Araştırma makalesi

Meme Kanserinde MPO Ekspresyonunun İmmün Mikroçevre ile İlişkisi: Biyoenformatik ve Tek Hücre Analizlerinden Elde Edilen Bilgiler

38 görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/71189

⸱

14 Ağustos 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Traditional Chinese Medicine, Aerospace Center Hospital, 2Third Affiliated Hospital, Beijing University of Chinese Medicine, 3China Academy of Chinese Medical Sciences, 4Graduate School, Beijing University of Chinese Medicine, 5College of Traditional Chinese Medicine, Shandong University of Traditional Chinese Medicine

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Bu makale, meme kanserinde myeloperoksidaz (MPO) ekspresyonu ile immün/miyeloid özellikler arasındaki ilişkileri araştırmak için tekrarlanabilir bir biyoinformatik ve tek hücreli çalışma akışı sunmaktadır. Analizler kamuya açık veri setlerine ve in silico yöntemlere dayandığı için bulgular, keşifsel ve hipotez oluşturucu olarak yorumlanmıştır.

Özet

Meme kanseri, kansere bağlı ölümlerin temel nedenlerinden biri olmaya devam etmektedir ve keşifsel hesaplamalı iş akışları, daha ileri araştırmalar için immün ilişkili belirteçlerin önceliklendirilmesine yardımcı olabilir. Burada, myeloperoksidaz (MPO) ekspresyonu ile klinik sonuçlar, immün infiltrasyon, metilasyon, yukarı akış regülatör açıklamaları, tek hücreli ekspresyon paternleri, sanal knockdown hassasiyet çıktıları, ilaç-gen etkileşim geri çağırımı ve absorpsiyon, dağılım, metabolizma, ekskresyon ve toksisite (ADMET) açıklamaları arasındaki ilişkileri incelemek için Cancer Genome Atlas meme invaziv karsinomu (TCGA-BRCA) bulk transkriptomik verilerini ve halka açık tek hücreli veri seti GSE161529'u kullandık. MPO ekspresyonu, meme kanseri dokularında komşu tümör dışı dokulardan daha düşüktü. Daha yüksek MPO ekspresyonu, daha uzunle bir progresyonsuz süreçle ilişkilendirilirken, genel sağkalım ve hastalığa özgü sağkalım ile olan ilişkileri istatistiksel olarak anlamlı değildi. Alıcı işletim karakteristiği (ROC) analizi, analiz edilen halka açık veri seti dahilinde tümör-normal ayrımı olduğunu göstermiştir, ancak bu durum klinikle tanısal doğrulama olarak yorumlanmamalıdır. İmmün dekonvolüsyon ve zenginleştirme analizleri, MPO ekspresyonunun immün mikroçevrenin tümör içi regülasyonunu kurmaktan ziyade, temel olarak immün ve myeloid ilişkili transkripsiyonel özelliklerle birlikte seyrettiğini göstermiştir. Tek hücre çözünürlüğünde MPO sinyali seyrek olup, k-en yakın komşu (KNN) tabanlı komşuluk genişlemesinden önce yalnızca 85 MPO-pozitif hücre tespit edilmiştir. Tespit edilebilir MPO sinyali ve MPO ile ilişkili skorlar; seyrek ekspresyon, hücre tipi açıklama belirsizliği, dropout, dubletler veya ortam RNA'sı tarafından etkilenmiş olabileceği için dikkatle yorumlanmıştır. In silico sanal knockdown, aday immün ve inflamasyon ilişkili transkripsiyonel değişiklikler önermiştir, ancak bu sonuçlar keşifsel olarak değerlendirilmiş olup doğrulama gerektirmektedir. İlaç-gen etkileşim veri tabanı (DGIdb) tabanlı ilaç-gen geri çağırımı ve ADMET açıklamaları yalnızca ön kimyasal açıklamalar olarak kullanılmış ve terapötik kanıt olarak yorumlanmamıştır. Genel olarak bu çalışma, meme kanserinde MPO ile ilişkili immün/myeloid özellikler hakkında hipotezler üretmek için, harici kohort doğrulaması ve deneysel onay gerektiren, tekrarlanabilir bir in silico iş akışı sunmaktadır.

Giriş

Meme kanseri, oldukça heterojen, bağışıklıkla ilişkili bir malignitedir1. Hastalığın seyri, nüks ve metastaz riski ile tedaviye verilen yanıt, tümör immün mikroçevresinin (TIME) bileşimi ve fonksiyonel durumuyla yakından ilişkilidir2. Kapsamlı tedavi stratejilerinin sürekli olarak optimize edilmesine rağmen, bazı hastalar hala ilerleme veya nüksle karşılaşmaktadır; bu durum, TIME durumunu karakterize eden ve risk stratifikasyonunu destekleyen moleküler biyobelirteçlerin belirlenmesinin ve bunların altında yatan mekanizmaların aydınlatılmasının acil gerekliliğini vurgulamaktadır.

Miyeloperoksidaz (MPO), ağırlıklı olarak nötrofillerde ve daha az oranda monositler ile makrofajlarda eksprese edilen, hem içeren bir peroksidazdır. MPO, hipokloröz asit ve diğer reaktif oksidanların üretimi yoluyla antimikrobiyal savunmaya katkıda bulunur, ancak aynı zamanda oksidatif doku hasarını ve kronik inflamasyonu da tetikleyebilir. Kanserde, MPO'nun biyolojik önemi bağlama bağımlı görünmektedir3. Bir yandan, MPO aracılı oksidatif stresin; DNA hasarı, lipid ve protein oksidasyonu, inflamatuar sinyalleme ve tümör mikroçevresinin yeniden şekillenmesi yoluyla karsinogenez ve tümör progresyonunda rol oynadığı belirtilmiştir4,5,6. Öte yandan, belirli tümör bağlamlarında MPO-pozitif doğuştan gelen bağışıklık veya miyeloid hücre infiltrasyonunun, uygun bir prognoz veya antitümör immün aktivite ile ilişkili olduğu görülmüştür7,8,9. Görünüşte çelişen bu bulgular, MPO'nun klinik ve biyolojik öneminin tümör tipine, hastalık evresine, MPO'nun hücresel kaynağına ve tümör mikroçevresinin immün kompozisyonuna bağlı olabileceğini düşündürmektedir. Bununla birlikte, meme kanserinde, özellikle tek hücre düzeyinde MPO'nun ekspresyon paterni ve prognostik önemi henüz tam olarak tanımlanmamıştır.

Tümör immün mikroçevresi (TIME); heterojen myeloid, lymphoid, stromal ve epitelyal kompartmanlar içerir10. MPO klasik olarak nötrofiller ve diğer myeloid soy hücreleri ile ilişkilidir; bu nedenle bulk tümör profillerindeki MPO ile ilgili sinyaller, tümör hücresine özgü aktiviteden ziyade immün hücre kompozisyonunu yansıtabilir10. Meme kanserinde, MPO sinyalinin bulk ve tek hücreli veri setleri arasındaki dağılımı, immün infiltrasyon tahminleri ile ilişkisi ve alt hesaplamalı analizlerin tekrarlanabilirlik sınırları henüz yeterince karakterize edilmemiştir. Bu nedenle, bu çalışma MPO'yu TIME'ın kanıtlanmış nedensel bir düzenleyicisi veya valide edilmiş terapötik bir hedef olarak değil, keşifsel iş akışı geliştirme için immün ilişkili bir marker olarak ele almaktadır. Tek kohortlu diferansiyel ekspresyon analizleri veya tek platformlu immün infiltrasyon tahminleri ile karşılaştırıldığında; bulk transkriptomik, immün dekonvolsiyon, metilasyon anotasyonu, tek hücreli haritalama ve hesaplamalı perturbasyon yöntemlerini birleştiren entegre bir iş akışı, gene ilişkili immün bağlama dair daha geniş bir keşifsel bakış sunabilir. Bu yaklaşım, özellikle deneysel veri setlerinin henüz mevcut olmadığı durumlarda, aday markerların önceliklendirilmesi ve test edilebilir hipotezlerin oluşturulması için faydalıdır. Ancak, bu tür hesaplamalı entegrasyonlar tek başına hücresel kaynağı, nedenselliği, farmakolojik aktiviteyi veya klinik yararlılığı belirleyemez. Büyük ölçekli kamuya açık kanser kohortlarının ve tek hücreli transkriptomik teknolojilerin ilerlemesiyle birlikte, biyoinformatik yaklaşımlar hem popülasyon hem de tek hücre seviyelerinde gen ekspresyonu, klinik sonuçlar, immün hücre kompozisyonu ve transkripsiyonel durumlar arasındaki ilişkileri keşfetmek için kullanılabilir11. Tek hücreli gen düzenleyici ağlara dayalı hesaplamalı perturbasyon yöntemleri, gene ilişkili transkripsiyonel hassasiyet konusunda hipotez üreten ek bilgiler sağlayabilir12,13. Bu nedenle, bu çalışma meme kanserinde MPO'nun ekspresyon paternini, sağkalım ilişkisini, immün/myeloid bağlamını, metilasyon profilini, tek hücreli dağılımını ve keşifsel hesaplamalı perturbasyon profilini karakterize etmeyi amaçlamıştır. Genel iş akışı Şekil 1'de gösterilmiştir.

Protokol

TCGA veri tabanından veri edinimi

TCGA meme invaziv karsinomu (TCGA-BRCA) kohortuna ait RNA dizileme verileri ve klinik bilgiler genomic data commons portalından elde edildi14. STAR iş akışı RNA-seq verileri, milyon başına transkript (TPM) formatında, eşleşen klinik açıklamalarla birlikte çıkarıldı. Karşılık gelen klinik bilgileri eksik olan RNA-seq örnekleri hariç tutuldu. Ekspresyon tabanlı analizler için TPM değerleri log2(TPM + 1) olarak dönüştürüldü. MPO ekspresyonu, MPO gen sembolü ve ENSG00000005381.8 Ensembl gen ID'si kullanılarak çıkarıldı. MPO-yüksek ve MPO-düşük gruplandırma gerektiren analizler için yalnızca TCGA-BRCA tümör örnekleri dahil edildi ve komşu normal örnekler grup atamasından hariç tutuldu. Tümör örnekleri, TCGA-BRCA tümör örnekleri arasındaki log2(TPM + 1) dönüştürülmüş MPO ekspresyonunun medyan değerine göre bölündü. MPO ekspresyonu medyan değerine eşit veya daha büyük olan örnekler MPO-yüksek grubuna, medyanın altında kalan örnekler ise MPO-düşük grubuna atandı. Aksi belirtilmedikçe, bu medyan tabanlı gruplandırma stratejisi sağkalım analizi, diferansiyel ekspresyon analizi, zenginleştirme analizi, metilasyon gruplandırması ve immün hücre zenginleştirme karşılaştırmaları için kullanıldı. Cinsiyet, yaş, etnisite, patolojik T evresi, histolojik derece, PAM50 alt tipi, patolojik evre, tümör durumu gibi klinik patolojik özellikler ile genel sağkalım (OS), progresyonsuz aralık (PFI) ve hastalığa özgü sağkalım (DSS) dahil olmak üzere sağkalım son noktaları R versiyon 4.2.1 kullanılarak analiz edildi.

Kamuya Açık İmmünohistokimya Görüntü Erişimi

Komşu normal meme dokusunun ve meme kanseri dokusunun temsili MPO immünohistokimya (IHC) görüntüleri, kalitatif protein düzeyi referansları olarak kullanılmıştır. Bu görüntüler, kantitatif morfometrik veya istatistiksel analizlere dahil edilmemiştir. Kutulu alanlar, daha yüksek büyütmede gösterilen bölgeleri belirtmektedir. Ölçek çubukları, 20× görüntülerde 100 µm ve 40× görüntülerde 50 µm'yi göstermektedir.

