Kahverengi adipositlerin ve AGPAT2 eksikliği olan preadiositlerin farklılaşmasında dış mitokondriyal transferde

Özet

İnsan ve fare kökenli dış mitokondriler, preadipositlerin ayırt edilmesiyle içselleştirilebilir ve görüntüleme ile genetik araçlarla adipojenik farklılaşma boyunca takip edilebilir. Bu mitokondriler endogen mitokondriyal ağ ile fiziksel olarak etkileşime girse de, olgun kahverengi adipositlerle ilişkili belirteçlerin ekspresyonunu artırmazlar.

Özet

Mitokondriler önemli sinyal merkezleridir; Ancak, mitokondriyal kütle genişlemesinin farklılaşma için mekanik olarak gerekli olup olmadığı açık bir sorudur. AGPAT2, lizofosfatidik asidin fosfatidik asite dönüşmesini katalize eder ve bu eksikliği mitokondriyal kütlenin azalmasıyla ilişkili yağ dokusu eksikliğine ve adipogenezin bozulmasına yol açar. Mitokondriyal kütle genişlemesinin adipogenezdeki etkisi, dışsal mitokondrilerin farklılaşan kahverengi adipositlere aktarılmasıyla değerlendirildi. Mitokondriyal transferin AGPAT2 eksikliği olan hücrelerin bozulmuş adipogenezini kurtarıp kurtaramayacağı da araştırıldı. İnsan ve fare mitokondrileri, fare preadipositlerinin endogen mitokondriyal ağına başarılı bir şekilde aktarıldı ve kahverengi adipogenez boyunca devam etti. Transfer mitokondrilerin tutulması için adipojenik farklılaşma gerekliydi. Mitokondriyal transfer, olgun esmer adipositlerin moleküler belirteçlerinin veya lipid damlacık içeriğinin ifadesini değiştirmedi, ancak türe bağlı olarak lipid damlacık boyutunun göreceli dağılımını etkiledi. Agpat2^-/- preadipositlerde, mitokondriyal transfer adipogenezi kurtaramadı; bu da bu modelde lipodistrofiye yol açan mekanizmaları tersine çevirmek için sadece mitokondriyal kütle genişlemesinin yeterli olmadığını gösterir. Bu sonuçlar, dış insan ve fare mitokondrilerinin mitokondriyal dipositlerin mitokondriyal ağına dahil edilebildiklerini, ancak doğrudan adipojenik programı etkilemediklerini göstermektedir.

Giriş

Birincil biyoenerjik rollerinin ötesinde, mitokondriler hücre^{farklılaşması} 1,2,3,4 dahil olmak üzere birçok hücresel süreçte sinyal merkezi olarak hizmet verir. Kahverengi yağ dokusu (BAT), termojenik aktivitesini desteklemek için belirgin şekilde yüksek bir mitokondriyal kütleye sahiptir; bu da tüm vücut enerji dengesinde ve obezitenin patogenezinde rolünü^vurgular. Mitokondriyal kütle biyogenez ile mitopaji arasındaki dengeyle düzenlense de, kahverengi adiposit farklılaşması sırasında mitokondriyal kütle genişlemesinin adipogenez için işlevsel olarak gerekli olup olmadığı yoksa sadece sürecin bir sonucu olup olmadığı belirsizdir.

Hücreler arasında fizyolojik mitokondriyal transfer, hem in vitro hem de in vivo belgelenmiş olup, patolojik koşullar altında doku adaptasyonuna katkıda bulunmuştur; bunlara obezite ile ilişkili yağ dokusu işlev bozukluğu ve insülin direnci ^6,7 dahildir. Ayrıca, yapay mitokondriyal transferin in vitro olarak alıcı hücrelerin solunum kapasitesini artırdığı^{gösterilmiştir 8}. Bu bulgular birlikte, mitokondriyal transferin hücresel metabolik fonksiyonu değiştirebileceği ve biyoenerjik stres koşullarında doku adaptasyonuna katkıda bulunabileceği^{fikrini desteklemektedir 9,10,11}. Nükleer ve mitokondriyal transkripsiyon programlarını aktive ederek endogen mitokondriyal biyogenezi uyaran farmakolojik veya genetik stratejilerle karşılaştırıldığında, mitokondriyal transfer organelleri doğrudan alıcı hücrelere ulaştırır ve mitokondriyal kütlenin transkripsiyonel manipülasyonlardan bağımsız hızlı bir şekilde^{değiştirilmesini sağlar 12,13}. Bu yaklaşım, mitokondriyal hastalıklardaki kusurların düzeltilmesi için kritik olup, aynı zamanda farmakolojik veya genetik yaklaşımların potansiyel hedef dışı etkileri olmadan mitokondriyal etkilerin incelenmesine^{olanak tanır 14}.

Bu çalışmada, mitokondriyal kütleyi yapay olarak artırmanın dış mitokondriyal transferle kahverengi adipositlerin farklılaşmasında etkisini inceledik. Bu yaklaşım, mitokondriyal kütlenin adipojenik program üzerindeki etkisinin doğrudan değerlendirilmesini mümkün kılmıştır. Bunu başarmak için, mezenkimal kök hücreler için geliştirilen mitokondriyal transfer protokolleri, hem insan hepatik hücreleri hem de mare preadipositleri mitokondriyal donör olarak kullanılarak uyarlanmıştır^. İnsan mitokondrilerinin fare hücrelerinde farklılaşan bir yöntem geliştirilmesinde, genetik araçlar ve görüntüleme teknikleri kullanılarak geliştirildi ve her iki kökenden gelen mitokondrilerin endogen mitokondriyal ağa dahil olduğu ve adipojenik farklılaşma boyunca devam ettiği gösterildi.

