Yöntem makalesi

Gerçek Zamanlı Etiketsiz Görüntüleme ve Makrofaj Morfodinamiğinin Optik Kırınım Tomografisi Kullanılarak Nicel Analizi

DOI:

10.3791/71209

⸱

9 Haziran 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Sichuan Provincial Key Laboratory of Innovation and Efficient Utilization of Chinese Medicine Germplasm Resources, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2Yangtze Delta Institute of Optoelectronics, Peking University

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, makrofaj morfodinamiğinin gerçek zamanlı görüntülemesi ve nicel analizi için etiketsiz optik kırınım tomografisi tabanlı bir iş akışını tanımlar. Bu yöntem, tek hücre morfolojisi ve göçünün sürekli izlenmesini sağlar ve uzun vadeli canlı hücre görüntüleme sırasında projeksiyon alanı, çevresi ve ortalama göç hızının zaman çözünçüsüyle ölçümlerini sağlar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, makrofajlarda zamana bağlı morfolojik değişiklikleri gözlemlemek için canlı hücre görüntüleme ve analizinde etiketsiz optik kırınım tomografisi (ODT) tabanlı bir iş akışı oluşturmaktadır. Bu yöntem, stabil çevresel koşullarda uzun süreler boyunca tek hücre morfolojisi ve hareketinin sürekli kaydedilmesini sağlar ve projeksiyon alanı, çevresi ve ortalama göç hızı gibi nicel parametrelerin çıkarılmasını sağlar. Bu iş akışı, tek hücre düzeyinde dinamik hücresel davranışları dışsal etiketleme olmadan yakalamak için pratik bir yaklaşım sunar. RAW264.7 makrofajları model olarak kullanarak, farklı koşullarda dinamik hücresel değişiklikleri yakalamak için baicalin ön tedavisiyle lipopolisakkarit stimülasyonu altında zaman geçişli görüntüleme yapıldı. Takip ve nicel analiz için temsilci hücreler seçildi. Sonuçlar, bu iş akışının uzun vadeli istikrarlı tek hücre takimini desteklediğini ve hücre morfolojisi ile hareketliliğindeki zamansal değişiklikleri yansıttığını göstermektedir. Bu yaklaşım, farklı uyaranlara yanıt olarak dinamik hücresel davranışları gözlemlemek için etiketsiz bir yöntem sunar ve geleneksel uç nokta tabanlı testlere faydalı bir tamamlayıcı olarak hizmet edebilir. Ayrıca hücre morfodinamiği çalışmaları için diğer yapışkan hücre tiplerine de uygulanabilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Makrofajlar, doğuştan gelen bağışıklık yanıtlarında ve doku homeostazında merkezi bir rol oynar ve fonksiyonel durumları mikroçevresel uyaranlara yanıt olarak dinamik olarak değişebilir. Geleneksel olarak, makrofajlar pro-inflamatuar veya anti-inflamatuar/onarımla ilişkili fenotipler 1,2'yi benimsedikleri belirtilmiştir. Ancak, artan kanıtlar makrofaj aktivasyonunun ayrı ikili bir durum değil, sürekli ve plastik bir süreç olduğunu göstermektedir3,4. Farklı uyaranlar altında, makrofajlar zamanla kademeli değişiklikler geçirir; bu değişiklikler hücre morfolojisi ve göç davranışlarındadeğişikliklerle birlikte gerçekleşir. Bu nedenle, tek hücre düzeyinde morfolojik ve göç edici değişikliklerin zaman çözümlü karakterizasyonu, dinamik hücresel yanıtların incelenmesi için önemli bir yaklaşım sunar.

Makrofaj durumlarını incelemek için mevcut yaklaşımlar esas olarak immünboyama, akış sitometrisi ve transkriptomik veya proteomik analizleredayanır. Bu yöntemler genellikle sabit örneklere veya ayrık zaman noktalarına dayanır; bu da aynı hücredeki sürekli değişiklikleri canlı koşullarda takip etme yeteneklerinisınırlar 7. Floresans tabanlı canlı hücre görüntüleme dinamik gözlem sağlar ancak uzun süreli deneyler sırasında fototoksisite ve foto ağartmadan etkilenebilir 8,9. Optik kırınım tomografisi (ODT), hücrelerin üç boyutlu kırılma indeksi dağılımını yeniden inşa ederek nicel yapısal bilgi sağlayan etiketsiz bir görüntülemetekniğidir 10. Dışsal etiketleme gerektirmediği için, ODT uzun vadeli canlı hücre görüntülemesi için uygundur ve hücresel davranışa yapılan bozuklukları azaltır. Son yıllarda ODT, çeşitli hücre modellerinde dinamik çalışmalarauygulanmıştır 11; önceki çalışmalar öncelikle görüntüleme yeteneği ve yapısal karakterizasyona odaklanmıştır. Buna karşılık, mevcut çalışma, makrofaj morfodinamiğinin uzun vadeli, zaman çözünürcesiyle tek hücreli analizi için tanımlanmış in vitro uyarlama koşulları altında standartlaştırılmış, etiketsiz bir iş akışı oluşturmaktadır.