Ekspresyon korelasyon analizi

Meme kanserinde MPO ekspresyonu ile birlikte değişkenlik gösteren genleri incelemek için TCGA-BRCA veri seti kullanılmıştır. MPO ile protein kodlayan genler arasında genom çapında Pearson korelasyon katsayıları hesaplanmış ve görselleştirme için en yüksek pozitif korelasyona sahip 30 gen ile en yüksek negatif korelasyona sahip 30 gen seçilmiştir. Birden fazla test edilen geni içeren korelasyon analizleri için nominal p-değerleri, Benjamini-Hochberg yanlış keşif oranı yöntemi kullanılarak düzeltilmiştir. MPO ile ilişkili protein-protein etkileşim (PPI) ağı, etkileşen genlerin/proteinlerin geri çağrılması için arama aracı (STRING) veri tabanı kullanılarak oluşturulmuş ve 0,40'tan büyük etkileşim skorları sergileyen protein çiftleri görselleştirme için tutulmuştur15.

Fonksiyonel zenginleştirme analizi

Diferansiyel olarak eksprese edilen genler (DEG'ler), |log2FC| > 1 ve Benjamini-Hochberg ile düzeltilmiş p-değeri < 0,05 eşik değerleri kullanılarak MPO-yüksek ve MPO-düşük TCGA-BRCA tümör grupları karşılaştırılarak belirlenmiştir. DEG'lerin fonksiyonel zenginleştirme analizi; gen ontolojisi (GO) biyolojik süreç, hücresel bileşen, moleküler fonksiyon ve Kyoto gen ve genom ansiklopedisi (KEGG) yolak analizlerini içerecek şekilde R paketinin clusterProfiler 4.4.4 versiyonu kullanılarak gerçekleştirilmiştir16,17,18,19,20. Zenginleşmiş GO ve KEGG terimleri, düzeltilmiş p-değeri < 0,05 olduğunda anlamlı kabul edilmiştir.

MPO-yüksek ve MPO-düşük gruplar arasındaki diferansiyel ekspresyon istatistiklerine dayanan ön sıralamaya tabi tutulmuş bir gen listesi kullanılarak gen seti zenginleştirme analizi (GSEA) gerçekleştirilmiştir. MSigDB v2022.1.Hs ile uyumlu ve 3.050 gen seti içeren MSigDB C2 Kanonik Yolaklar koleksiyonu c2.cp.all.v2022.1.Hs.symbols.gmt kullanılmıştır21,22. Zenginleşen terimler, Benjamini–Hochberg düzeltmeli p-değeri < 0.05, FDR q-değeri < 0.25 ve |normalize edilmiş zenginleştirme skoru| > 1 kriterlerine göre anlamlı kabul edilmiştir. Uygun olan durumlarda, anlamlı derecede zenginleşen terimler için Z-skorları, görselleştirme amacıyla GOplot paketi kullanılarak hesaplanmıştır.

Tümörlerdeki immün hücre zenginleştirmesinin analizi

TCGA-BRCA kohortundaki immün ve stromal bileşenler, R paketinin estimate versiyon 1.0.13 sürümünde uygulanan ESTIMATE algoritması kullanılarak değerlendirilmiştir. Girdi olarak Log2(TPM + 1)-transforme edilmiş ekspresyon verileri kullanılmış; her bir tümör örneği için immün skor, stromal skor ve ESTIMATE skor hesaplanmıştır. B hücreleri, CD8+ T hücreleri, CD4+ T hücreleri, makrofajlar, nötrofiller ve dendritik hücreler dahil olmak üzere, TCGA-BRCA kohortundaki MPO ekspresyonu ile ana immün hücre popülasyonlarının tahmini infiltrasyon seviyeleri arasındaki ilişkileri değerlendirmek için TIMER/TIMER2.0 kullanılmıştır23,24,25. TIMER tabanlı sonuçlar, ilgili çevrimiçi kaynaktan elde edilen immün infiltrasyon tahminleri olarak yorumlanmıştır. 24 immün hücre tipi üzerinden immün hücre zenginleştirme analizi için, R paketinin GSVA versiyon 1.46.0 sürümü kullanılarak tek örnek gen seti zenginleştirme analizi (ssGSEA) uygulanmıştır26. 22 immün hücre tipinin CIBERSORT tabanlı dekonvolüsyonu için kullanılan LM22 immün hücre imza matrisi Ek Tablo 1'de sunulmuştur. MPO ekspresyonu ile immün hücre zenginleştirme skorları arasındaki korelasyonlar, Spearman sıra korelasyonu kullanılarak değerlendirilmiştir. Medyan ile tanımlanmış MPO-yüksek ve MPO-düşük tümör grupları arasındaki immün hücre zenginleştirme skorlarındaki farklılıklar, Wilcoxon sıra toplamı testi kullanılarak karşılaştırılmıştır. Birden fazla immün hücre tipini içeren analizler için p-değerleri, Benjamini–Hochberg yanlış keşif oranı yöntemi kullanılarak düzeltilmiştir.

MPO geninin DNA metilasyonu

MPO lokusundaki DNA metilasyon modelleri MethSurv kullanılarak değerlendirildi. TCGA-BRCA için CpG metilasyon beta değerleri ve sağkalım ilişkileri MethSurv platformundan elde edildi. Seçilen MPO ile ilişkili CpG bölgeleri görselleştirildi ve bunların sağkalım sonuçlarıyla olan ilişkileri, MethSurv tarafından sağlanan sağkalım analizi çıktıları kullanılarak değerlendirildi27. Birden fazla CpG bölgesini içeren analizler için p-değerleri, test edilen MPO ile ilişkili CpG bölgeleri genelinde Benjamini-Hochberg yanlış keşif oranı yöntemi kullanılarak düzeltildi. Bu metilasyon analizleri, keşifsel epigenetik anotasyonlar olarak yorumlandı.

Nötrofille ilişkili genlerin PPI ağının oluşturulması ve korelasyon analizi

MPO ile nötrofil ilişkili biyoloji arasındaki ilişkiyi incelemek için sistematik bir ağ analizi gerçekleştirilmiştir. Mevcut literatürden, nötrofil aktivasyonunun ve ilgili inflamatuar süreçlerin kanıtlanmış mediyatörlerini içeren bir gen seti oluşturulmuştur. Nötrofille ilişkili tam gen listesi Ek Tablo 2'de sunulmuştur. Gen sembolleri resmi gen sembolleriyle uyumlu hale getirilmiş, mükerrer girişler kaldırılmış ve mevcut genler; STRING/PPI analizi, hub-gen önceliklendirmesi ve MPO–hub gen korelasyon analizi öncesinde TCGA-BRCA ekspresyon matrisi ile kesiştirilmiştir. Bu genler arasındaki PPI ağı, orta güvenilirlikteki etkileşim skoru eşiği (>0,40) kullanılarak STRING veritabanı (versiyon 11.5) ile oluşturulmuştur. Bu ağdaki hub genler, düğüm başına doğrudan etkileşim sayısını belirleyen derece merkeziliği (degree centrality) temel alınarak algoritmik olarak önceliklendirilmiştir. En yüksek derece skoruna sahip ilk 20 gen, sonraki korelasyon analizi için seçilmiştir.

Ardından, bu hub genlerin ve MPO'nun ekspresyon profilleri TCGA-BRCA transkriptomik veri setinden çıkarıldı. MPO ile her bir hub gen arasındaki ilişki, Spearman sıra korelasyonu kullanılarak istatistiksel olarak değerlendirildi. Hub genlerin kendi aralarındaki korelasyon modellerini karakterize etmek için, tüm tümör örnekleri genelinde ikili bir Spearman korelasyon matrisi hesaplandı. Bu korelasyon analizleri; MPO-hub gen korelasyonlarının lolipop grafiği ve hub-gen korelasyon modellerini betimleyen kord diyagramı/ısı haritası dahil olmak üzere, sonraki görselleştirmeler için kantitatif temel oluşturdu.

MPO'yu hedefleyen üst akış transkripsiyon faktörlerinin ve miRNA'ların tahmini

MPO'nun hedef TF'lerini öngörmek için KnockTF veritabanı (https://bio.liclab.net/KnockTF/index.php)28,29, ChIP veritabanı (http://chip-atlas.org/)30,31 ve GTRD veritabanı32,33 (https://gtrd.biouml.org/#!) kullanıldı. Ayrıca, MPO'yu hedefleyen potansiyel miRNA bağlanma bölgelerini öngörmek için TargetScan veritabanından (https://www.targetscan.org/vert_80/) yararlanıldı. Venn diyagramları, MicroBioinformatics web sitesi (https://www.bioinformatics.com.cn/static/others/jvenn/example.html)34 kullanılarak oluşturuldu.

MPO'nun tek hücre analizi

GSE161529 numaralı spesifik veri seti Gene Expression Omnibus (GEO) kaynaklıdır. Veri ön işleme aşamasında, düşük kaliteli hücreleri hariç tutmak için hücre düzeyinde filtreleme yapılmıştır; bu kapsamda şu kriterlerden herhangi birini karşılayan hücreler dışlanmıştır: mitokondriyal gen ekspresyonunun %25'i aşması, toplam benzersiz moleküler tanımlayıcı (UMI) sayısının 5000'in altında olması veya 2500'den az gen saptanması. Ardından, ortam RNA kontaminasyonu ve teknik grup (batch) etkileri düzeltilmiştir35. Hücresel benzerliği değerlendirmek amacıyla boyut indirgeme için temel bileşen analizi (PCA) yapılmış, ardından hücre kümeleme ve görselleştirme için UMAP uygulanmıştır. Daha sonra, hücrelerin tipik marker genlerine göre farklı kümeler hücre tipleri olarak tanımlanmıştır11. Tek hücre imza skorlaması için kullanılan MPO ilişkili gen seti Ek Dosya 1'de sunulmuştur. Skorlamadan önce, gen sembolleri resmi gen sembolleriyle harmonize edilmiş, yinelenen girişler kaldırılmış ve mevcut genler GSE161529 ekspresyon matrisi ile kesiştirilmiştir. Hücre başına MPO ilişkili skorları hesaplamak için AUCell, Seurat AddModuleScore ve ssGSEA kullanılmıştır. Üç yöntemden elde edilen skorlar Z-skoru ile normalize edilmiş, karşılaştırılabilir bir aralığa ölçeklendirilmiş ve sonraki tanımlayıcı analizler için kompozit bir MPO ilişkili skor oluşturacak şekilde entegre edilmiştir. MPO ilişkili sinyale göre katmanlandırılmış epitelyal tümör hücreleri ile çeşitli partner hücre tipleri arasındaki çıkarılan ligand-reseptör iletişim modellerini karşılaştırmak için hücre-hücre etkileşim ağları incelenmiştir. Bu çıktılar, MPO eksprese eden hücrelerin hücreler arası iletişimi doğrudan yönettiğine dair bir kanıttan ziyade, tanımlayıcı iletişim modelleri olarak yorumlanmıştır.

scTenifoldKnk kullanarak MPO'nun tek hücreli sanal nakavtı ve yol zenginleştirme analizi

MPO'nun tek hücreli sanal nakavtı (virtual knockdown), Seurat ve scTenifoldKnk entegre edilerek gerçekleştirilmiştir. Standart kalite kontrolünün ardından (hücre başına 200–6.000 gen; mitokondriyal fraksiyon < %10), veriler log-normalleştirilmiş ve boyut indirgeme ile kümeleme için 2.000 yüksek değişkenli gen seçilmiştir. MPO ile ilgili bağlamları zenginleştirmek amacıyla, bir myeloid/nötrofil gen modülünde ilk %50'lik dilimde yer alan hücreler tutulmuştur. Bu hücreler arasından, PCA uzayında k = 40 en yakın komşu kullanılarak MPO-pozitif tohumlardan genişletme yapılarak bir MPO-komşuluk alt kümesi tanımlanmıştır. Genişletilen alt küme, saf bir MPO-pozitif popülasyon olarak değerlendirilmemiş ve bu KNN genişletme adımından herhangi bir hücre tipi oranı sonucu çıkarılmamıştır. Bu alt küme, yüksek değişkenli genlerin ve MPO'nun (≥25 hücrede ifade edilen) birleşimi gen seti olarak kullanılarak scTenifoldKnk aracılığıyla sanal nakavt analizine tabi tutulmuştur. Anlamlı düzeyde pertürbe olmuş genler belirlenmiştir (FDR < 0,05, BH-düzeltmeli). Elde edilen genler, GO Biyolojik Süreçler ve KEGG yolakları açısından fonksiyonel zenginleştirme için ileri analizlere tabi tutulmuştur (q < 0,05).