Düşük mitokondriyal kütleyle ilişkili kusurlu adipogenezi modellemek için, 1-asilgliserol-3-fosfat-O-asiltransferaz 2 (AGPAT2) eksikliği (Agpat2^-/-) farelerden türetilen kahverengi adipositler farklılaştı. AGPAT2, gliserolipid biyosentez yolunda fosfatidik asit oluşumunu katalize eden yağ dokusunda yüksek derecede ekspresyondadır. AGPAT2 eksikliği, hem insanlarda hem de farelerde ciddi lipodistrofiye yol açar ve beyaz ve kahverengi adiposit modellerinde mitokondriyal kütlenin azalmasıyla ilişkili adipogenezi^bozar 16,17,18. Dışsal mitokondrilerin farklılaşan preadipositlere dahil edilmesi, lipid damlası boyut dağılımını hafifçe değiştirdi ancak olgun kahverengi adiposit belirteçlerinin ekspresyonunu artırmadı veya Agpat2^-/- preadipositlerin adipojenik bozulmasını kurtarmadı.

Protokol

Hayvan prosedürleri, Pontificia Universidad Católica de Chile'deki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi tarafından protokol 210609003 onaylandı. Bu çalışmada her iki cinsiyetten vahşi tip ve Agpat2^-/ - P0.5 yenidoğan fareler, karışık C57BL/6J ve 129J genetik geçmişinden türetilmiştir. Kişisel Koruyucu Ekipman (PPE): Laboratuvar önlüğü, koruyucu gözlük ve nitril eldiven takın. Ek protokol detayları için Ek Dosya 1'e ve bu protokol için gerekli tamponlar için Tablo 1'e bakınız.

Elektron mikroskopi hazırlığı, paraformaldehit fiksasyonu ve nüklein asit ekstraksiyonu sırasında oluşan tüm toksik kimyasal atıklar, kurumsal Çevre Sağlığı ve Güvenliği (EHS) düzenlemelerine uygun olarak belirlenmiş, açıkça etiketlenmiş akışlara sıkı bir şekilde ayrılmalıdır. Bu reaktiflerin hiçbir koşulunda laboratuvar lavabosuna veya kamu kanalizasyon sistemine tahliye edilmemelidir. Üretilen tüm tehlikeli kimyasal atıklar, kurumsal EHS sınıflandırmalarına göre ayrılmalıdır.

1. Hücre kültürü

1. Birincil adipositlerin izolasyonu, farklılaşması ve korunması (iBAT)
   NOT: Prosedürlerin kısa açıklaması için Ek Dosya 1'e ve gerekli çözümlerin bileşimi için Tablo 1'e bakınız. In vitro kahverengi adipojenik farklılaşma protokolümüzün tam ve ayrıntılı bir açıklaması Figueroa ve ^ark.19'da bulunabilir.
   1. Figueroa ve ^ark.19 tarafından tanımlanan cerrahi ve enzimatik sindirim prosedürlerini takip ederek neonatal (P0.5) farelerin interskapulyar kahverengi yağ dokusundan (iBAT) preadipositleri izole edin.
   2. Kahverengi adiposit kültürünü farklılaştırma kokteyli ve medya değişim programına göre ayırt edin ve sürdürün.
      NOT: Başarılı bir adipojenik farklılaşma için, kültürlerin adipojenik indüksiyona başlamadan önce %90–100 birleşime ulaşması kritik öneme sahiptir.
2. HepG2 kültürü
   1. DMEM'de %10 fetal sığır serumu, 100 U/mL penisilin, 100 μg/mL streptomisin ve 0,25 μg/mL amfoterisin B ile takviye edilen HepG2 hücrelerini kültürleyin. Hücreleri %5 CO₂ içeren nemlendirilmiş kuluçka içinde 37 °C sıcaklıkta tutun.
      NOT: Bu hücreler kümeler halinde büyür ve çok katmanlı büyüme nedeniyle yüksek yoğunluklara rağmen alt konfulens görünebilir.

2. Mitokondriyal izolasyon ve transferans

1. Mitokondriyal izolasyon
   NOT: Tüm adımları 4 °C sıcaklıkta veya buz üzerinde bir biyogüvenlik dolabında yapın. Hazırlığı 2 saat içinde kullanın.
   1. Tohum 2 × 100 mm kültür kablarında 10⁶ donör hücre (HepG2 veya preadipositler) bulunur. Hücreleri %80 (HepG2) veya %100 (preadipositler) birleşimine ulaşana kadar büyütün.
   2. 100 nM MitoTracker Deep Red FM ile FBS-içermeyen ortamda, %5_CO2 inkübatörde 30 dakika boyunca 37 °C'de donör hücreleri boyan.
   3. Hücreleri fazla boya çıkarmak için iki kez büyüme ortamıyla yıkayın.
   4. Hücreleri tripsin kullanarak ayırın, süspansiyonu toplayın ve 300 × g sıcaklığında 4 °C'de 5 dakika boyunca santrifüj yapın.
   5. Pellet, BSA, proteaz inhibitörleri ve fosfataz inhibitörleriyle takviye edilmiş 1 mL mitokondriyal izolasyon tamponu (MIB) içinde yeniden süzülür. Plazma zarını 5 kez tüberkülin şırıngasından geçirerek bozun. Süspansiyonu en az 10 kez insülin şırıngasından geçirerek homojenleştirin; ta ki çözelti açık kahverengi hale gelene ve görünür kümeler oluşsun.
      NOT: Western blot analizi için, toplam lizatın 50 μL'sini aliquot edinin ve -20 °C'de depolayın.
2. Homojenatı 900 × g ile 11 dakika boyunca 4 °C'de santrifüj yapın.
   NOT: 900 × g spinden sonraki süpernatant bulanıksa, hücresel liz muhtemelen eksik değildir.
   1. Süpernatantı toplayıp 10.000 × g sıcaklığında 10 dakika boyunca 4 °C'de mitokondrileri pellet etmek için santrifüj yapın. Mitokondriyal pelleti BSA takviyesi olan MIB ile 3 kez yıkayın.
   2. 100 μL BSA-sız MIB'de son bir yeniden süspansiyon yapıldı. BCA protein testi kullanarak protein konsantrasyonunu nicelikle ölçün.
3. Preadipositlerde mitokondriyal transfer testi (MTA)
   1. Tohum alıcı preadipositler, testten 24 saat önce 12 kuyruklu plakalarda (mikroskopi için 18 mm örtüklerle) 5 × 10⁵ hücre aralığında.
   2. İzole donör mitokondrileri doğrudan alıcı ortama 10 μg mitokondriyal protein oranında^10-5 hücre başına ekleyin. Mitokondrileri dağıtmak için plakaları nazikçe sallayın. Hücreleri 24–120 saat boyunca (1., 3. ve 5. farklılaşma günlerine karşılık gelir) 37 °C'de, %5 CO₂ ile nemlendirilmiş bir kuluçka içinde, analiz öncesinde inkübe yapın.