İş akışı, lipopolisakkarit (LPS) stimülasyonu ve Baicalin (BAI) ön tedavisiyle in vitro RAW264.7 makrofaj modeli kullanılarak gösterilmiştir. BAI, iş akışını göstermek için tanımlanmış bir koşul oluşturmak amacıyla temsil edici deneysel modülatör olarak kullanıldı. Sürekli görüntüleme, projeksiyon alanı, çevresi ve ortalama göç hızı dahil olmak üzere nicel tek hücre parametrelerinin çıkarılmasını sağlar ve morfolojik ve davranışsal değişikliklerin zaman çözünürlüğüyle karakterize edilmesini sağlar. Bu yaklaşım, fonksiyonel durumları veya polarizasyonu tanımlamak yerine dinamik fenotipik değişikliklerin tanımlayıcı analizini sağlamak amacıyla tasarlanmıştır ve zamansal bilgi sağlayarak uç noktaya dayalı testlere tamamlayıcı bir yöntem olarak hizmet edebilir. İş akışı bu model sisteminde doğrulanır ve potansiyel olarak diğer yapışkan hücre türlerine uygulanabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Makrofaj kültürü

DIKKAT: Tüm işlemleri laboratuvar eldivenleri ve laboratuvar önlüğü takarak bir biyogüvenlik dolabında yapın.

  1. Tam kültür ortamı (yüksek glikozlu Dulbecco'nun modifiye Eagle ortamı (DMEM) %10 fetal sığır serumu (FBS) ve %1 penisilin streptomisin ile takviye edilmiş) hazırlanın.
  2. RAW264.7 makrofaj hücrelerinden oluşan bir şişeni 37 °C su banyosunda 1 dakikadan kısa sürede eritin.
  3. Hücre süspansiyonunu %10 FBS ve %1 penisillin-streptomisin takviyesi olan yüksek glikozlu DMEM'e aktarın.
  4. Santrifüj 300 × g'de 5 dakika koyun.
  5. Üst yüzeyi at.
  6. Hücreleri taze, tam ortamda yeniden süzülür.
  7. Tohum hücrelerini 60 mm tabaklara 2–5 × 10-5 hücre şeklinde yerleştirin.
  8. Hücreleri %5 CO₂ ile 37 °C'de kuluçka yapın.
  9. Ortamı eritmeden sonra 12–24 saat içinde değiştirmeyin.
  10. Ortamı her 2–3 günde bir değiştirin.
  11. Hücre morfolojisini ters mikroskop ile izleyin.
  12. Geçiş hücreleri, %80–90 birleşimde nazik pipetleme ile yapılır.
    NOT: Tripsin kullanmaktan kaçının. 6–18. pasajlarda hücreler kullanın. Deneyler için vakuolizasyon olmayan ve uniform morfolojiye sahip hücreleri seçin. Hücre hattı STR profilleme ile doğrulandı ve kalite kontrol testlerine tabi tutuldu. Ayrıntılı raporlar ve İngilizce özet Ek Dosyalarda sunulmaktadır.

