Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Hasta Kaynaklı Kolon Tümör Organoidi-İmmün Hücre Ko-kültürlerini Değerlendirmek İçin Çok Modlu Bir Çerçeve

196 görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/71204

⸱

3 Eylül 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Montefiore Einstein Comprehensive Cancer Center, Albert Einstein College of Medicine, 2Department of Oncology and Molecular Pharmacology, Albert Einstein College of Medicine, 3Department of Cell Biology, Albert Einstein College of Medicine, 4Department of Surgery, Albert Einstein College of Medicine

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Bu protokol, otolog lenfositlerle birlikte kültür ortamında hasta kaynaklı kolon tümör organoidlerinin oluşturulmasını ve ardından T hücresi reaktivitesi ile tedavi etkinliğini değerlendirmek amacıyla terapötik küçük moleküller ve immün kontrol noktası inhibitörleri ile tedavi edilmesini açıklamaktadır.

Özet

T hücreleri kanser immünoterapisinde kilit bir rol oynar ve bu hücrelerin tümörlerle olan etkileşimlerini anlamak, yeni immünoterapilerin geliştirilmesi için esastır. Bu protokol, biyobankamızdan kolorektal kanser hastasından türetilmiş organoidlerin (PDO'lar) kurulması ve otolog PDO-T hücresi ko-kültür sistemlerinin geliştirilmesine yönelik adım adım iş akışını tanımlamaktadır. Annexin V NIR ve cleaved caspase-3 boyamalarını kullanarak, T hücresi reaktivitesini, sitotoksisitesini ve tümör organoid öldürmesini değerlendirmek amacıyla yüzey ve hücre içi boyama için akış sitometrisi protokollerini standardize ettik. Akış sitometrisi tabanlı analizlerin yanı sıra protokol; granzyme B ve perforin sekresyonunu nicelendirmek için ELISpot analizleri ve Annexin V tabanlı apoptoz tespiti aracılığıyla T hücresi aracılı tümör öldürmesini zaman içinde izlemek için canlı hücre görüntüleme gibi fonksiyonel analizlere yönelik metodolojik yaklaşımları da içermektedir. Bu iş akışı ayrıca, hem monoterapi hem de kombinasyon tedavi ortamlarında hedef inhibitörlerin ve immün kontrol noktası inhibitörlerinin dahil edilmesi dahil olmak üzere ko-kültür koşullarının kurulumunu detaylandırmaktadır. T hücresi reaktivitesi için CD137, T hücresi degranülasyonu için CD107a, tümör apoptozu için caspase-3 ve tümör proliferasyonu için Ki67 dahil olmak üzere temel immünolojik ve tümörle ilişkili markerların seçimi ve uygulanması için kılavuzlar sağlanmıştır. Toplu olarak bu çalışma; kolorektal kanser organoid kurulumu, otolog T hücresi kültürü ve ekspansiyonu, ko-kültür kurulumu, terapötik perturbasyonlar ile akış sitometrisi, ELISpot, konfokal mikroskopi ve canlı hücre görüntüleme kullanılarak yapılan aşağı akış analizleri için kapsamlı ve tekrarlanabilir bir çerçeve sunmaktadır.

Giriş

Erken teşhis ve multimodal tedavilerdeki ilerlemelere rağmen, kolorektal kanser (CRC) dünya çapında kansere bağlı ölümlerin önde gelen nedenlerinden biri olmaya devam etmektedir1. Hasta sonuçlarını iyileştirmedeki temel zorluklardan biri, insan CRC'sinde gözlemlenen karmaşık mimariyi, intratümöral heterojeniteyi, tümör-immün etkileşimlerini ve terapötik yanıtları doğru şekilde yeniden oluşturabilen preklinik modellerin eksikliğidir2,3,4,5,6. Genetik olarak mühendislik ürünü fare modelleri (GEMM'ler) ve hastadan türetilen ksenogreftler (PDX'ler) dahil olmak üzere geleneksel modeller, CRC araştırmalarını önemli ölçüde ilerletmiş olsa da belirgin sınırlamalara sahiptir. GEMM'ler genellikle insan tümörlerinin çeşitliliğini yakalamakta yetersiz kalır ve insan fizyolojisinden önemli ölçüde farklı olan fare mikroçevrelerinde geliştirilirler. Benzer şekilde, PDX modelleri tümör heterojenitesinin bazı yönlerini korur ancak maliyetli ve zaman alıcıdırlar, immün yetmez farelere bağımlıdırlar ve türler arası farklılıklar nedeniyle insana özgü immün yanıtları çalışma kapasiteleri sınırlıdır7,8. Ayrıca, küçük hayvan kullanımına yönelik artan kısıtlamalar, insanla daha ilişkili ve etik açıdan daha sürdürülebilir alternatiflerin gerekliliğini vurgulamaktadır.

Son yıllarda, hasta türevli organoidler (PDO'lar), translasyonel kanser araştırmaları için dönüştürücü bir platform olarak ortaya çıkmıştır. Taze cerrahi veya biyopsi örneklerinden üretilen CRC organoidleri; klonal çeşitlilik ve tedaviye yanıt veren hücre durumları dahil olmak üzere, primer tümörlerin histolojik, genetik ve fenotipik özelliklerini korur. Bu özellikler, PDO'ları hastalık modellemesi, fonksiyonel genomik, biyobelirteç keşfi ve kişiselleştirilmiş tıp için değerli araçlar haline getirmektedir7,8,9,10,11. Önemli bir nokta olarak, insan immün bileşenlerinin organoid sistemlerine dahil edilmesi, bu sistemlerin kullanım alanını daha da genişletmiştir. CRC organoidlerinin periferik kan mononükleer hücreleri (PBMC'ler) veya mühendislik ürünü immün alt kümeleri ile ko-kültürü; tümör-immün etkileşimlerinin, immün kaçış mekanizmalarının, antijen sunumunun ve immünoterapi yanıtlarının fizyolojik olarak ilgili bir sistemde araştırılmasına olanak tanır12. Bu tür modeller, kontrol noktası inhibitörlerinin, CAR-T/TCR tedavilerinin ve bispesifik antikorların değerlendirilmesini desteklerken, öngörücü biyobelirteçler ve direnç mekanizmaları hakkında içgörü sağlar.

İmmünoterapinin ötesinde, CRC organoidleri ilaç tarama ve hassas onkoloji uygulamaları için giderek daha önemli hale gelmiştir. Bireysel tedavi yanıtlarını öngörmek amacıyla, hastadan türetilen kültürler kemoterapötik ve hedeflenmiş terapötik ajanlara karşı test edilebilir; birçok çalışma organoid yanıtları ile klinik sonuçlar arasında korelasyonlar olduğunu göstermiştir. Bu nedenle, söz konusu sistemler geleneksel hayvan tabanlı yaklaşımlara karşı ölçeklenebilir ve hasta merkezli bir alternatif sunmaktadır10,13,14,15,16,17,18.

Burada, translasyonel ve preklinik araştırmalar için hastadan türetilmiş CRC organoidlerinin oluşturulması ve bunların immün ko-kültür sistemlerine entegrasyonu için uygulanabilir ve ölçeklenebilir bir protokol sunulmaktadır. Tümör dokuları enzimatik olarak ayrıştırılır ve tümör heterojenliğini ve soy farklılaşmasını koruyan optimize edilmiş büyüme koşulları altında üç boyutlu bir ekstraselüler matrise gömülür. Oluşturulan organoidler genişletilebilir, kriyoprezerve edilebilir, genetik olarak manipüle edilebilir ve moleküler karakterizasyon, ilaç perturbasyon çalışmaları ve immün profilleme dahil olmak üzere alt uygulamalar için kullanılabilir. Ek olarak, PBK'lar ile yapılan ko-kültür; immün kaynaklı sitotoksisitenin, kontrol noktası blokaj hassasiyetinin ve tümöre özgü immün aktivasyonun değerlendirilmesine olanak tanır.