3. Mitokondriyal oksijen tüketimi ve MTA verimliliği

1. Mitokondriyal respirometri
   1. Dış dolaşım su banyosunu 25 °C'ye ayarlayın ve ölçümlere başlamadan önce odadaki cekette stabil termal dengeyi sağlayın.
   2. Cihazın alım yazılımını kullanarak iki noktalı sıvı faz kalibrasyonu yapın.
      1. Hava doygunluğu kalibrasyonu (Yüksek Nokta): Odaya 500 μL hava doygunluğuna sahip mineralsizleştirilmiş su ekleyin. Manyetik karıştırıcıyı 60 rpm'ye ayarlayın ve sinyali bir platoda (>1.500 mV) stabilize edene kadar kaydedin.
      2. Sıfır oksijen kalibrasyonu (Düşük Nokta): Kalan havayı yer değiştirmek için odaya küçük (~3 mm çapında) miktarda sodyum sülfit ekleyin. Sinyal stabil bir bazal platoya (~%1, ~20 mV) düşene kadar kaydet.
   3. Gerçek zamanlı kaydı başlatın (toplam çalışma süresi: ~10 dakika).
   4. Stabil doğrusal bir okuma elde edilene kadar 3 dakika kayd edin.
   5. İzole mitokondrileri, 5 mM glutamat ve 2,5 mM malat takviyesi ile takviye edilmiş 200 μL mitokondriyal test tamponu (MAS)²⁰ ile yeniden askıya alın.
      NOT: Mevcut çalışmada, toplam mitokondri pelleti iki 100 mm hücre plakasından çıkarılmıştır.
   6. Süspansiyonu Oksigraf odasına aktarın ve emniyet pistonu sıkıca kapatın, böylece hava kabarcıkları kalmamasını sağlarsınız.
   7. 3 dakika boyunca oksijen tüketimini kaydedin.
   8. Mitokondriyal bağlı solunumu tetiklemek için 150 μM ADP ekleyin ve ATP sentez-bağlantılı solunumu 3 dakika boyunca ölçün.
   9. Her solunum evresine karşılık gelen kararlı, doğrusal segmentleri manuel olarak tanımlayın. Yazılım tarafından otomatik olarak hesaplanan eğim değerlerini, oksijen tüketim oranları olarak nmol∙^mL-1∙^min-1 cinsinden çıkarın.
      NOT: Levhalar arası hazne temizliği için, hazneyi 1 mL demineralize su ile 2 kez durulayın ve iç kısmın tamamen kuru olduğundan emin olun. Bir sonraki plakaya geçmeden önce odaya 100 μL PBS ekleyin.
2. Akış sitometrisi
   NOT: Hücresel ve biyoenerjik bütünlüğü korumak için işlem boyunca tüm örnekleri buzda tutun.
   1. Mitokondrileri izole edin ve MitoTracker Deep Red FM ile etiketlenmiş donör hücreler kullanılarak, sırasıyla 2.1 ve 2.2. bölümlerde açıklandığı gibi mitokondriyal transfer testi (MTA) gerçekleştirilin.
   2. Kültür ortamını aspire edin ve hücre monotabakasını 1 mL steril PBS ile bir kez yıkayın.
   3. %0,25 %0,25 Tripsin-EDTA 500 μL eklenir ve mikroskop altında tam hücre ayrımı gözlemlenene kadar kapları 37 °C'de kuluçka altına alın.
   4. Tripsini 1 mL tam büyüme ortamı (%10 FBS ile DMEM) ekleyerek nötralize edin. Tüm hacmi 15 mL'lik konik bir tüpe aktarın ve 300 × g sıcaklıkta 4 °C'de 5 dakika boyunca santrifüj yapın.
   5. Süpernatantı aspirasyonla atın ve hücre pelletini koruyun. Pelleti nazik pipetle 500 μL buz gibi soğuk PBS içinde yeniden süskü altına alın.
   6. 640 nm lazerle donatılmış bir akış sitometresi kullanılarak örnekleri analiz edin (akış sitometrisi edinimi ve analizi hakkında detaylar için Ek Dosya 1'e bakınız).
      1. Hücre popülasyonunu İleri Saçılma (FSC) ve Yan Saçılma (SSC) grafikleriyle tanımlayın ve enkaz ile hücre çiftlerini dışlamak için bir kapı stratejisi uygulayın.
      2. Uzak kırmızı kanaldaki floresans yoğunluğunu (670/30 nm emisyon filtresi) nicelleştirerek içselleştirilmiş MitoTracker etiketli mitokondrileri tespit edin.
      3. Floreada.io kullanarak analiz yapın (kapı protokolü detayları için Ek Dosya 1'e bakınız).
         NOT: Arka plan otofloresansı için temel oluşturmak amacıyla negatif bir kontrol (MTA'sız alıcı hücreler) ekleyin.
3. Konfokal ve elektron mikroskopi
   1. Canlı hücre görüntüleme testi
      1. P0.5 yenidoğan farelerden türetilen tohum birincil preadipositler, 18 mm örtülü 12 kuyulu plakalara ulaşır; bu plaklar Bölüm 1'de detaylandırılan spesifik hücre yoğunluğu ve ortam gereksinimlerine uygundur.
      2. Mitokondrileri izole edin ve MitoTracker Deep Red FM ile etiketlenmiş donör hücreleri kullanarak mitokondriyal transfer testi (MTA) uygulanın, Bölüm 2'de belirtildiği gibi.
      3. Alıcı kültürleri, mitokondriyal alım için %5_CO2 ile 37 °C'de nemli bir kuluçka içinde 24 saat boyunca tutun.
      4. 70 nM'lik MitoTracker Green çalışma çözümü hazırlamak için stoku FBS-siz kültür ortamında seyreltirin.
      5. 12 kuyu plakalarından büyüme ortamını aspire edin ve yerine 70 nM MitoTracker Green çözeltisi verin. Plakaları, %5_CO2 ile nemlendirilmiş bir kuluçka makinesinde 37 °C'de 25 dakika kuluçka geçirerek toplam mitokondriyal ağı karşı boya uygular.
      6. Boyama çözeltisini çıkarın ve örtükleri 1 mL sıcak, tam kültür ortamıyla 2 kez yıkayın.
      7. Son hacmi fenol kırmızısız tam ortamla değiştirin, böylece alım sırasında arka plan otofloresansı en aza indirilebilir.
      8. Kapak kazmalarını veya plakayı konfokal mikroskop aşamasına aktarın. Mikroskobun kuluçka odasını sabit 37 °C ve %5_CO2 ortamı koruyacak şekilde ayarlayın.
      9. Hem uzak kırmızı (MitoTracker Derin Kırmızı FM) hem de yeşil (MitoTracker Yeşil) kanallar için uygun uyarılma/emisyon ayarlarıyla hemen görüntüler alın. Ek detaylar için Ek Dosya 1'e bakınız.
         NOT: Tüm boyama ve işleme adımlarını düşük ışık koşullarında uygulayarak floroforların fotobeyazlanmasını önleyin. Mitokondriyal morfolojinin optimal çözünürlüğü için yüksek sayısal açıklık (NA) yağ daldırma hedefi (60x veya 100x) kullanın.
   2. Sabit hücrelerle konfokal immünoflüoresans testi