2. Hücre tedavisi

  1. Logaritmik büyüme evresinde hücreleri nazik pipetleme ile toplayın.
  2. Hücreleri tam ortamda yeniden süspansiyona alın.
  3. Hücre yoğunluğunu bir hücre sayacı kullanarak ölç.
  4. Hücre yoğunluğunu 4 × 104 hücre/mL'ye ayarlayın.
  5. Her 35 mm çanakta 2 ml hücre süspansiyonu tohumlayın.
  6. Yemekleri iki gruba atayın: (i) LPS grubu, (ii) BAI + LPS grubu.
  7. Hücreleri %5 CO₂ ile 37 °C'de 12–16 saat kuluçka altına alın.
  8. DMSO'da 50 mM BAI stok çözümü hazırlayın. BAI stok çözeltisini −20 °C'de sakla.
  9. BAI + LPS grubuna BAI ekleyin ve nihai konsantrasyon 100 μM. BAI stok çözeltisini doğrudan kültür ortamında seyreltirerek nihai çalışma konsantrasyonuna ulaşın.
  10. LPS grubuna eşit miktarda DMSO ekleyin.
  11. LPS stok çözeltisini (1 mg/mL) tam ortamda hazırlayın.
  12. Her iki gruba da LPS ekleyin ve nihai konsantrasyon 1 μg/mL olur. LPS stok çözeltisini doğrudan kültür ortamında seyreltirerek nihai çalışma konsantrasyonuna ulaşın.
  13. Hemen görüntülemeye geçin ve görüntüleme sırasında ortamı değiştirmeyin.

3. Optik kırınım tomografisi alımı

  1. ODT görüntüleme sistemini açın ve çevresel kontrol modülünü başlatın.
  2. Sahne sıcaklığını 37 °C'ye ayarlayın.
  3. CO₂ konsantrasyonunu %5'e ayarlayın.
  4. Sistemin en az 20 dakika dengelenmesine izin verin.
  5. Satın alma yazılımını açın.
  6. Kültür tabağını görüntüleme aşamasına yerleştirin.
  7. Hücreleri bulmak için 60x hedef (NA = 1.42) kullanın.
  8. Görüntüleme için net sınırları olan izole hücreleri seçin.
  9. Görüntüleme aralığını 8 dakikaya ayarlayın.
  10. Toplam kare sayısını 181 olarak ayarlayın.
  11. Time-Lapsed görüntüleme sırasında odak korunmak için otomatik odak fonksiyonunu etkinleştirin.
  12. Zaman geçişli alım başlatın.
  13. Edinim sırasında sistem kararlılığını izleyin.
    NOT: Deney boyunca odak kaymasını en aza indirmek için otomatik odak stabilizasyonu uygulandı.

4. Görüntü yeniden yapılandırma ve nicel analiz

  1. Görsel alındıktan sonra, yazılım otomatik olarak görüntü yeniden yapılandırmasını gerçekleştirir.
  2. Yerleşik standart algoritmayı kullanarak.
  3. İlerleme çubuğu tamamlanana kadar bekle.
  4. Analiz yazılımını açın (Intellyseg, v2.1.0).
  5. Ham veri setini Ham Veri İçe Aktar seçeneğini seçerek içe aktarın.
  6. Hedef klasöre göz atmak.
  7. Hedef dosyayı seçin ve veri setini içe aktarın.
  8. Veri setleri arasında tutarlı ayarlarla otomatik segmentasyon yapmak için "Hücre"tuşuna tıklayın 13.
  9. Hücreleri aşağıdaki kriterlere göre seçin: (i) komşu hücrelerle örtüşmeme, (ii) görüntü sınırlarıyla temas etmemek, (iii) zaman serisi boyunca sürekli takip edilebilir.
  10. Veri setleri arasında tutarlı analiz için görüş alanı başına sabit sayıda hücre (n = 8) seçin.
  11. "Uzun Vadeli İzleme" modülünü açın.
  12. Başlangıç ve son çerçeveye girin.
  13. Takip başlatmak için "İzle" tuşuna tıklayın; bu, hücre pozisyonu tutarlılığına dayanan ardışıkkareler 14.
  14. Yörünge sürekliliğini sağlamak için gerekirse takip hatalarını manuel olarak düzeltin: (i) Yanlış maskelere sağ tıklayın ve "Öğeyi Sil"i seçin, (ii) "Manuel Segmentasyon"u açın, (iii) "Cell"i seçip "Ekle"ye tıklayın, (iv) "Click" veya "Box" kullanarak doğru maskeleri ekleyin.
  15. "Dışa Aktar"a tıklayın, ardından "Veri Dışa Aktarma"yı seçin.
  16. "Video Dışa Aktarma"yı seçin ve çıkış öğelerini seçin.
  17. Başlangıç ve son kareleri girin.
  18. Kayıt yolunu ve dosya formatını seçin.
  19. Videoyu dışa aktarmak için "OK" tuşuna tıklayın.
  20. "Dışa Aktar"a tıklayın, ardından "Chart System"i seçin.
  21. "Track Chart" seçeneğini seçin.
  22. Segmentasyon kategorisi olarak "Hücre"yi seçin.
  23. Takip çerçevesi aralığına girin.
  24. Çıkış parametrelerini seçin (örneğin, Alan, Çevre).
  25. "Image veya Excel'i Dışa Aktar" seçeneğine tıklayın ve dosyayı kaydet.
  26. Her hücre için ortalama göç hızını (μm/s) tüm zaman serisi boyunca centroid yer değiştirmeye göre hesaplayın.