Ayrıca doku işleme, organoid kalite değerlendirmesi, akış sitometrik analiz, immünofloresan görüntüleme ve ELISpot tabanlı immün monitörizasyon için protokolleri açıklıyoruz. Topluca bu organoid tabanlı sistemler; CRC biyolojisini, terapötik direnci, tümör heterojenliğini ve immünoterapi yanıtlarını incelemek için etik açıdan sürdürülebilir ve klinik olarak ilgili bir platform sunmaktadır. Organoid mühendisliği ve mikroçevresel entegrasyondaki süregelen ilerlemeler, bu modelleri gelecekteki CRC araştırmalarının ve hassas onkolojinin temel taşı olarak konumlandırmaya devam etmektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Tüm hastalar, IRB onaylı Montefiore Einstein Comprehensive Cancer Center Biobank protokolü (Einstein IRB# 2021-13730) kapsamında bilgilendirilmiş onam vermiştir. Klinik koordinasyon ve düzenleyici destek Kanser Klinik Araştırmalar Ofisi (CCTO) tarafından sağlanmıştır. Tümör dokuları, standart cerrahi rezeksiyon ve patoloji incelemesinin ardından toplanmış; ardından formalin fiksasyonu, hastadan türetilmiş organoid üretimi veya %20 FBS ve %10 DMSO içeren DMEM içinde kriyoprezervasyon için işlenmiştir. Tüm reaktif hazırlıkları Tablo 1'de yer almaktadır.

1. Biyopsi veya rezeksiyon dokusundan tümör organoid kültürünün oluşturulması (4 sa)

  1. Yeni alınmış tümör dokusunu steril bir Petri kabına yerleştirin ve buz üzerinde, her biri 5 dakika sürecek şekilde 5 kez organoid yıkama tamponu ile yıkayın. Steril bir jilet veya ince iğneler kullanarak dokuyu yaklaşık olarak şu boyutlarda küçük küpler şeklinde parçalayın: 1–2 mm3.
    NOT: Kurumayı önlemek için diseksiyon sırasında dokuyu buz gibi soğuk fosfat tamponlu salin (PBS) ile nemli tutun.
  2. Diseke edilmiş doku fragmanlarını 15 mL'lik bir Falcon tüpüne aktarın, bir kez Dulbecco fosfat tamponlu salyeni (DPBS) ile yıkayın ve 200 x g'de santrifüjleyin. g oda sıcaklığında (RT) 5 dakika boyunca bekletin. Süpernatantı dikkatlice uzaklaştırın, ardından doku küplerini steril bir 6 kuyucuklu plakaya veya 35 mm'lik bir Petri kabına aktarın.
  3. Steril, açılı ve otoklavlanmış makaslar kullanarak dokuyu daha küçük parçalara ayırın. 1X Gentle Collagenase/Hyaluronidase'den 1 mL'yi 9 mL DPBS içinde seyreltin. Ekleyin 10 µL Y-27632 (ROCK inhibitörü) ve 20 µL Primosin'in.
  4. Doku parçalarını içeren 15 mL'lik tüpe önceden ısıtılmış disosyasyon solüsyonu ekleyin. Doku parçalarını ajite etmek için pipetle yukarı-aşağı hareketleri yapmadan önce P1000 pipet ucunuzu yeniden kaplayın.
  5. 15 mL'lik tüpü şurada inkübe edin: 37 °C 30 dakika boyunca sallamalı su banyosunda, her 10 dakikada bir ters çevirerek bekletin. Doku parçalarının çökelmesine izin verin, sindirim solüsyonunun büyük kısmını yeni bir tüpe aktarın ve 500 x g'de santrifüjleyin g oda sıcaklığında 5 dk boyunca.
  6. Orijinal 15 mL'lik tüpe 1 mL DMEM ekleyin ve doku fragmanlarını mekanik olarak ayrıştırmak ve ek kriptleri serbest bırakmak için kaplamalı bir P1000 uçla güçlü bir şekilde pipetleyin.
  7. Dokunun tek hücrelere veya küçük kümelere ayrılıp ayrılmadığını izlemek için mikroskop altında ilerlemeyi kontrol edin. 10–20 µL doku parçaları içeren DMEM'inizden bir miktar petri kabına aktarın ve kriptler için mikroskop altında inceleyin.
    NOT: İnkübasyon süresi örnek tipine göre değişir. Biyopsiler için inkübasyon süresi 15–30 dk ve cerrahi rezeksiyonlar için ise 45–60 dk.
  8. Kriptler tespit edildiğinde (veya biyopsiler için 30 dakika / rezeksiyonlar için 60 dakika sonra), sindirimi eşit hacimde buz gibi soğuk bazal besiyeri ile durdurun ve 500 x g'de santrifüjleyin. g oda sıcaklığında 5 dk boyunca.
  9. Pelleti resüspand etmek için DPBS ile yıkayın, ardından tekrar santrifüjleyin. İsteğe bağlı olarak, süspansiyonu konik bir tüpe aktarın ve şu hızda santrifüjleyin: 300 x g oda sıcaklığında 5 dk boyunca hücreleri çöktürmek için.
    NOT: İçin CRC'de RBC lizine genellikle gerek duyulmaz.
  10. Pelet kırmızı görünüyorsa, eritrositleri şu ortamda inkübe ederek lizleyn: 5 mL RBC liziz tamponu oda sıcaklığında 15 dakika boyunca bekletin. Lizisten sonra, tüpü hemen PBS ile doldurun ve tekrar santrifüjleyin.
  11. Pelleti bir kez yıkayın DPBS. Şu hızda santrifüjleyin: oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj edin, ardından süpernatantı uzaklaştırın. Pelleti küçük bir hacim besiyerinde yeniden süspande edin. Canlı hücreleri şu yöntemle sayın: hemositometre trypan mavisi dışlama yöntemiyle veya bir otomatik hücre sayıcı
  12. Hücreleri şunlarda tekrar süspande edin: buz gibi soğutulmuş Matrigel (bazal membran matrisi) (Opsiyonel: ~1,5–3 x 10 konsantrasyonu)4 hücre/ 10 µL besiyeri). Hücre süspansiyonunu şununla karıştırın soğutulmuş geniş ağızlı uçlar kullanılarak bazal membran matrisi (bazı laboratuvarlar bazal membran matrisi ile tamamlanmış organoid ortamını 1:1 oranında kullanmaktadır).
    NOT: Bazal membran matriksini ve tüm karışımları muhafaza edin buz gibi soğuk erken polimerizasyonu önlemek için.
  13. Plaka ~50 µL hücre-bazal membran matrisi karışımından oluşturulmuş kubbeleri, önceden ısıtılmış, steril her bir kuyucuğa 24 kuyucuklu kültür plağı. Plağı şu koşullarda inkübe edin: 37 °C bazal membran matriksinin kubbe şeklinde katılaşması için 10–12 dakika bekleyin (plakayı ters çevirin).
  14. Bazal membran matriksi katılaştıktan sonra, plakayı dik konuma getirin. Dikkatlice ekleyin 500 µL/well Rock inhibitörü (1:1000) ve Primocin (1:500) içeren PDO besiyerinin.
    NOT: Kontaminasyonu önlemek için, dondurulmuş bir organoid biyobanka oluşturulana kadar tüm kültür ortamlarında Primocin kullanın.
  15. Organoid besiyerini yenileyin haftada iki kez taze, tam organoid besiyeri ile. Organoid büyümesini düzenli olarak mikroskop altında izleyin.