      NOT: Hücre fiksasyonundan sonra, toksik paraformaldehit ve glutaraldehit çözeltileri halojenlenmemiş organik olarak sınıflandırılır. Nükleik asit ekstraksiyon yan ürünleri sıkı ayrıştırma gerektirir: fenol/kloroform karışımları halojenlenmiş organik olarak bertaraf edilmeli, guanidinyum bazlı tamponlar ise aşındırıcı organik olarak sınıflandırılır.
      1. Tohum birincil preadipositler, P0.5 yenidoğan farelerden 12 mm örtülü levhalara türetilmiştir; bu plakalar, Bölüm 1'de açıklandığı gibi.
      2. Mitokondrileri izole edin ve Bölüm 2'de belirtilen prosedürlere uygun olarak mitokondriyal transfer testi (MTA) gerçekleştirilir.
      3. Mitokondriyal alım için kültürleri 24 saat kuluçka edin.
      4. Kahverengi adipojenik farklılaşmayı Ek Dosya 1'de tanımlanan protokolü takip ederek indük edin ve gerekli tamponların bileşimi için Tablo 1'e bakın.
      5. Hücreleri diferensiasyonun 7. gününde (168 saat) sabitleyin. Kültür ortamını aspire edin ve her kuyuya %4 paraformaldehit (PFA) 500 μL ekleyin. Oda sıcaklığında 20 dakika kuluçka yapın.
      6. Kapak kapaklarını her kuyuya 1 mL buz gibi soğuk PBS ekleyerek 2 kez yıkayın. Oda sıcaklığında %0,05 saponin ve %0,2 BSA içeren örtü kapaklarını inkubasyon yoluyla hücreleri permeabilize edip bloke edin. Plakayı hafif bir çalkalama altında yörünge sallayıcısına yerleştirin.
      7. Hücreleri 1 mL PBS ile 2 kez yıkayın. Çekirdekleri ve lipid damlacıklarını aynı anda boyayın. Bloklama/permeabilizasyon tamponu içinde hazırlanmış 1 μg/mL Hoechst 33342 ve 1 μg/mL BODIPY uygulanır. Oda sıcaklığında 30 dakika kuluçka yapın, böylece plaka ışıktan korunur.
      8. Kapak kapaklarını 1 mL buz gibi soğuk PBS ile 2 kez yıkayın. Kapak kaymalarını temiz cam kaydırmalara monte edin. 10 μL montaj maddesini sürgüye bırakın ve kapak kazağı hücre tarafı aşağıya monte ortamına yerleştirin. Numunelerin görüntülemeden önce oda sıcaklığında karanlık bir ortamda gece boyunca kurumasına izin verin.
      9. Konfokal mikroskop kullanarak görüntü alın. Hoechst ve BODIPY'nin emisyon spektrumları için kalibre edilmiş iki floresan kanalı kullanın. Ek görüntüleme detayları için Ek Dosya 1'e bakınız.
      10. ImageJ v1.54s kullanarak lipid damlacık analizi yapın. Lipid damlacık kanalını açın, Freehand seçimleri ve ROI Manager araçlarıyla bireysel damlacıkları manuel olarak belirleyin ve Analyze | Ölçü komutu.
      11. RStudio v4.5.2 ortamında Ek Dosya 2'de sağlanan R betikleriyle ortaya çıkan verileri işleyin ve analiz edin.
          NOT: Temsil eden örnekleme sağlamak için her kapak fişini 10x büyütme ile tam olarak beş görüntü alın. Sağlanan betiklerle uyumluluk için R sürüm 4.5.2 veya üzeri kullanın.
   3. Geçirim elektron mikroskopisi (TEM)
      NOT: Elektron mikroskopi yan ürünleri için, yüksek toksik osmiyum tetrooksit ve arsenik içeren sodyum kakodilat tamponları toksik ağır metal atıkları olarak toplanmalıdır; uranil asetat ise kurumsal radyasyon güvenlik protokolleri kapsamında radyoaktif ağır metal atığı olarak ayrı olarak yönetilmelidir.
      1. Bölüm 2'den izole mitokondrileri 10.000 × g sıcaklıkta 4 °C'de 10 dakika boyunca santrifüjlenerek kompakt bir pelet elde edin.
      2. Pelleti 0,1 M sodyum kakodilat tamponuna (pH 7,0) %2,5 glutaraldehit ekleyerek sabitleyin. 4 °C'de 2 saat kuluçka yapın.
         NOT: Her zaman glutaraldehit stok çözeltilerini ele alın ve ilk fiksasyon adımlarını kimyasal bir buhar davlumbazında gerçekleştirin. Göz koruması için nitril eldiven ve gözlük takın. Isıtılan glutaraldehit yüksek tahriş edici buharlar salgıladığı için ısıtma kaynaklarıyla temas etmekten kaçının.
      3. Mitokondriyal preparatı 0,05 M sodyum kakodilat tamponu ile 3 × 10 dakika boyunca yıkayın ve tampon değişimleri arasında peleti tutmak için kısa bir süre santrifüj yapın.
      4. Numuneyi %1 sulu osmiyum tetroksit (OsO₄) ekleyerek sabitleyin. Oda sıcaklığında 15 dakika kuluçka yapın.
         NOT: Osmiyum tetroksit yalnızca sertifikalı, tam işlevsel kimyasal bir hava davlumbanında açılmalı ve tutulmalıdır. Laboratuvar önlüğü, koruyucu gözlük veya tam yüz kalkanı ve kalın veya çift nitril eldiven giyin (herhangi bir sıçrama olursa hemen eldivenleri değiştirin, çünkü OsO₄ zamanla ince nitrili delebilir).
      5. Örneği çift damıtılmış suyla 3 × 5 dakika boyunca yıkayın. Pelleti %1 sulu uranil asetatla 15 dakika boyayın.
         NOT: Tek kullanımlık plastik tabanlı tezgah kağıdı üzerinde çalışın. Laboratuvarda radyoaktif boyama için özel bir alan ayırın. Çift eldiven, laboratuvar önlüğü ve güvenlik gözlüğü takın. İşlemi tamamladıktan sonra ellerinizi iyice yıkayın.
      6. Preparatı derecelendirilmiş etanol serisi kullanarak kurutun. Pelleti her konsantrasyonda 5 dakika boyunca 30%, %50, %70, %95 ve %100 etanol içinde kuluçka yapın.
      7. Mitokondriyal fraksiyonları gömül. 30 dakika boyunca 1:1 Epon/etanol çözeltisinde kuluçkalayın, ardından saf Epon reçinesi ile 1 saat kullanın.
      8. Örnekleri gömülü kalıplara aktarın ve 60 °C fırında 48 saat polimerize edin.
      9. Reçine bloklarını ultramikrotoma bağlayın ve ultra ince kesitler (80 nm) kesin.
      10. Bölümleri ızgaralara toplayın. Izgaraları %1 sulu uranil asetat ile 4 dakika boyayın. Çift damıtılmış suyla durulayın.
      11. Reynolds'un²¹ yöntemiyle 5 dakika boyunca kurşun sitratla boyan. İyice durulayın. Şebekeleri TEM ile görselleştirin. Reynolds yöntemi ve TEM görüntü edinimi hakkında detaylar için Ek Dosya 1'e bakınız.

