Fare Korteksinin Derin Transkraniyal Görüntülemesi İçin Başa Monte Optik Şeffaf Kafatası (HOTS) penceresi

Özet

Bu protokol, optimize edilmiş iki aşamalı kafatası temizleme prosedürüne dayalı kafatası üzerine monte edilen optik şeffaf kafatası (HOTS) penceresini tanımlar. Bu yaklaşım, yetişkin fare beyin korteksinin ~800 μm'ye kadar derinliklere kadar iki fotonlu görüntülenmesini sağlayan son derece şeffaf bir kafatası sağlar.

Özet

Yetişkin fare beyin korteksinin yüksek çözünürlüklü iki fotonlu görüntülemesi, kafatasından gelen ışık saçılması nedeniyle ciddi şekilde sınırlanır; bu da sinyalleri zayıflatır ve in vivo görüntüleme derinliğini kısıtlar. Kafatası temizleme yöntemleri sağlam kafatası üzerinden kortekse optik erişim sağlamak için geliştirilmiş olsa da, pratik performansları sınırlı temizleme süresi ve optimal olmayan temizleme kokteylleri nedeniyle sınırlandırılmaktadır. Burada, başa monte optik şeffaf kafatası (HOTS) penceresi uygulamak için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Bu yaklaşımda, kafatası üzerinde temizleyici çözeltileri tutmak için başa monte edilen bir şapka kullanıldı; böylece uzun süreli anestezi veya fiziksel kısıtlamadan kaçınıldı ve uyanık, özgür davranan farelerde uzun süreli kafatası temizlenmesi (birkaç saat) mümkün oldu. Ayrıca, reaktifler kullanılarak iki aşamalı bir temizleme işlemi gerçekleştirildi (HOTS-S1: %10 wt/v EDTA, %15 wt/v D-mannoz, %10 wt/v sulfolan, %0,5 wt/v Tween 20; HOTS-S2: %70 ağırlık/v D-mannoz, %5 kızıl/v sulfolan, %0,5 ağırlık/v Tween 20) sistematik kimyasal tarama ile optimize edilmiştir. Kafatası açığa çıkışı ve stabilizasyonu, başa monte edilen kapağın oluşturulması ve montajı, temizleyici reaktiflerin teslim edilmesi ve yenilenmesi ile ardından görüntüleme hazırlıklarını içeren adım adım bir protokol sunuyoruz. 6 haftalık farelerde (~20 g), HOTS protokolü rutin olarak kortikal yapıların iki fotonlu görüntülemesini destekleyen ve pia'nın ~800 μm derinliğine kadar derinliklerde yüksek şeffaf bir kafatası üretir; bu da açık kafatası pencerelerinin performansına yaklaşır. HOTS penceresi, Thy1-GFP-M farelerinde yapısal görüntüleme ve Thy1-GCaMP6 farelerinde fonksiyonel kalsiyum görüntüleme imkanı sağlar. Uygun ve minimal invaziv bir yaklaşım olarak, HOTS penceresinin derin transkraniyal görüntüleme ve optogenetik, fotofarmakolojik ve diğer ışık bazlı manipülasyonları in vivo önemli ölçüde kolaylaştıracağına inanıyoruz.

Giriş

Kortikal nöronların intravital izlemesi, beyin yapısı ve fonksiyonunu anlamak için gereklidir¹. İki foton mikroskopisi (TPM), bu tür in vivo çalışmalar için önemli bir^{araçtır 2,3}. Ancak, görüntüleme kalitesi ve derinliği, korteksin üzerindeki opak kafatasından gelen güçlü ışık saçılması nedeniyle^{ciddi şekilde sınırlandırılmıştır 4,5}.