2. Kandan insan PBKlarının izolasyonu (2 sa)

  1. Steril 15 mL'lik Falcon tüplerine 5 mL Histopaque paylaştırın, oda sıcaklığına getirin ve üzerine dikkatlice eşit hacimde taze insan kanı (en fazla 5 mL) ekleyin. Arayüzü bozmadan, kanı tüp duvarı boyunca Ficoll üzerine yavaşça ekleyin; tüp başına toplam hacmi ≤10 mL olarak tutun.
    NOT: Optimal ayırma için santrifüjden önce Ficoll ve kan katmanlarını ayrı tutun.
  2. Birden fazla tüp kullanılıyorsa, bunları santrifüjle uygun şekilde dengeleyin. Karıştırmaktan veya sallamaktan kaçının. kan–Ficoll ara yüzeyi bozulmadan korunmalıdır.
  3. ... hızında santrifüj edin 1500x g oda sıcaklığında 15 dakika boyunca. Kullanın Gradyanın bozulmasını önlemek için fren ayarını 0'a getirin. Santrifüj sonrası belirgin tabakalar oluşacaktır: a) en altta RBC tabakası, b) ortada PBMC buffy coat (lüks tabakası) ve c) en üstte plazma tabakası. Buffy coat tabakası görünür olana kadar plazmayı nazikçe aspire ederek uzaklaştırın.
    NOT: PBMC tabakasını bozmamak için tüpü nazikçe tutun.
  4. Taze steril bir pipet kullanarak, dikkatlice aspire edin buffy coat tabakası PBMC'ler içeren ve hücreleri yeni steril bir ortama aktarın 15 mL'lik Falcon tüpü. Ficoll ve trombositleri uzaklaştırmak için hücreleri, 1000 x g'de santrifüjasyon ile 10 mL PBSA (PBS + %0,1 BSA) kullanarak iki kez yıkayın. g oda sıcaklığında 7 dakika boyunca; her yıkama sonrası süpernatant dikkatlice uzaklaştırılmalıdır.
  5. Kalıntı trombositleri uzaklaştırmak için bir kez PBSA ile yıkayın ve şu hızda santrifüjleyin: 200 x g RT'de 7 dk boyunca bekletin. Süpernatantı dikkatlice uzaklaştırın. Pellet kırmızı görünüyorsa, 5 mL RBC liz süspansiyonunda inkübe ederek RBC lizini gerçekleştirin. 37 °C 5 dakika boyunca bekletin, ardından PBSA ile yıkayın ve 200 x g'de santrifüjleyin g oda sıcaklığında 7 dakika boyunca.
  6. PBMC pelletini 2 mL DPBS veya kültür ortamında yeniden süspanse edin ve bir hemositometre veya otomatik hücre sayıcıyla Trypan mavisi kullanarak canlı hücre sayısını belirleyin. Hemen kullanılmayacaksa, PBMC'leri 5–10 x 106 %90 FBS ve %10 DMSO içerisinde hücre/mL. – derecede yavaşça dondurun.80 °C gece boyunca bekletin, ardından uzun süreli saklama için sıvı azota aktarın.
  7. PBK'lerin genişletilmesi (7–12 gün):
    1. Hücreleri 500 x g'de santrifüj ederek çöktürün. g RT'de 5 dakika boyunca. 5 x 10 konsantrasyonunda yeniden süspanse edin5 T hücresi genişletme ortamında kuyu başına hücre/kuyu ve bir CD3/CD28 kokteyli ile aktive edin.
    2. Hücreleri 500 IU/mL IL-2 ile stimüle edin ve 3 gün boyunca inkübe edin. 3. günde hücreleri karıştırıp sayın, ardından IL-2 takviyeli T hücresi genişletme medyumu ekleyerek kültürü genişletin.
    3. Hücreleri, komple T Hücresi Genişletme Besiyerinde 1–2,5 x 10^5 hücre/mL olacak şekilde ayarlayın, 2 gün boyunca inkübe edin ve genişletme süreci boyunca her 2–3 günde bir canlılığı izleyin.
      NOT: Her 2-3 günde bir taze, sıcak tam besiyeri ile değiştirin (şu süreyi aşmayın >3 gün). PBMC'ler, gelecekte kullanmak üzere T-hücresi dondurma ortamında kriyoprezerve edilebilir.