4. Moleküler niceliklendirme

1. Mitokondriyal DNA (mtDNA) standart eğrisi
   1. HepG2 hücrelerini beş adet 100 mm kültür kabına tohumlayın. Kültürleri birleşme noktasının %80'ine ulaşana kadar kuluçka edin.
   2. Mitokondrileri, 2. Bölümde detaylandırılan teknik prosedürü takip ederek toplanan hücrelerden izole edin.
   3. Ortaya çıkan mitokondriyal pelletten asit-guanidinyum-fenol-kloroform yöntemiyle Bölüm 4.2.6'da açıklandığı gibi toplam DNA çıkarın. DNA konsantrasyonunu ölçün ve saflığı değerlendirin ((A₂₆₀/_{A 280} ve (A₂₆₀/A₂₃₀ oranları) mikrohacimli UV-Vis spektrofotometre kullanarak.
   4. Nukleazsız suyu seyreltici olarak kullanarak seri bir seyreltme serisi hazırlayın. DNA stokunu seyreltirerek reaksiyon hacmi başına 1, ^10-1, ^10-2, ^10-3, ^10-4 ve ^10-5 ng nihai miktarlara ulaşın. Her seyreltmeyi 5 saniye boyunca vortex ile tam homojenlik sağlanarak serideki bir sonraki adıma geçilmesini sağlar.
      NOT: Standart eğrinin konsantrasyon aralığını belirli örnek konsantrasyonu ve nihai PCR reaksiyon hacmine göre ayarlayın.
2. Alıcı hücrelerde İnsan mtDNA'sının Tespiti
   1. P0.5 yeni doğumlu farelerden türetilen tohum birincil preadipositler, Bölüm 1'de belirtilen yoğunluk ve ortam koşullarına uygun olarak 60 mm kültür kablarına alınmıştır.
   2. Mitokondrileri donör HepG2 hücrelerinden izole edin ve Bölüm 2'de detaylandırıldığı gibi mitokondriyal transfer testini (MTA) gerçekleştirin.
   3. Kültürleri 37 °C ve %5_CO2 sıcaklıkta 24 saat kuluçka edin.
   4. Bölüm 1'de tanımlanan medya değişim protokolünü takip ederek 24–120 saat boyunca (1, 3 ve 5. günlerde) kahverengi adipojenik farklılaşmayı indükleyin.
   5. Kültür ortamını aspire edin ve hücreleri 2 mL buz gibi soğuk PBS ile 2 kez yıkayın.
   6. Asit-guanidinyum-fenol-kloroform yöntemiyle toplam DNA^{çıkarın 22}.
      NOT: Her zaman alüt yapın ve zürünlü fenol buharlarını solumaktan kaçınmak için duman başlıkta faz ayırma işlemi yapın. Çift nitril eldivenler veya ağır kimyasallara dayanıklı eldivenler kullanın.
   7. Faz ayrımı gerçekleştirin ve interfazın üstünde bulunan tüm sulu fazı atın.
      KRİTİK ADIM: Sulu fazı tamamen çıkararak kirlenmeyi önleyin ve aşağı akış qPCR için yüksek DNA saflığını sağlasın.
   8. Başlangıç ekstraksiyon reaktifine 1 mL başına %100 etanol 0,3 mL ekleyin. Tüpü kaplayıp ters çevirerek sertçe karıştırın.
   9. Oda sıcaklığında 3 dakika bekletin ve 2.000 × g sıcaklığında 5 dakika boyunca 4 °C'de santrifüj yapın, böylece DNA pellet edildi.
   10. Fenol-etanol süpernatantını potansiyel protein izolasyonu için ayrı bir tüpe aktarın. DNA peletini 1 mL ekstraksiyon reaktifine göre 1 mL 0,1 M sodyum sitrat (%10 etanol, pH 8,5) ile yeniden askıya alın.
   11. Oda sıcaklığında 30 dakika bekletin, birkaç kez nazikçe ters çevirin ve 2.000 × g sıcaklıkta 4 °C'de 5 dakika santrifüj yapın. Üst yüzeyi at.
   12. Sodyum sitrat yıkama adımlarını iki kez daha tekrarlayın.
   13. Ortaya çıkan peleti 1 mL ilk ekstraksiyon reaktifine 2 mL %75 etanol ile yıkayın.
   14. Oda sıcaklığında 20 dakika bekletin ve 2.000 × g sıcaklığında 4 °C'de 5 dakika santrifüj yapın.
   15. Üst yüzeyi atın ve pelleti 10 dakika boyunca hava ortamında kurutun. DNA'yı 0.3–0.6 mL 8 mM NaOH ekleyerek ve pelet kaybolana kadar tekrar tekrar yukarı aşağı pipetle çözerek çözebilir.
   16. 12.000 × g sıcaklıkta 4 °C'de 10 dakika boyunca çözünmeyen kalıntıları temizlemek için santrifüj yapın. Süpernatantı steril bir tüpe aktarın ve pH HEPES ile 7–8'e ayarlayın.