Keşifsel ilaç-gen erişimi ve ADMET anotasyonu

Öncelikle MPO ile ilişkili ilaç–gen veya kimyasal–gene etkileşim kayıtlarını elde etmek için DGIdb sorgulandı. Veritabanı kaynaklı etkileşim listeleri, heterojen kanıt türleri tarafından desteklenen girişler içerebileceği ve klinik olarak uygulanabilir terapötik ajanlarla doğrudan örtüşmeyebileceği için, geri getirilen bileşikler öncelikli tedavi adaylarından ziyade keşif amaçlı notlar olarak değerlendirildi. Ardından, tahmin edilen fizikokimyasal, farmakokinetik ve toksikolojik özellikleri özetlemek için SwissADME ve ADMETlab kullanıldı. Bu in silico notlar, bileşik düzeyindeki yorumlamalar için ön bilgi sağlamak ve herhangi bir terapötik ilişki değerlendirilmeden önce daha fazla farmakolojik, toksikolojik ve klinik kürasyon ihtiyacını vurgulamak amacıyla kullanıldı36.

Sonuçlar

Meme kanserinde MPO ekspresyon modelleri ve keşifsel sağkalım ilişkileri

Kanser veri setlerindeki MPO ekspresyon modellerini tanımlamak için TCGA pan-kanser veri setinden MPO RNA-seq verilerini analiz ettik ve mesane urotheliyal karsinomu (BLCA), invaziv meme karsinomu (BRCA), glioblastoma multiforme (GBM), baş ve boyun skuamöz hücreli karsinomu (HNSC), böbrek kromofob hücreli karsinomu (KICH), karaciğer hepatosellüler karsinomu (LIHC), akciğer adenokarsinomu (LUAD), akciğer skuamöz hücreli karsinomu (LUSC), pankreatik adenokarsinom (PAAD), prostat adenokarsinomu (PRAD) ve tiroid karsinomu (THCA) tümör dokularında daha düşük MPO ekspresyonu; kolon adenokarsinomu (COAD), böbrek renal papiller hücreli karsinomu (KIRP) ve diğer dokularda ise daha yüksek MPO ekspresyonu gözlemledik (Şekil 2A). Ardından, her kanser türünde MPO ekspresyonu ile klinik sonuçlar arasındaki ilişkileri değerlendirdik. TCGA-BRCA kohortunda, hem eşleştirilmemiş hem de eşleştirilmiş karşılaştırmalar, tümör dokusunda normal/komşu dokuya göre daha düşük MPO ekspresyonu olduğunu gösterdi (Şekil 2B,C). TCGA-BRCA tümör örnekleri, medyan tümör MPO ekspresyon eşiği kullanılarak katmanlandırıldıktan sonra, Kaplan-Meier analizi daha yüksek MPO ekspresyonuna sahip hastaların daha uzun progresyonsuz aralığa sahip olduğunu gösterdi (Hazard Ratio (HR) = 0.67, p = 0.028) (Şekil 2D). Genel sağkalım (OS) (p = 0.296; Ek Şekil 1A) ve hastalığa özgü sağkalım (DSS) (p = 0.18; Ek Şekil 1B) istatistiksel olarak anlamlı değildi. Tümör-normal ROC eğrisi, bu veri setindeki doku grupları arasında bir ayrım olduğunu öne sürdü (Şekil 2E), ancak bu analiz klinik tanısal doğrulama olarak yorumlanmamalıdır. Bu keşifsel ayrım; normal örnek kaynağı, parti etkileri (batch effects), tümör saflığı ve doku kompozisyonu farklılıklarından etkilenebilir. MPO ekspresyonu ayrıca patolojik T evresi (Şekil 2F) ve PAM50 alt tip dağılımı (Şekil 2G) ile ilişkiliydi. Komşu normal meme dokusu ve meme kanseri dokusunun temsili MPO immünohistokimya (IHC) görüntüleri, kalitatif protein düzeyinde referanslar olarak eklenmiştir (Şekil 2H). Kutulu alanlar, daha yüksek büyütmede gösterilen bölgeleri belirtmektedir. 20× genel bakış görüntüleri 10 µm ölçek çubuklarını içerirken, 40× yüksek büyütmeli görüntüler 50 µm ölçek çubuklarını içermektedir.

TCGA-BRCA kohortunda MPO'nun korelasyon ve zenginleştirme analizi

Pearson korelasyon analizi, MPO ile pozitif korelasyon gösteren ve MPO ekspresyon gradyanı boyunca koordineli bir yukarı regülasyon sergileyen en yüksek 30 geni belirlemişken (Şekil 3A), negatif korelasyon gösteren en yüksek 30 gen ters bir ekspresyon paterni sergilemiştir (Şekil 3B). Yolak düzeyinde MPO ekspresyonu; inflamatuar yanıt imzası (r = 0.41; Şekil 3C), EMT markerları (r = 0.264; Şekil 3D) ve reaktif oksijen türleri (ROS)-ilişkili gen seti skoru (r = 0.415; Şekil 3E) dahil olmak üzere birden fazla tümörle ilişkili imza skoru ile anlamlı ve pozitif bir ilişki göstermiştir; bu durum, TCGA-BRCA kohortunda MPO ekspresyonunun inflamatuar/oksidatif ve mezenşimal benzeri transkripsiyonel durumlarla paralel seyrettiğini düşündürmektedir.

MPO ile ilişkili genlerin gözetimsiz kümelemesi, tümörleri patolojik T evresi ve PAM50 intrinsik alt tipleri dahil olmak üzere klinik anotasyonlarla uyumlu ekspresyon modellerine göre daha fazla stratifiye etti (Şekil 3F). MPO ile ilişkili genler arasındaki olası bağlantısalılığı araştırmak için STRING kullanarak bir protein-protein etkileşim (PPI) ağı oluşturduk ve birkaç MPO-korele gen arasında birbirine bağlı bir modül ortaya çıkardık (Şekil 3G). PPI ağında; ESR1, FOXA1, XBP1, GATA3 ve KRT18, bu korelasyondan türetilen modül içinde yüksek ağ bağlantısallığına sahipti. Bu sonuçlar, MPO ekspresyonu ile birlikte değişen genleri tanımlamakta olup MPO ile ilişkili patogenezi veya yönelimi belirlemez. MPO-yüksek ve MPO-düşük gruplar arasındaki diferansiyel ekspresyon analizi, volcano plot'ta özetlenen transkriptomik farklılıkları ortaya çıkardı (Şekil 3H). Toplam 1.159 yukarı regüle ve 854 aşağı regüle gen tanımlanarak sonraki zenginleştirme analizleri için veri sağlandı.

Ardından, R'daki clusterProfiler paketi kullanılarak MPO-yüksek ve MPO-düşük gruplar arasındaki farklı şekilde ifade edilen genlerin (DEG'ler) fonksiyonel ilişkisi incelendi. Gen Ontolojisi (GO) zenginleştirme analizi, bu DEG'lerin öncelikle bağışıklık yanıtı ile ilişkili hücre yüzeyi reseptörü sinyallemesinin düzenlenmesi ve lenfosit aracılı bağışıklık dahil olmak üzere bağışıklıkla ilgili biyolojik süreçlerde yer aldığını; ayrıca T-hücre reseptör kompleksi gibi hücresel bileşenlerde ve reseptör aktivatör aktivitesi ile ilgili moleküler fonksiyonlarda da zenginleşme olduğunu gösterdi (Şekil 4A). Buna paralel olarak, KEGG yolak analizi; sitokin-sitokin reseptör etkileşimi, kemokin sinyallemesi, T-hücre reseptör sinyallemesi, doğal öldürücü hücre aracılı sitotoksisite, Th1/Th2 ve Th17 farklılaşması, NF-κB sinyallemesi, primer immün yetmezlik ve IgA üretimi için bağırsak bağışıklık ağı dahil olmak üzere bağışıklık ve inflamasyonla ilişkili yolakları ön plana çıkardı (Şekil 4B).

Ekspresyon yönelimini fonksiyonel terimlerle daha fazla entegre etmek için, DEG |log2FC| değerlerine dayalı terim düzeyindeki Z-skorlarını hesaplamak amacıyla GO grafiği kullanılmış olup; bu işlem hümoral bağışıklık yanıtı, lökosit/lenfosit aracılı bağışıklık, bağışıklık yanıtı aktivasyonu ve sinyal iletimi gibi bağışıklık açısından zenginleştirilmiş transkripsiyonel programları yeniden vurgulamıştır (Şekil 4C). Sıralanmış gen listesine dayalı gen seti zenginleştirme analizi (GSEA) de adaptif bağışıklık sistemi, sitokin-sitokin reseptör etkileşimi ve nötrofil degranülasyonu dahil olmak üzere bağışıklık sistemi yolaklarının zenginleştiğini göstermiştir (Şekil 4D–G). MPO bir miyeloid/nötrofil ilişkili gen olduğundan, bu zenginleşmeler, MPO'nun kendisinin bağışıklık mikroçevresini yeniden şekillendirdiğinin bir kanıtı olarak değil, MPO-yüksek örneklerin daha güçlü bağışıklık/miyeloid transkripsiyonel sinyaller sergilediğinin bir kanıtı olarak yorumlanmıştır.

