Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Araştırma makalesi
Sesquiterpene lakton XTT, makrofajlarda lipopolisakkarit (LPS) kaynaklı inflamatuar yanıtları etkili bir şekilde azaltır. XTT, MAPK aktivasyonunu etkilemeden NF-κB sinyalini inhibe etmek için IKKα/β'yi hedefliyor ve böylece in vitro güçlü anti-inflamatuar etkiler uygular.
Nükleer faktör-κB (NF-κB) zincirinin düzensizliği, inflamatuar bozuklukların ilerlemesiyle sıkı sıkıya bağlantılıdır. IκB kinazlar (IKK'lar), NF-κB aktivitesinin merkezi modülatörleri olarak iyi tanınmıştır ve bu da onları inflamatuar patolojilerin tedavisinde cazip terapötik adaylar yapar. Sesquiterpene laktonu 1β-hidroksil-5α-kloro-8-epi-ksanthatin (XTT) güçlü antikanser etkileri sağladığı belgelenmiştir. Ancak, anti-inflamatuar etkinliği ve altta yatan moleküler mekanizmaları belirsizdir. Bu çalışmada, XTT lipopolisakkarit (LPS) ile aktive edilmiş RAW264.7 makrofajlarında nitrik oksit (NO) ve prostaglandin E2 (PGE2) sentezini belirgin şekilde bastırmıştır. XTT ayrıca LPS tetiklediği indüklenebilir nitrik oksit sentaz (iNOS), siklooksijenaz-2 (COX2), tümör nekroz faktörü-α (TNF-α), interlökin-1β (IL-1β) ve interlökin-6 (IL-6) mRNA seviyelerini önemli ölçüde düşürdü. Ayrıca, XTT, LPS tedavisiyle ortaya çıkan iNOS ve COX2 protein seviyelerini aşağı düşürdü. Mekanik düzeyde, XTT mitojen-aktifete edilmiş protein kinaz (MAPK) kaskadının aktivitesini belirgin şekilde değiştirmedi. Buna karşılık, XTT IKKα/β ile etkileşime girerek LPS tetikleyici fosforilasyonu ve inhibitör κBα (IκBα) parçalanmasını güçlü şekilde engelledi ve böylece NF-κB nükleer translokasyonunu olumsuz etkiledi. Bu veriler bir arada, XTT'nin IKKα/β hedefleyerek ve NF-κB sinyalini engelleyerek in vitro güçlü anti-inflamatuar etkiler ortaya koyduğunu göstermektedir. Bu sonuçlar, XTT'nin anti-enflamatuar ajanların geliştirilmesinde umut vadeden bir lider bileşik olabileceğini göstermektedir. Doğrudan IKKα/β inhibisyonunu ve terapötik potansiyeli doğrulamak için daha fazla biyokimyasal ve in vivo çalışmalar gereklidir.
İltihaplanma, organizmaların enfeksiyon, doku hasarı ve diğer çevresel sorunlara yanıt vermesini sağlayan sıkı şekilde düzenlenmiş bir biyolojiksüreçtir. 1. Akut inflamatuar yanıtlar genellikle koruyucu olsa da, inflamatuar yolların kalıcı aktivasyonu doku homeostazını bozabilir ve inflamatuar bağırsak hastalığı (IBD) ve romatoid artrit (RA) dahil olmak üzere kronik bozuklukların başlangıcına ve ilerlemesine katkıda bulunabilir. Birçok hücre içi sinyal ağı inflamatuar düzenlemeye katılır; bunlar arasında nükleer faktör-κB (NF-κB) yolu en kapsamlı incelenenlerdenbiridir 3.
NF-κB ailesinin üyeleri, p50, p52, p65 (RelA), RelB ve c-Rel dahil, bağışıklık ve iltihaplanmada rol alan genlerin ifadesini düzenleyen dimerik transkripsiyonfaktörleri olarak işlev görür 4,5. Bazal koşullarda, NF-κB dimerleri κB (IκB) proteinlerinin inhibitörüyle ilişkilendirilerek sitoplazmada inaktif kalır. Lipopolisakkarit (LPS) veya tümör nekroz faktörü-α (TNF-α gibi inflamatuar aracılarla uyarıldıktan sonra, IκB kinaz (IKK) kompleksi aktive olur ve IκBα'yi fosforile eder; bu da her yerde yayılmasına ve bozulmasına yol açar. Bu süreç, NF-κB komplekslerinin çekirdekte birikmesini ve inflamatuar aracıların ve sitokinlerin transkripsiyonunubaşlatmasını sağlar 6. Aşırı veya sürekli NF-κB aktivasyonu çeşitli inflamatuar ve otoimmün hastalıklarla yakından ilişkili olduğundan, IKK sinyal düzeyinde farmakolojik müdahale önemli ilgiçekmiştir 7,8,9.