Açık^{kafatası 6} ve inceltilmiş kafatası^{pencereleri 7,8}, kortekse optik erişimi büyük ölçüde iyileştirmiş ve yaygın olarak kullanılmaktadır, ancak her iki yaklaşımın da doğuştan gelen sınırlamaları vardır. Açık kafatası pencereleri akut beyin hasarı ve iltihap yanıtlarına^{neden olabilir 9,10} iken, kafatası inceltmesi teknik olarak zorludur ve eşit kalınlığa ulaşmak^{zordur 11,12}.

In vivo kafatası optik temizleme teknikleri, yetişkin farelerde aksonal çözünürlükte iki foton görüntülemeyi mümkün kılan minimal invaziv bir alternatif sunar. Ancak, ulaşılabilir görüntüleme derinliği sınırlıdır (genellikle pia'nın 150–400 μm altında)12,13,14,15. Pratikte, kafatası temizleme genellikle sert baş fiksasyonu ile kısa bir süre anestezi altında sınırlıdır ve kafatası kemiği bileşimi için temizleme kokteyllerinin sistematik optimizasyonu henüz yeterince^{araştırılmamıştır} 12,13,14,15.

Bu sınırlamaları aşmak için, daha önce serbest davranan farelerde uzun süreli, çevrimdışı kafatası temizlemesini destekleyen kafatası tabanlı bir kafatası (HOTS) penceresi geliştirmiştik (Şekil 1A⁾¹⁶. Bu yaklaşım, önceki çalışmamızda sistematik kimyasal tarama ile optimize edilmiş reaktifler (S1 ve S2) kullanılarak iki aşamalı bir temizleme prosedürü kullanır¹⁶. Temizleme reaktiflerinin sistematik optimizasyonu ve HOTS penceresinin temizlenme etkinliği, geri dönüşü, biyogüvenlik ve in vivo görüntüleme performansının karakterizasyonu, önceki^{çalışmamız 16'da} rapor edilmiştir; bu çalışmalar HOTS tedavisinden sonra olumlu bir astrogliyal yanıt göstermiştir. Burada, yetişkin farelerde derin transkraniyal iki foton görüntülemeyi mümkün kılan HOTS penceresini oluşturmak için adım adım bir protokol sunuyoruz. Temsilci hazırlıklarda, görüntüleme derinlikleri pia'nın ~800 μm altına ulaşır ve açık kafatası pencereleriyle elde edilebileceklerle neredeyse eşleşir. HOTS penceresi, Thy1-GFP-M farelerinde derin yapısal görüntüleme ve uyanık Thy1-GCaMP6 farelerinde fonksiyonel kalsiyum görüntüleme imkanı sağlar.

Protokol

Tüm hayvan bakımı ve deneysel prosedürler, Guangdong Eyalet Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmış ve Çin Bilimler Akademisi Shenzhen İleri Teknoloji Enstitüsü Hayvan Deneyi Etik Komitesi'nin yönergelerine uygun olarak yürütülmüştür. Bu protokolde kullanılan reaktifler ve ekipmanlar Malzeme Tablosu'nda listelenmiştir.

NOT: Bu protokol, yaklaşık 100 μm kafatası kalınlığına sahip 6 haftalık fareler (vücut ağırlığı ~20 g) için optimize edilmiştir.

