. Gün: Toplama adımlarını tekrarlayın ve 3. günden itibaren süpernatantlarla birleştirin.
   1. %50 (w/v) Polietilen glikol (PEG)-8000 çözeltisi fosfatla tamponlanmış tuzlu (PBS) hazırlayarak 5× PEG stok çözeltisi elde edin. Otoklav olarak çözülüp sterilize edilir.
   2. Toplanan viral süpernatantları 300 x g ile 5 dakika boyunca santrifüjlenerek kalıntı hücreleri pellet hale getirin, ardından filtrasyona geçin.
   3. 16 mL viral süpernatantı 0,45 μm filtre (şırınga veya 50 mL vakum filtre) ile 4 mL PEG çözeltisi içeren tüpe filtreleyin; böylece son 1× PEG konsantrasyonu elde edilir ve kalan kalıntı ile hücreler çıkarılır.
   4. Tüpü kaplayıp ters çevirerek karıştırın. Tüm viral hazırlıklar için bu adımı tekrarlayın. Gece boyunca 4 °C'de karanlıkta saklanın, isteğe bağlı hafif çaltlama seçeneği var.
   5. Ertesi gün görünür çökelti olmalı. Tüpleri 1400 x g sıcaklığında 20 dakika boyunca 4 °C'de santrifüj yapın.
      NOT: PEG çökelmiş viral peletler, santrifüjasyondan 5 gün öncesine kadar 4 °C'de saklanabilir; ancak viral titer uzun süreli kuluçka ile azalabilir.
   6. Santrifüjlemeden sonra, süpernatantı dikkatlice atarak tüpte küçük bir hacim (yaklaşık 100 μL) bırakarak peletin rahatsız edilmesini önlemek için kullanılır.
   7. Tüpleri 5 dakika boyunca 300 x g ile santrifüj yapın, böylece tüpün yanlarından mümkün olduğunca fazla sıvı toplansın. Sonra kalan süpernatantı dikkatlice atın.
   8. Virüsü 100 kat yoğunlaştırmak için, peletin başlangıç hacminin 1/100'üne PBS ekleyin ve peleti pipetle yeniden askıya alın (örneğin, 16 mL viral süpernatantla başlarsanız, pellet hacmi hesaba olarak 160 μL nihai hacme ulaşmak için pellete 120–140 μL PBS ekleyin). Güçlü pipetlemeden kaçının; Virüsün takıntısı.
      NOT: PEG konsantrasyonu sonrası beklenen titre LentiGuide sistemi için >1 × 10⁸ bulaşıcı partikül/mL (ip/mL) ve LentiCRISPR sistemi için >1 × 10^7'dir . Bir kat daha düşük titrler yine de kabul edilebilir, ancak hedef hücre hattının enfektifliği ve gerekli viral hacmi ile karşılaştırıldığında doğrulanmalıdır.
   9. Virüs konsantrasyonu gerekmiyorsa, donma-çözülme döngülerini en aza indirmek için virüsü aliquot kullanın. Konsantre veya konsantre olmayan virüsü -80 °C'de sakla. Çamaşır suyu ve çöp tabakları.
      NOT: Lentiviral üretimi ve yönetiminin daha ayrıntılı bir tanımı için okuyucular yerleşik^{protokollere yönlendirilmektedir 20}. Lentivirüs üretimi sırasında karşılaşılan yaygın sorunlar için Ek Tablo 1'e bakınız.

	1 kuyu 6 kuyu plaka	60 mm plaka	100 mm plaka	150 mm plaka
PEI (stok 1 mg/mL) hacmi	6 μL	9 μL	30 μL	60 μL
DMEM (-/-) hacmi	54 μL	100 μL	270 μL	540 μL

Tablo 1: PEI karışımı için farklı plakalar için gerekli PEI ve DMEM hacimleri.

	1 kuyu 6 kuyu plaka	60 mm plaka	100 mm plaka	150 mm plaka
VSV-G	75 ng	150 ng	375 ng	750 ng
Gag-Pol	675 ng	1350 ng	3375 ng	6750 ng
Hedef vektör	750 ng	1500 ng	3750 ng	7500 ng
DMEM (-/-) son sesi şu şekilde ayarlayın	60 μL	100 μL	300 μL	600 μL

Tablo 2: DNA karışımı için farklı plakalar için gerekli plazmid ve DMEM hacimleri.

3. MDR hücreleri için optimize edilmiş puromisin seçiminin kurulması

NOT: ABCB1 aşırı ekspresyonunu gösteren kemodirençli hücrelerde, aktif ABCB1 aracılı puromisin akışı nedeniyle puromisin seçilimi başarısız olur ve sgRNA enfekte hücrelerin etkili seçimini engeller. Bu sınırlamayı aşmak için, verapamil puromisin ile birlikte verilerek ABCB1 aracılı efısın geçici olarak inhibe edilir; böylece hücre içi puromisin birikimi sağlanır ve enfekte olmayan hücreler etkili şekilde yok edilir.

1. ABCB1 aracılı ilaç akışını engelleyen verapamil konsantrasyonunu hücre canlılığını etkilemeden belirleyin. Bunun için, direnç kazanılan kemoterapi ajanı (bu durumda Taxol) verapamil dozlarının artmasıyla birlikte kullanın.
   1. Tohum SUM159PT Taxol-dirençli ve ebeveyn hücreleri, 96 deliklik siyah şeffaf taban plakalara, her kuyu başına 2 ×^10-3 hücre üçlü olarak yerleştirilir. Hücreleri gece boyunca %5 CO2 ile 37 °C'de kuluçka_{altına alın.}
   2. Verapamil'in seri seyreltmeleriyle (0, 1.25, 2.5, 5, 10, 20, 40 ve 80 μM) hücreleri tedavi ederek tüm koşullarda Taxol'ün sabit konsantrasyonunu (örneğin bakım dozu) koruyun.
   3. 72 saatlik tedaviden sonra, lüminesans tabanlı ATP niceliklendirme hücre canlılığı testi ile hücre canlılığını değerlendirin. Kendi başına canlılığı azaltmayan verapamil konsantrasyonunu belirleyin (≥tedavi edilmemiş kontrollere göre %90–%95 canlılık) ancak dirençli hücrelerde duyarlılığı geri kazandırır.
2. Verapamil ile birlikte kullanılacak puromisin konsantrasyonunu bulmak için, tohum Taxol-dirençli hücreleri 96 delikli bir plakaya 2 × 10-3 hücre SUM159PT kuyudayerleştirir. Plakayı %5_CO2 ile 37 °C'de 16 saat kuluçka yapın.
   1. Daha önce belirlenen verapamil konsantrasyonunu içeren ortamda puromisin (0, 0.625, 1.25, 2.5, 5, 10, 20 ve 40 μg/mL) seri seyreltmeleri hazırlanır ve hücreleri buna göre tedavi eder.
   2. 72 saat sonra, hücre yaşamlılığını lüminesans tabanlı ATP hücre canlılık testi ile ölçün ve verapamil varlığında tüm hücreleri (%≤%5 canlılık) ortadan kaldıran minimum puromisin konsantrasyonunu belirler. Bu konsantrasyon CRISPR taraması sırasında seçim için kullanılacaktır.
      NOT: Bu ilaç konsantrasyon optimizasyon adımları hücre hattı ve bağlama bağlıdır. İçsel ilaç hassasiyeti, ABC taşıyıcı ekspresyon seviyeleri ve büyüme hızı gibi faktörler etkili konsantrasyonları etkileyebilir. Bu nedenle, her yeni hücre hattı ve direnç modeli için bu optimizasyonu gerçekleştirin. (Referans olarak, bu çalışmada kullanılan Taxol-dirençli hücreler için 5 μg/mL puromicin ve 20 μM verapamil kombinasyonu^{kullanılmıştır 17}). Puromicin + verapamil seçimi sorunlarını çözmek için Ek Tablo 1'e bakınız.