Doğal ürünler, uzun süredir ilaç geliştirme için hayati kaynaklar olmuştur; bunlar arasında anti-inflamatuar tedavilerde bulunmaktadır 10. 1β-hidroksil-5α-kloro-8-epi-ksanthatin (XTT), Xanthium sibiricum 11,12'den izole edilmiş bir sesquiterpene laktonudur. Önceki araştırmalar, XTT'nin hücre çoğalmasını bastırdığını ve insan hepatosellüler karsinom hücrelerinde ROS aracılı ERK/p38 MAPK aktivasyonu ve glutatyon azalması nedeniyle oluşan JAK2/STAT3 inhibisyonu yoluyla apoptozu tetiklediğinigöstermiştir. Ancak, XTT'nin anti-inflamatuar potansiyeli ve ilişkili moleküler mekanizmaları hâlâ yeterince anlaşılmamaktadır.
Mevcut bulgular, XTT'nin in vitro önemli anti-inflamatuar etkiler gösterdiğini göstermektedir. Mekanik araştırmalar, XTT'nin IKKα/β ile etkileşime girdiğini ve NF-κB sinyalini baskıladığını, böylece aktive makrofajlarda inflamatuar yanıtları inhibe ettiğini göstermektedir. Bu bulgular, XTT'nin anti-enflamatuar ajanların geliştirilmesi için umut vadeden bir lider bileşik olabileceğini göstermektedir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Bu çalışma yalnızca yerleşik ticari hücre hatlarını içermekte olup, insan katılımcıları, klinik örnekler veya hayvan deneylerini içermemiştir. Bu nedenle, kurumsal etik onayı ve bilgilendirilmiş onay gerekmiyordu. Tüm deneyler kurumsal laboratuvar güvenlik yönergelerine uygun olarak gerçekleştirildi. Tehlikeli reaktifler, belirlenmiş duman kapaklarında ele alındı ve uygun kişisel koruyucu ekipmanlar (PPE) kullanıldı. Kimyasal ve biyolojik atıklar kurumsal düzenlemelere uygun olarak bertaraf edilmiştir. Protokolde kullanılan kimyasallar, kitler ve reaktifler Malzeme Tablosu'nda listelenmiştir.
1. Hücre kültürü
RAW264.7 fare makrofajları, HeLa insan servikal karsinom hücreleri ve HEK293T insan embriyonik böbrek hücresi Çin Bilimler Akademisi Hücre Bankası'ndan (Şanghay, Çin) satın alındı. Tüm hücreler, %10 fetal sığır serumu (FBS) ve %1 penisillin-streptomisin içeren Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM) içinde tutuldu. Kültür ortamı %5 CO₂ ve doymuş nem ile 37 °C olarak belirlendi.
2. Hücre yaşama testi
Hücre yaşamalılığı, Cell Counting Kit-8 (CCK-8) testi ile değerlendirildi. RAW264.7 hücreleri (2,5 × 10adet 4 hücre/kuyruk) 96 kuyu tabaklı plakalara yerleştirildi ve gece boyunca 37 °C'de kültürlendi. Hücreler daha sonra LPS ile veya LPS olmadan (0,5 μg/mL) 24 saat boyunca değişen konsantrasyonlarda XTT ile tedavi edildi. LPS konsantrasyonu ve tedavi süresi, ön deneylerde optimize edilmiş, önemli sitotoksisite yaratmadan orta derecede inflamatuar yanıtlar indükte edilmiştir. Daha sonra, her kuyuya 10 μL CCK-8 reaktifi eklendi ve plaka 2 saat boyunca 37 °C'de tutuldu. Soğukkans, mikroplaka okuyucu kullanılarak 540 nm olarak ölçüldü.
3. Hücre kültür ortamında NO ve PGE₂ seviyelerinin belirlenmesi
RAW264.7 hücreleri, 2.5 × 10.5 5 hücre/iyi yoğunlukta 24 kuyruklu plakalara yerleştirildi ve gece boyunca 37 °C'de kültürlendi. Hücreler, LPS stimülasyonundan önce 2 saat XTT ile veya TNF-α (15 ng/mL) ile 24 saat daha ön tedavi edildi. 2 saatlik tedavi öncesi dönem, inflamatuar sorun öncesi XTT ile hücresel hedefler arasında yeterli etkileşimi sağlamak için seçilmiştir. Kültür ortamındaki nitrik oksit (NO) ve prostaglandin E₂ (PGE₂) seviyeleri, üreticinin protokollerine uygun olarak nicelendirildi.