3. Organoid ko-kültürü (4 gün):

  1. Hazırlık ve kalite kontrol:
    1. Ko-kültürden önce organoidlerin sağlıklı, kontaminasyonsuz ve fenotipik olarak karakterize edildiğinden emin olun. Onay vermiş bağışçılardan veya ticari kaynaklardan PBMC'ler temin edin ve kullanmadan önce canlılıklarını ve temel fenotiplerini doğrulayın.
    2. PBMC'lerin taze, dinlendirilmiş veya önceden aktive edilmiş olarak mı kullanılacağına ve otolog mu yoksa allojenik mi olduklarına karar verin. Ko-kültür öncesinde organoid canlılığını, boyut tekdüzeliğini ve marker ekspresyonunu değerlendirin.
    3. PBMC canlılığını ve bazal immün kompozisyonu (CD3, CD4, CD8, NK markerları, monositler) valide edin, bağışçı meta verilerini kaydedin.
  2. PBMC'lerle ko-kültür için organoid izolasyonu:
    1. Kültür ortamını uzaklaştırın ve hücre dışı matrisi çözmek ve organoidleri serbest bırakmak için her kuyucuğa önceden ısıtılmış hücre geri kazanım solüsyonu ekleyin. Organoidleri geniş ağızlı bir pipet ucuyla nazikçe resüspande edin ve matris çözülene ve organoidler serbest kalana kadar kısa bir süre inkübe edin.
    2. Süspansiyonu bir toplama tüpüne aktarın, gerekirse 0,5M EDTA ekleyin ve hacmi dengeli tampon ile ayarlayın. Organoidleri pelitlemek için santrifüjleyin, süpernatantı uzaklaştırın, takviyeler (HEPES ve Glutamax) ve antibiyotikler içeren bazal ortamla yıkayın ve yeniden pelitlemek için tekrar santrifüjleyin.
    3. Organoidleri komple kültür ortamında resüspande edin, doku kültürü işlem görmüş bir plakaya ekleyin ve daha fazla işlem yapmadan önce yaklaşık 24 saat boyunca toparlanmalarına izin verin.
  3. Paralel PBMC geri kazanımı:
    1. Kriyoprezerve PBMC'leri standart uygulamayı kullanarak hızla çözün ve ozmotik şoku minimize etmek için hemen önceden ısıtılmış T hücresi genişletme ortamında seyreltin.
      NOT: Çözme sırasında bir miktar hücre kaybı tipiktir; ortamın önceden ısıtılması geri kazanımı iyileştirir.
    2. Hücreleri pelitlemek için çözülmüş PBMC'leri 400 x g'de santrifüjleyin, dondurma ortamını uzaklaştırın ve hücre kümelenmesini azaltmak ve tek hücre süspansiyon kalitesini artırmak için benzonaz içeren T hücresi genişletme ortamında kısa bir süre inkübe edin.
    3. PBMC'leri taze genişletme ortamında yıkayın ve yeniden pelitleyin, ardından canlılığı ve geri kazanımı desteklemek için sitokinlerle (örneğin, IL-2) desteklenmiş T hücresi kültür ortamında resüspande edin. Ko-kültür öncesinde gece boyunca dinlenme süresi için PBMC'leri çok kuyucuklu bir plakaya ekleyin.
  4. Ko-kültür öncesi hazırlık (ko-kültürden 1 gün önce):
    1. Antijen sunum yollarını geliştirmek için ko-kültürden önce organoidleri isteğe bağlı olarak immün-stimülatuvar bir sitokinle (örneğin, IFN-γ) tedavi edin.
    2. Kuyucukları ko-stimülatuvar bir antikorla (örneğin, anti-CD28) kaplayarak ko-kültür plağını en az 24 saat önceden hazırlayın ve 4 °C'de saklayın. Kullanmadan önce, bağlanmamış antikoru uzaklaştırın ve kuyucukları iki kez DPBS ile yıkayın.
  5. Organoidlerin tek hücrelere disosiyasyonu (ko-kültür deney günü):
    1. Önceden stimüle edilmiş organoidleri toplayın, pelitleyin ve süpernatantı uzaklaştırın, ardından tüm hücre popülasyonunu geri kazanmak için yapışkan hücrelerle birlikte enzimatik disosiyasyon reaktifi (örneğin, TrypLE) içinde resüspande edin.
    2. Aşırı sindirimi önleyerek, organoidlerin çoğu tek hücrelere veya küçük kümelere disosiye olana kadar nazik karıştırma ile inkübe edin ve mikroskobik olarak izleyin.
    3. Disosiyasyon reaktifini tamponla nötralize edin, hücreleri pelitleyin, süpernatantı uzaklaştırın ve sayım ve karıştırma için T hücresi kültür ortamında resüspande edin.
  6. Hücre sayımı ve ko-kültür hazırlığı:
    1. Hücre süspansiyonunu nazikçe karıştırın ve bir hemositometre veya canlılık boyalı otomatik sayıcı kullanarak canlı hücre sayılarını belirleyin. Tümör–PBMC oranını T hücresi ortamında istenen yoğunluğa ayarlayın.
    2. PBMC'leri pelitleyerek, taze ortamda resüspande ederek ve canlı hücre sayılarını belirleyerek hazırlayın. PBMC'leri yıkayın ve gerektiği gibi sitokinlerle (örneğin, IL-2) ve isteğe bağlı immünomodülatör antikorlarla (örneğin, anti-PD-1) desteklenmiş T hücresi ortamında resüspande edin.
  7. Ko-kültürü gerçekleştirin:
    1. Disosiye edilmiş tümör hücrelerini ve PBMC'leri istenen efektör:hedef oranında birleştirin. Hücreleri eklemeden önce, kuyucukların kurumasını önleyerek anti-CD28 kaplı kuyucukları yıkayın.
    2. Organoid–PBMC karışımını gerekli analiz hacminde ekleyin ve standart kültür koşulları altında inkübe edin. Deney sırasında gerektiğinde kültürleri tazeleyin veya bölün.
  8. Deneysel tasarım ve kontroller (tedavi stratejisi için):
    1. İlaçların (örneğin, kontrol noktası inhibitörleri veya küçük moleküller) PBMC'lerin tümör organoidlerine verdiği yanıtları nasıl modüle ettiğini değerlendirmek için ko-kültür sistemini kullanın.
    2. Biyolojik tekrarları (birden fazla organoid hattı ve PBMC bağışçısı) ve teknik tekrarları (koşul başına en az üç paralel kuyucuk) dahil edin.
    3. Kontrolleri dahil edin: yalnızca organoid, yalnızca PBMC (araç veya aktive edilmiş), organoid + PBMC'ler (araç), organoid + ilaç ve PBMC + ilaç koşulları.
  9. Tipik ko-kültür zaman noktası çerçeveleri:
    1. İmmün aktivasyonu, proliferasyonu, sitokin sekresyonunu, apoptozu ve tümör hücresi öldürmesini değerlendirmek için ko-kültürleri başlatmadan sonra 24, 48 ve 72. saatlerde analiz edin.
    2. Erken aktivasyon markerlarını ve sitokin sekresyonunu 24. saatte değerlendirin; sitotoksisiteyi, proliferasyonu ve aktivasyon/tükenmişlik markerlarını 48–72. saatlerde akış sitometrisi, görüntüleme veya canlılık analizleri kullanarak değerlendirin.
      NOT: Kronik aktivasyonu, immün tükenmişliği veya uzun vadeli ilaç yanıtlarını değerlendirmek için daha geç zaman noktaları (örneğin, 5–7. günler) dahil edilebilir.
  10. Organoidlerin immünofloresan boyaması:
    1. Lamları PBS içinde 5 dakika yıkayın ve oda sıcaklığında (RT) 20 dakika boyunca %4 paraformaldehit (PFA) solüsyonunda fikse edin. Fiksasyondan sonra, lamları PBS ile iki kez 5'er dakika yıkayın.
      NOT: Boyama boyunca organoidleri nemli tutun. Gerektiğinde lamlar oda sıcaklığında PBS içinde 3 saate kadar saklanabilir, ancak PBS içinde gece boyunca saklamaktan kaçının.
    2. Organoid yapısını korurken hücre içi ve nükleer boyamaya olanak sağlamak için organoidleri oda sıcaklığında 15–20 dakika boyunca PBS içinde %0,1–0,5 Triton X-100 ile permeabilize edin.
      NOT: Organoid yapısını bozabileceği için aşırı permeabilizasyondan kaçının. Doğru permeabilizasyon, görüntüleme için morfolojiyi korurken düzenli sitoplazmik ve nükleer boyama sağlar.
    3. Lamları iki kez 1x IF tamponu ile yıkayın ve spesifik olmayan boyamayı azaltmak için oda sıcaklığında 60–120 dakika boyunca IF tamponunda %1–10 BSA (veya türle eşleşmiş serum) ile bloke edin.
      NOT: BSA genel bloklama için uygundur, ancak spesifik marker boyaması için spesifik olmayan bağlanmayı azaltmak ve sinyal spesifikliğini artırmak amacıyla türle eşleşmiş serum önerilir.
    4. Lamları üç kez (her biri 5 dakika) yıkayın ve primer antikorlar (10–50 µg/mL) ile %1 serum bloklama tamponunda 4 °C'de nemli bir bölmede gece boyunca inkübe edin.
      NOT: Buharlaşmayı önlemek için lamların üzerini parafilmle kapatın ve minimum arka plan ile spesifik boyama için primer antikor konsantrasyonunu titrasyonla optimize edin.
    5. Lamları 1x IF ile 3 x 5 dakika yıkayın.
      NOT: Yıkama, bireysel antikor boyaması için optimize edilmelidir. Aynı anda birden fazla primer antikor kullanılıyorsa, yıkama standartlaştırılmalıdır.
    6. Organoid lamlarını florofor konjuge ikincil antikorlar (%1 serum bloklama tamponunda 1:200–1:500) ile nemli bir bölmede 4 °C'de gece boyunca veya oda sıcaklığında karanlıkta 2 saat inkübe edin.
      NOT: İkincil antikor eklendikten sonra, floroforların fotobeyazlamasını önlemek için sonraki tüm adımları karanlıkta gerçekleştirin.
    7. Lamları 1x IF tamponu (2x 5 dakika) ve ardından PBS (5 dakika) ile yıkayın. %5 serum bloklama tamponunda DAPI (1 µg/mL) ve AlexaFluor-594 konjuge antikorlar (20 µg/mL) ile oda sıcaklığında karanlıkta 1 saat inkübe edin, ardından PBS ile yıkayın (3x 5 dakika).
    8. Lamlara kapatma ortamı ekleyin ve lametle kapatın, hava kabarcıkları oluşmamasına dikkat ederek lameti lam üzerine ters çevirin. Alternatif olarak, DAPI içeren bir kapatma ortamı kullanılıyorsa DAPI boyamasını atlayın. Lam tarama uygulamaları için sert bir kapatma ortamı kullanın.
    9. Lamların oda sıcaklığında bir saat kurumasını sağlayın, –20 °C'de saklayın ve konfokal mikroskopi veya bir lam tarayıcı kullanarak görüntüleyin.