5. Veri sunumu

  1. Nicel ölçümler tanımlayıcı olarak sunulur. İstatistiksel bir çıkarım yapılmadı. Her tedavi grubunda beş bağımsız örnek yer aldı.
    Deneysel iş akışına genel bir bakış Şekil 1'de gösterilmiştir. Ana reaktifler, enstrümanlar ve yazılımlar Malzeme Tablosu'nda listelenmiştir. Görüntüleme koşulları Tablo 1'de özetlenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ODT tabanlı iş akışının performansını değerlendirmek için, iki tedavi grubu (LPS ve BAI + LPS) için zaman geçişli görüntüleme yapıldı; her grup için beş bağımsız örnek alındı. Tüm örnekler aynı görüntüleme koşulları altında alındı. Uzun vadeli tek hücre takibi ve nicel analizle ilişkili yüksek iş yükü nedeniyle, her gruptan bir temsilci örneklem tek hücre analizi ve görselleştirmesi için seçildi. Sonuçlar betimleyici olarak sunulmakta olup, istatistiksel çıkarım için tasarlanmamıştır.

...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, tek hücre düzeyinde makrofaj morfodinamiğinin sürekli görüntülemesi ve nicel analizi için etiketsiz ODT tabanlı bir iş akışı oluşturmaktadır. Bu yaklaşım, uzun vadeli canlı hücre görüntüleme sırasında projeksiyon edilen alan, çevre ve ortalama göç hızının zaman çözünürcesiyle ölçülmesini sağlar. Hücre tohumlama yoğunluğu, segmentasyon ve takip performansını etkileyen kilit bir faktördür. Yüksek yoğunlukta hücrelerin üst üste bulaşması, düşük yoğunlukta ise analiz edilebilir h...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, Jie-jie Zhu ve Yan-qing Yang'ın Pellucid Optics (Nantong) Co., Ltd. ile bağlantılı olduğunu belirtmektedir. Bu çalışmada kullanılan ODT görüntüleme sistemi bu şirketle ilgilidir. Ancak bu bağlılık, deneysel tasarım, veri toplama, analiz veya sonuçların yorumlanmasını etkilemedi. Kalan yazarlar ise rekabet eden çıkarlar belirtmemektedir.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (U24A20790), Bilim ve Teknoloji Bakanlığı (2022YFF0712500 ve 2023YFF0722600) ve Jiangsu Eyalet Bilim ve Teknoloji Departmanı (BK20250540) tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
ODT görüntüleme sistemiPellucid OpticsMH-PanoViewEtiket içermeyen canlı hücre görüntülemede kullanılır
Kapak yazılımıPellucid Optics Lucida-Pano v2.1.0Görüntü alımı için kullanılır
Analitik yazılımPellucid Optics Intellyseg v2.1.0Görüntü yeniden yapılandırma, segmentasyon ve izleme için kullanılır
RAW264.7Wuhan Zishan Biotechnology STCC20020PVitro polarizasyon ve görüntüleme deneylerinde kullanılan murin makrofaj hücre hattı.
Baikalin (BAI)Shanghai Yuanye JB246114Hücre ön işlemi için kullanılır
Lipopolisakkarit (LPS)SolarbioL8880Makrofajları uyarmakta kullanılır
DMEM ortamıGibcoC11995500BTHücre kültürü ortamı
Fetal boğa serumuProcell164210Hücre kültürü için destek
Penisilin – Streptomisin (100x)ProcellPB180120Hücre kültürü için antibiyotikler
60 mm kültür kabıCorningCLS430166Hücre kültürü için kullanılır
35 mm cam tabanlı kabıCellvisD35-10-1.5-NODT görüntüleme için kullanılır
Ters mikroskopOLYMPUSCKX53Kültür sırasında rutin hücre gözlemi ve izleme için kullanılır.
Hücre sayacıRWD Life ScienceC100Hücre yoğunluğunun belirlenmesi için kullanılır

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Canl H cre G r nt lemeTek H cre zlemeZaman Atlamal G r nt lemeH cre MorfolojisiH cre Hareketlili iRAW264 7 Makrofajlar
Video yakında

İlgili makaleler