Meme kanserinde MPO ekspresyonu ile immün hücre infiltrasyonu arasındaki korelasyon

TCGA-BRCA kohortunda MPO ekspresyonu ile tümör mikroçevresel özellikleri arasındaki ilişkiyi değerlendirdik. ESTIMATE algoritmasının uygulanması, MPO ekspresyonu ile ESTIMATE skoru (R = 0,347, p < 0,01), immün skor (R = 0,361, p < 0,01) ve stromal skor (R = 0,232, p < 0,01) arasında anlamlı pozitif korelasyonlar olduğunu ortaya koymuştur (Şekil 5A). Bu skorların örnekler genelindeki dağılımı Şekil 5B'de gösterilmiştir. TIMER/TIMER2.0 kaynağı kullanılarak yapılan analiz, TCGA-BRCA kohortunda MPO ekspresyonunun B hücreleri, CD8+ T hücreleri, nötrofiller, CD4+ T hücreleri, makrofajlar ve dendritik hücreler dahil olmak üzere temel immün hücre popülasyonlarının tahmini infiltrasyon seviyeleri ile ilişkili olduğunu göstermiştir (Şekil 5C). Bu ilişki örüntüsü, 24 immün hücre tipi için ssGSEA tabanlı immün hücre zenginleşme skorları kullanılarak daha ayrıntılı değerlendirilmiştir. Benjamini–Hochberg yanlış keşif oranı düzeltmesinden sonra MPO ekspresyonu; T hücreleri, B hücreleri, sitotoksik hücreler, dendritik hücre alt kümeleri, makrofajlar, T yardımcı hücre alt kümeleri, regülatör T hücreleri, CD8+ T hücreleri, NK hücreleri, mast hücreleri ve nötrofiller dahil olmak üzere birden fazla immün hücre zenginleşme skoru ile pozitif ilişkiler göstermiştir (Şekil 5D). Bu bulgular, MPO'nun immün hücre infiltrasyonunu doğrudan kontrol ettiğinin kanıtı olarak değil, immün kompozisyon ilişkileri olarak yorumlanmıştır. TCGA-BRCA kohortu genelindeki örnek düzeyindeki immün hücre zenginleşme örüntülerini görselleştirmek için bir ısı haritası oluşturulmuştur (Şekil 5E). Ardından, medyan ile tanımlanmış MPO-yüksek ve MPO-düşük tümör grupları arasında ssGSEA ile tahmin edilen immün hücre zenginleşme skorlarını karşılaştırdık. Aktive dendritik hücreler (aDC), B hücreleri, CD8+ T hücreleri, sitotoksik hücreler, nötrofiller, T hücreleri, Treg'ler, Th1 hücreleri, Th2 hücreleri, Th17 hücreleri, γδ T hücreleri, foliküler yardımcı T hücreleri (TFH) yüksek değişken gen (HVG) hücreleri, efektör bellek T hücreleri, merkezi bellek T hücreleri ve T yardımcı hücreleri dahil olmak üzere birkaç immün hücre zenginleşme skoru iki grup arasında farklılık göstermiştir (Şekil 5F,G). Ek olarak, 2 immün hücre tipinin göreceli fraksiyonlarını tahmin etmek için LM2 imza matrisi kullanılarak CIBERSORT tabanlı dekonvolüsyon gerçekleştirilmiş ve sonuçlanan immün hücre kompozisyon örüntüleri Şekil 5H'de gösterilmiştir.

TCGA-BRCA kohortunda MPO'nun DNA metilasyon analizi

Aynı medyan tümör MPO ekspresyon kesme değeri kullanılarak, TCGA-BRCA örnekleri MPO-yüksek ve MPO-düşük gruplara ayrıldı ve her grup için DNA metilasyon paternleri görselleştirildi (Şekil 6A). MPO lokusu içindeki seçili CpG bölgeleri, cg23120, cg14619064 ve cg151395 dahil olmak üzere, MethSurv analizinde sağkalım ilişkileri gösterdi (Şekil 6B–G). Bu metilasyonla ilgili sonuçlar, keşifsel epigenetik anotasyonlar olarak yorumlanmıştır ve prognostik veya mekanistik sonuçlar çıkarılmadan önce bağımsız doğrulamaya gereksinim duymaktadır.

Meme kanserinde MPO ekspresyonu ile nötrofil ilişkili gen ağları arasındaki ilişki

MPO ekspresyonu ile nötrofil ilişkili genler arasındaki ilişkiyi incelemek için TCGA-BRCA kohortu kullanılmıştır. Nötrofil ilişkili genler için STRING tabanlı bir PPI ağı oluşturulmuş ve hub genler ağ topolojisine göre önceliklendirilmiştir (Şekil 7A). Ardından, en üstteki 20 hub genin MPO ekspresyonu ile korelasyonu değerlendirilmiştir. Lollipop grafiğinde gösterildiği üzere, MPO'nun birden fazla nötrofil ilişkili medyatörle ağırlıklı olarak pozitif korelasyon gösterdiği; CCL5, CCL2 ve TLR2 gibi kemokin/doğuştan gelen bağışıklık sinyal bileşenlerinin yanı sıra TLR4, CXCR4, TNF ve MMP9 ile daha güçlü ilişkilerin olduğu gözlemlenmiştir (Şekil 7B).

Bu merkez genler arasındaki ko-regülasyon paternini daha ayrıntılı karakterize etmek için, ikili ilişkilerini bir akor diyagramı ve bir korelasyon ısı haritası kullanarak görselleştirdik; bu işlem, koordineli bir inflamatuar/nötrofil ilişkili transkripsiyonel program ile uyumlu olarak merkez modül boyunca kapsamlı pozitif genler arası korelasyonlar olduğunu ortaya koymuştur (Şekil 7C,D). Topluca bu sonuçlar, meme kanserinde daha yüksek MPO ekspresyonuna, nötrofil ilişkili bir gen ağının koordineli ekspresyonunun eşlik ettiğini göstermektedir.

MPO için aday transkripsiyon faktörü anotasyonu

MPO ile potansiyel olarak ilişkili aday transkripsiyon faktörlerini araştırmak için KnockTF, ChIP-Atlas ve GTRD dahil olmak üzere halka açık transkripsiyon faktörü kaynakları sorgulanmış ve kesiştirilmiştir. Aday transkripsiyon faktörleri, ağ tabanlı önceliklendirme ve korelasyon analizi kullanılarak daha ayrıntılı olarak özetlenmiştir. Grafiksel bir özet Ek Şekil 2'de gösterilmekte olup, tam tablo sonuçları Ek Dosya 2'de sunulmuştur. Bu veritabanları heterojen deneysel bağlamlardan gelen kanıtları entegre ettiği için, veritabanı örtüşmesi ve ağ derecesi yalnızca aday anotasyonu ve önceliklendirme için kullanılmıştır. Bu sonuçlar, meme kanserinde MPO'nun doğrudan transkripsiyonel düzenlemesine dair fonksiyonel kanıt olarak yorumlanmamıştır. Bu nedenle, MYC dahil olmak üzere aday faktörler, doğrulanmış üst düzenleyiciler olarak değil, ek keşifsel anotasyonlar olarak sunulmuştur.

Tek hücreli kümeleme ve MPO sinyaline göre katmanlandırılmış tanımlayıcı hücre-hücre etkileşim analizi

Hücre tiplerini tanımlamak için öncelikle her bir soy hattı için kanonik belirteçlere dayalı küme spesifik ekspresyon analizi gerçekleştirdik. Bu anahtar genleri eksprese eden hücrelerin yüzdesi ve ortalama ekspresyon seviyeleri kümeler genelinde gösterilerek sonraki tanımlamalar desteklenmiştir (Şekil 8A). Buna göre, tanımlanan hücre kümeleri, her bir popülasyonun plazmasitoid dendritik hücreler, endotel hücreler, miyoepitelyal hücreler, döngüdeki epitelyal hücreler, plazma hücreleri, sitotoksik T hücreleri, epitelyal tümör hücreleri, B hücreleri, aktive olmuş CD4 T hücreleri, monositler-makrofajlar, fibroblastlar ve konvansiyonel T hücreleri dahil olmak üzere belirlenen tipine göre renk kodlandığı bir tek düzenli manifold yaklaşımı ve projeksiyon (UMAP) grafiğinde görselleştirilmiştir (Şekil 8B). Isı haritası, seçilen genlerin hücre kümeleri (C1-C8) boyunca ekspresyon seviyelerini göstermektedir. Her satır bir geni ve her sütun bir hücre kümesini temsil eder. Renk gradyanı ekspresyon seviyelerini belirtmekte olup, kırmızı yüksek ekspresyonu, mavi ise düşük ekspresyonu ifade etmektedir. Soldaki dendrogram, benzer ekspresyon paternine sahip genleri kümelemektedir (Şekil 8C). MPO ilişkili skor, Ek Dosya 1'de verilen MPO ilişkili gen seti kullanılarak hücre başına hesaplanmıştır. Hücre başına skorların hesaplanmasında AUCell, Seurat AddModuleScore ve tek örneklem gen seti zenginleştirme analizi (ssGSEA) kullanılmıştır. Üç yöntemden elde edilen skorlar Z-skoru ile normalize edilmiş, karşılaştırılabilir bir aralığa ölçeklenmiş ve alt tanımlayıcı analizler için kompozit bir MPO ilişkili skor elde etmek üzere entegre edilmiştir (Şekil 8D).

Bu hücre-hücre etkileşimi analizi, etkileşim ağı, sinyalizasyon örüntüsü ısı haritaları, giden sinyalizasyon balon grafiği ve gelen sinyalizasyon balon grafiği dahil olmak üzere, MPO ile ilişkili sinyale göre tabakalandırılmış hücre grupları arasındaki çıkarılan ligand-reseptör iletişim örüntülerini karşılaştırmıştır (Şekil 8E–H). MPO sinyali tek hücre düzeyinde seyrek olduğu ve açıklanan hücre tipleri arasındaki görünür dağılım dropout, ortam RNA'sı, dubletler ve anotasyon belirsizliğinden etkilenebileceği için, bu iletişim grafikleri tanımlayıcı iş akışı çıktıları olarak yorumlanmalıdır. Bunlar, MPO eksprese eden hücrelerin hücreler arası iletişimi aracılık ettiğini veya kontrol ettiğini kanıtlamaz. Belirlenmiş epitelyal tümör hücreleri ve monosit-makrofajlar dahil olmak üzere sınırlı sayıda hücrede tespit edilebilir MPO sinyali gözlemlenmiştir (Şekil 8I). MPO'nun kanonik olarak nötrofil/miyeloid soy hatlarıyla ilişkili olduğu göz önüne alındığında, bu örüntünün bağımsız tek hücre veri setlerinde veya ortogonal deneysel yöntemlerle doğrulanması gerekmektedir.

Seyrek MPO-pozitif hücrelere dayalı keşifsel scTenifoldKnk duyarlılık analizi

Çok sayıda 10x Genomics örneği entegre edilmiş, ardından normalizasyon ve HVG seçimi, PCA tabanlı boyut indirgeme, k-en yakın komşu grafiğinin oluşturulması ve Louvain kümelemesi gerçekleştirilmiştir. Kümeler genelindeki kanonik marker-gen ekspresyon paternleri, sonraki hücre tipi anotasyonunu destekleyecek şekilde bir DotPlot kullanılarak özetlenmiştir (Şekil 9A). UMAP görselleştirmesi, entegre veri setindeki anotasyonlanmış tek hücre popülasyonlarını göstermiştir (Şekil 9B). Kanonik soy belirteçleri (örneğin, epitel hücreler için EPCAM ve KRT8/KRT18; immün hücreler için PTPRC; B hücreleri için MS4A1; myeloid hücreler için LST1/S10A8/S10A9; endotel hücreler için PECAM1; ve fibroblast/düz kas soyları için COL1A1), hücre tipi anotasyonunu destekleyen kümeye özgü ekspresyon paternleri göstermiştir (Şekil 9C). Örnek bazlı katmanlı çubuk grafikleri, her bir örneğin, genel olarak sınırlı parti-parti varyasyonuyla çok sayıda küme içerdiğini göstermiştir (Şekil 9D).

Tek hücreli veri setinde MPO ekspresyonu nispeten seyrekteydi ve başlangıçta yalnızca 85 MPO-pozitif hücre tespit edildi (Şekil 9E). Bu sınırlı sayı nedeniyle, KNN tabanlı komşuluk genişlemesi yalnızca keşifsel hassasiyet analizi için yerel bir MPO-komşuluk alt kümesi tanımlamak amacıyla kullanıldı. Bu genişletilmiş alt küme, düşük veya tespit edilemeyen MPO ekspresyonuna sahip komşu hücreleri içerebileceği için saf bir MPO-pozitif popülasyon olarak yorumlanmamalıdır. Bu MPO-komşuluk alt kümesi içinde, hesaplamalı bir hassasiyet analizi olarak scTenifoldKnk kullanılarak MPO'nun sanal nakavtı (knockdown) gerçekleştirildi. Ortaya çıkan volkan grafiği, manifold yer değiştirme analizi, manifold hizalama görselleştirmesi, GO/KEGG zenginleştirme sonuçları ve en yüksek yer değiştirme gösteren genler (Şekil 9F-N); antijen sunumu, myeloid/lenfosit aktivasyonu, sitokin üretimi ve fagozomla ilişkili yolaklarla bağlantılı aday transkripsiyonel programları vurguladı. Bu sonuçlar, MPO'nun meme kanserinde bu yolakları mekanik olarak düzenlediğine dair doğrudan kanıtlardan ziyade, keşifsel transkripsiyonel hassasiyet çıktıları olarak yorumlanmalıdır. Bu gözlemleri doğrulamak için bağımsız tek hücreli veri setleri ve immünohistokimya, akış sitometrisi, qPCR veya fonksiyonel analizler gibi ortogonal deneysel doğrulamalar gerekecektir.