1. Kafatası temizleme çözeltilerinin hazırlanması

1. Kafatası temizleme çözeltisi S1 (%10 wt/v EDTA, %15 wt/v D-mannoz, %10 wt/v sulfolan, %0,5 wt/v Tween 20; RI: 1.38; nihai pH: 7.0-7.4)
   1. 0,35 g sodyum hidroksit (NaOH) ağırlığında bulun. Bir bedekte 20 ml deionize suya ekleyin ve tamamen çözünene kadar karıştırın. Bu, çözeltinin pH seviyesini yükseltir ve EDTA'nın ardından çözülmesini kolaylaştırır.
      NOT: NaOH aşındırıcıdır. Uygun kişisel koruyucu ekipman (eldiven, laboratuvar önlüğü, göz koruma) giyin ve kimyasal bir duman kaputu ile kullanın.
   2. NaOH çözeltisine 4 g etilenidiamintetraasetik asit (EDTA) ekleyin. Kabı 40 °C su banyosuna yerleştirin ve EDTA tamamen çözünene kadar sürekli karıştırın.
   3. Karışımı oda sıcaklığına soğutun. Çözeltiye 6 g D-mannoz, 4 g sülbolan ve 0,2 g Tween 20 ekleyin. Tüm bileşenler tamamen çözünene kadar oda sıcaklığında karıştırın.
   4. Son hacmi 40 mL'ye çıkarmak için deiyonize su ekleyin. S1 elde etmek için iyice karıştırın.
      NOT: S1 oda sıcaklığında birkaç ay boyunca saklanabilir.
2. Kafatası temizleme çözeltisi S2 (%70 wt/v D-mannoz, %5 wt/v sulfolan, %0.5 wt/v Tween 20; nihai RI: 1.44; nihai pH: 7.0-7.4)
   1. 28 g D-mannoz, 2 g sülbolan ve 0,2 g Tween 20 tartın ve bunları temiz bir beaker'e aktarın.
   2. Deiyonize suyu yaklaşık 30 mL'ye ekleyin ve tüm bileşenler tamamen çözünene kadar oda sıcaklığında karıştırın.
   3. Son hacmi 40 mL'ye getirmek için deiyonize su ekleyin ve iyice karıştırarak S2 elde edin.
      NOT: Nazik ısıtma (25–30 °C) ve sürekli karıştırma D-mannozun çözünmesini hızlandırır. S2 oda sıcaklığında birkaç ay boyunca saklanabilir.

2. Ameliyata hazırlık

1. Tüm cerrahi aletleri otoklav edin ve çalışma alanını %75 alkolle kapsamlı sterilize edin.
2. Fareyi %1 (w/v) sodyum pentobarbital (vücut ağırlığında 150–200 μl) intraperitoneal enjeksiyonla anestezi edin.
   NOT: Sodyum pentobarbitalin alternatifi olarak diğer geri dönebilir anestezikler kullanılabilir.
3. Anestezi derinliğini ayak sıkıştırma refleks testi ile izleyin ve ameliyata başlamadan önce farenin tamamen anestezi olduğundan emin olun.
4. Fareyi stereotaksik bir çerçeveye yerleştirin ve başı kulak çubuklarıyla sabitleyin.
5. Isıtıcı pedle vücut sıcaklığını 37 °C'de tutun.
6. Korneanın kurumasını önlemek için her iki göze oftalmik merhem uygulayın.
   NOT: Anestezi aşırı doz ve solunum depresyonunu önlemek için solunum ve refleksleri yakından izleyin.