4. Viral titrasyon ve enfeksiyonun çokluğu (MOI) hesaplaması

1. Gün -1: Tam Ham's F12 besin karışımıyla 6 kuyruklu bir plakanın her kuyuğunda 2 × 10-5 olarak tohum SUM159PT Taxol-dirençli hücreler yerleştirilin.
2. 0. Gün: Ham F12 besin karışımında Protamin sülfat (PS) içeren 8 μg/mL oranında virüsün dört seri seyreltmesi gerçekleştirildi. (Konsantre virüsler için, 1 μL ile başlayın ve her seyreltmede 1 > ^10-1 > ^10-2 > ^10-3 olarak on kat seyreltirin. Konsantre olmayan virüsler için hacimleri buna göre ayarlayın (örneğin, 100 μL > 10 μL > 1 μL > 0,1 μL).
   1. Dört kuyuya 1 mL virüs içeren ortam verin. Bir kuyu puromisin seçilimi kontrolü olarak, diğeri ise tedavi edilmemiş kontrol olarak bırakın.
3. 1. Gün: Viral medyayı enfeksiyondan 16 saat sonra 2 ml taze ilaç ile değiştirin.
4. 2. Gün: Her kuyunun hücre içeriğini, 3.2. adımda belirlenen konsantrasyonlarda puromisin + verapamil içeren Ham's F12 besin karışımıyla 100 mm hücre kültürü kabına aktarın. Seçilmemiş hücreler aşırı birleşmişse, tanımlanmış bir kesri tohumlayın (örneğin, 1/2) ve bu son hesaplamalar yapılırken dikkate alınacaktır.
   NOT: Gerekirse kontrol plakasındaki tüm hücreler ölene kadar taze puromisin + verapamil ile gerekli şekilde ortamı yenileyin.
5. 4–5. Gün: Kontrol plakasındaki hücreler öldüğünde, saymak için yeterli hücreye sahip plakaları belirler. Hücreleri tripsine edin, sayın ve toplam hücre sayısını belirleyin.
6. Canlı hücreler saydıktan sonra, transdüksiyon verimliliği ve Enfeksiyonun Çokluğu (MOI) aşağıdaki şekilde hesaplayın ( Ek Tablo 2'yi şablon olarak kullanın):
   1. Aşağıdaki formülü kullanarak transdüksiyon oranını (enfekte hücrelerin oranı) hesaplayın
      
      
      N_Seçilmiş: Enfekte kuyularda puromisin seçildikten sonra toplam hücre sayısı
      N_Kontrol: Aktarılmamış, seçilmemiş kontrol kuyusundaki toplam hücre sayısı
      p: Transdüksiyon hızı (enfekte hücrelerin oranı).
      NOT: Eğer işlenmemiş kontrol hücrelerinin sadece bir kısmı tohumlanmışsa, N_Kontrol hesaplanırken bunu göz önünde bulundurun
   2. Yatırım Hattı Hesaplayın. Lentiviral transdüksiyon sırasında, enfeksiyon olayları Poisson dağılımı takip eder. Bu nedenle, en az bir virüsle enfekte olan hücrelerin oranı şu şekilde tanımlanır:
      p =1- e ^-MOI
      Böylece, MOI'yi şu şekilde hesaplayın:
      MOI = - ln(1-p)
   3. Enfekte hücre sayısına göre lentiviral titri (enfeksîyonel partikül/mililitre, IP/mL) hesaplayın:
      Titer (IP/mL) = (MOI x N_başlıyor)/ Virüs hacmi
      N_başlangıç: enfeksiyon için tohumlanmış hücre sayısı
      Virüs hacmi: kuyuya eklenen virüs hacmi (ml cinsinden)
      NOT: Her enfeksiyon için lentiviral titre ayrı ayrı hesaplayın ve orantılı virüs miktarı ve titre değerlerini gösteren kuyunun ortalamasını alarak nihai titre belirlenin. Doygunluk veya orantılı ölçeklendirmeden sapma gösteren kuyular titer hesaplamalarından hariç tutulmalıdır.

5. Cas9 ile eksprese eden stabil hücre hattının oluşturulması ve/veya doğrulanması

NOT: Bu adım LentiGuide_EPIKOL kullanılırken gereklidir. Eğer doğrulanmış bir Cas9-kararlı çizgi zaten mevcutsa veya LentiCRISPR_v2_EPIKOL kullanılıyorsa, doğrudan Bölüm 6'ya geçin.

1. Bölüm 2'de tanımlandığı gibi LentiCas9_blast vektörünü kullanarak Cas9 lentivirüsü üretin.
2. Ertesi gün hücreleri enfekte et, MOI 10 hedeflendi. Virüs miktarını, bölüm 4'teki amaçlanan MOI'ye göre hesaplayın, hesaplanan virüs hacmi miktarını kullanın ve doğrudan 8 μg/mL Protamin sülfat (PS) içeren kültür ortamı içeren plakadaki hücrelere verin.
3. Enfeksiyondan 16 saat sonra viral ortamı taze ortamla değiştirin
4. Ertesi gün, hücrelere önceden belirlenmiş blastisidin konsantrasyonunu içeren kültür ortamı vererek uygulanır (bölüm 3'te açıklandığı hücre canlılığı testi ile hücre hattı başına nihai konsantrasyon) ve enfekte olmayan hücreler (genellikle 6–7 gün boyunca) tamamlanır.
   NOT: Cas9 eksprese eden hücreler taramadan önce uzun süre kültürlenirse, Cas9 negatif hücreleri elemek için blastisidin seçimi tekrarlanın.
5. Cas9 doğrulaması (önerilir): Cas9 aktivitesini temel genleri hedefleyen kontrol sgRNA'ları (sgRNA dizileri EPIKOL kütüphanesinde mevcuttur; Ek Tablo 3'e bakınız) veya yeşil floresan protein (GFP) gibi raporlayıcı sistemlerle doğrulanarak nakatlanma etkinliği ve kinetik değerlendirin. Detaylı doğrulama yöntemleri önceki bir^{çalışmada bulunabilir 19}.

6. Epigenom genelinde CRISPR knockout lentiviral kütüphanesi enfeksiyonu ve taraması

NOT: Doğru genotip-fenotip eşlemesi sağlamak için, havuzlu CRISPR ekranları düşük MOI enfeksiyonu ve yeterli kütüphane kapsamı (genellikle 500×–1000) gerektirir; bu, deneysel katlık ve hücre hattı davranışına bağlı olarak geçerlidir. Kütüphane tasarımı ve deneysel kurulum dahil olmak üzere genom çapında havuzlu CRISPR tarama iş akışlarının genel ilkeleri için daha önce yayımlanmış^{protokoller 21,22'ye} bakınız. EPIKOL için, ekran boyunca >500x kapsama koruması şiddetle tavsiye edilir; çünkü bu eşiğin altına düşmek, özellikle ilaç tedavi kolunda stokastik sgRNA kesintisi riskini artırır. EPIKOL transdüksiyonunun düşük MOI enfeksiyonu gerçekleştirebilmesi için kütüphane karmaşıklığını bozmadan gerçekleştirmesi için gereken başlangıç hücre sayısı, transdüksiyon verimliliği ve viral hacmi belirlemek için aşağıdaki hesaplamalar gereklidir.