Keşifsel ilaç-gen etkileşimi erişimi ve ADMET anotasyonu

MPO merkezli analizin keşifsel bir uzantısı olarak, ilaç-gen etkileşim bilgileri DGIdb'den alınmıştır. Grafiksel bir özet Ek Şekil 3'te gösterilmekte ve bileşik düzeyindeki sonuçlar Ek Tablo 3'te sunulmaktadır. DGIdb sorgusu, klinik olarak uygulanabilirliği sınırlı olan veya elverişsiz toksikolojik profillere sahip bileşikler de dahil olmak üzere MPO ile ilişkili heterojen bir kimyasal girişler seti döndürmüştür. Bu nedenle, veritabanından türetilen bu bileşikler, mevcut analiz temelinde meme kanseri için terapötik adaylar olarak değerlendirilmemiştir. Öngörülen fizikokimyasal, farmakokinetik ve toksikolojik özelliklerin ön anotasyonunu sağlamak amacıyla ADMET ile ilgili bilgiler özetlenmiştir. Veritabanı tabanlı bileşik geri kazanımı ve ADMET anotasyonu, klinik olarak kürate edilmiş ilaç önceliklendirmesi ile eşdeğer değildir. Bu nedenle, söz konusu sonuçlar yalnızca tarama düzeyinde kimyasal anotasyonlar olarak hizmet etmekte ve herhangi bir bileşiğin terapötik inceleme için değerlendirilmeden önce dikkatli farmakolojik, toksikolojik ve klinik filtreleme gerekliliğini ortaya koymaktadır. Bu çalışmanın ana bulguları, MPO ekspresyonu ile immün/miyeloid ilgili transkripsiyonel özellikler arasındaki ilişkiye odaklanmaktadır.

VERİ KULLANILABİLİRLİĞİ>:

TCGA-BRCA transkriptomik ve klinik verileri Genomic Data Commons portalından (https://portal.gdc.cancer.gov; 26 Ağustos 2025 tarihinde indirilmiş; veri sürümü/versiyonu 20208) elde edilmiştir. GSE161529 tek hücreli veri seti Gene Expression Omnibus'tan (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE161529) temin edilmiştir. Bu çalışmada yeni bir sekanslama verisi üretilmemiştir. Analiz scriptleri https://github.com/tengfeitcm/MPO adresinde halka açık olarak sunulmaktadır.

Çoklu omik analizi, hücre iletişimi, MPO ekspresyonu ve klinik veri entegrasyonu akış şeması.
Şekil 1Veri toplama ve analiz sürecinin akış şeması. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Meme kanseri araştırması; MPO ekspresyon sütun grafikleri, sağkalım eğrisi, ROC, histoloji görüntüleri analizi.
Şekil 2Meme kanserinde MPO ekspresyon modelleri ve keşifsel sağkalım ilişkileri. (AMPO ekspresyon seviyeleri, TCGA veri tabanı kullanılarak 3 farklı kanser türünde ve bunlara komşu normal dokularda analiz edilmiştir.B) Meme kanseri ve normal dokularda MPO mRNA ekspresyonunu analiz etmek amacıyla TCGA-BRCA veri setinden eşleşmemiş örnekler seçilmiştir. (CMeme kanseri ve normal dokularda MPO mRNA ekspresyonunu analiz etmek için TCGA-BRCA veri setinden eşleşmiş örnekler seçilmiştir.D) TCGA-BRCA kohortunda, medyan tümör MPO ekspresyon kesme değerine göre stratifiye edilen hastalarda PFI'nın Kaplan-Meier analizi. (E) Analiz edilen halka açık transkriptomik veri setindeki MPO ekspresyonuna dayalı olarak tümör-normal ayrımını değerlendiren keşifsel ROC eğrisi. (F) Farklı patolojik T evrelerinde MPO ekspresyonu. (G) Alt tip etiketleri gösterilmiş şekilde, PAM50 moleküler alt tipleri genelinde MPO ekspresyonu. (HBitişik normal meme dokusu ve meme kanseri dokusunun temsili MPO immünohistokimya (IHC) görüntüleri. Kutuyla çevreli alanlar, daha yüksek büyütmede gösterilen bölgeleri belirtmektedir. 20× genel bakış görüntüleri şunları içermektedir: 100 µm ölçek çubukları; buna karşılık 40× yüksek büyütmeli görüntüler şunları içerir 50 µm ölçek çubukları. Bu görüntüler, kalitatif protein düzeyi referansları olarak sunulmuştur; kantitatif morfometrik veya istatistiksel analizler için kullanılmamıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Gen ekspresyon analizi grafikleri ve ağ diyagramı, ısı haritaları, dağılım ve volkan grafikleri.
Şekil 3: Meme kanserinde MPO ile ilişkili korelasyon ve diferansiyel ekspresyon analizi. (A) TCGA veri tabanından elde edilen Pearson korelasyon katsayılarına göre, mRNA düzeyinde MPO ekspresyonu ile pozitif korelasyon gösteren ilk 30 kodlayan gen. (B) Pearson korelasyon katsayılarına göre, mRNA düzeyinde MPO ekspresyonu ile negatif korelasyon gösteren ilk 30 kodlayan gen. (C) MPO ile inflamatuar yanıt tarafından yukarı regüle edilen genler arasındaki Spearman korelasyonlarını gösteren saçılım grafikleri. (D) MPO ile EMT belirteçleri tarafından yukarı regüle edilen genler arasındaki Spearman korelasyonlarını gösteren saçılım grafikleri. (E) MPO ile ROS tarafından yukarı regüle edilen genler arasındaki Spearman korelasyonlarını gösteren dağılım grafikleri. (F) Klinik öneme (T evresi ve PAM50) dayalı MPO ile ilişkili gen kümelerinin ısı haritası. (G) MPO ile ilişkili proteinler için STRING veri tabanı kullanılarak tahmin edilen PPI ağı. (H) TCGA-BRCA kohortunda, medyan değerine göre tanımlanmış MPO-yüksek ve MPO-düşük tümör grupları arasında diferansiyel ekspresyon gösteren genlerin volcano plot grafiği. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Yolaklar ve ontoloji kategorilerini içeren gen zenginleştirme analizi diyagramları; sütun grafikleri ve çizgi grafikleri.
Şekil 4Meme kanserinde MPO'nun zenginleştirme analizi. (A) MPO-yüksek ve MPO-düşük grupları arasında diferansiyel olarak eksprese edilen 2.013 genin Gene Ontology zenginleştirme analizi. (B) 2.013 diferansiyel eksprese olmuş genin Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes yolak zenginleştirme analizi. (C) Zenginleşmiş terimleri, diferansiyel ekspresyon yönü ve |log2FC| değerleri ile entegre eden kombine Gen Ontolojisi zenginleştirme görselleştirmesi. (D) MPO ile ilişkili immün yanıt gen seti için temsili GSEA zenginleştirme grafiği; panelde gen seti adı, normalize edilmiş zenginleştirme skoru ve FDR q-değeri gösterilmektedir. (E) Ek bir MPO ilişkili immün ilgili gen seti için temsili GSEA zenginleştirme grafiği; gen seti adı, normalize edilmiş zenginleştirme skoru ve FDR q-değeri panelde gösterilmiştir. (F) Ek bir MPO ilişkili bağışıklıkla ilgili gen seti için temsili GSEA zenginleştirme grafiği; gen seti adı, normalize edilmiş zenginleştirme skoru ve FDR q-değeri panelde gösterilmektedir. (G) Ek bir MPO ile ilişkili bağışıklık sistemiyle ilgili gen seti için temsili GSEA zenginleştirme grafiği; panelde gen seti adı, normalize edilmiş zenginleştirme skoru ve FDR q-değeri gösterilmektedir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Gen ekspresyon analiz grafikleri, MPO'nun immün hücre infiltrasyonundaki rolü, korelasyon ve veri görselleştirme.
Şekil 5: Meme kanserinde immün hücre zenginleşmesi ile MPO ekspresyonu arasındaki korelasyon. (A) MPO ekspresyonu ile ESTIMATE skoru, immün skor ve stromal skor arasındaki korelasyonları gösteren dağılım grafikleri. (B) Medyan ile tanımlanmış MPO-yüksek ve MPO-düşük tümör grupları arasındaki ESTIMATE skoru, immün skor ve stromal skor farklılıklarını gösteren kutu grafikleri. (C) MPO ekspresyonu ile ana immün hücre popülasyonlarının tahmini infiltrasyonu arasındaki ilişkileri gösteren TIMER/TIMER2.0 tabanlı analiz. (D) MPO ekspresyonu ile 24 immün hücre tipine ait ssGSEA ile hesaplanmış zenginleştirme skorları arasındaki Spearman korelasyonlarını gösteren lollipop grafik. Birden fazla immün hücre korelasyonundan elde edilen p-değerleri, Benjamini–Hochberg yanlış keşif oranı yöntemi kullanılarak düzeltilmiştir. (E) TCGA-BRCA kohortu genelinde örnek düzeyindeki bağışıklık hücresi zenginleşme modellerini gösteren ısı haritası. (F) Medyan ile tanımlanan MPO-yüksek ve MPO-düşük tümör grupları arasındaki ssGSEA ile tahmin edilen ilk immün hücre zenginleşme skoru farklarını gösteren kutu grafikleri; grup karşılaştırmaları, Benjamini–Hochberg düzeltmeli Wilcoxon sıra toplamı testi kullanılarak gerçekleştirilmiştir. (G) Medyanla tanımlanmış MPO-yüksek ve MPO-düşük tümör grupları arasındaki ssGSEA ile tahmin edilen ikinci set immün hücre zenginleşme skoru farklarını gösteren kutu grafikleri; grup karşılaştırmaları Benjamini-Hochberg düzeltmeli Wilcoxon sıra toplamı testi kullanılarak gerçekleştirilmiştir. (H) Medyan ile tanımlanmış MPO-düşük ve MPO-yüksek tümör gruplarındaki 2 immün hücre tipi için LM2 imza matrisine dayalı, CIBERSORT ile tahmin edilen immün hücre fraksiyonlarını gösteren yığılmış sütun grafiği. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Gen ifadesi çalışması için DNA metilasyon modellerinin ısı haritası ve sağkalım analizi grafikleri.
Şekil 6: Meme kanserinde MPO geninin DNA metilasyon analizi. (A) Median değerle tanımlanmış MPO-yüksek ve MPO-düşük gruplardaki MPO metilasyon modellerini gösteren ısı haritası. (B) cg27456487 bölgesindeki metilasyonun prognostik önemini gösteren Kaplan-Meier sağkalım eğrisi. (C) cg026873 bölgesindeki metilasyonun prognostik önemini gösteren Kaplan-Meier sağkalım eğrisi. (D) cg0710356 bölgesindeki metilasyonun prognostik önemini gösteren Kaplan-Meier sağkalım eğrisi. (E) cg1151395 bölgesindeki metilasyonun prognostik önemini gösteren Kaplan-Meier sağkalım eğrisi. (F) cg14619064 bölgesindeki metilasyonun prognostik önemini gösteren Kaplan-Meier sağkalım eğrisi. (G) cg23120 bölgesindeki metilasyonun prognostik önemini gösteren Kaplan-Meier sağkalım eğrisi. Lütfen bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayın.