4. Organoidler için akış sitometrisi ve hücre içi boyama protokolü

  1. Organoid kültür ortamını dikkatlice aspire edin ve kalıntı ortam ile serum proteinlerini uzaklaştırmak için organoidleri 1x PBS ile bir kez nazikçe yıkayın. Soğuk PBS veya geri kazanım solüsyonu kullanarak organoidleri hücre dışı matriksten serbest bırakın ve kayma stresini minimize ederek matrisi bozmak için nazikçe pipetleyin.
  2. Organoid süspansiyonunu bir santrifüj tüpüne aktarın, 4 °C'de 5 dakika boyunca 300 x g ile pelletleyin ve süpernatantı dökün. Enzimle ayrıştırma için organoid pelletini 250–500 µL 0.05% TrypLE solüsyonu içinde yeniden süspanse edin. Hücre-hücre bağlantılarının etkin sindirimi için 37 °C'de inkübe edin.
    NOT: Her 5 dakikada bir, tüpü hafifçe vurarak ve yukarı-aşağı pipetleyerek süspansiyonu nazikçe karıştırın ve aşırı sindirim meydana gelmeden tek hücreli süspansiyon elde edilene kadar mikroskop altında izleyin.
  3. Topaklanmaları gidermek için hücre süspansiyonunu 40 µm'lik bir hücre süzgecinden geçirin. Hücreleri 4 °C'de 5 dakika boyunca 300 x g ile santrifüjleyin ve Ca2+ / Mg2+ içermeyen 1x PBS tamponu içinde yeniden süspanse edin.
  4. Hücreleri sayın ve boyama tamponu içinde ~1 x 106 hücre/mL olacak şekilde ayarlayın. Spesifik olmayan bağlanmayı azaltmak ve canlı/ölü hücreleri belirlemek için Fc blok (1:200) ve canlılık boyası (örneğin, Live/Dead Blue, 1:1000–1:3000) ile inkübe edin.
  5. Hücreleri karanlıkta, oda sıcaklığında (RT) 30 dakika inkübe edin, ardından bir kez 1x PBS ile ve bir kez boyama tamponu ile yıkayın.
  6. Her bir antikoru boyama tamponu içinde optimize edilmiş çalışma dilüsyonunda karıştırarak ve master mix için titrasyonla belirlenmiş µL/test değerlerini kullanarak toplam hacimleri hesaplayarak yüzey antikor kokteylini hazırlayın.
    NOT: Paneliniz birden fazla polimer tabanlı florokrom (örneğin, Brilliant Violet, Brilliant Ultraviolet veya Brilliant Blue boyaları) içeriyorsa, florokrom etkileşimlerini azaltmak ve sinyal çözünürlüğünü artırmak için antikor kokteyline Brilliant Stain Buffer (BSB) ekleyin. BSB'yi üretici talimatlarına göre ekleyin (tipik olarak 1x nihai konsantrasyon), nazikçe karıştırın ve tüm örnekler için bir master mix hazırlayın (~%10 fazla hacim). Işıktan koruyun ve kullanıma kadar buz üzerinde tutun.
  7. Antikor kokteylini ekleyin ve karanlıkta, oda sıcaklığında 30–50 dakika inkübe edin. Boyama tamponu ve PBS (Ca2⁺/Mg2⁺ içermeyen) ile yıkayın, ardından 500 x g ile 5 dakika santrifüjleyin. Konsantre çözeltiyi dilüent ile seyrelterek çalışma fiksasyon/permeabilizasyon solüsyonunu hazırlayın. Örneğin, 1 birim Konsantre: 3 birim dilüent (1x veya belirtilen çalışma gücünü oluşturacak şekilde).
  8. Hücreleri tamamen yeniden süspanse etmek için fiksasyon/permeabilizasyon solüsyonunu ekleyin (1 milyon hücre başına ~100–200 µL) ve ışıktan koruyarak oda sıcaklığında veya 2–8 °C'de 15–20 dakika inkübe edin. Fiksasyon süresinden sonra hücreleri 1x Permeabilizasyon Tamponu ile yıkayın. Süpernatantı dökün. Fazla fiksatörü uzaklaştırmak için yıkama işlemini en az bir kez (bazen iki kez) tekrarlayın.
  9. Floresan işaretli antikorları 1x permeabilizasyon tamponu içinde optimize edilmiş konsantrasyonlara seyrelterek bir hücre içi boyama kokteyli hazırlayın. Gerektiğinde sitokinleri, transkripsiyon faktörlerini veya fosforile proteinleri hedefleyen antikorlar da dahil olmak üzere hücre içi antikor kokteylini permebilize edilmiş hücrelere ekleyin.
  10. Hücreleri karanlıkta, oda sıcaklığında 2 saat inkübe edin.
    NOT: Gerekirse inkübasyon süresi, boyama kalitesini etkilemeden üreticinin minimum önerisine indirilebilir veya karanlıkta 4 °C'de gece boyunca gerçekleştirilebilir.
  11. Hücreleri iki kez 1x permeabilizasyon tamponu ile ve bir kez boyama tamponu ile yıkayın, ardından pelletle 250–300 µL boyama tamponu içinde yeniden süspanse edin.
  12. Tek hücreli bir süspansiyon elde etmek için süspansiyonu 40 µm'lik bir süzgeçten geçirin ve analiz aşamasına kadar örnekleri buz üzerinde veya 4 °C'de, ışıktan koruyarak tutun. Boyanmış örneklerin uzun süre saklanmasından kaçının ve boyamadan sonra mümkün olan en kısa sürede sitometrede örnekleri alın.
  13. Floroforlarla uyumlu uygun lazerlere ve filtrelere sahip bir akış sitometresi kullanın. Tek boyanmış örnekler ve floresans-eksi-bir (FMO) kontrolleri dahil olmak üzere kompanzasyon kontrollerini ayarlayın.
  14. Güçlü bir istatistiksel analiz için örnek başına en az 50.000–100.000 olay toplayın. Verileri FlowJo, FCS Express veya eşdeğer bir yazılım kullanarak analiz edin. Canlı, tek hücreler üzerinden gating yapın. Yüzey ve hücre içi marker ekspresyonlarını analiz edin.
    NOT: Maksimum sinyal, minimum arka plan ve net popülasyon ayrımı sağlayan optimal konsantrasyonu belirlemek için her bir antikor-florokrom konjugatını seri dilüsyonlar kullanarak titre edin.