1. Gün -1: Aşağıda hesaplanan toplam hücre sayısını, her plaka başına uygun sayıda hücre ile 100 mm veya 150 mm hücre kültürü kablarına tohumlayın.
   1. İstenilen kütüphane kapsamına ulaşmak için başarıyla enfekte edilen hücre sayısını hesaplayın ( Ek Tablo 2'yi şablon olarak kullanın):
      N_enfekte = (sgRNA sayısı) × (hedef kapsaması)
   2. Düşük MOI (0.3–0.4) enfeksiyonu durumunda enfekte olmayan hücrelerin oranını telafi etmek için replikasyon başına başlangıç hücre sayısını hesaplayın:
      N_başlangıç = N_enfekte/p
      burada p, Poisson dağılımına göre belirlenen transdüksiyon hızıdır (enfekte hücrelerin fraksiyonu).
      NOT: Bu ayarlama, düşük MOI enfeksiyonu sırasında havuzda yeterli sayıda tek sgRNA enfekte hücrenin bulunmasını ve istenen kütüphane kapsamına ulaşmasını sağlar.
2. 0. Gün - Transdüksiyon
   1. Bir çoğaltma başına gerekli viral hacmi hesaplayın
      Gerekli viral hacmi = (N_başlangıç × MOI) / (Viral Titer (önceden belirlenmiş ip/mL))
      NOT: Hedef MOI aralığında transdüksiyon verimliliği yaklaşık olarak karşılık gelir
      Seçilmeden önce %26–%33 puromisin dirençli hücreler.
   2. Hücreleri, 8 μg/mL Protamin sülfat (PS) içeren tam kültür ortamında hesaplanan viral hacmle enfekte edin. Enfeksiyon sırasında virüs-hücre temasını artırmak için ortam hacmini azaltın (örneğin, 100 mm plaka için 10 mL yerine 8 mL)
   3. Her biyolojik çoğaltma için bağımsız enfeksiyon karışımları hazırlayın.
      NOT: En az iki biyolojik çoğaltma önerilmektedir; üç tercih edilir. Biyolojik kopyalar ayrı ayrı olarak aktarılmalı, seçilmeli ve korunmalıdır (medya değişiklikleri ve geçiş dahil) ve dizileme öncesi hiçbir aşamada bir arada toplanmamalıdır.
3. 1. Gün - Viral ortamı 16 saat sonra taze ortamla değiştirin ve %5_CO2 ile 37 °C'de kuluçka yapın
4. 2. Gün - Transdüksiyon edilen hücrelerin seçimi: Verapamil (adım 3.2'de belirlenen konsantrasyonlar) varlığında puromisin seçimini uygulayarak SUM159PT Taxol-dirençli hücrelerde sgRNA enfekte hücreleri zenginleştirin. Enfekte olmamış kontrol plakasındaki tüm hücreler yok olana kadar (genellikle ~3 gün boyunca) seçime devam edin.
5. 5. Gün - T₀ Referans numunesi: Puromisin + verapamil seçimi tamamlandıktan sonra hücreleri tripsinize edin ve her biyolojik replikasyondan transdüksiyon sırasında belirlenen kapsama seviyesine karşılık gelen başlangıç zaman noktası zaman sıfır (T₀) hücre pelleti toplayın. İlk kütüphane dağıtımı için bir referans olarak hizmet edeceğinden, seçim tamamlanır tamamlanmaz hücre peletlerini toplayın, herhangi bir hücre kaybı olmadan önce. Her zaman kapsamayı koruyacak yeterli hücre sayısı ekin.
   NOT: Puromisin + verapamil seçimi sonrası, hayatta kalan transdüksiyon hücre sayısı, hücre hattının ikiye katlanma süresine ve elde edilen transdüksiyon verimliliğine bağlı olarak değişecektir. Hayatta kalan popülasyon genellikle seçilim tamamlandığında ilk tohumlama yoğunluğuna ulaşır ve daha hızlı büyüyen hücre hatlarında bunu aşabilir. Hayatta kalan hücre sayısı izin verirse, birden fazla_T0 pelleti toplayın ve yedek örnekleri -80 °C'de dondurun. Ayrıca, EPIKOL enfekte hücreler örtü korunurken sıvı azotta kriyokonserve edilebilir. Bu yedek stoklar, beklenmedik bir ekran arızası durumunda veya gelecekteki alternatif deneysel yaklaşımlar için (örneğin, ek ilaç tedavilerinin test edilmesi) çözülebilir. Enfekte olmamış bir kontrol plakası kullanarak transdüksiyon verimliliğini kontrol ederek hedeflenen transdüksiyon verimliliğinin sağlandığını doğrulayın (bkz. bölüm 4). Gözlemlenen transdüksiyon verimliliği beklenenden yüksekse, transdüksiyonun düşük MOI ile yapılmasını sağlamak için deneyi yeniden başlatın; böylece hücre başına çoklu sgRNA entegrasyonu önlenir.
6. Ekran uygulaması: Cas9 aracılı genom düzenlemesinin tamamlanmasına izin verildikten sonra, 5. bölümde belirlenen süre boyunca hücreler tedavi gruplarına ayrılır.
   NOT: Bu genellikle transdüksiyondan sonra 7–9 gün sürer, çünkü maksimum nakavt verimliliği yaklaşık olarak transdüksiyon sonrası 7²³. günde elde edilir. Epigenetik hedefler için, ilaç seçimi başlamadan önce kromatin seviyesinde değişikliklere de izin veren 9 günlük pencere vardır.
   1. Hücreleri deneysel kollara ayırarak kapsamayı koruyun: biri DMSO alan temel bir durum olan kontrol kolu, diğeri ise Taxol alan tedavi koludur.
   2. 14–16 nüfus artışı için kültürleri korumak. Popülasyon katına çıkma seviyesi (PDL) şu şekilde hesaplanır:
      PDL = PDL_s + 3.322 (Log C_f – log C_i)
      PDL_s = başlangıç popülasyon ikiye katlama seviyesi
      C_i = tohumlanmış ilk hücre numarası
      C_f = büyüme döneminin sonunda toplam hücre sayısı
   3. Her geçişte, canlılık ve büyüme kinetiklerini izleyin ve yeterli hücre sayısını koruyarak darboğazlardan kaçının. Aşırı hücre ölümü durumunda tedavi yoğunluğunu ayarlayın.
      NOT: Her geçişte, haftalık veya ekran sırasında belirli PDL'lerde yedek hücre pelletleri toplamayı hedefleyin. Bu yedek örnekler, dizileme için alternatif zaman noktaları veya genomik DNA çıkarma süreci için optimizasyon örnekleri olarak hizmet edebilir. Beklenmedik hücre kaybını önlemek için hücreleri periyodik olarak kriyopreserve yapın.
7. T_son örnekleme: İstenilen PDL'ye ulaştığınızda, her çoğaltma ve koşul için kütüphane kapsamını koruyarak son zaman noktası pelletlerini (T_final) toplayın. Pelletleri -80 °C'de saklayıp aşağı akış gDNA ekstraksiyonuna kadar.
   NOT: Kültür süresi koşullar arasında farklı olsa bile, kollar arasında karşılaştırılabilir PDL'lerde ekranı sonlandırmayı hedefleyin.

7. Genomik DNA çıkarımı

1. Genomik DNA (gDNA) çıkarmak, doğrulanmış bir yöntemle (örneğin, MN NucleoSpin Tissue Kit) ve büyük, biriktirilmiş hücre pelletlerinden liz verimliliğini artırmak için küçük protokol ayarlamaları yapılabilir.
   1. Büyük pelet boyutu nedeniyle hücre protokolü yerine doku protokolünü takip edin. Verimli lizisi sağlamak için reaktif hacmlerini artırmayı ve gerekirse hücre pelleti başına birden fazla spin sütunu kullanmayı düşünün (kolon başına 5 × 10-6 hücreyi aşmayın).
      NOT: Lizisden önce, peletin minimum miktarda PBS (~50 μL) ile yeniden süzülmesi lizis verimliliğini artırabilir. Pelletin eksik lizisi spin kolonunu tıkayabilir ve DNA veriminin azalmasına neden olabilir.
   2. Yüksek verimli ve yüksek konsantrasyonlu elüsiyon önerilerini takip edin. Sütun başına önerilen hacmin yaklaşık 2/3'ü olan elülasyon tamponu hacminde gDNA'yı elüte edin, özellikle hücre pelletleri birden fazla sütuna bölündüğünde.
2. gDNA kalitesini ve niceliğini ölçmek (örneğin, Nanodrop).

8. Genomik DNA'dan EPIKOL dizileme kütüphanesi hazırlığı

1. GDNA PCR'ları sırasında plazmid kontaminasyonunu önlemek için tüm kütüphane PCR adımlarını gerçekleştirmek için özel bir PCR kabini kullanın; çünkü plazmid şablonları genomik DNA'dan daha verimli şekilde amplifikasyon sağlar ve sgRNA dağılımını bozabilir.
   1. İş alanını, mikropipetleri ve rafları sırasıyla %10 çamaşır suyu ve %70 etanol ile temizleyin.
   2. Çapraz kontaminasyon ve donma-erime döngüleri riskini azaltmak için tüm reaktifleri (özellikle primerleri) tek kullanımlık hacimlerde Aliquot edin.
   3. Reagentleri -20 °C'de sakla ve PCR kurulumu sırasında buzda tut.
2. Uygun kütüphane karmaşıklığını korumak için sgRNA başına 200×–500× kapsama hedefleyerek başlangıç gDNA giriş hacmini optimize edin. Örnek: EPIKOL kütüphanesi için, gDNA'lar tercihen 1000× kapsama ile toplanan hücre pelletlerinden çıkarılır ve gDNA amplifikasyonu için son kapsam 250× kullanılır.
   1. İstenilen kapsama için gerekli gDNA girdisini aşağıdaki gibi hesaplayın.
      gDNA miktarı = (sgRNA sayısı) × kapsam × (66pg DNA/çekirdek)
      Örnek: 8000 gRNA × (250× kapsam) × (6.6 pg DNA/çekirdek) = 13.2 μg gDNA/örnek amplifikasyon yapılmalıdır.
   2. Tablo 3, Tablo 4, Tablo 5 ve Tablo 6'daki harici ve iç PCR reaksiyon koşullarını kullanarak bir test PCR yapın; her reaksiyon başına artan miktarda gDNA (örneğin, 1 μg, 3 μg, 6 μg) kullanılarak bir tüp başına optimal gDNA miktarı belirlenir.
      NOT: Yetersiz gDNA girişi veya aşırı PCR döngüsü, amplifikasyon yanlılığına yol açabilir ve sgRNA kapsamını bozabilir.
   3. İç PCR ürünlerini analiz etmek için %2 agaroz jeli çalıştırın. Yaklaşık 350 bp'de parlak bir bant gözlemlendiğinden emin olun.
   4. Tüp başına optimal gDNA miktarına dayanarak, istenen kütüphane kapsamını sağlamak için örnek başına gereken toplam PCR reaksiyon sayısını belirleyin ve bireysel reaksiyon başına aşırı miktarda gDNA kaçının.
      NOT: Eğer 13,2 μg toplam gDNA gerekiyorsa ve reaksiyon başına 3,3 μg gDNA optimal amplifikasyon sağlıyorsa, 100 μL reaksiyon hacminde 3,3 μg gDNA içeren dört paralel PCR reaksiyonu hazırlayın. Bu durumda, aşırı şablon girişi nedeniyle PCR inhibisyonunu önlemek için gDNA hacmi reaksiyon hacminin %10'unu geçmemelidir.
3. gDNA şablonundan sgRNA kasetlerini güçlendirin (İlk/Harici PCR)
   1. Ek Tablo 2'de listelenen primerlerle stabil entegre lentiviral sgRNA kasetini içeren genomik bölgeleri amplifikasyon yapın. Adım 8.2'de belirlenen gDNA miktarıyla (bkz. Tablo 3) PCR reaksiyon koşullarını kullanarak PCR reaksiyonları gerçekleştirilir. Olası kontaminasyon olup olmadığını kontrol etmek için şablon DNA içermeyen bir PCR kontrol tüpü hazırlayın ve tüpleri her zaman buzda tutun.
   2. Son olarak DNA Polimeraz ekleyin, tık veya pipet ile iyi karıştırın ve PCR tüplerini termal döngüye koymadan önce kısa bir süreliğine aşağı döndürün. Spesifik olmayan amplifikasyonu önlemek için sıcak başlatma yapın.
   3. Harici PCR tamamlandıktan sonra, tüm PCR reaksiyonlarını tek bir mikrosantrifüj tüpünde toplayın. Dış PCR sonrası PCR temizleme veya jel görselleştirmesi zorunlu değildir. İkinci (dahil) PCR'de doğrudan havuza alınmış PCR ürününü şablon olarak kullanın. PCR ürünlerini -20 °C'de sakla.