3. Ameliyat ve başlık kaplamasının montajı

1. Kafatası açığı ve temizlik (Şekil 1B, a)
   1. Saç derisini ince forseps ve cerrahi makasla tüm dorsal kafatası yüzeyine çıkarın. Deriyi yanlara, temporal kasların kenarlarını açığa çıkarmak ve arka tarafa boyun kaslarına doğru kesin.
   2. Periosteumu kafatası yüzeyinden ince forseps kullanarak nazikçe çıkarın.
   3. Nemli pamuk uçlu bir aplikatör ile kafatası yüzeyini temizleyin ve hafifçe hava akışıyla kafatasını kurutun.
   4. Beyin korteksinin fonksiyonel alanlarının kesin lokalizasyonu gerekiyorsa, stereotaktik bir aparatla kafatası yüzeyinde 1 mm aralıklı referans noktalarını işaretleyin.
2. Diş çimento ve baş-plaka uygulaması (Şekil 1Bb)
   1. Diş çimentosunu üreticinin talimatlarına göre hazırlayın. Sağlam yapışma ve iyi dayanıklılığa sahip, uzun vadeli fiksasyon için uygun diş çimentoları sağlam bir şekilde sabitlenmesi sağlamak için önerilir.
   2. Açık kafatası yüzeyine ve çevresindeki dokulara ince bir diş çimento tabakası uygulayarak koruma için, temizlik penceresi için ayrılan bölgeyi kaplamadan bırakın.
      NOT: Diş çimentosunun toz ve sıvı bileşenlerini 1:1 hacim oranında karıştırdıktan sonra, uygulamadan önce çimenonun kürdanın ucuna yapışmasını yaklaşık 10 saniye bekleyin. Bu, akışkanlığını azaltır ve yol tutuşunu iyileştirir. Uygulama sırasında, çimentoyu çevreden belirlenen açıklık penceresine doğru uygulayın ve pencere alanını tamamen çimentodan arındırın. Temizlenmiş bölge, kafatası yüzeyindeki diş sızdırmazlığı (diş çimento ve yumuşak astar malzemesi) sınırıyla tanımlanır. Bu nedenle, boyutu ayarlanabilir, ancak kranial dikişler veya başlık boyutu ile sınırlıdır. Bir yarımkürede yaygın uygulama için, temizlenen bölge genellikle ~3–5 mm çapındadır.
   3. Küçük bir titanyum başlık plakasını (sonraki görüntüleme sırasında özel bir tutucuya sabitlemek için) diş çimentosu ile kafatasına sabitleyin.
      NOT: Baş sabitleme için farklı başlık tasarımları kullanılabilir. Bu çalışmada, hem ticari olarak mevcut başlıklar hem de özel iki delikli titanyum plakalar başarıyla kullanılmıştır. Tasarım ne olursa olsun, başlık plakası sonraki görüntüleme için yeterli mekanik stabiliteyi sağlamalı ve hedeflenen temizleme/görüntüleme penceresini engellememelidir.

4. HOTS penceresi oluşturmak

1. Kafatasını kendi kendine kürlenen yumuşak diş astar malzemesiyle kapatın (Şekil 1B, c)
   1. Diş çimentosu yaklaşık 5 dakika tamamen kürleştikten sonra, çimento tabakasını, temizleme penceresi hariç olarak, ince bir katman kendi kendine kürlenen yumuşak diş astar malzemesiyle kaplayın ve böylece kafatası üzerinde sürekli bir mühür oluşturun.
      NOT: Yumuşak astar malzemesi, uzun süre temizleme reaktiflerine maruz kalma sırasında sızdırmazlığı iyileştirir ve sızıntıyı azaltır.
   2. Kendi kendine kürlenen yumuşak diş astar malzemesini planlanan temizlik penceresi kenarının etrafında pürüzsüz şekilde şekillendirin, böylece kapağı için düz bir sızdırmazlık yüzeyi oluşturun.
2. Kapağın montajı (Şekil 1Bd)
   1. Tek kullanımlık plastik pipetin (polietilen, PE) başını keserek kapalı üstü ve açık alt kısmı olan küçük silindirik bir kapak oluşturun. PE iyi bir kimyasal stabiliteye sahiptir ve temizleme işlemi sırasında S1 veya S2 temizleme çözeltileriyle görünür bir bozulma veya reaksiyon göstermez.
      NOT: 1 mL'lik transfer pipet ampulünün başından kesilen kapak genellikle ~12 mm çapında ve ~10–14 mm yüksekliğindedir.
   2. Kapağı belirlenen açıklık penceresi bölgesine yerleştirin ve yumuşak astar malzemesine nazikçe bastırın.
      NOT: Başlık, temizlenen bölgeden daha büyüktür ve kapağın altındaki kafatasının bir kısmı, temizlenen bölge için kullanılmayan bir kısmı, kafatasının temizlenmesini önlemek için diş sızdırmazlığı ile uygulanabilir.
   3. Kapağı, tabanının etrafına ek yumuşak astar malzemesi kullanarak sabitleyin; böylece kapalı ile kafatası arasındaki bağlantı tamamen kapalı olduğundan emin olun.
   4. 1 mL bir şırınga, 26 G iğneyle kapağının duvarında bir veya daha fazla küçük delik delmek için kullanılır; bu delikler temizleme çözelyelerinin enjekte ve çekme portu olarak kullanılır.
   5. Yumuşak astar malzemesinin tamamen kürlenmesine izin verin. Kapak kapağının sıkıca takıldığından ve arayüzde görünür boşluk kalmadığından emin olun.
   6. Fareyi stereotaksik çerçeveden çıkarın ve anesteziden tam iyileşmeye kadar sıcak bir kafese yerleştirin.
      NOT: Burası uygun bir durak noktasıdır. Diş çimento ve yumuşak astar tamamen kürledikten sonra kafatası temizleme işlemini gerçekleştirin. Bizim uygulamamızda, HOTS penceresi öğleden sonra takılabilir, ardından fare ameliyattan tamamen iyileştikten sonra ertesi sabah kafatası temizlenmesi yapılabilir. Alternatif olarak, kafatası temizleme işlemi HOTS pencere kurulumundan yaklaşık 15 dakika sonra başlatılabilir. HOTS pencere kurulumunda, kafatası yapısal olarak sağlam kalır, ancak periost çıkarılır.