   17. Mikrohacimli UV-Vis spektrofotometre kullanarak DNA konsantrasyonu ve saflığını ((A(260)/A(280) ve (A(260)/A(230) oranları) ölçün.
   18. Şablonu nükleazsız suda toplam DNA'nın son 15 ng'ine kadar seyreltirin. Bölüm 4.3'te belirtildiği gibi optik 96 kuyu plakaları kullanarak insan mtDNA'sı için nicel gerçek zamanlı PCR (qPCR) gerçekleştirin.
   19. Amplifikasyon sonuçlarını logaritmik regresyon modeli uygulayarak analiz edin.
       NOT: DNA konsantrasyonu ve buna karşılık gelen eşik döngü (Ct) değerlerini değişken olarak kullanarak logaritmik regresyon analizi yapın.
3. Gen ekspresyonu için RT-qPCR
   1. Hücre hazırlığı ve farklılaşma
      1. Tohum birincil preadipositler, 60 mm kültür kablarında P0.5 yenidoğan farelerden türetilmiştir, Bölüm 1.1'de detaylandırılmıştır.
      2. Mitokondrileri izole edin ve Bölüm 2'deki prosedürleri takip ederek mitokondriyal transfer testi (MTA) yapılın. Kültürleri 24 saat kuluçka edin.
      3. Bölüm 1'deki protokole göre 24–120 saat boyunca (farklılaşmanın 1., 3. ve 5. günlerinde örnekleme alınır) esmer adipogenezi indük edilir.
   2. Toplam RNA izolasyonu
      1. Kültür ortamını çıkarın ve 1 × 10-6 hücre başına 1 mL Asit-guanidinyum-fenol-kloroform ekstraktan reaktifini doğrudan tabağa ekleyin. Örnekleri tekrar tekrar pipetleyerek lizat uniform hale gelene kadar homojenleştirin.
         NOT: Her zaman alüt yapın ve zürünlü fenol buharlarını solumaktan kaçınmak için duman başlıkta faz ayırma işlemi yapın. Çift nitril eldivenler veya ağır kimyasallara dayanıklı eldivenler kullanın.
      2. Kullanılan 1 mL ekstraktant reaktifine 0,2 mL kloroform ekleyin. Tüpleri sıkıca kapatın ve 15 saniye boyunca elle sertçe sallayın. Oda sıcaklığında 3 dakika bekletin ve 12.000 × g sıcaklığında 4 °C'de 15 dakika santrifüj yapın.
      3. Üst sulu fazı dikkatlice yeni bir nükleaz içermeyen tüpe aktarın. Ara faz ile temastan kaçının. Örnekleri buzda tutun.
      4. Kullanılan 1 mL ekstraktan reaktifine 0,5 mL izopropanol ekleyin. Nazikçe karıştırın, ters çevirerek ve oda sıcaklığında 10 dakika kuluçka yapın.
      5. RNA'yı pelletlemek için 12.000 × g sıcaklıkta 10 dakika boyunca 4 °C'de santrifüj yapın. Üst maddeyi tersleme yoluyla at.
      6. RNA peletini 1 mL %75 etanol ile yıkayın. Kısa bir süre vortex ve 7.500 × g sıcaklıkta 4 °C'de 5 dakika boyunca santrifüj yapın.
      7. Süpernatantı atıp RNA pelletini oda sıcaklığında 10 dakika boyunca hava kurutması. Pelleti 30 μL nukleazsız suya yeniden süsküyünüz. Örnekleri 60 °C'de 15 dakika boyunca kuluçka yapın ve böylece tam çözünürlüğü sağlanır.
      8. Mikrohacimli UV-Vis spektrofotometre kullanarak RNA konsantrasyonu ve saflığını (A₂₆₀/_{A 280} oranları) belirleyin.
      9. Agaroz jel elektroforezi ile RNA bütünlüğünü doğrulayın.
   3. DNaz tedavisi
      1. Her RNA örneğine 0.1 hacim 10× DNaz tamponu ve 1 μL DNaz enzimi ekleyin. Nazikçe pipetle karıştırın. Reaksiyonları 37 °C'de 30 dakika kuluçka edin.
      2. DNaz İnaktivasyon Reaktifini, sıvılaştırma veya vortexleme yoluyla tekrar askıya alın, çamur homojen hale gelene kadar. İnaktivasyon Reaktifini (0.1 hacim RNA örneği veya 2 μL, hangisi daha büyükse) ekleyin ve iyice karıştırın. Oda sıcaklığında 5 dakika kuluçka yapın. Bu süre içinde reaktifi askıda tutmak için tüpleri 3 kez salla.
      3. Santrifüj 10.000 × g'de 1,5 dakika boyunca. RNA içeren süpernatantı yeni bir tüpe aktarın.
         KRİTİK ADIM: DNAZ İnaktivasyon Reaktifinin taşınmadığından ve sonraki cDNA sentezini engellediğinden emin olun.
   4. Ters transkripsiyon (RT)