Reaktif	Reaksiyon başına hacim
dNTP (her biri 10 mM)	2 μL
Füzyon Polimeraz	1 μL
6' GC Buffer	20 μL
Ön primer (10 μM)	5 μL
Ters Astar (10 μM)	5 μL
gDNA	X μL
Nükleazsız su	100 μL'ye (67–X μL) kadar
Toplam	100 μL

Tablo 3: İlk/harici PCR için gerekli reaktifler.

Döngü numarası	Denature	Tavlama	Genişletme
1	95 °C, 3 dakika
2–19	95 °C, 25 saniye	65 °C, 20 saniye	72 °C 15 s
20			72 °C 3 dakika

Tablo 4: İlk/harici PCR için PCR koşulları.

4. İndeks barkodlaması (İkinci/İç PCR) ve jel çıkarımı yapın
   1. İkinci (iç) PCR'de, örnekleri barkodlamak için ters indeks primer kullanılır; bu nedenle, her örnek için farklı indeks primerleri kullanın.
      NOT: pLentiCrispr v2 omurgası kullanılarak oluşturulan kütüphaneler için, CT bazlarıyla biten, lenticrisprv2_rev(index X) olarak etiketlenmiş ters indeks primerleri kullanın ( bkz. Ek Tablo 2).
   2. pLentiGuide omurgasını kullanarak oluşturulan kütüphaneler için, GT tabanlarıyla biten ve Ek Tablo 2'de rev_index_X olarak etiketlenmiş indeksler kullanın.
   3. Dokuz kademeli primerin her birinden 2 μL (stok 100 μM) birleştirerek steril bir mikrosantrifüj tüpüne 162 μL nukleazsız su ekleyerek öne kademeli bir primer karışımı hazırlayın. Astar karışımının nihai konsantrasyonu 10 μM olacaktır.
   4. Havuzlanmış harici PCR ürünü giriş olarak kullanın ve Tablo 5 ve Tablo 6'daki talimatları kullanarak her örnek için iki paralel 100 μL dahili PCR reaksiyonu gerçekleştirin. Potansiyel kontaminasyonu izlemek için harici PCR'den (adım 7.3) alınan 'Şablon DNA Yok' kontrolünü kullanarak bir PCR kontrol reaksiyonu hazırla.
   5. Son olarak DNA Polimeraz ekleyin, tık veya pipet ile iyi karıştırın, PCR tüplerini kısa bir süreliğine döndürüp termal döngüye koyun. Spesifik olmayan amplifikasyonları önlemek için sıcak başlatma yapın.
   6. Hedef amplikonu ayırmak için %2 agaroz jelinde iç PCR reaksiyonlarını birleştirip çalıştırın.
      NOT: Şablonsuz PCR kontrollerinde hiçbir bant tespit edilmemelidir. LentiCrispr_V2 için 337 bp civarında ve LentiGuide kütüphaneleri için 357 bp civarında belirgin bir bant gözlemlenmelidir. Yaklaşık 500 bp'lik üst özgül olmayan bir bant da bulunabilir ve aşağı akış işlemesinden hariç tutulmalıdır.
   7. Bantları görselleştirmek için 12 μL (10 μL PCR ürünü + 2 μL yükleme boyası) dahili PCR ürünü yükleyin, geri kalan PCR ürünü ise jel çıkarımı için ayrılmış birleşik veya bitişik kuyruklara yüklenin. DNA geri kazanımını maksimize etmek için agaroz kalınlığını en aza indirin. Jel çıkarma sırasında UV kaynaklı DNA hasarını en aza indirmek için görselleştirme sırasında jel çıkarma yollarını aşırı maruz bırakmaktan kaçının.
   8. PCR ürünlerini, üreticinin talimatlarına uygun olarak belirli bir jel ekstraksiyon kiti (örneğin, NucleoSpin Gel ve PCR Clean-up) kullanarak agaroz jelden arındırın. DNA konsantrasyonunu spektrofotometre kullanarak ölçün. PCR ürünlerini -20 °C'de sakla.
      NOT: Doğru dizileme için jel ekstraksiyonundan sonra minimum >20 ng/μL konsantrasyon gereklidir. Üç paralel iç PCR reaksiyonuyla bile gerekli verim sağlanamazsa, yeni gDNA izole edin ve işlemi tekrarlayın.

Reaktif	Reaksiyon başına hacim
dNTP (her biri 10 mM)	2 μL
Füzyon Polimeraz	1 μL
6' GC Buffer	20 μL
İleri Stagger Mix astar (10 μM)	5 μL
Ters İndeksli Astar (10 μM)	5 μL
Dış PCR	5 μL
Nükleazsız su	62 μL
Toplam	100 μL

Tablo 5: İkinci/dahili PCR için gerekli reaktifler.

Döngü numarası	Denature	Tavlama	Genişletme
1	95 °C, 3 dakika
2–25	95 °C, 25 saniye	65 °C, 20 saniye	72 °C 15 s
26			72 °C 3 dakika

Tablo 6: İkinci/dahili PCR için PCR koşulları.

9. Sıralama

1. Ekranın başında tanımlanan kütüphane kapsamına göre gerekli haritalanmış okuma sayısını belirleyin. %60–%70 eşleme verimliliği varsayarsak, okuma kaybını telafi etmek için daha fazla toplam okuma talep edilir. EPIKOL kütüphanesinin 1000× kapsamı için ~8 milyon haritalanmış okuma gereklidir; bu da toplam 10–12 milyon okumaya karşılık gelir.
2. Dizileme öncesi Tapestation veya Bioanalyzer kullanarak dizileme kütüphanelerinin kalite kontrolünü gerçekleştirerek kütüphane büyüklüğünü ve bütünlüğünü doğrulayın.
3. Farklı örneklerden dizileme kütüphanelerini dizileme öncesi havuz yapar, çünkü indeks primerleriyle benzersiz şekilde barkodlanmıştır.
4. Okuma yapısını (R1/R2 yönelimi) ve demultiplex gereksinimlerini dizileme tesisiyle doğrulayın. 2× 150 bp eşleştirilmiş dizileme Illumina HiSeq, Novaseq veya eşdeğer bir Illumina uyumlu dizileme platformunda önerilmektedir. Dizileme çeşitliliğini artırmak için en az %5 PhiX artışı talep etmeyi düşünün.