5. Uyanık ve özgürce davranan farelerde kafatası temizleme

NOT: Temizleme aşamasında, fare uyanık kalır ve ev kafesinde özgürce davranır. Sadece çözelti enjeksiyonu için kısa süreli izofluran anestezisi kullanın ve kafa monte edilen kapak üzerinden değişim yapın.

1. S1'in ilk yüklemesi
   1. Fare bir indüksiyon odasına yerleştirilir ve fare hareketsiz hale gelene kadar %3–4 isofluran ile havada %300–500 mL/dakika akış hızında kısa bir anestezi uygulanır. Bakım anestezi uygulanmadı.
   2. Fareyi nazikçe tutun ve baştaki kapağı elle stabilize edin.
   3. 1 mL bir şırınga ve 26 G iğne kullanarak başlığa monte edilen kapağa yaklaşık 1 mL S1 enjekte edin.
   4. Fareyi ev kafesine geri koyup S1'in kafatasına 2 saat boyunca etki etmesine izin verin.
      NOT: S1 ve S2 kuluçka aşamasında, fareyi standart bir kafeste tek tek barındırın.
2. Ferahlatıcı S1
   1. İlk S1 yüklemesinden 2 saat sonra, fareyi tekrar izofluran ile kısa bir süre anestezi edin.
   2. S1'i kapağadan 1 mL bir şırınga ile aspire edin.
   3. Kapağı 1 mL şırınga kullanarak taze S1 ile doldurun.
   4. Faresi kafese geri götürün ve S1'in 2 saat daha hareket etmesine izin verin.
   5. İlk yüklemeden 4 saat sonra 5.2.1–5.2.4 adımlarını tekrarlayarak ikinci S1 değişimini gerçekleştirin.
   6. İkinci değişimden sonra, S1'in 6 saat toplam S1 pozlama süresine ulaşana kadar hareket etmesine izin verin.
      NOT: Bu protokol (6 saat için 1 mL S1) 6 haftalık fareler (~20 g) için optimize edilmiştir. Daha kalın kafatası olan yaşlı hayvanlar için S1 kuluçka süresi kademeli olarak uzatılabilir. Her ayarlama, aşırı kafatası yumuşamasını önlemek için hayvan refahı ve nihai görüntüleme kalitesinin yakından izlenmesi ile birlikte yapılmalıdır.
3. S2'nin Uygulaması
   1. 6 saat S1 tedavisinden sonra, fareyi kısa süreliğine izofluran ile anestezi edin.
   2. S1'i kapağadan 1 mL bir şırınga ile aspire edin ve yerine 0,7 mL S2 ile değiştirin.
   3. Faresi kafese geri götürün ve S2'nin kafatasında 1 saat boyunca etkisi olmasına izin verin, böylece şeffaflık daha da artırılır ve kırılma indisi eşleşmesi sağlanır.
      NOT: Bu koşullarda, birleşik S1 ve S2 temizleme aşaması genellikle 7 saat içinde tamamlanır (6 saat S1 + 1 saat S2). Başarılı temizleme, kanamadan belirgin şekilde şeffaf bir kafatası yüzeyiyle gösterilir. Kafatası temizlendikten sonra hafifçe yumuşayabilir; İnce forsepsle hafifçe dokunulduğunda, hafif uyum göstermeli ancak yapısal olarak sağlam kalmalıdır. Kafatası yüzeyine aşırı baskı uygulamaktan kaçının.