5. Akış sitometrisi ile Annexin V tabanlı apoptoz analizi:

  1. Temel kontroller ve reaktifler:
    1. Boyanmamış kontrol: Hücresel otofloresansın temel çizgisini belirleyerek gerçek pozitif sinyalin arka plandan ayırt edilmesini sağlar.
    2. Tekli boyama kontrolleri: Uygun kompanzasyon (konvansiyonel sitometri) veya spektral ayrıştırma (spektral sitometri) yapabilmek için paneldeki her florokrom için gereklidir. Bunlar, kanallar arasında doğru sinyal ayrımını sağlar.
    3. Floresan-eksi-bir (FMO) kontrolleri: Sönük veya geçiş aşamasındaki popülasyonların kapılamalarını (gate) belirlemek için gereklidir. Zayıf pozitif olayların olduğundan fazla tahmin edilmesini önlemeye yardımcı olurlar.
    4. Apoptoz için pozitif kontrol: Apoptaza girmesi için kasıtlı olarak indüklenmiş bir örnek (örneğin, staurosporin ile işlem görmüş hücreler), assayin apoptotik olayları güvenilir bir şekilde tespit ettiğini doğrular.
    5. İzotip kontrolleri: Bağlanma antikor aracılı değil, fosfolipid spesifik olduğundan Annexin V için faydalı değildir. Ancak, ihtiyaç duyulursa ek yüzey belirteç antikorları için dahil edilebilirler.
      NOT: Annexin V bağlanması kalsiyuma bağımlı olduğundan, kalsiyum iyonları içeren Annexin V bağlama tamponu kullanın; ticari veya valide edilmiş eşdeğer bir tampon kullanın.
    6. Erken apoptotik hücreleri geç apoptotik/nekrotik hücrelerden ayırt etmek için membran geçirgen olmayan bir canlılık boyası (örneğin, PI, 7-AAD, DAPI veya fikse edilebilir ölü hücre boyaları) kullanılır. Akım sitometre lazerleri ve fiksasyon koşullarıyla uyumlu bir boya seçin.
  2. Boyama prosedürü:
    1. Birlikte kültüre edilen hücreleri, plakları 500 x g hızda 5 dk santrifüj ederek hasat edin. Kültür ortamını ve yüzen kalıntıları uzaklaştırmak için süpernatantı dikkatlice aspire edin ve atın. Arka plan boyamasını azaltmak ve girişim yapan proteinleri uzaklaştırmak için hücreleri soğuk boyama tamponuyla (örneğin, %1–2 FBS içeren PBS) iki kez yıkayın.
    2. Soy veya alt küme belirteçleri gerekiyorsa (örneğin, PBMC'ler için CD8, tümör hücrelerinde Lgr5 gibi kanser kök hücre belirteçleri), hücreleri antikor kokteylleriyle oda sıcaklığında, ışıktan korunmuş şekilde, hafif bir çalkalayıcıda 30–45 dk inkübe edin. Bu aşamadaki yüzey boyaması, antijen bütünlüğünü korur ve kompartman spesifik analize olanak tanır.
    3. Hücreleri iki kez yıkayın: önce bağlanmamış antikorları uzaklaştırmak için soğuk boyama tamponuyla, ardından kalsiyum mevcudiyetini sağlamak için Annexin V bağlama tamponuyla (örneğin, BioLegend Kat. No. 422201). Hücre konsantrasyonunu bağlama tamponu içinde yaklaşık 1 x 106 hücre/mL olacak şekilde ayarlayın.
    4. Her örnek için 100 µL'lik hücre süspansiyonuna 5 µL florokrom-konjuge Annexin V reaktifi ekleyin. Seçilen florokrom, paneldeki diğer boyalarla spektral olarak uyumlu olmalıdır.
    5. PI, 7-AAD veya DAPI gibi bir canlılık boyası ile karşıt boyama yapın. PI ve DAPI için optimal dilüsyonlar, cihaza ve lazer gücüne bağlı olarak genellikle 1:1000 ile 1:60.000 arasında değişir ve ampirik olarak belirlenmelidir. Sonrasında fiksasyon gerekiyorsa, fikse edilebilir canlılık boyaları tercih edilir.
    6. Hücreleri pipetleyerek nazikçe yeniden süspande edin ve oda sıcaklığında (RT), karanlıkta 20–40 dk inkübe edin. Aşırı inkübasyon spesifik olmayan bağlanmayı veya yalancı pozitifleri artırabileceği için optimal inkübasyon süresi ampirik olarak belirlenmelidir.
    7. Her kuyuya 200 µL Annexin V bağlama tamponu ekleyin (örnekler çok konsantre ise minimum 100 µL). Bu, akım sitometrisi için yeterli hacim sağlar ve akvizisyon sırasında tampon koşullarını korur. Negatif ve pozitif popülasyonların net bir şekilde ayrıştırılması için voltaj ayarlarının optimize edildiğinden emin olarak, örnekleri kalibre edilmiş bir akım sitometresinde derhal analiz edin.
  3. Önerilen kapılama stratejisi:
    1. Küçük kalıntıları ve büyük agregatları elemek, yalnızca sağlam hücreleri tutmak için ileri saçılım (FSC) vs yan saçılım (SSC) grafiklerini kullanın. Sadece tekil hücrelerin analiz edildiğinden emin olmak için dubletleri ve agregatları uzaklaştırmak amacıyla FSC-A vs FSC-H (veya FSC-W) kapılamasını uygulayın.
    2. Canlılık boyasına dayanarak, uygunsa güçlü pozitif ölü hücreleri hariç tutun. Alternatif olarak, boyayı Annexin V analiz kadranlarına dahil edin. PBMC'leri (örneğin, CD45+) tümör hücrelerinden (örneğin, EpCAM+ veya başka bir tümör spesifik belirteç) ayırt etmek için yüzey belirteçlerini kullanın. Bu, apoptozun kompartman spesifik kantifikasyonuna olanak tanır.
    3. Kapılan her kompartman içinde, dört popülasyon oluşturmak için Annexin V vs canlılık boyası grafiği çizin: a) Annexin V− / Boya− = Canlı hücreler; b) Annexin V+ / Boya− = Erken apoptotik hücreler; c) Annexin V+ / Boya+ = Geç apoptotik veya nekrotik hücreler; d) Annexin V− / Boya+ = Primer nekrotik hücreler veya artefaktlar (dikkatli yorumlanmalıdır).
    4. Spesifik immün popülasyonlardaki apoptoz profillerini incelemek için PBMC'leri daha alt kümelere (örneğin, CD4 T hücreleri, CD8 T hücreleri, NK hücreleri, monositler) ayırın.

6. Organoid ko-kültürlerinde T-hücre izleme için ELISPOT testi (3 gün):

  1. 0. Gün'de, önceden kaplanmış PVDF-membran 96 kuyucuklu plakayı yıkayın ve aktive edin. İlgilenilen antikorun/sitokinin tespiti için ELISpot protokol kitine uygun olarak 24 saat boyunca 4 °C'de saklayın.
  2. 1. Gün'de,
    1. Organoidleri bölüm 3.5'te açıklandığı şekilde tek hücre süspansiyonuna getirin. Oda sıcaklığında (RT), 500 x g kuvvetinde 5 dakika boyunca santrifüjleyin, ardından CTL medyumu (CTL ELISpot kiti ile birlikte sağlanır) içinde yeniden süspande edin. Kriyoprezerve edilmiş PBMC'leri çözün veya taze izole edilmiş PBMC'leri kullanın. PBMC'leri oda sıcaklığında, 500 x g kuvvetinde 5 dakika boyunca santrifüjleyin.
    2. PBMC'leri kit medyumu içinde yeniden süspande edin. Organoid tek hücrelerini PBMC'lerle 5:1 oranında nazikçe karıştırarak ko-kültür gerçekleştirin. Önceden aktive edilmiş 96 kuyucuklu analiz plakasının her bir kuyucuğuna 200 µL/kuyucuk ko-kültür karışımı ekleyin. Plakayı çok dikkatli bir şekilde hafifçe vurun. 37 °C'de 4 saat boyunca inkübe edin. 4 saat sonra, analiz plakasını inkübatörden nazikçe çıkarın. Uygun pozitif ve negatif kontrolleri dahil ederek, belirlenen kuyucuklara işlemleri ekleyin.
      NOT: Optimal sitokin spot gelişimi ve tarama sonuçları için organoid:PBMC oranı optimize edilmelidir.
  3. 2. Gün'de,
    1. 24 saatlik inkübasyonun ardından, üreticinin boyama protokolünü izleyin. Belirtilen markerları salgılayan hücrelerin sayısını tespit etmek ve karşılaştırmak için tek renkli ve çift renkli kontrolleri değerlendirin. İnkübasyon süresi renge göre değişiklik gösterir ve spot gelişimi düzenli olarak izlenmelidir. Üreticinin talimatlarını takip ederek plakayı tarayın. Salgılanan immün spotları grafikleştirin ve karşılaştırın.
      NOT: Deneysel tasarıma ve ilgilenilen markerlara bağlı olarak, ekilen hücreler ile spotlar arasındaki ilişki, sitokinin/antikorun tek veya çift renkteki ekspresyonunu gösterir.

7. Annexin V NIR ve canlı hücre görüntüleme kullanılarak gerçek zamanlı apoptoz tespiti (3 gün):

Otomatik canlı hücre görüntüleme ile birleştirilen Annexin V NIR, ilaç yanıtı ve sitotoksisite analizi için apoptotik hücre ölümünün gerçek zamanlı ve yüksek kapasiteli izlenmesini sağlar.