Gen ekspresyon ağı analizi; diyagram, grafik, korelasyon sonuçları; protein etkileşim verileri.
Şekil 7: TCGA veri tabanı kullanılarak mRNA düzeyinde MPO ve nötrofil ilişkili gen korelasyonlarının analizi. (A) Çekirdek protein ile diğer proteinler arasındaki etkileşimleri betimleyen protein etkileşim ağının görselleştirilmesi. (B) En yüksek etkili 20 nötrofil ilişkili genin MPO ile korelasyon analizi; farklı genler için korelasyon katsayılarını ve P-değeri dağılımlarını göstermektedir. (C) En yaygın 20 nötrofil ilişkili gen arasındaki korelasyonların, gen ilişkilerinin gücünü ve yönünü görsel olarak temsil eden koro (chord) diyagramı. (D) En yüksek etkili 20 nötrofil ilişkili genin korelasyon ısı haritası; renk gradyanları ve istatistiksel belirteçler aracılığıyla korelasyon katsayılarını ve anlamlılık düzeylerini göstermektedir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Hücresel kümeler ve ekspresyon analizi; grafikler, ısı haritaları ve ağ diyagramı; RNA sekanslama verileri.
Şekil 8Meme kanseri tek hücre veri setinde tek hücre kümeleme ve MPO ile ilişkili hücre-hücre etkileşimi analizi. (A) Hücre tipi anotasyonu için kümeler genelinde kanonik marker genlerin DotPlot grafiği. (B) Anote edilmiş hücre popülasyonlarının UMAP görselleştirmesi. (C) Hücre kümeleri genelinde seçilmiş marker genlerin ısı haritası. (D) AUCell, ssGSEA ve Seurat AddModuleScore kullanılarak, belirtilen gen setine dayanarak hesaplanan ve açıklanmış hücre tipleri genelindeki MPO ile ilişkili skorları özetleyen DotPlot Ek Dosya 1. (E) MPO ile ilişkili sinyale göre tabakalandırılmış epitelyal tümör hücreleri ile diğer hücre tipleri arasındaki iletişimi gösteren hücre-hücre etkileşim ağı; kenar genişliği etkileşim gücünü ve düğüm boyutu genel etkileşim aktivitesini yansıtmaktadır. (F) Hücre tipleri genelindeki giden ve gelen sinyalizasyon modellerini gösteren ısı haritaları. (G) Epitelyal tümör hücrelerinden diğer hücre tiplerine yönelen ve MPO ilişkili sinyale göre katmanlandırılmış sinyal yolaklarının kabarcık grafiği. (H) Diğer hücre tiplerinden epitelyal tümör hücrelerine doğru gelen, MPO ilişkili sinyale göre katmanlandırılmış sinyal yolaklarının balon grafiği. (I) Açıklamalı hücre tipleri genelindeki MPO ekspresyon dağılımı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayınız.

Veri analizi için UMAP kümeleme diyagramları, gen ekspresyon ısı haritası, sütun grafikleri ve volcano grafiği.
Şekil 9Tek hücreli atlas analizi ve MPO duyarlılık çıktısının keşifsel sanal nakavt analizi. (A) Tek hücre kümeleri boyunca kanonik marker genlerin ekspresyonunu gösteren Nokta Grafiği (DotPlot); nokta boyutu her bir markerı eksprese eden hücrelerin yüzdesini, renk yoğunluğu ise ortalama ekspresyon seviyesini temsil etmektedir. (B) Her bir rengin farklı bir hücre tipini veya kümesini temsil ettiği, açıklama eklenmiş tek hücre popülasyonlarının UMAP görselleştirmesi. (C) Miyeloid hücreler dahil olmak üzere hücre tipleri için marker genlerin ekspresyon dağılımını gösteren, temel marker gen ekspresyonunun UMAP görselleştirmesi. (D) Örnekler genelinde hücre kümesi oranlarını gösteren yığılmış sütun grafiği. (E) MPO gen ekspresyonunun UMAP görselleştirmesi. (F) Tek hücreli sekanslama kalite kontrol (QC) metriklerini gösteren keman grafiği. (G) Temel belirteç genlerin kümeleme grafiği. (H) Küme düzeyindeki kanonik belirteç genlerin DotPlot'u. (I) Sanal nakavt duyarlılık analizinde değişen genlerin volcano grafiği. (J) Yer değiştirme ile anlamlılık arasındaki ilişkiyi gösteren saçılım grafiği. (K) Manifold hizalama ok grafiği. (L) Sanal nakavt çıktısındaki genlerin GO BP zenginleştirme analizi. (M) Sanal nakavt (knockdown) çıktısındaki genlerin KEGG yolak zenginleştirme analizi. (N) MPO hariç tutulduktan sonra en yüksek manifold yer değiştirmesine sahip ilk 20 gen. Lütfen bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayın.

Ek Şekil 1: TCGA-BRCA kohortunda MPO için ek sağkalım analizleri. (A,B) Bu dosya, medyan tümör MPO ekspresyon kesme noktasına göre katmanlandırılmış (A) genel sağkalım ve (B) hastalığa özgü sağkalım için ek Kaplan-Meier sağkalım analizlerini içermektedir. Bu analizler, Şekil 2D'ye ek sonuç analizleri olarak sunulmuştur ve mevcut kohortta istatistiksel olarak anlamlı bulunmamıştır.Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 2: MPO için keşifsel aday transkripsiyon faktörü anotasyonu. (A) Üç halka açık transkripsiyon faktörü kaynağındaki aday transkripsiyon faktörlerinin kesişimini gösteren Venn şeması. (B) MYC ekspresyon karşılaştırma çıktısı. (C) Satır ve sütun etiketli transkripsiyon faktörü korelasyon ısı haritası. (D) MPO–MYC korelasyon çıktısı. (E) MYC sağkalım analizi çıktısı. (F) MYC ROC çıktısı. MYC ile ilgili çıktılar yalnızca tamamlayıcı aday transkripsiyon faktörü anotasyonları olarak gösterilmiştir ve mekanistik üst düzenleyici sonuçlarını desteklemek için kullanılmamıştır.Lütfen bu dosyayı indirmek için buraya tıklayın.

Ek Şekil 3: MPO için keşifsel DGIdb ilaç-gen geri çağırma çıktısıGri düğümler MPO genini, turuncu düğümler erişilen küçük molekül girişlerini ve bağlantı çizgileri veri tabanı tarafından tahmin edilen ilaç-gen ilişkilerini temsil etmektedir.Lütfen bu dosyayı indirmek için buraya tıklayın.

Ek Tablo 1: 2 immün hücre tipinin CIBERSORT tabanlı immün hücre dekonvolüsyon analizi için kullanılan LM2 immün hücre imza matrisiGen sembolleri standardize edildi, mükerrer girişler kaldırıldı ve mevcut genler, ileri analizlerden önce ilgili TCGA-BRCA veya GSE161529 ekspresyon matrisleri ile kesiştirildi.Lütfen bu dosyayı indirmek için buraya tıklayın.

Ek Tablo 2: STRING/PPI analizi, merkez gen önceliklendirmesi ve MPO–merkez gen korelasyon analizi için kullanılan nötrofil ilişkili gen listesi. Lütfen bu dosyayı indirmek için buraya tıklayın.

Ek Tablo 3: MPO için keşifsel DGIdb ilaç-gen geri çağırma ve ADMET anotasyon çıktılarıBu dosya, DGIdb'den alınan MPO ile ilişkili kimyasal-gen etkileşim kayıtları ile bileşik düzeyindeki öngörülen fizikokimyasal, farmakokinetik ve toksisiteyle ilgili açıklama notlarını içermektedir. Bu çıktılar yalnızca ön kimyasal açıklamalar olarak sunulmuştur ve terapötik aday listeleri olarak yorumlanmamalıdır. Bu veriler; MPO inhibasyonunu, hedef etkileşimini, ligand spesifikliğini, seçiciliğini, güvenliğini, terapötik etkinliğini veya klinik uygunluğunu kanıtlamaz. Bu tablodaki değerler, listelenen bileşikler için öngörülen fizikokimyasal ve ilaç benzerliği parametrelerini temsil etmektedir. Moleküler ağırlık gram/mol (g/mol) cinsinden ifade edilmiştir. Hidrojen bağı akseptörü ve hidrojen bağı donörü değerleri, sırasıyla öngörülen hidrojen bağı akseptörü ve donörü sayılarını belirtmektedir. Moriguchi oktanol-su partisyon katsayısı, öngörülen lipofillisiteyi ifade eder. Lipinski ihlalleri, her bir bileşik tarafından karşılanmayan Lipinski beşli kuralı kriterlerinin sayısını belirtir. Biyoyararlanım skoru, öngörülen oral biyoyararlanım ile ilgili skoru temsil eder ve topolojik yüzey alanı, öngörülen topolojik polar yüzey alanını ifade eder.Lütfen bu dosyayı indirmek için buraya tıklayın.

Ek Dosya 1: AUCell, Seurat AddModuleScore ve ssGSEA ile tek hücreli imza skorlaması için kullanılan MPO ilişkili gen listesi. Lütfen bu dosyayı indirmek için buraya tıklayın.

Ek Dosya 2: MPO için keşifsel aday transkripsiyon faktörü ve miRNA anotasyon çıktılarıBu dosya, KnockTF, ChIP-Atlas, GTRD ve TargetScan dahil olmak üzere kamuya açık kaynaklara dayalı, veri tabanından türetilmiş aday transkripsiyon faktörü ve miRNA anotasyon sonuçlarını içermektedir. Bu anotasyonlar yalnızca keşifsel aday önceliklendirmesi için sağlanmıştır ve meme kanserinde MPO'nun yukarı akış regülasyonuna dair fonksiyonel kanıt olarak yorumlanmamalıdır.Lütfen bu dosyayı indirmek için buraya tıklayın.

Tartışma

Bu çalışma, meme kanserinde MPO ekspresyonu ile immün/miyeloid özellikler arasındaki ilişkileri incelemek için keşifsel bir kamu veri seti ve in silico iş akışı sunmaktadır. TCGA-BRCA analizleri, MPO ekspresyonunun tümör dokularında komşu tümör dışı dokulara göre daha düşük olduğunu ve daha yüksek MPO ekspresyonunun daha uzun bir progresyonsuz aralık ile ilişkili olduğunu göstermiştir. Ancak, genel sağkalım ve hastalığa özgü sağkalım istatistiksel olarak anlamlı bulunmamıştır. Bu nedenle, mevcut kanıtlara dayanarak MPO, güçlü veya yerleşmiş bir prognostik biyobelirteç olarak yorumlanmamalıdır. Gelecekteki çalışmalar; MPO'yu, yerleşmiş klinikopatolojik değişkenlere göre ayarlanmış çok değişkenli Cox regresyon modelleri, bağımsız doğrulama kohortları ve alt tip tabakalı analizler kullanarak değerlendirmelidir.

Geleneksel tek kohortlu diferansiyel ekspresyon analizleri veya tek platformlu immün infiltrasyon tahminleri ile karşılaştırıldığında, bu MPO merkezli iş akışı; MPO ile ilişkili immün/miyeloid özelliklerin daha geniş bir keşifsel görünümünü sağlamak amacıyla bulk transkriptomik, immün zenginleştirme, metilasyon anotasyonu, tek hücre haritalama ve sanal pertürbasyonu entegre etmektedir. Bununla birlikte, bu iş akışı; dış kohort validasyonunun, mekansal veya protein düzeyindeki validasyonun ve deneysel pertürbasyon analizlerinin yerine geçmekten ziyade, bunlara tamamlayıcı bir nitelik taşımaktadır.