6. Görüntüleme hazırlığı

1. Anestezi ve görüntüleme için baş fiksasyonu
   1. S2 kuluçkasının sonunda, fareyi 20 g vücut ağırlığı başına 150–200 μL oranında %1 (w/v) sodyum pentobarbital intraperitoneal enjeksiyonla anestezi edin.
   2. Ayak sıkıştırma refleks testiyle yeterli anestezi doğrulayın.
   3. Titanyum başlık plakasını özel tasarlanmış bir başlık tutucuya vidalayarak farenin başını sabitleyin.
   4. Görüntüleme sırasında kurumamayı önlemek için her iki göze de oftalmik merhem uygulayın.
   5. Vücut sıcaklığını bir ısıtma pediyle ~37 °C'de tutun.
2. Temizlenmiş kafatası yüzeyinin açığa çıkması (Şekil 1B, e,Bf)
   1. S2 çözeltisini kapağdan bir şırınga ile aspire edin.
   2. Plastik kapağı ince makasla dikkatlice kesin ve forseps ile çıkarın, kafatasına aşırı kuvvet vurmadan.
   3. Temizlik penceresinin etrafındaki yumuşak astar malzemesini nazikçe soyarak temizlenmiş kafatası bölgesini tamamen açığa çıkarın.
   4. Görüntüleme sırasında kırma indisine uyum sağlayan bir daldırma ortamı olarak kullanılmak için temizlenmiş kafatasına küçük bir S2 çözeltisi damlası uygulayın.
      NOT: Bu çalışmada standart suya batma hedefleri kullanıldı; bunlar arasında 16×/NA 0.8 (N16XLWD-PF, Nikon) ve 25×/NA 1.1 hedef (N25X-APO-MP, Nikon) yer aldı. S2'yi daldırma ortamı olarak kullanırken, mümkünse nesnenin düzeltme yakasını, küresel aberrasyonları azaltmak için S2'nin kırılma indisi için uygun ayarla ayarlayın. Buradaki deneylerde, temizlenmiş kafatası yaklaşık 2 saat iki fotonlu görüntüleme için yeterli optik netliği korudu ve dendritik omurga gözlemi sırasında görüntü kalitesinde belirgin bir bozulma olmadı. Yaklaşık 2 gün sonra, daha fazla görüntüleme için yeniden temizleme gerekti ve yeniden temizleme süresi ilk temizlikten çok daha kısaydı, böylece aynı hayvandan verimli tekrar görüntüleme yapılmasına olanak sağladı.
3. Uyanık kafa sabit görüntüleme (isteğe bağlı)
   NOT: Uyanık görüntüleme için, deneyden önce farenin başa takılması alışkanlığı edin. Fareyi kısa bir süreliğine izofluran ile anestezi edin, ardından implante edilen baş plakasını tutucuya 15–30 dakika boyunca sabitleyin ve bunu 2–3 gün tekrarlayın.
   1. Kullanımı kolaylaştırmak için kısa süreli izoflüran anestezisi kullanın. Sadece implante edilmiş baş plakasını tutucuya sabitleyin, böylece gövde hareket eden tekerlek veya platform üzerinde serbestçe hareket edebilir.
   2. 6.2.1–6.2.4 numaralı adımları takip ederek temizlenmiş kafatası yüzeyini açığa çıkarın ve görüntülemeden önce S2 uygulayın.