4. Nicel gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (qRT-PCR)
RAW264.7 hücreleri (2 × 106 hücre) gece boyunca 6 delikli plakalara yerleştirildi ve 2 saat boyunca çeşitli dozlarda XTT ile ön işlemden sonra 24 saat boyunca LPS meydan okuması (0,5 μg/mL) uygulandı. Toplam RNA, üreticinin talimatlarına göre TRIzol reaktifi kullanılarak izole edildi. RNA konsantrasyonu ve saflığı spektrofotometre kullanılarak değerlendirildi ve A260/A280 oranlarına >1.8 olan örnekler aşağı akış analizleri için kullanıldı.
Toplam RNA (2 μg), cDNA sentez kiti kullanılarak 20 μL nihai reaksiyon hacminde cDNA'ya ters transkribe edildi. Nicel gerçek zamanlı PCR, SYBR Green kimyası kullanılarak gerçek zamanlı PCR tespit sisteminde gerçekleştirildi. Giriş dizileri şu şekildeydi:
iNOS forward: 5′-GGA TCT TCC CAG GCA ACC A-3′
iNOS reverse: 5′-AAT CCA CAA CTC GCT CCA AGA TT-3′
COX2 ileri: 5′-CAA CAC CTG AGC GGT TAC-3′
COX2 tersi: 5′-GTT CCA GGA GGA TGG AGT-3′
IL-1β ileri: 5′-GCC TTG GGC CTC AAA GGA AAG AAT C-3′
IL-1β tersi: 5′-GGA AGA CAC AGA TTC CAT GGT GAA G-3′
IL-6 forward: 5′-TGG AGT CAC AGA AGG AGT GGC TAA G-3′
IL-6 tersi: 5′-TCT GAC CAC AGT GAG GAA TGT CCA C-3′
TNF-α ileri: 5′-CAC CAC GCT CTT CTG TCT-3′
TNF-α tersi: 5′-GGC TAC AGG CTT GTC ACT C-3′
GAPDH forvet: 5′-TGC ACC ACC AAC TGC TTA GC-3′
GAPDH tersi: 5′-GGC ATG GAC TGT GGT CAT GAG-3′
PCR amplifikasyon prosedürü şu şekilde gerçekleştirildi: ilk denatürasyon 95 °C'de 5 dakika sürdü, ardından 39 döngü boyunca 95 °C ile 15 saniye ve 60 °C ile 30 saniye yapıldı. Göreli gen ifade seviyeleri, GAPDH ile iç kontrol olarak kullanılan 2−ΔΔCt yöntemiyle hesaplandı.
5. Western blotting
Tedaviden sonra, RAW264.7 hücreleri proteaz ve fosfataz inhibitörleri içeren RIPA tamponu içinde homojenleştirildi. Bu inhibitörler, protein bozunmasını ve defosforilasyonu önlemek için kullanımdan hemen önce taze hazırlanmıştır. Toplam protein seviyeleri BCA test seti kullanılarak nicel edildi. Eşit miktarda protein, %10 sodyum dodekil sülfat-poliakrilamid jel elektroforezi ile ayrılarak nitroselüloz membranlarına aktarıldı. Transferden sonra, zarlar TBST'de Tween-20 (TBST) içeren %5 yağsız sütle inkübe edildi ve ardından 4 °C'de gece boyunca primer antikorlarla (1:1.000 seyreltme) prodak edildi. Sonra zarlar, oda sıcaklığında 1 saat boyunca yaban turpu peroksidaz ile konjuge ikincil antikorlarla (1:5.000 seyreltme) prodendendi. Protein bantları kemilyüminsans tespit sistemi kullanılarak tespit edildi ve bant yoğunlukları densitometrik niceleme ile analiz edildi.