10. EPIKOL için dizileme analizinin genel görünümü

1. MAGeCK analiz boru hattını kullanarak eşleştirilmiş uçlu FASTQ^{dosyalarını analiz edin 24}. Her biyolojik çoğaltmayı bireysel bir giriş dosyası olarak düzenleyin.
2. MAGeCK ile uyumlu olan EPIKOL'un sgRNA giriş dosyasını referans kütüphanesi olarak kullanın ( Ek Tablo 4'te sağlanmıştır) ve her replikasyon ve koşul için ham sayım dosyaları oluşturmak için bireysel FASTQ dosyalarından sgRNA okumalarını niceliklendirmek için sayım fonksiyonunu uygulayın.
   1. Her sayım dosyasını normalleştirerek Milyonda Okuma (RPM) normalizasyonu kullanarak her örnekin kalitesini ve dağılımını normalleştirerek normalize edilmiş sgRNA sayı^{grafiklerini görselleştirin 14}.
3. Varsayılan ayarlarla medyan normalizasyon kullanarak sayıları tek bir dosyaya birleştirmek için ikinci bir -count fonksiyonu uygulanır.
4. Gen düzeyindeki değişiklikleri birleştirilmiş ham sayı dosyaları kullanarak tanımlamak için -test fonksiyonunu çalıştırın. Ekran performansını değerlendirmek için, T_final örneklerini_T0 örnekleriyle karşılaştırın ve hedefleme dışı kontrol ile temel gen hedefleyici sgRNA'ların dağılımını kontrol edin.
   NOT: Her bir ekran kolunda pozitif kontrol genlerinin tükenmesinin değerlendirilmesi kritik öneme sahiptir ve ekran performansını değerlendirmek önemlidir. İlaçla tedavi edilen ekran kolunda replikatlar arasında biyolojik değişkenlik görülmesi beklenmektedir; çünkü ilaç maruziyeti hücresel yanıtta stokastik farklılıklara yol açabilir. Bu değişkenlik, kemodirenç ekranlarına özgü bir yapıdır ve mutlaka düşük ekran kalitesini göstermez. Bu nedenle, hit-call sırasında en az üç biyolojik tekrar birlikte analiz edilmeli ve vuruşlar, 10 sgRNA'dan en az 6'sına sahip genler olarak belirlenmelidir.
5. İlaç kaynaklı sgRNA bolluklarında ve gen düzeyinde etkilerdeki değişiklikleri belirlemek için, DMSO grubunu kontrol olarak kullanarak T final-Taxol ile işlenmiş örnekleri T_final-DMSO ile karşılaştırın.
6. Tedavi grubundaki tükenmiş genleri belirlemek ve Taxol-dirençli hücrelerin uygunluğuna veya direncine katkıda bulunan genleri ortaya çıkarmak için FDR 0.05 < yanlış keşif oranı (FDR) kesme sınırı uygulanır.

Sonuçlar

TNBC'de kemodirenç epigenetik düzenleyicilerini incelemek için, SUM159PT hücre hattını kullanan genel protokol Şekil 1'de gösterilmiştir. İlk olarak, SUM159PT hücrelerdeki IC₁₀ ve IC₅₀ Taxol değerleri, hücrelerin artan Taxol konsantrasyonlarıyla işlenmesiyle belirlendi (Şekil 2A). Taxol-dirençli SUM159PT hücreleri oluşturmak için adımlı doz yükseltme yöntemi kullanıldı. Birkaç ay sonra, IC50 değerlerindeki bir değişim, bu protokol kullanılarak Taxol maruziyeti olmadan paralel geçiş yapan kontrol hücreleriyle karşılaştırıldığında dirençli bir fenotipin başarılı şekilde oluşturulduğunu göstermektedir (Şekil 2B).

Şekil 1: Taxol-dirençli SUM159PT hücrelerinde EPIKOL ekranının şeması. Üretilen Taxol-dirençli SUM159PT hücrelerinde EPIKOL taramasının genel iş akışı. Figür BioRender.com Lütfen bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayın.

Dirençli hücreler kurulduktan sonra, fenotipik ve moleküler değişikliklerini karakterize etmek için birkaç deney yapıldı. Taxol tedavisi altında dirençli hücrelerin proliferasyon kapasitesi, ebeveyn hücrelerine kıyasla koloni oluşumu testi ile değerlendirildi. Şekil 2C,D'de görüldüğü üzere, dirençli hücreler Taxol tedavisi altında çoğalma kapasitesini korurken, ebeveyn hücreler hayatta kalamaz. Bu test, dirençli hücre karakterizasyonunda önemli adımlardan biridir ve ilaç tedavisi altında çoğalma kapasitesinin ebeveyn ve dirençli hücreler arasında nasıl değerlendirilebileceğini gösterir.

Dirençli hücre karakterizasyonunun bir parçası olarak, kemodirençle ilişkili transkriptomik değişiklikleri analiz etmek için ebeveyn ve dirençli hücrelerde RNA dizileme yapıldı (Şekil 2E). Dirençli hücrelerde en çok regülasyona uğrayan genlerden biri ABCB1 idi ve ardından ABCB4 ve ABCA5 gibi birkaç başka ABC taşıyıcısı geldi. ABCB1 ekspresyonunun yukarı regülasyonu, niceliksel polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) ile doğrulanmış ve bu, aday gen ekspresyonu değişikliklerinin qPCR ile nasıl doğrulanabileceğini göstermektedir (Şekil 2F).

Şekil 2: Dirençli hücrelerin üretimi ve karakterizasyonu. (A) Doz yükseltme yöntemiyle Taxol-dirençli SUM159PT hücrelerinin oluşumunu gösteren şematik. (B) Ebeveyn ve üretilen dirençli hücrelerin IC50 değerleri arasındaki farkı gösteren doz yanıt eğrisi. Ebeveyn IC50 = 6 nM ve Taxol-dirençli IC50 = 355,4 nM. (C) Taxol'un huzurunda koloni oluşumu testi. (D) Koloni alanlarının nicelendirilmesi. (C) Tukey'nin post hoc testi ile iki yönlü varyans analizi (ANOVA) Prism 8 (GraphPad Yazılımı) kullanılarak uygulandı. Anlamlılık seviyeleri *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001 olarak belirlendi. (E) Volkan grafikleri, Taxol-Res hücrelerinde ebeveyn hücrelerine kıyasla farklı şekilde eksprese edilen genleri gösteriyor; LFC>2 ve p<0.001 kesim noktası var. (F) ebeveyn ve Taxol-Res hücrelerinde ABCB1 mRNA ekspresyonunun qPCR doğrulanması. P değerleri, kontrol grubuna kıyasla iki kuyruklu öğrencinin t-testi ile belirlenmiştir; **P < 0.01. Panel A BioRender.com ile oluşturuldu. Panel E şekili, Yedier-Bayram ve ^ark.17'nin izniyle değiştirilmiştir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Taxol-dirençli hücrelerde ABCB1 ve diğer ABC taşıyıcılarının aşırı ekspresyonunun gösterilmesinin ve ABCB1'in geniş substrat spektrumunun değerlendirilmesinin ardından MDR fenotipinin varlığı değerlendirildi. Bu amaçla, Taxol-dirençli hücreler, ABCB1 taşıyıcısının bilinen substratları olan ve farklı etki mekanizmalarına sahip birden fazla ilaçla tedavi edilmiş ve ilaç hassasiyetleri değerlendirilmiş (Şekil 3A,B). Gözlemlenen ABC taşıyıcı ekspresyon profiline uygun olarak, Taxol-dirençli hücreler ayrıca Doksorubisin ve Vinkristine karşı direnç gösterdi; bu da MDR profilinin varlığını doğruladı ve çoklu ilaç direnç fenotipinin işlevsel olarak nasıl değerlendirilebileceğini gösterdi.

MDR fenotipi, kütüphanenin transdüksiyon hücrelerini zenginleştirmek için puromisin seçimi gerektirdiği CRISPR tabanlı tarama yaklaşımı EPIKOL için bir zorluktur. Puromisin, ABCB1 aracılı ilaç akışıyla hücrelerden pompalanabildiğinden, puromisin seçimi dirençli hücrelerde verimli olmayabilir (Şekil 3C). Bu nedenle, transdüksiyon yapılmamış hücreler seçilime rağmen hayatta kalabilir ve bu da ekran sonuçlarını karıştırır.

Bu sınırlamayı gidermek için, MDR profiline sahip kemodirençli hücrelerin seçim süreci EPIKOL ekranından önce optimize edilmiştir. Verapamil, birinci nesil ABCB1 inhibitörü, ABC taşıyıcı aracılı ilaç akışını engellemek için kullanıldı ve böylece kemoterapi ajanlarının veya puromisin hücre içi birikimine izin verdi (Şekil 3D). Verapamil tek başına hücre canlılığını etkilemese de, kemoterapî ajanlarla birleştiğinde ilaç hassasiyetini geri kazandırdı (Şekil 3E,F). Benzer şekilde, puromisin öldürme eğrileri ve toksik olmayan verapamil dozları birleştiğinde, ABCB1 inhibitionunun puromisin hassasiyetini geri getirdiğini göstermiştir (Şekil 3G,H). Bu, seçilimden sağ çıkan hücrelerin, ABCB1 kaynaklı ilaç akışı nedeniyle seçilimden kaçan hücreler değil, başarılı şekilde transdüksiyon edilen hücreler olmasını sağlar. Kemodirençli hücrelerde etkili bir seçim iş akışı oluşturmak, güvenilir EPIKOL ekran sonuçları için çok önemlidir.