  1. 0. Gün'de, organoidleri tek hücre süspansiyonu haline getirin. Hücreleri GFP hücre izleyici ile boyayın. Boyanmış tek hücreleri her kuyucuk başına 100 µL komple medyum ile ekimleyin. Hücrelerin yapışmasına ve kümeler oluşturmasına izin verin.
    NOT: 96'lı U tabanlı, ultra düşük yapışmalı plakalar kullanın. Tipik başlangıç yoğunlukları (ampirik olarak ayarlayın): 5.000 hücre/kuyucuk, 10.000 hücre/kuyucuk. İşlem görmemiş negatif kontrol, taşıyıcı kontrol ve her türlü deneysel işlem için (üç tekrarlı veya daha fazla) kuyucuklar ekleyin.
  2. 1. Gün'de, kriyoprezerve edilmiş PBMC'leri çözün veya taze izole edilmiş PBMC'ler kullanın. PBMC'leri oda sıcaklığında 500 x g hızda 5 dakika santrifüjleyin. PBMC'leri IL-2 ile desteklenmiş ekspansiyon medyumunda yeniden süspanse edin ve inkübatörde inkübe edin.
  3. 2. Gün'de, PBMC'leri sarı hücre izleyici boya ile boyayın. Boyamadan sonra, PBMC'leri RPMI içinde yeniden süspanse edin. Organoid medyumunu plakadan çok nazikçe çıkarın. Organoid tek hücrelerini PBMC'lerle 1:5 oranında nazikçe karıştırarak ko-kültür işlemini gerçekleştirin. Ko-kültür karışımının her kuyucuğuna PBMC içeren 200 µL RPMI medyumu ekleyin. Plakaya çok dikkatli bir şekilde vurun ve inkübatöre yerleştirin.
    NOT: Kuyucukların dibindeki organoid tek hücrelerini rahatsız etmekten kaçının.
  4. 37 °C'de 2–4 saat inkübe edin. 4 saat sonra, plakayı inkübatörden nazikçe çıkarın.
  5. Uygun pozitif ve negatif kontrollerle ilaç kuyucuklarını hazırlayın. Liyofilize Annexin V NIR reaktifini 100 µL komple medyum veya PBS içinde rekonstitüe edin, nazikçe karıştırın. Annexin V NIR'yi final çalışma konsantrasyonunun iki katı (örneğin, 1:200 final dilüsyonu için 1:100) konsantrasyonda içeren 2x işlem medyumu hazırlayın ve medyumun ≥1 mM Ca2⁺ içerdiğinden emin olun.
  6. Kuyucuklara 1:200 dilüsyonunda Annexin V NIR ekleyin. Plakayı sonraki 48–72 saat boyunca bir canlı hücre görüntüleme inkübatörüne yerleştirin.
    NOT: Yeterli hücre-hücre etkileşimlerini ve ölçülebilir apoptotik yanıtları sağlamak için organoid:PBMC oranı optimize edilmelidir.
  7. Canlı hücre görüntüleme ve analiz
    1. 4x veya 10x objektif kullanın ve Annexin V NIR için NIR kanalında (multiplexing yapılıyorsa ek kanallarla birlikte) görüntüler alın. İşlem süresine bağlı olarak, plakayı 24–72 saat boyunca her 4–6 saatte bir tarayın.
    2. IncuCyte CX3 gibi bir canlı hücre görüntüleme yazılımı kullanın. Temel kantifikasyon için, toplam alan veya nesne sayısını kullanarak NIR kanalını analiz edin; tek hücre kinetiği için, Hücre-bazlı (Cell-by-Cell) veya Nesne (Object) analiz modüllerini kullanın. Multiplexing yapılıyorsa (örneğin, sarı hücre izleyici ve GFP), spektral ayrıştırma notlarını kontrol edin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Başlangıçta, standartlaştırılmış bir iş akışı kullanarak birkaç hastadan alınan örneklerden tümör organoidleri oluşturduk (Şekil 1). Bu PDO'ların genellikle 2 haftalık bir kurulum süresine ihtiyacı vardır ve sonrasında daha fazla araştırma için genişletilip pasajlanabilirler. Kurulum süresinin ve organoid oluşumunun dokular arasında farklılık gösterdiği unutulmamalıdır. Örneğin, bazı dokuların organoidleri oluşturmak için ek süreye ihtiyacı vardır ve bazı organoidlerin pasajlanabilecek uygun...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu protokolde, biyobanka arşivimizden PDO'lar ve genişletilmiş T hücreleri üretmek için uygulanabilir ve tekrarlanabilir bir yöntem açıklanmıştır. Farklı mutasyonlara sahip hasta örneklerimiz için PDO CRC ko-kültür kurulumu ve tedavi rejimi de ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Elde edilen sonuçlar, tedavinin ko-kültür modelleri üzerindeki etkisini göstermiştir.

Burada açıklanan organoid ko-kültür sistemi, in vitro ortamda karmaşık biyolojik etkileşimleri modellemek için sağlam ve uyarlanabilir b...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

C.K., tamamı bu makale ile ilgisiz olan şu beyanlarda bulunmaktadır: Loki Therapeutics (araştırma fonu), Teiko (danışman), Seattle Genetics (danışman), Insights Driven Research (danışman), BMS (danışman), Guardant Health (danışman), OMNI Oncology (danışman), Exelixis (danışman), Nuvectis Pharma (danışman, ilaçlar), Real CME (onuraryum). C.K. ve N.T., bu makale ile ilgisiz olan ve 17 Ocak 2025 tarihinde dosyalanan 63/746,435 sayılı ABD Geçici Başvurusunun ortak mucitleridir. Diğer yazarların bildirecekleri herhangi bir beyanı yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışma, Montefiore Einstein Comprehensive Cancer Center CCSG (P30CA013330) tarafından desteklenmiştir. Teknik destekleri için Hillary Guzik, Rotem Alon, Jinghang Zhang, Swathi Swaminathan ve Jacky Chuen'e teşekkür ederiz. Akış sitometrisi çalışmaları, Albert Einstein College of Medicine Akış Sitometrisi Çekirdek Tesisi'nde, National Institutes of Health (1S10OD026833-01) tarafından finanse edilen bir Cytek Aurora analizörü kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Konfokal görüntüleme, Albert Einstein College of Medicine Analitik Görüntüleme Tesisi'nde, NIH (1S10OD034397-01) tarafından finanse edilen bir Leica STELLARIS 8 mikroskobu kullanılarak yapılmıştır. E.N., W.E. ve C.K., T32CA200561, R01CA248536, R42CA287679 ve K12CA279871 numaralı NIH hibeleri ile desteklenmiştir. Fon sağlayan kuruluşların makalenin hazırlanmasında herhangi bir rolü olmamıştır.