      1. İşlenmiş RNA'yı nicelikleştirin ve nükleaz içermeyen suda seyreltirerek 20 μL reaksiyon başına toplam 2 μg'a kadar toplam RNA kullanın.
      2. RT master karışımını üreticinin talimatlarına uygun olarak buz üzerinde hazırlayın. Karışımı reaksiyon tüplerine dağıtın ve RNA örneklerini ekleyin.
      3. Termal döngüye yüklenin ve kit üreticisinin belirttiği şekilde ters transkripsiyon programını çalıştırın.
   5. Nicel gerçek zamanlı PCR (qRT-PCR)
      1. PCR şablonu olarak Bölüm 4.3.4'te oluşturulan cDNA'yı kullanın. CDNA'yı nükleaz içermeyen suda 10 μL reaksiyon başına 20 ng çalışma konsantrasyonuna kadar seyreltirin. Tüm reaktifleri buzda tutun.
      2. SYBR Green, primerler ve nükleaz içermeyen su içeren bir master karışım hazırlayın. Pipetleme kaybı için fazla hacmi ekleyin. Reaksiyon karışımından 10 μL her bir optik qPCR plakasına dağıtılır.
      3. Plakayı optik yapışkan filmle kapatın ve alt kısımdaki sıvıyı toplamak için kısa bir süre santrifüj yapın. Plakayı gerçek zamanlı bir PCR cihazına yükleyin ve hızlı döngü modunu kullanarak amplifikasyon yapın.
      4. Eşik döngü (Ct) değerlerini belirleyin ve ΔΔCt yöntemiyle göreceli nicelendirme yapın. Amplifikasyon özgüllüğünü doğrulamak için çalışmanın sonunda bir erime eğrisi analizi ekleyin.
         NOT: Hedef mRNA bolluğunu endogen ev geni olarak 36B4 mRNA seviyelerine normalize edin. QPCR plakalarını kurulumdan 2 saat içinde çalıştırın; aksi takdirde, kapalı plakaları 4 °C'de saklayabilirsiniz.
4. Western Blot
   1. Tam hücre ve mitokondriyal ekstraktlardan elde edilen protein konsantrasyonunu BCA testi kullanarak nicelikle ölçün (bkz. Bölüm 2.1.8 ve 2.1.12).
   2. Her örnek için 30 μg protein hazırlayın ve uygun hacimde SDS-PAGE örnek yükleme tamponu (örneğin, Laemmli tamponu) ekleyin.
   3. Örnekleri 5 dakika boyunca 95 °C'de ısıtarak denatüre edin (veya membran proteinleri için özel sıcaklık gereksinimlerini takip edin).
   4. Örnekleri poliakrilamid jelinin yuvalarına yükleyin. Proteinler, sodyum dodekil sülfat–poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) ile sabit bir voltajda (örneğin 80–120 V) boya cephesi jelin altına ulaşana kadar ayrılır.
   5. PVDF membranını %100 metanole daldırarak 1 dakika aktive edin, ardından transfer tamponunda denge sağlanır.
   6. Transfer sandviçi birleştirin, jel ile membran arasında hava kabarcıklarının olmadığından emin olun.
   7. Proteinleri PVDF membranına 400 mA'da 2 saat boyunca elektroblotlama ile aktarın. Süreç boyunca sistemi 4 °C'de tutun.
   8. Oda sıcaklığında 1 saat boyunca 0,1 tampon içeren tuzlu suyda hazırlanmış %5 yağsız sütte zarı inceleyerek spesifik olmayan bağlanma noktalarını engelleyin.
   9. Zarı, 4 °C'de hafif çalkalama altında primer antikorlarla (bloklayıcı çözeltide 1:1.000 seyreltilmiş) inkübe edin.
   10. Membranı TBS-T ile 3 × 15 dakika yıkayın.
   11. Oda sıcaklığında 2 saat boyunca yaban turpu peroksidaz (HRP) ile konjuge edilmiş ikincil antikorlarla kuluçka yapın.
   12. Zarı TBS-T ile 3 kez yıkayın, ardından son 5 dakikalık 1× TBS ile yıkama yapın.
   13. Protein bantlarını geliştirilmiş kemimilüminesans (ECL) alt tabakası kullanarak görselleştirin. Sinyali dijital görüntüleme sistemi kullanarak yakalayın.
       NOT: Poliakrilamid jel oranını hedef proteinlerin moleküler ağırlığına göre (örneğin, %8, %10 veya %12) ayarlayın. Elektrotransfer cihazında aktif bir soğutma sistemi yoksa, buz kaplarını her saat başı değiştirin ve odayı buz banyosunda tutun. Görselleştirme gecikirse membranları 4 °C'de 1× TBS içinde depolayın.