Şekil 3: Çok ilaç dirençli fenotipi ve verapamil'in dirençli hücreler üzerindeki etkisi. Ebeveyn ve üretilen dirençli hücrelerin IC50 değerleri arasındaki farkı gösteren doz yanıt eğrileri; (A) Doksorubisin, (B) Vinkristin, (C) Puromycin. (D) Verapamil ile ve olmadan Taxol-dirençli SUM159PT hücrelerinin seçimini gösteren şematik. Figür BioRender.com ile oluşturulmuştur. (E) Taxol-Res hücreleriyle hücre canlılık testi, Taxol ile optimal verapamil konsantrasyonu belirlenir. (F) Verapamil, Taxol-dirençli hücreleri Taxol'e karşı yeniden duyarsızlaştırır. (G) Verapamil, Ebeveyn hücrelerinin puromisine karşı yanıtını değiştirmez. (H) Verapamil, Taxol-Res hücrelerinde puromisin hassasiyetini geri getirir. A, B ve F panelleri Yedier-Bayram ve ^ark.17'nin izniyle yeniden kullanılmıştır. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

TNBC'de kemodirenç regülatörlerini bulmak için, Şekil 4A'da gösterildiği gibi Taxol-dirençli SUM159PT hücreleriyle EPIKOL ekranı yapıldı. Dirençli hücreler ebeveyn^{hücrelerine göre daha yavaş büyüdüğünden 17}, hem Taxol hem de DMSO ile tedavi edilen gruplarda popülasyon ikiye çıkma seviyeleri ekran boyunca izlenerek 16 popülasyon çiftine çıkma süresi belirlendi (Şekil 4B). Buna göre, DMSO ile tedavi edilen grup için EPIKOL taraması yaklaşık 35. günde tamamlandı, Taxol ile tedavi edilen grup ise aynı popülasyon katına çıkmak için ek 15 gün kültürlendi.

Dizileme sonrasında, MAGeCK analiz hattı, aynı geni hedefleyen sgRNA'ların etkisini birleştirerek nakavt^24'te gen seviyesindeki değişiklikleri ortaya çıkarmak için kullanıldı. EPIKOL kütüphanesi, temel genleri hedefleyen sgRNA'ları pozitif kontrol olarak içeriyor; ilk kalite kontrol adımı bu sgRNA'ların beklendiği gibi tükenip tükenmediğini değerlendirmekti. Şelale grafikleri, temel genlerin Log2 katlanma değişimlerini farklı karşılaştırmalar üzerinden gösterir (Şekil 4C–E). DMSO veya Taxol ile tedavi edilen koşullardan alınan nihai zaman noktası örnekleri başlangıç zaman noktası ile karşılaştırıldığında, neredeyse tüm temel genler nakavt edildiğinde tükenmiş, bu da etkili ekran performansını gösterir (Şekil 4C,D). Ancak, bu azalma beklendiği gibi iki son nokta örnek (DMSO ile tedavi edilmiş ve Taxol ile tedavi edilmiş) birbirleriyle karşılaştırıldığında net bir şekilde gözlemlenmemiştir; çünkü her iki durumda da hücre hayatta kalması için gerekli genler gereklidir (Şekil 4E).

Ekran sonuçlarının alternatif bir görselleştirmesi ise volkan grafikidir; burada Log2 katlama değişiklikleri ve istatistiksel anlamlılık (p-değeri veya FDR değerleri) gösterilir. Taxol-dirençli hücrelerde yapılan EPIKOL taramasında, birden fazla pozitif kontrol geninin önemli ölçüde azalmış olduğu tespit edilmiştir; bu da pozitif kontrol genlerini hedefleyen sgRNA'ların azalması, başarılı bir ekranın tipik kalite kontrolünü gösterdiğinden bu da ekranın güvenilirliğini daha da desteklemiştir (Şekil 4F). Temel gen kontrollerine ek olarak, EPIKOL kütüphanesi birkaç ABC taşıyıcı genini hedefleyen bağlam özgül pozitif kontrol sgRNA'larını içerir. Beklendiği gibi, farklı gruplarda normalize edilmiş ABCB1 sgRNA sayıları, özellikle Taxol ile işlenmiş grupta ABCB1 hedefleyen sgRNA'ların önemli azalmasını vurguladı (Şekil 4G). Genel olarak, bu durum sgRNA seviyesindeki değişikliklerin ilaç yanıtıyla ilişkili aday genleri belirlemek için nasıl yorumlanabileceğini gösterir.

Şekil 4: EPIKOL ekranı Taxol-dirençli hücreler ve örnek grafikler elde eder. (A) EPIKOL ekran protokolünün şeması. (B) Taxol-Res hücrelerinin Popülasyon Ikiye Çıkarma Seviyesi (PDL). (K–E) Taxol-Res hücrelerinde EPIKOL taramasının sonuçlarını gösteren şelale grafikleri, temel genleri vurgulayan Taxol-Res hücreleri, DMSO ile işlenmiş grubun panel C'deki Başlangıç zaman noktasına karşılaştırılması, Taxol ile işlenmiş grubun panel D'deki Başlangıç zaman noktasına kıyasla karşılaştırılması, Taxol ile işlenmiş grubun DMSO ile tedavi edilen grup ile E panelindeki karşılaştırılması. (F) Volkan grafiki, Taxol ile işlenmiş örneklerdeki genlerin Log2Fold değişimlerini Başlangıç zaman noktasına göre gösteriyor. p<0.05 genleri renklendirildi ve etiketlendi. Bu rakam, önceki bir yayından^{değiştirilmiştir 17}. (G) EPIKOL'dan 10 farklı ABCB1 sgRNA grafiğinin milyon/milyon (rpm) okuma sayıları. Panel A BioRender.com ile oluşturuldu. Panel E, Yedier-Bayram ve ^ark.17'nin izniyle yeniden kullanılmıştır. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Tablo 1: Sorun giderme tablosu.Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Tablo 2: Viral Titer ve MOI hesaplaması.Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Tablo 3: EPIKOL kütüphanesinin sgRNA listesi.Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Tablo 4: EPIKOL dizileme kütüphane hazırlanmasında kullanılan primerler. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

CRISPR-Cas9 tabanlı havuzlu tarama yaklaşımları farklı hücresel bağlamlarda iyi kök salmıştır. Ancak, kemodirençli hücrelerde tarama belirgin zorluklar sunar ve ek optimizasyon gerektirir. Kemodirençli hücreler, kemodirençli tümörlerin açıklıklarını incelemek için değerli modeller olarak hizmet ettiğinden, kemodirençli genetik veya epigenetik düzenleyicileri güvenilir şekilde belirlemek için tarama stratejilerinde bu sınırlamaların ele alınması önemlidir.

Kemodirençli hücre hatlarının üretimi zahmetli olabilir ve kullanılan kemoterapötik ajana büyük ölçüde bağlıdır. Hücreler bazı ilaçlara kolayca uyum sağlayabilirken, diğerlerine karşı oldukça hassas^{olabilirler 25}. Bu nedenle, dirençli hücre hattı oluşturma protokolünden önce hücre hattı spesifik IC50 değerlerinin belirlenmesi önemlidir. Hücrelerin IC50 seviyesinde ilaç maruziyetine birkaç geçiş boyunca tolere edemediği durumlarda, daha düşük bir ilaç konsantrasyonu ile başlamak mümkündür (örneğin, IC10-20) (bkz. Protokol bölüm 1)¹⁷). Direnç kazanımı stokastik bir olay olduğundan, dirençli hücreler elde etme olasılığını artırmak için aynı anda birkaç hücre kuyusu/levhası işlenebilir. Elde edilen ilaç dirençli hücre popülasyonun, doz yükseltme işlemi sırasında transkripsiyonel ve fenotipik değişiklikleri saf halleriyle karşılaştırmak için kapsamlı bir şekilde karakterize edilmesi çok önemlidir. RNA-seq gibi küresel profilleme yaklaşımları, ebeveyn hattına göre farklı şekilde ifade edilen genleri tanımlamak için kullanılabilir. Fonksiyonel olarak, edinilmiş ilaç direnci hücre canlılığı ve çoğalma testleriyle doğrulanarak dirençli hücrelerin ebeveyn hücrelerine sitotoksik ilaç tedavi koşullarında hayatta kaldığını göstermelidir. Ayrıca, proliferatif kapasite ve büyüme hızlarındaki potansiyel değişiklikler, ilgili PDL'leri hesaplamak için ebeveyn hücre hattına kıyasla ölçülmelidir. Edinilmiş Taxol direncinin en azından kısmen ABC aracılı ilaç akışı aracılığı yaptığı bilindiğinden, anahtar ABC taşıyıcılarının (örneğin ABCB1) ifadesi mRNA ve protein seviyelerinde qPCR ve Western blotting kullanılarak değerlendirilmeli ve transkriptomik verilerle tamamlanabilir. ABC taşıyıcı ekspresyon profiline dayanarak, MDR fenotipinin varlığı dikkate alınmalı ve diğer kemoterapi ajanlarına karşı direnç değerlendirilmelidir. Önceki çalışmamızda, Taxol-dirençli hücre hatlarını karakterize etmiş ve ABCB1'i en çok regülasyona uğramış genlerden biri olarak tanımlamıştık; ayrıca ABCB1 aracılı çoklu ilaç direncinin puromisin seçiminde başarısızlığa yol açabileceğini^{düşündük.} Bu nedenle, dirençli hücre üretiminden sonra, ABC taşıyıcılarının ve MDR fenotipinin ekspresyonu herhangi bir transfeksiyon işleminden önce değerlendirilmelidir.