Ayrıca MM, NS ve NT için The Ruth L. and David S. Gottesman Institute for Stem Cell and Regenerative Medicine Research kurumuna teşekkür ederiz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Kimyasallar, Reaktifler ve Antikorlar
A vitamini içermeyen B27 takviyesi GIBCO C12587-010
B27 takviyesi GIBCO 17504-044 
N-Asetilsistein Sigma-Aldrich A9165-5G 
Nikotinamid Sigma-Aldrich N0636 
İnsan rekombinant EGF Peprotech AF-100-15 
N2Gibco17502001
A83-01 Tocris2939
SB202190 Cayman Chemicals 10010399
Prostaglandin E2 Cayman Chemicals 14010-1 
Y-27632 Sigma-Aldrich Y-0503 
Kollagenaz tip II Sigma-Aldrich C6885 
Hiyalüronidaz tip IV Sigma-Aldrich H3506 
Advanced DMEM-F12 GIBCO 12634-028 
Penisilin/streptomisin GIBCO 15070063
Ultraglutamin tip I Lonza BE17-605E 
HEPES GIBCO 15630-056 
TrypLE Express GIBCO 12604-013 
Hücre Kültürü Dondurma Ortamının Geri Kazanılması GIBCO 12648-010 
RPMI 1640 GIBCO 11875093
İnsan erkek AB plazmasından elde edilmiş insan serumu Sigma-Aldrich H3667 
Benzonaz Merck 70746-3 
İnsan rekombinant interferon gama Peprotech 300-02 
Dispase tip II Sigma-Aldrich D4693 
Hücre Geri Kazanım Solüsyonu Corning 354253
Invivogen PrimocinInvivogen ANTPM1NC9141851
Rekombinant İnsan IL-2 (E. coli ile eksprese edilmiş, taşıyıcısız)Biolegend791906
Rekombinant İnsan IL-7 (E. coli ekspresyonlu, taşıyıcısız)Biolegend569706
Rekombinant İnsan IL-15 (taşıyıcı içermeyen)Biolegend570306
PE/Cyanine5 anti-insan CD107a (LAMP-1)Biolegend328656
Brilliant Violet 711™ anti-human CD137 (4-1BB)Biolegend309832
Pacific Blue™ anti-human CD8a AntikoruBiolegend300928
anti-insan CD3-APC/Cy7Biolegend317342
anti-insan CD4PerCP/Siyanin5.5 anti-insan CD4Biolegend980810
Alexa Fluor® 647 anti-insan/fare Granzyme BBiolegend515406
anti-insan CD56-PE/Cy7Biolegend985912
PE/Dazzle™ 594 anti-insan IFN-γ AntikorBiolegend506530
PE anti-insan CD274 (B7-H1, PD-L1)Biolegend393608
Saflaştırılmış anti-human CD28 AntikoruBiolegend302901
Brilliant Violet 510™ anti-human CD45 AntikoruBiolegend304036
Mouse anti-insan CD326 (EpCAM) (PE/Cy7-konjugasyonlu)Biolegend324222
anti-Ki67Abcamab15580
NucView® Canlı Hücreler için 488 Caspase-3 Analiz KitiBiotium30029
PI ile FITC Annexin V Apoptos Tespit KitiBiolegend640914
PE/Cyanine7 Annexin VBiolegend640950
Incucyte® Annexin V NIR BoyasıSartorius4768
CANLI/ÖLÜ™ UV eksitasyonu için Sabitleştirilebilir Mavi Ölü Hücre Boyama KitiInvitrogenL23105
Cell Trace Far YellowThermo FisherC34567
Cell Trace Far RedThermo FischerC34564
Yeşil CMFDAMedChem ExpressHY-126561 
Human TruStain FcX™ (Fc Reseptör Bloklama Solüsyonu)Biolegend422302
Brilliant Boyama TamponuBD Biosciences563794
BD Pharmingen™ Boyama Tamponu (BSA)BD Biosciences554657
Kompanzasyon BoncuklarıBiolegends424602
Corning® Dulbecco’Fosfat Tamponlu Tuzlu Serum, kalsiyum ve magnezyum içermeyen 1XCorning20-031-CM
Corning® Dulbecco’Kalsiyum ve magnezyum içeren 1X Fosfat Tamponlu Tuzlu SuCorning20-030-CV
Anti-insan PD1 antikoru (nivolumab)Merus/SelleckchemA2002
Dimetil sülfoksitFisher ScientificBP231-100 
DMEMGenesee25-500
EDTA tamponuInvitrogen15575020
FBS (Fetal Bovine Serum)VWR97068-075
PBSGenesee25-507
Paraformaldehit (PFA)Thermo Scientific Kimyasallar0473779L
Fiksasyon/Permeabilizasyon Çözelti KitiBD554714
İNSAN Gastrin IMilliporeG9145-.1MG
GLUTAMAX IFisher Scientific35050061
CD3/CD28 kokteyli STEMCELL Technologies 10971
Immunocult Genişletme BesiyeriSTEMCELL Technologies 10981
DAPI İçeren ProLong Diamond Antifade Montaj MedyumuInvitrogenP36962
Triton X-100Thermo Scientific Kimyasallar215680025
Tripan mavisi çözeltisi, %0,4Gibco15250061
Tween-20TCI AmericaT0543500G
Ekipmanlar
Akış Sitometresi/Akış Sitometrisi Çekirdek TesisiCytek (Wuxi) BiosciencesModel No. N7-0021
Akış Sitometresi/Singh LaboratuvarıInvitrogenATTUNE NXT (Model no. 4486517)
Konfokal MikroskopLeicaSTELLARIS 8
Canlı hücre analiz sistemiSartoriusIncucyte CX3

Kaynaklar

  1. Cervantes A, et al. Metastatic colorectal cancer: ESMO Clinical Practice Guideline for diagnosis, treatment and follow-up. Ann Oncol. 2023;34(1):10-32.
  2. Colonna G. Overcoming barriers in cancer biology research: current limitations and solutions. Cancers (Basel). 2025;17(13):2102.
  3. Liu Y, et al. Patient-derived xenograft models in cancer therapy: technologies and applications. Signal Transduct Target Ther. 2023;8(1):160.
  4. Rocha Neto J, Gaspar MM, Reis CP. Experimental murine models for colorectal cancer research. Cancers (Basel). 2023;15(9):2570.
  5. Bleijs M, van de Wetering M, Clevers H, Drost J. Xenograft and organoid model systems in cancer research. EMBO J. 2019;38(15).
  6. Hou X, et al. Opportunities and challenges of patient-derived models in cancer research: patient-derived xenografts, patient-derived organoids and patient-derived cells. World J Surg Oncol. 2022;20(1):37.
  7. Tentler JJ, et al. Patient-derived tumour xenografts as models for oncology drug development. Nat Rev Clin Oncol. 2012;9(6):338-50.
  8. Drost J, Clevers H. Organoids in cancer research. Nat Rev Cancer. 2018;18(7):407-18.
  9. Zeng G, et al. Advancing cancer research through organoid technology. J Transl Med. 2024;22(1):1007.
  10. Jin MZ, et al. Organoids: an intermediate modeling platform in precision oncology. Cancer Lett. 2018;414:174-80.
  11. Dart A. Organoid 2.0. Nat Rev Cancer. 2019;19(3):126-7.
  12. Cattaneo CM, et al. Tumor organoid-T-cell coculture systems. Nat Protoc. 2020;15(1):15-39.
  13. Neal JT, et al. Organoid modeling of the tumor immune microenvironment. Cell. 2018;175(7):1972-88.e16.
  14. Bar-Ephraim YE, Kretzschmar K, Clevers H. Organoids in immunological research. Nat Rev Immunol. 2020;20(5):279-93.
  15. Jang J, et al. Redefining preclinical testing: human-relevant alternatives beyond animal models. BMB Rep. 2025; in press.
  16. Xie BY, Wu AW. Organoid culture of isolated cells from patient-derived tissues with colorectal cancer. Chin Med J (Engl). 2016;129(20):2469-75.
  17. Vlachogiannis G, et al. Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers. Science. 2018;359(6378):920-6.
  18. Ooft SN, et al. Patient-derived organoids can predict response to chemotherapy in metastatic colorectal cancer patients. Sci Transl Med. 2019;11(513).
  19. Mohammadi M, et al. Cyclin-dependent kinase 9 inhibitors as oncogene signaling modulators in combination with targeted therapy for the treatment of colorectal cancer [Preprint]. bioRxiv. 2025:2025.08.13.669992. doi:10.1101/2025.08.13.669992.
  20. Guo L, et al. Toward reproducible tumor organoid culture: focusing on standardization. Front Immunol. 2024;15:1290504.
  21. Wang J, et al. Tumor organoid-immune co-culture models: exploring a new frontier in cancer research. Cell Death Discov. 2025;11:98.
  22. Najafi M, et al. Organoid-immune co-cultures: a next-generation platform for studying human immunology and disease. Trends Immunol. 2026;47(1):45-62.
  23. Kakni P, et al. A microwell-based intestinal organoid-macrophage co-culture system to study intestinal inflammation. Biomaterials. 2022;276:121018.
  24. Meirelles LA, Persat A. Decoding host-microbe interactions with engineered human organoids. EMBO J. 2025;44(6):1569-73.
  25. Ryu JO, et al. Applications and research trends in organoid-based infectious disease models. Sci Rep. 2025;15:7816.
  26. Du L, et al. Spatial omics in 3D culture model systems. Nat Rev Bioeng. 2025;3(1):45-67.
  27. Lombardi M, et al. Organoid models through the lens of metabolomics. Analyst. 2026;151(4):1458-78.
  28. Skardal A, et al. Drug compound screening in single and integrated multi-organoid body-on-a-chip systems. Biofabrication. 2020;12(2):025017.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Kolon Tümör OrganoidleriT Hücresi Ko-kültürüAkış SitometrisiELISpot AnaliziCanlı Hücre GörüntülemeTümör Öldürme Analiziİmmün Kontrol Noktası İnhibitörleriKaspaz-3 BoyamaGranzim B SalınımıTümör Proliferasyon Markörleri

Bu makale yayımlandı

Video yakında

Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.