İmmün infiltrasyon ve zenginleştirme sonuçları, MPO kaynaklı immün yeniden şekillenmeden ziyade MPO ile ilişkili immün bağlam olarak yorumlanmalıdır. MPO ağırlıklı olarak nötrofillerde ve diğer myeloid soy hücrelerinde eksprese edilir37. Bu nedenle, MPO ekspresyonu ile ESTIMATE skorları, immün skorlar, immün hücre zenginleştirme skorları, nötrofil ilişkili genler, sitokin yolakları, antijen sunumu imzaları veya nötrofil degranülasyon yolakları arasındaki pozitif korelasyonlar biyolojik olarak makuldür ve büyük ölçüde bulk tümör örneklerindeki immün/myeloid hücre bolluğundaki farklılıkları yansıtıyor olabilir. Bu yorum, MPO-pozitif nötrofil infiltrasyonunun meme kanserinde olumlu bir prognozla ilişkili olduğunu ve MPO'nun dendritik hücre fonksiyonu ve T hücresi kaynaklı doku inflamasyonunda rol oynadığını gösteren önceki çalışmalarla tutarlıdır38,39. Bulk RNA-seq verileri, MPO'nun tümör hücresine özgü bir aktivitesi olup olmadığını veya gözlemlenen sinyalin öncelikle infiltre olan immün hücreleri yansıtıp yansıtmadığını belirleyemez. Hücresel kaynağı ve fonksiyonu netleştirmek için bağımsız tek hücre veri setleri, uzamsal profilleme, immünohistokimya, akış sitometrisi veya perturbasyon tabanlı deneysel modellere ihtiyaç duyulacaktır.

Tek hücreli analiz ek tanımlayıcı bilgiler sağlamaktadır, ancak seyrek MPO saptaması nedeniyle sınırlı kalmaktadır. KNN tabanlı komşuluk genişletmesi öncesinde başlangıçta yalnızca 85 MPO-pozitif hücre saptanmıştır. KNN genişletmesi, MPO-pozitif hücrelerin yerel transkripsiyonel komşuluğundaki hücrelerin duyarlılık analizine izin vermiş olsa da bu prosedür, doğrudan MPO eksprese etmeyen hücreleri de içerebilir. Buna bağlı olarak, scTenifoldKnk sanal nakavt çıktısı, MPO aracılı yolak regülasyonunun bir kanıtından ziyade, keşifsel bir hesaplama duyarlılık analizi olarak yorumlanmalıdır40. Mekanistik sonuçlar çıkarılmadan önce, bağımsız tek hücreli meme kanseri veri setlerinde ve ortogonal deneysel analizlerle doğrulama yapılması gerekecektir.

Transkripsiyon faktörü analizi de ihtiyatla yorumlanmalıdır. KnockTF, GTRD ve ChIP-Atlas tahminlerinin örtüşmesi ve ardından derece tabanlı önceliklendirme, aday transkripsiyon faktörlerini belirleyebilir ancak meme kanserinde MPO'nun fonksiyonel transkripsiyonel düzenlemesini kanıtlayamaz. Bu nedenle MYC ve diğer aday faktörler yalnızca keşif amaçlı açıklamalar olarak tutulmuştur. Transkripsiyon faktörü aktivitesi yüksek derecede bağlama bağımlı olduğundan ve tümör alt tipine, hücresel kompozisyona, analiz platformuna ve ön işleme stratejisine göre değişiklik gösterebileceğinden, herhangi bir aday faktöre yukarı yönlü bir düzenleyici rol atanmadan önce bağlama özgü doğrulama gerekecektir. Böyle bir doğrulama; ChIP-qPCR veya ChIP-seq, promotör raporlayıcı analizleri ve transkripsiyon faktörü pertürbasyonu ile ardından MPO ekspresyonunun ölçümünü içermelidir.

İlaç-gen geri çağırma ve ADMET anotasyonları da ihtiyatla yorumlanmalıdır. DGIdb, seçici MPO ligandları olmayan ve klinik olarak uygulanabilirliği sınırlı olabilecek veya elverişsiz toksikolojik özelliklere sahip bileşikler dahil olmak üzere heterojen kimyasal-gen ilişkileri döndürebilir36. ADMET tahminleri öncül kimyasal anotasyonlar sağlar ancak hedef etkileşimini, potensi, seçiciliği, güvenliği veya terapötik etkinliği belirlemez41. Bu nedenle, mevcut bileşik düzeyindeki sonuçlar terapötik potansiyeli çıkarımı yapmak için kullanılmamalıdır. Anlamlı bir translasyonel değerlendirme; farmakolojik olarak ilgili kürat edilmiş bir MPO inhibitörleri veya probları setini, yerleşik MPO hedefli bileşiklerle karşılaştırmayı ve biyokimyasal, hücresel ve farmakolojik deneyler kullanılarak doğrulamayı gerektirecektir. İlaçla ilgili bulgular yorumlanırken, MPO'nun kanserdeki bağlama bağımlı ve potansiyel olarak ikili rolü de dikkate alınmalıdır. MPO; oksidatif stres, reaktif oksidant üretimi, DNA hasarı, kronik inflamasyon ve tümör mikroçevresinin yeniden şekillendirilmesi yoluyla tümör destekleyici süreçlere katkıda bulunabilir. Aynı zamanda, toplu tümör veri setlerindeki MPO ekspresyonu, bazı bağlamlarda immün-aktif bir mikroçevre ve daha olumlu klinik sonuçlarla ilişkili olabilen nötrofil veya diğer myeloid immün hücrelerin infiltrasyonunu yansıtabilir39,42. Bu nedenle MPO'nun biyolojik yorumu; tümör tipine, hücresel kaynağa, hastalık evresine ve immün hücre kompozisyonuna bağlıdır.

MPO lokusundaki DNA metilasyon bulguları da keşifsel olarak değerlendirilmiştir. Seçilen CpG bölgeleri MethSurv analizinde sağkalım ilişkileri göstermiştir, ancak prognostik veya mekanistik sonuçlar çıkarılmadan önce bu sonuçların bağımsız olarak doğrulanması gerekmektedir. MPO'nun epigenetik düzenlemesi, transkripsiyon faktörü bağlanması ve kromatin düzeyindeki düzenleme ile etkileşim içinde olabilir, ancak bu tür etkileşimler fonksiyonel kromatin veya pertürbasyon verileri olmadan spekülatif kalmaktadır43.

MPO ekspresyonunun klinik etkileri ihtiyatla değerlendirilmelidir. Mevcut sonuçlar, MPO'yu klinik olarak uygulanabilir bir biyobelirteç veya meme kanserinde şu an için immünoterapi kararlarına yön verebilecek bir belirteç olarak tanımlamamaktadır. Aksine MPO, tümör mikroçevresindeki myeloid/nötrofil ilişkili bir immün bağlamı yansıtıyor olabilir. Gelecekteki çalışmalarda MPO ekspresyonu; tümörle ilişkili lenfositler, PD-L1 ekspresyonu, immün kontrol noktası gen ekspresyonu, moleküler alt tip ve valide edilmiş immün imzalar dahil olmak üzere yerleşik immünoterapi ilişkili belirteçlerle birlikte değerlendirilebilir. MPO'nun hasta stratifikasyonu veya immünoterapi karar verme süreçleri için değerlendirilebilmesi öncesinde, bu tür analizlerin bağımsız kohortları, çok değişkenli modelleri ve tedavi yanıt veri setlerini kapsaması gerekmektedir.

Tutarlı TCGA-BRCA veri ön işleme, yalnızca tümör temelli medyan bazlı MPO-yüksek/MPO-düşük gruplandırma, önceden tanımlanmış istatistiksel eşikler ve çoklu test düzeltmesi, immün hücre zenginleştirme algoritmaları ve imza setleri, tek hücreli kalite kontrolü ve anotasyonu, KNN tabanlı MPO-komşuluk genişletmesi ve sanal nakavt ile DGIdb/ADMET çıktılarının keşifsel işlenmesi dahil olmak üzere birçok iş akışı adımı tekrarlanabilirlik açısından kritiktir. Bu parametrelerdeki değişiklikler, alt sonuçları ve yorumlamayı etkileyebilir; bu nedenle, bu parametreler dikkatle raporlanmalı ve tekrarlanmalıdır. Sorun giderme aşamasında, tutarsız çıktılar; örnek kaynağı, ekspresyon normalizasyonu, gruplandırma kesme noktası, çoklu test düzeltmesi, immün hücre imza setleri, tek hücreli QC ve anotasyonu, KNN-komşuluk tanımı, sanal nakavt eşikleri, zenginleştirme kesme noktaları ve heterojen DGIdb/ADMET bileşik kayıtları kontrol edilerek ele alınmalıdır.

Bu çalışmanın bazı kısıtlamaları kabul edilmelidir. İlk olarak, bu çalışma TCGA-BRCA ve kamuya açık tek hücre verilerini kullanan kamuya açık veri tabanlarının retrospektif analizlerine dayanmaktadır ve bu nedenle kohort heterojenliğinden, örnek kaynağı farklılıklarından, parti etkilerinden, eksik klinik açıklamalardan ve tümör kompozisyon farklılıklarından etkilenmiş olabilir. İkinci olarak, mevcut bulgular temel olarak transkriptomik ilişkilerden ve in silico analizlerden türetilmiştir ve doğrudan deneysel doğrulamadan yoksundur. Bu nedenle, MPO ekspresyonu, immün/miyeloid özellikler, metilasyon açıklamaları, transkripsiyon faktörü adayları ve sanal knockdown çıktıları arasındaki gözlemlenen ilişkiler nedensel mekanizmalar olarak yorumlanmamalıdır. Üçüncü olarak, tek hücre veri setindeki MPO tespiti seyrektir ve KNN tabanlı komşuluk genişletmesinden önce yalnızca 85 MPO-pozitif hücre tespit edilmiştir. Genişletilmiş MPO-komşuluk alt kümesi, düşük veya tespit edilemeyen MPO ekspresyonuna sahip hücreleri içerebilir ve saf bir MPO-pozitif popülasyon olarak değerlendirilmemelidir. Dördüncü olarak, MPO ağırlıklı olarak nötrofiller ve diğer miyeloid soy hücreleri ile ilişkili olduğundan, bulk RNA-seq verilerindeki MPO ile ilişkili sinyaller, tümör hücresine özgü aktiviteyi yansıtmaktan ziyade, immün hücre bolluğu, tümör saflığı ve hücresel kompozisyon tarafından etkilenmiş olabilir. Son olarak, DGIdb tabanlı ilaç-gen geri çağırımı ve ADMET açıklamaları yalnızca keşifsel kimyasal açıklamalar niteliğindedir. Bu çıktılar; MPO inhibisyonunu, hedef etkileşimini, seçiciliği, güvenliği, terapötik etkinliği veya klinik uygunluğu kanıtlamaz. Bu bulguların biyolojik ve klinik önemini doğrulamak için bağımsız kohortların, mekansal veya protein düzeyinde doğrulamanın ve fonksiyonel deneylerin kullanıldığı gelecek çalışmalara ihtiyaç vardır.

Özetle, mevcut halka açık veri seti analizleri, meme kanserinde MPO ekspresyonu ile immün/miyelyoid transkripsiyonel özellikler arasındaki ilişkiyi desteklemekte olup, analiz edilen kohortta daha yüksek MPO ekspresyonu daha uzun progresyonsuz aralıkla ilişkilendirilmiştir. Bulgular keşifsel düzeydedir ve hipotez oluşturma niteliğindedir. Bu bulgular, MPO'nun tümör immün mikroçevresini nedensel olarak düzenlediğini, MYC'nin MPO'yu fonksiyonel olarak düzenlediğini veya elde edilen bileşiklerin terapötik önemi olduğunu kanıtlamamaktadır. Bu çalışmanın temel katkıları, tekrarlanabilir bir hesaplamalı iş akışı ve harici kohort doğrulaması ile deneysel onay gerektiren bir dizi test edilebilir hipotezdir.