Sonuçlar

Mitokondriyal ekstraksiyon ve yapısal ile solunum bütünlüğü

Artan mitokondriyal kütlenin kahverengi adipogenezi üzerindeki etkisini değerlendirmek için, farklılaşmamış preadipositlerde mitokondriyal transfer testi (MTA) gerçekleştirildi (Şekil 1A). Mitokondriler, primer fare preadipositlerinden (mMito) ve insan karaciğer HepG2 hücre hattından (hMito) izole edildi. Western blot analizi, her iki preparatın da bütün ...

Tartışma

Mitokondriyal transferin adipogenezde biyolojik etkileri

Sonuçlarımız, hem insan hem de fare kaynaklarından gelen dışdışı mitokondrilerin, ayrılan preadipositlerin endogen mitokondriyal ağına dahil edilebileceğini gösterse de, mitokondriyal kütledeki yapay artışın kahverengi adipojenik programı sürdürmek için yeterli olmadığını göstermektedir. Bu bulgular, kahverengi adipogenezin mitokondriyal genişlemesinin mekanik olarak sınırlayıcı bir fak...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
100 mm plate	SPL Life Science	10101SPL
10x Tris/Glycine Buffer	BioRad	1610734
12 mm glass coverslips	Marienfeld	111520
12-well plate	SPL Life Science	30012SPL
16% Paraformaldehyde Aqueous Solution	Invitrogen	28908
18 mm glass coverslips	HART	-
24-well plate	SPL Life Science	30024SPL
3,3′,5-Triiodo-L-thyronine sodium salt (T3)	Sigma	T6397
3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX)	Calbiochem	410957
30% Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1	BioRad	1610158
35 mm plate	SPL Life Science	20035SPL
6-well plate	SPL Life Science	30006SPL
60 mm culture dish	SPL Life Science	20060SPL	İlköncelikli preadiposit ve DNA/qPCR deneyleri için kullanılır; tedarikçi/katalog sağlanmamıştır
AccuRuler RGB Plus Pre-stained Protein Ladder	Maestrogen	02102-250
ACK lysing buffer	Gibco	A10492-01
Actrapid 100 UI/mL (Insulin)	Novo Nordisk	A10AB01
ADP	Merck	117105
Agarose	FERMELO BIOTEC	FER00AL200G	RNA bütünlüğü doğrulaması için kullanılır; tedarikçi/katalog sağlanmamıştır
Ammonium Persulfate	BioRad	1610700
Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody	Cell Signaling	7074
Anti-rat IgG, HRP-linked Antibody	Cell Signaling	7077
Antibiotic-antimycotic	Gibco	15240062
Axio Observer inverted microscope stand	Carl Zeiss	431007-9901-000	Ek Yöntemlerden eklendi
BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific	D49328
BD Cytometer Setup and Tracking beads	BD Biosciences	-	Ek Yöntemlerden eklendi; katalog sağlanmamıştır
BD FACSDiva Software v8.0.3	BD Biosciences	-	Ek Yöntemlerden eklendi
BD LSRFortessa X-20 cell analyzer	BD Biosciences	-	Mevcut giriş, ek dosyayla eşleştirilmek üzere standart hale getirildi
BioRender	BioRender	-	Şekil 1 iş akışı oluşturmak için kullanıldı
Blotting-grade blocker	BioRad	170-6404
BODIPY 493/503	Invitrogen	D3922
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma	A1470
CaCl2	Calbiochem	208291
cDNA Reverse Transcription Kit	Invitrogen	4374966
Cell Strainer 100 μm, nylon	Falcon	352360
Cell Strainer 40 μm, nylon	Falcon	352340
Collagenase type II	Gibco	17101-015
Dexamethasone	Sigma	D4902
DMEM Powder, High Glucose, Pyruvate	Thermo Scientific	12800017
DMEM/F-12, no phenol red	Thermo Scientific	21041025
DMEM/F-12, powder	Gibco	12500062
DMSO	Sigma	D8418	İndüksiyon ortamı çözücüsü; tedarikçi/katalog sağlanmamıştır
EMBed-812 EMBEDDING KIT (Epon)	Electron Microscopy Sciences	14120
Ethanol absolute	Merck	100983
Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid tetrasodium salt (EGTA)	Merck	324626
FAST SYBR MASTER MIX	Thermo Scientific	4385612
FCCP	Sigma	C2920
Fetal bovine serum	Capricorn Scientific	BS-16A
Floreada.io	Floreada.io	-	Akış sitometri analizi yazılımı
Fluoromount-G	Thermo Scientific	7984-25
GAPDH Antibody	Santa Cruz	sc-32233
Glucose	Gibco	15023-021
Glutamate	Sigma	G1626
Glutaraldehyde 25% Aqueous Solution	Electron Microscopy Sciences	16210
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP	Invitrogen	62-6520
GraphPad Prism v10.6.1	GraphPad Software	-	İstatistiksel/logaritmik regresyon analizi yazılımı
Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail 100X	Thermo Scientific	78442
HEPES	Biological Industries	41-122-100
Histone H3 (1G1)	Santa Cruz	sc-517576
Hoechst 33342	Life Technologies	H3570
ImageJ v1.54s	NIH	-	Lipit damlacık görüntü analizi yazılımı
Immun-Blot PVDF Membrane	BioRad	1620177
Indomethacin	Sigma	I7378
Insulin syringe	Cranberry	AAJECIN3	Hücre homojenizasyonu için kullanılır; tedarikçi/katalog sağlanmamıştır
KCl	Calbiochem	529552
KH2PO4	Calbiochem	529568
KHCO3	Sigma	60339
LAMP-1