Doz yükseltme yöntemi, yüksek dozlu ilaç maruziyet protokollerine göre avantajlar sunar; hücreler ilaç dozunu artırmadan önce her adımda kriyokonserve yapılabilir; bu da esneklik ve kültür kaybına karşı koruma sağlar. Ayrıca, kademeli doz yükseltmesi zamanla direnç fenotiplerinin edinilmesine olanak tanır ve adaptif evrimi mümkün kılar; akut yüksek dozlu tedavinin aksine, bu tedavi, önceden var olan dirençli alt popülasyonların seçilmesiyle sonuçlanır. Adım adım ilerlemesi, araştırmacıların seçimi durdurmak için istenen direnç seviyesini kasıtlı olarak seçmelerini ve ortaya çıkan fenotipin özelliklerini değerlendirmelerini sağlar. Ayrıca, doz yükseltmenin ara adımları, kazanılmış direnç mekanizmalarını zaman akışı şeklinde incelemek için kullanılabilir. Temel biyolojik soruya göre, daha dirençli hücrelerde erken adaptif mekanizmaların daha düşük direnç seviyelerine sahip veya kararlı ve tam olarak yerleşik direnç fenotiplerini incelemek için farklı dirençli seviyeler elde edilebilir. Ayrıca, klinik olarak önemli direnç eşikleri ilaç, hücre hattı ve içsel proliferasyon oranına bağlı olarak önemli ölçüde değişir; bu nedenle, doz yükseltme zamanlaması buna göre değişebilir (bizim durumumuzda Taxol-dirençli hücrelerin üretimi yaklaşık 6 ay sürdü). Bu gerekçeyle tutarlı olarak, önceki çalışmamızda SUM159PT hücrelerle iki farklı direnç seviyesi belirledik ve onların ayırt edici ve ortak özelliklerini^{karşılaştırdık 17}. Bu nedenle, araştırmacıların ilgi duyulan ilacın hedef IC50 aralığını klinik ve biyolojik öneme göre tanımlamalarını öneriyoruz.

İlaç basıncının çekilmesinin kemodirenç kaybına yol açabileceği iyi bilinmektedir; çünkü hücreler epigenomlarını ve^{transkriptom 25'i} yeniden kablolayabilir. Bu nedenle, direnç fenotipinin birkaç ay boyunca stabilitesinin değerlendirilmesi önerilir. Hücreler ilaç çekildiğinde hassas bir duruma geri dönme eğiliminde, dirençli hücreler, direnç fenotiplerini korumak için genellikle direnç üretimi sırasında kullanılan son ilaç konsantrasyonuna karşılık gelen domat dozunun varlığında kültürlenebilir. In vitro kemodirençli hücre hattı modelleri pratik, tekrarlanabilir ve edinilmiş kemodirenç incelemelerinde yaygın olarak kullanılsa da, hasta tümörlerinde gözlemlenen fenotipik heterojenliği tam olarak yansıtmayabilir ve tümör mikro ortamı, bağışıklık etkileşimleri ve mekânsal heterojenlikten^{yoksun 3,4,25}. Ayrıca, direnç üretimi sırasında uzun süreli geçiş, hasta örneklerinde gözlemlenenlerden genetik ve epigenetik değişikliklere yol açabilir ve tespit edilen isabetlerin translasyonel önemini sınırlayabilir. Bu nedenle, bu protokolle tanımlanan aday genler ve mekanizmalar, ortak kültür modelleri, hasta kaynaklı organoidler veya in vivo çalışmalar gibi daha klinik açıdan ilgili deneysel sistemlerde daha fazla doğrulanmalıdır. EPIKOL, bu modellerde tamamlayıcı ekranlar yapılacaksa, odaklanmış yapısıyla avantaj sağlar; çünkü elde edilebilecek maksimum hücre sayısı doğası gereği sınırlıdır.

Kemodirençli hücreler genellikle ebeveynlerine göre daha yavaş büyür; bu da kütüphane kapsamını sürdürmek için büyük hücre popülasyonları gerektiren genom çapındaki ekranlar için pratik bir zorluk oluşturabilir. EPIKOL gibi odaklı kütüphaneler, daha az başlangıç materyaliyle bir ekran yapma avantajı sunarken, gen başına sgRNA derinliğini artırır, böylece tanımlanmış hedef alanında hassasiyet ve tekrarlanabilirliği artırır. Ancak, tasarım gereği EPIKOL sadece epigenetik direnç mekanizmalarını yakalar ve kemodirenç için epigenetik olmayan katkı sağlayanları kapsamaz. Bu nedenle kütüphane seçimi önceki deneyler ve özel biyolojik soruya dayanarak yönlendirilmelidir. Bu kütüphanelerin kullanıcıları, odaklı kütüphaların sınırlamalarının farkında olmalı ve sonuçları kütüphane kapsamında yorumlamalı.

Kemodirençli modellerin CRISPR taramasında önemli bir engel, ABC taşıyıcı^{upreguasyonu 9,10} tarafından yönlendirilen MDR fenotipinin ortaya çıkmasıdır. Farklı ABC taşıyıcıları, farklı substratların akışını aracılık eder. İlaç dirençli bir hücre hattı oluşturulduktan sonra, dirençin diğer kemoterapötik ajanlara da uzanıp uzanmadığını değerlendirmek önemlidir. Puromisin direnci esas olarak ABCB1 aşırı ekspresyonundan kaynaklanır ve bu, havuzlu CRISPR tarama yaklaşımlarının seçim sürecini etkiler; çünkü bu kütüphanelerin çoğu, transdüksiyon hücrelerinin zenginleştirilmesi için puromicin seçim kasetleri taşır. Burada, birinci nesil ABCB1 inhibitörü olan verapamil kullanarak, puromisin hücre içi birikimi kolaylaştırmak ve ABCB1 aracılı ilaç akışı nedeniyle seçilmemiş dirençli hücreleri seçici olarak yok ettik. Verapamil ABCB1'e geri dönüş biçimde bağlandığı için, verapamil alındıktan sonra ABCB1 fonksiyonu saatler içinde yeniden sağlanır. Bu nedenle, verapamil sonraki ilaç tedavi aşamasında dirençli hücrelere karşı ek bir savunmasızlık sağlamaz. Ancak, verapamil'in birkaç sınırlaması kabul edilmelidir. Verapamil, kalsiyum kanalları ve diğer taşıyıcıların inhibitörü olduğundan, ABCB1^{inhibitionu 10'un} ötesinde hücresel fizyolojiyi etkileyebilir. Ayrıca, etkili verapamil konsantrasyonu, hücre hatları ve MDR modelleri arasında ABCB1 ekspresyon seviyesine ve diğer taşıyıcıların aktivitesine bağlı olarak değişir. Bu nedenle, her hücre hattı için verapamil konsantrasyonu optimize edilmeli ve hedef dışı etkiler endişe doğurursa, ABCB1'e daha özgü yeni nesil ABCB1 inhibitörü düşünülebilir. Bir diğer kritik adım olarak, viral titering ebeveyn muadilleri yerine dirençli hücrenin kendisi üzerinde yapılmalıdır; çünkü dirençli hücreler için enfeksiyon ve seçilebilirlik genellikle farklılık gösterir.