7. İyileşme

1. Görüntülemeden sonra, nazikçe aspirasyon yapın ve kafatası yüzeyinden kalan S2 çözeltisini çıkarın.
2. Temizlenmiş kafatası bölgesini, kafatasının doğal opak halinin kademeli olarak geri kazanmasını sağlamak için fosfatla tamponlu tuzlu (PBS) birkaç kez durulayın.
3. Kemiğe mekanik hasar vermeyi önlemek için kafatası ve çevresindeki dokudan kalan sıvıyı steril pamuk çubuklarıyla nazikçe kurutun.
4. Hayvan sonraki deneyler için canlı tutulursa, kemiği korumak için kafatası penceresinin üzerine biyouyumlu Kwik-Cast (WPI) tabakası uygulanarak kemiği korumak için kullanılır.
5. Koruyucu tabakanın tamamen kürlenmesine izin verin.
6. Fareyi başlıktan ayırın ve sıcak bir kafese yerleştirin. Hayvanı anesteziden tamamen iyileşene kadar izleyin, ardından onu ev kafesine geri götürün.

Sonuçlar

Protokole uygun olarak, başa monte optik şeffaf kafatası (HOTS) penceresi, yetişkin farelerde derin transkraniyal iki foton görüntüleme sağlarken kafatası bütünlüğünü korur. Başarılı bir hazırlık iki temel sonuçla gösterilir: (1) kortikal damar yapısı temizlendiğinde kafatasından net görünür hale gelir (Şekil 1Bf), ve (2) temizlenmiş kafatasında hafif bir girinti bulunur, bu da etkili kalsifikasyon ve kolajen gevşemesini gösterir. HOTS pence...

Tartışma

HOTS yöntemi, kafatası şeffaflığını artırırken kafatası bütünlüğünü koruyan iki aşamalı kafatası temizleme prosedürü ile iki aşamalı kafatası temizleme prosedürünü birleştiren bir kafatası penceresi (HOTS) kullanır. Standart protokol kapsamında (6 haftalık fareler için S1'de 6 saat, S2'de 1 saat), ortaya çıkan pencere derin transkraniyal iki fotonlu görüntülemeyi güvenilir şekilde destekledi ve yapıların pia'nın ~800 μm altına kadar görselleştirilmesine olanak sağladı.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
1 mL tek kullanımlık pipet	Pekin Biotopped  Science   & Technology  Co., Ltd.	Yok
Diş çimento	Şanghay Rongxiang Diş Malzemeleri A., Ltd.	Yok
D-mannoz	Macklin	D813082
EDTA	Aladdin	El 16428
İzofluran	RWD	Yok
Kwik-Cast	WPI	Yok	Biyouyumlu bir sızdırmazlık maddesi
NaOH	Macklin	S832169
Kendi kendine kürlenen        Dental          Yumuşak astar malzemesi	Yangmahu Biyoteknoloji (Hebi) Şirketi, Ltd.	Yok
Sodyum pentobarbital	Biopike	Yok
Stereotaksik cihaz	RWD	Yok
Steril tek kullanımlık şırınga	Minank	Yok	1 mL; 26 G iğne
Sülfolan	Macklin	S817950
Thy1-GFP-M fareleri		Yok	Sağlandı  Prof. Yang Zhan tarafından
Thyl-GCaMP6s  fareler	Jackson Laboratuvarı
Tween 20	Sigma-Vetec	V900548
Suya batma hedefi	Nikon	N25X-APO-MP	25×/NA 1.1 objective
Suya batma hedefi	Nikon	N16XLWD-PF	16×/NA 0.8 objective