Açıklamalar

Yazarlar, bu çalışmada herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan etmektedir. AI tabanlı bir dil düzenleme aracı, yalnızca taslak revizyonu sırasında İngilizce dilinin iyileştirilmesi ve okunabilirliğin artırılmasına yardımcı olmak amacıyla kullanılmıştır. Bu araç; çalışma tasarımı, veri analizi, şekil oluşturma, sonuçların yorumlanması, referans seçimi veya bilimsel sonuçların çıkarılması için kullanılmamıştır. Tüm analizler, sonuçlar, yorumlar, referanslar ve nihai metin; makalenin içeriği için tüm sorumluluğu üstlenen yazarlar tarafından dikkatle kontrol edilmiş, gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır.

Teşekkürler

Yazarlar, Aerospace Center Hospital Bilimsel Araştırma Fonu'ndan (YN202530) aldıkları finansal destek için müteşekkirler.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
CellChatR paketi/Açık kaynakhttps://github.com/sqjin/CellChatHücre-hücre iletişimi analizi
ChIP-AtlasKamu veritabanıhttps://chip-atlas.org/TF hedef taraması; 2021 güncellemesi 
clusterProfilerBioconductorhttps://bioconductor.org/packages/clusterProfiler/GO/KEGG zenginleştirme analizi; v4.4.4
CytoscapeCytoscape Konsorsiyumuhttps://cytoscape.org/Ağ görselleştirme ve topoloji analizi
DGIdbWashington Üniversitesi/Kamu veritabanıhttps://www.dgidb.org/İlaç-gen etkileşimi sorgulama
GDC/TCGA-BRCAUlusal Kanser Enstitüsühttps://portal.gdc.cancer.gov/Bulk transkriptomik ve klinik veri kaynağı
Gene Expression Omnibus: GSE161529NCBIhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/Tek hücreli veri seti kaynağı
GSEA/MSigDBBroad Enstitüsühttps://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdbGen seti zenginleştirme analizi ve gen-seti referansı; Versiyon 3.0 
GSVABioconductorhttps://bioconductor.org/packages/GSVA/Gen seti varyasyonu/ssGSEA ile ilişkili skorlama; Versiyon 1.46.0
GTRDKamu veritabanıhttp://gtrd.biouml.org/TF hedef taraması; 2021 
KnockTFKamu veritabanıhttp://www.licpathway.net/KnockTF/index.htmlTF perturbasyon kaynağı; Versiyon 2.0 
RR İstatistiksel Hesaplama Vakfıhttps://www.r-project.org/İstatistiksel hesaplama ortamı
scTenifoldKnkR paketi/Açık kaynakhttps://github.com/cailab-tamu/scTenifoldKnkSanal knockdown analizi
SeuratR paketi/Açık kaynakhttps://satijalab.org/seurat/Tek hücreli ön işleme ve kümeleme
STRINGELIXIR/Kamu veritabanıhttps://string-db.org/Protein-protein etkileşim analizi; v11 
SwissADMESIB İsviçre Biyoenformatik Enstitüsühttp://www.swissadme.ch/İlaç benzerliği değerlendirmesi; 2017 sürümü/web aracı 
TIMERKamu web kaynağıhttps://timer.cistrome.org/İmmün infiltrasyon analizi; TIMER2.0 
UCSC Xena veya bağlantılı TCGA portalıUCSChttps://xenabrowser.net/Keşifsel veri erişimi/doğrulama 

Kaynaklar

  1. Onkar SS, et al. The great immune escape: Understanding the divergent immune response in breast cancer subtypes. Cancer Discov. 2023;13(1):23-40.
  2. Quail DF, Park M, Welm AL, Ekiz HA. Breast cancer immunity: It is time for the next chapter. Cold Spring Harb Perspect Med. 2024;14(2):a041324.
  3. Valadez-Cosmes P, Raftopoulou S, Mihalic ZN, Marsche G, Kargl J. Myeloperoxidase: Growing importance in cancer pathogenesis and potential drug target. Pharmacol Ther. 2022;236:108052.
  4. Ohshima H, Tatemichi M, Sawa T. Chemical basis of inflammation-induced carcinogenesis. Arch Biochem Biophys. 2003;417(1):3-11.
  5. Davies MJ, Hawkins CL. The role of myeloperoxidase in biomolecule modification, chronic inflammation, and disease. Antioxid Redox Signal. 2020;32(13):957-981.
  6. Gomez-Mejiba SE, et al. Myeloperoxidase-induced genomic DNA-centered radicals. J Biol Chem. 2010;285(26):20062-20071.
  7. Eruslanov EB, et al. Tumor-associated neutrophils stimulate T cell responses in early-stage human lung cancer. J Clin Invest. 2014;124(12):5466-5480.
  8. Däster S, et al. Absence of myeloperoxidase and CD8 positive cells in colorectal cancer infiltrates identifies patients with severe prognosis. Oncoimmunology. 2015;4(12):e1050574.
  9. Droeser RA, et al. High myeloperoxidase positive cell infiltration in colorectal cancer is an independent favorable prognostic factor. PLoS One. 2013;8(5):e64814.
  10. Gerber-Ferder Y, et al. Breast cancer remotely imposes a myeloid bias on haematopoietic stem cells by reprogramming the bone marrow niche. Nat Cell Biol. 2023;25(12):1736-1745.
  11. Xu H, et al. Single-cell transcriptomics reveals CCL3+ classical monocyte subset linked to autoimmune pathogenesis. J Inflamm Res. 2025;18:16273-16291.
  12. Jiahao S, Cong W, Xin L, Xu C, Wenpeng X, et al. BCAT1 mediates the carcinogenic effects of environmental bisphenol exposure: mechanistic discoveries in osteosarcoma and pan-cancer analysis. Mol Divers. 2026. doi:10.1007/s11030-026-11566-7.
  13. Huo Z, Sun W, Lou C, Yang T. Integrated single-cell and spatial mapping coupled with machine learning unveils core stemness landscapes and regulatory drivers in triple-negative breast cancer. Discov Oncol. 2026;17(1):602.
  14. Das SC, et al. Comprehensive bioinformatics and machine learning analyses for breast cancer staging using TCGA dataset. Brief Bioinform. 2024;26(1):bbae628.
  15. Szklarczyk D, et al. STRING v11: protein-protein association networks with increased coverage, supporting functional discovery in genome-wide experimental datasets. Nucleic Acids Res. 2019;47(D1):D607-D613.
  16. Yu G, Wang LG, Han Y, He QY. clusterProfiler: an R package for comparing biological themes among gene clusters. OMICS. 2012;16(5):284-287.
  17. Ashburner M, et al. Gene ontology: tool for the unification of biology. Nat Genet. 2000;25(1):25-29.
  18. Kanehisa M, Goto S. KEGG: Kyoto encyclopedia of genes and genomes. Nucleic Acids Res. 2000;28(1):27-30.
  19. Chen GY, et al. Integrating network pharmacology and experimental validation to explore the key mechanism of gubitong recipe in the treatment of osteoarthritis. Comput Math Methods Med. 2022;2022:7858925.
  20. Chen GY, et al. Prediction of Rhizoma Drynariae targets in the treatment of osteoarthritis based on network pharmacology and experimental verification. Evid Based Complement Alternat Med. 2021;2021:5233462.
  21. Liberzon A, et al. Molecular signatures database MSigDB 3.0. Bioinformatics. 2011;27(12):1739-1740.
  22. Subramanian A, et al. Gene set enrichment analysis: a knowledge-based approach for interpreting genome-wide expression profiles. Proc Natl Acad Sci U S A. 2005;102(43):15545-15550.
  23. Li B, et al. Comprehensive analyses of tumor immunity: implications for cancer immunotherapy. Genome Biol. 2016;17(1):174.
  24. Li T, et al. TIMER: A web server for comprehensive analysis of tumor-infiltrating immune cells. Cancer Res. 2017;77(21):e108-e110.
  25. Li T, et al. TIMER2.0 for analysis of tumor-infiltrating immune cells. Nucleic Acids Res. 2020;48(W1):W509-W514.
  26. Hänzelmann S, Castelo R, Guinney J. GSVA: gene set variation analysis for microarray and RNA-seq data. BMC Bioinformatics. 2013;14:7.
  27. Modhukur V, et al. MethSurv: a web tool to perform multivariable survival analysis using DNA methylation data. Epigenomics. 2018;10(3):277-288.
  28. Feng C, et al. KnockTF: a comprehensive human gene expression profile database with knockdown/knockout of transcription factors. Nucleic Acids Res. 2020;48(D1):D93-D100.
  29. Feng C, et al. KnockTF 2.0: a comprehensive gene expression profile database with knockdown/knockout of transcription co-factors in multiple species. Nucleic Acids Res. 2024;52(D1):D183-D193.
  30. Oki S, et al. ChIP-Atlas: a data-mining suite powered by full integration of public ChIP-seq data. EMBO Rep. 2018;19(12):e46255.
  31. Zou Z, Ohta T, Miura F, Oki S. ChIP-Atlas 2021 update: a data-mining suite for exploring epigenomic landscapes by fully integrating ChIP-seq, ATAC-seq and Bisulfite-seq data. Nucleic Acids Res. 2022;50(W1):W175-W182.
  32. Kolmykov S, et al. GTRD: an integrated view of transcription regulation. Nucleic Acids Res. 2021;49(D1):D104-D111.
  33. Yevshin I, Sharipov R, Kolmykov S, Kondrakhin Y, Kolpakov F. GTRD: a database on gene transcription regulation—2019 update. Nucleic Acids Res. 2019;47(D1):D100-D105.
  34. Tang D, et al. SRplot: A free online platform for data visualization and graphing. PLoS One. 2023;18(11):e0294236.
  35. Wang Y, et al. Immunological profiling of rheumatoid factor-positive primary Sjögren's syndrome by single-cell RNA sequencing. Front Immunol. 2026;17:1822615.
  36. Daina A, Michielin O, Zoete V. SwissADME: a free web tool to evaluate pharmacokinetics, drug-likeness and medicinal chemistry friendliness of small molecules. Sci Rep. 2017;7:42717.
  37. Lin W, Chen H, Chen X, Guo C. The roles of neutrophil-derived myeloperoxidase MPO in diseases: The new progress. Antioxidants. 2024;13(1):132.
  38. Odobasic D, et al. Neutrophil myeloperoxidase regulates T-cell-driven tissue inflammation in mice by inhibiting dendritic cell function. Blood. 2013;121(20):4195-4204.
  39. Zeindler J, et al. Infiltration by myeloperoxidase-positive neutrophils is an independent prognostic factor in breast cancer. Breast Cancer Res Treat. 2019;177(3):581-589.
  40. Osorio D, et al. scTenifoldKnk: An efficient virtual knockout tool for gene function predictions via single-cell gene regulatory network perturbation. Patterns. 2022;3(3):100434.
  41. Li X, Tang L, Li Z, Qiu D, Yang Z, et al. Prediction of ADMET properties of anti-breast cancer compounds using three machine learning algorithms. Molecules. 2023;28(5):2326.
  42. Scandolara TB, et al. Anti-neutrophil antibodies anti-MPO-ANCAs are associated with poor prognosis in breast cancer patients. Immunobiology. 2020;225(6):152011.
  43. Gilbert J, Gore SD, Herman JG, Carducci MA. The clinical application of targeting cancer through histone acetylation and hypomethylation. Clin Cancer Res. 2004;10(14):4589-4596.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Tek H cre AnaliziBiyoenformatik Akmm n nfiltrasyonTCGA BRCAMiyeloid zelliklermm n Dekonvol syonla Gen Etkile imi

İlgili makaleler