Bir diğer önemli nokta ise ekranın uygun süresini belirlemektir; çünkü kemodirençli hücreler genellikle eşleşen ebeveyn muadillerinden daha yavaş^{büyürler 26}. Bu farkı hesaba katlamak için, kontrol ve tedavi gruplarının istenen PDL eşiğine ne zaman ulaştığını değerlendirmek için popülasyon ikiye katlama seviyesi hesaplamalarını (Protokol bölüm 6) kullandık. Bu nedenle taramalar farklı günlerde sonlandırılabilir, böylece popülasyon iki katına çıkabilir ve tedavi grubundaki sgRNA etkilerinin daha güvenli yorumlanmasını sağlar.

Kütüphane hazırlığı PCR'ları, aşağı akış isabetlerinin doğruluğu için oldukça önemlidir. Düşük gDNA girişi ve artan PCR döngüleriyle ortaya çıkan yanlılık, bazı sgRNA dizilerinin amplifikasyonuna yol açabilir ve yanlış pozitif zenginleşmelere veya azalmalara yol açabilir. Bunu azaltmak için, mümkün olan maksimum miktarda gDNA kullanılmasını, bu protokolün sunduğu PCR döngü sayılarına uymanızı ve dizilemeden önce havuza paralel reaksiyonlar yapılmasını öneriyoruz. Mümkünse, kütüphane kapsamı önerilen eşiklerin (>300× kapsama) altına düşmemelidir; böylece düşük kapsama nedeniyle düşük bolluklu sgRNA'ların stokastik olarak kesilmesinden ziyade, eksik sgRNA'ların güvenilir şekilde tespit edilmesini sağlar.

Dizileme sonrasında, MAGeCK analiz çerçevesini kullandık ve birkaç sonraki kalite kontrol analizi ile veri yorumlama^{adımlarını gerçekleştirdik 24}. İlk olarak, ana bileşen analizi (PCA) biyolojik replikatların dağılımı ve tekrarlanabilirliğini değerlendirmek için kullanıldı (veri gösterilmedi, MAGeCK çıktısı). PCA'da çoğaltma kümelenmesi her kol içinde beklenmektedir; Ancak, ilaç tedavisi gören kolda daha yüksek değişkenlik, kemodirenç ekranlarının yaygın bir özelliğidir; çünkü ilaç stokastik değişikliklere yol açabilir. Pozitif ve negatif kontroller her kolda beklendiği gibi davranırsa, bu değişkenlik gerçek-pozitif isabetlerin tanımlanmasını engellemez. Sonrasında, temel genleri hedefleyen sgRNA'ların beklendiği gibi tükenip tükenmediğini değerlendirmek için ilk ve son zaman noktalarında sgRNA sayılarının milyonda (RPM) normalizasyonu^{uygulandı 14}. Daha sonra, medyan normalizasyon kullanılarak sgRNA düzeyindeki etkiler toplandı ve böylece gen seviyesindeki^{kayıpların 24} tanımlanmasını sağladı. Gen düzeyinde tükenme puanları, en çok azalmış genlerden zenginleşenlere kadar sıralanan şelale grafikleri kullanılarak görselleştirildi. Uzun süreli ilaç maruziyetinden kaynaklanan kopya sayısı değişiklikleri ve poliploidi, verimsiz veya aşırı Cas9 kesimi²⁷ nedeniyle ekran sonuçlarını karıştırabilir. EPIKOL genellikle Taxol kaynaklı amplifikasyonlara tabi olmayan kromatin düzenleyicileri hedef alırken, taramadan önce dirençli hücrelerdeki ploidy durumu ve kopi sayı değişikliklerinin değerlendirilmesini öneririz. Kopya numarası değişiklikleri şüphelenilirse, MAGeCK analizi sırasında CRISPRcleanR veya CERES gibi hesaplamalı düzeltme araçları kullanılabilir.

İki deneysel kol, kontrol ve tedavi gruplarını içeren taramalarda, ekran performansı ve biyolojik bağımlılıkları doğru şekilde yorumlamak için farklı karşılaştırmalar gereklidir¹⁷. Başlangıçtan sona karşılaştırmalar, temel genlerin beklenen davranışları ve hedefleme dışı kontroller dahil olmak üzere ekran performansını değerlendirmek için uygundur. Kontrol grubunun (DMSO) son noktasının başlangıç zaman noktası ile karşılaştırılması, ilaç baskısı olmadan dirençli hücrelerin büyümesi ve fitnessiyeti için gerekli genlerin tanımlanmasına olanak tanır. Buna karşılık, ilaçla tedavi edilen (Taxol) ve kontrol (DMSO) olmak üzere iki son nokta örneklerinin karşılaştırılması, ilaca direnç için gereken spesifik genleri ortaya çıkarır; genel uygunluk değil. İki son nokta örneklerinin doğrudan karşılaştırılmasının, her iki grupta da hayatta kalmak için gerekli olan temel gen kontrollerinin çarpık dağılımına yol açtığı belirtilmelidir. Alternatif bir görselleştirme yöntemi, log2 kat değişimlerini ve anlamlılık değerlerini gösteren Volkan grafiki olabilir; bu da önemli ölçüde azalmış genlerin tanımlanmasını sağlar. Aday genler belirlendikten sonra, normalize edilmiş sgRNA sayıları ve görselleştirme grafikleri, aşağı akış doğrulama testleri için en iyi performans gösteren sgRNA'ları seçmek için faydalıdır. EPIKOL taraması için, en az 10 sgRNA'dan 6'sının uyumlu davranışıyla desteklenen aday genlerin önceliklendirilmesini öneriyoruz, çünkü bu, gen düzeyinde etkilere daha fazla güven sağlar.

Burada, ABCB1'i yükseltmiş ve MDR fenotipi gösteren Taxol-dirençli hücre hatlarında EPIKOL taraması yapmak için optimize edilmiş bir protokol sunuyoruz. Bu protokol, puromisin veya diğer seçici antibiyotiklere karşı çapraz direnç gösteren herhangi bir kemodirençli modele geniş çapta uygulanabilir ve böylece bu hücrelerde CRISPR taramasını mümkün kılar. Tüm protokol adımlarında karşılaşılan en yaygın teknik zorluklar için pratik rehberlik, Ek Tablo 1'de sunulmaktadır.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
100 mm plate	Corning	353003	Hücre kültürü
45 µm filter	Sigma-Aldrich	SLHVM33RS	Hücre kültürü
6 well plate	Corning	3506	Hücre kültürü
96-well black clear bottom plates	Sigma-Aldrich	CLS356259	CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay için
Blasticidin	Thermo Fisher	A1113903	Seçim için
CellTiter-Glo luminescent cell viability assay	CellTiter-Glo, Promega	G7570	CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay için
DMEM	Gibco		Hücre kültürü
DMSO	PanReac AppliChem	A3672,0050	Hücre kültürü
FBS	Gibco	16140071	Hücre kültürü
Ham’s F12 nutrient mix	Gibco	11765054	Hücre kültürü
HEK293T cells			Robert Weinberg (MIT, Boston, USA) tarafından sıcak dostluk hediyesi olarak verilmiştir.
HEPES	Thermo Fisher	15630080	Hücre kültürü
Hydrocortisone	Sigma-Aldrich	H4001-1G	Hücre kültürü
Insulin	Sigma-Aldrich	I9278-5ML	Hücre kültürü
LentiCas9-blast	Addgene	#52962	Cas9-stable hücre hattı oluşturma için
LentiGuide-Puro	Addgene	#52963	gRNA klonlama için omurga
MN NucleoSpin tissue kit	Macherey-Nagel	740952.5	Genomik DNA ekstraksiyonu için
PBS	Gibco	10010023	Hücre kültürü
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122	Hücre kültürü
pLentiCRISPR v2	Addgene	#52961	gRNA klonlama için omurga
Polyethylene glycol (PEG)-8000	Sigma-Aldrich	P2139-500G	Lentivirus konsantrasyonu için
Polyethylenimine, linear (PEI)	Sigma-Aldrich	765090-1G	Lentivirus üretimi için
Protamine sulfate (PS)	Sigma-Aldrich	P4380-25G	Lentivirus enfeksiyonu için
psPAX2	Addgene	# 12260	Lentivirus üretimi için
Puromycin	Thermo Fisher	A1113803	Seçim için
SUM159PT adherent cells			Robert Weinberg (MIT, Boston, USA) tarafından sıcak dostluk hediyesi olarak verilmiştir.
Taxol	Paclitaxel, Sigma	PHR1803-200MG	Res hücre oluşturma ve bakımı için
Trypsin-EDTA (0.05%)	Gibco	25300054	Hücre kültürü
Verapamil	Selleck Chemicals	S4202	Seçim için
VSV-G	Addgene	# 8454	Lentivirus üretimi için