6. İmmünoflüoresans testi
HeLa hücreleri 6 delikli plakalara tohumlanıp XTT (8 μM) ile 4 saat önce, TNF-α uyarısı (15 ng/mL) uygulanmadan önce 30 dakika boyunca işlem gördü. Bu 4 saatlik kuluçka öncesi dönem, NF-κB aktivasyonu öncesinde hedefe en üst düzeye çıkmak için seçildi. Hücreler %4 paraformaldehit ile 15 dakika sabitlendi ve oda sıcaklığında %0,25 Triton X-100 ile 15 dakika geçirimlileştirildi. %2 sığır serum albümini (BSA) ve %10 keçi serumu ile fosfatla tamponlu tuzlu (PBS) seyreltilmiş şekilde bloke edildikten sonra, hücreler anti-p65 birincil antikor (1:250 seyreltme) ile gece boyunca 4 °C'de inkübe edildi, ardından TRITC ile konjuge edilmiş ikincil antikor (1:1.000 seyreltme) ile oda sıcaklığında 1 saat boyunca sonlama yapıldı. Çekirdekler karanlıkta 5 dakika boyunca DAPI (0.5 μg/mL) ile karşı boyandı. Floresans görüntüleri floresans mikroskobu kullanılarak çekildi. HeLa hücreleri, büyük sitoplazma-çekirdek oranlarının p65 nükleer translokasyonunun görselleştirilmesini kolaylaştırdığı için seçilmiştir.
7. Sitoplazmik ve nükleer fraksiyonlaşma
HeLa hücreleri XTT ile 4 saat önceden inkubasyon edildi ve ardından 30 dakika boyunca TNF-α (15 ng/mL) ile uyarıldı. Hücreler toplandı, soğuk PBS ile durulandırıldı ve üreticinin talimatlarına göre ticari nükleer ve sitoplazmik protein ekstraksiyon kiti kullanılarak sitoplazmik ve nükleer protein ekstraksiyonu için işlendi. Tüm işlemler protein bütünlüğünü korumak için buz üzerinde gerçekleştirildi.
8. Hücresel termal kaydırma testi (CETSA)
CETSA daha önce belirtildiğigibi gerçekleştirildi 14. Yaklaşık 1 × 107 HeLa hücresi toplandı ve proteaz inhibitörleri içeren 500 μL soğuk PBS içinde yeniden süspansiyona getirildi, ardından sıvı azotta üç donma-çözülme döngüsüyle lizedildi. Hücre lizatları 20.000 × g sıcaklıkta 4 °C'de 15 dakika boyunca santrifüjlendi. Ortaya çıkan süpernatanlar eşit şekilde iki gruba ayrıldı ve oda sıcaklığında 1 saat boyunca XTT (100 μM) veya DMSO ile işlendi. XTT (100 μM), CETSA deneylerinde algılama hassasiyetini artırmak için kullanılmıştır. Örnekler daha sonra yedi tüpte alkotasyon edilip belirtilen sıcaklıklarda 3 dakika ısıtıldı, ardından oda sıcaklığında 3 dakika daha kuluçka yapıldı. Çözünür protein fraksiyonları immünoblotasyon analizi için toplandı.
9. Moleküler kenetlenme
Moleküler kenetlenme analizi daha önce açıklandığı gibiyapılmıştır 14. IKKβ'nun kristal yapıları (PDB ID'leri: 3BRT ve 4KIK) Protein Veri Bankası'ndan (PDB) alındı. Protein yapıları, su moleküllerini, orijinal ligandları ve safsızlıkları çıkarmak için PyMOL (sürüm 2.3.4) ile ön işlenmiş ve ardından hidrojen atomu eklenmiştir. Gasteiger ücretleri hesaplandı ve aktif cepler AutoDock Tools (sürüm 1.5.6) kullanılarak tanımlandı. Protein yapıları daha sonra PDBQT formatında depolanmıştır.
XTT yapısı Chem3D (sürüm 15.1) ile oluşturulmuş ve enerji minimizasyonu ile optimize edilmiştir. Yarı esnek kenetlenme AutoDock Vina (sürüm 1.1.2) kullanılarak gerçekleştirildi. Grid kutuları aktif cepleri tamamen kapsayacak şekilde inşa edildi, diğer tüm parametreler ise varsayılan ayarlarda kaldı. Analiz için en düşük bağlanma enerjisine ve en stabil konformasyona sahip kenetlenme pozları seçildi. −5 kcal/mol altındaki bağlanma enerjileri, yayımlanmış kriterlere göre güçlü bağlanma eğiliminin göstergesi olarak kabul edildi. PyMOL, bağlanma modlarını görselleştirmek ve hidrojen bağlarını, hidrofobik etkileşimleri, van der Waals etkileşimlerini ve potansiyel bağlanma noktalarını değerlendirmek için de kullanıldı.
10. İstatistiksel analiz
Tüm istatistiksel analizler GraphPad Prism 5.0 yazılımı kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Veriler, üç bağımsız deneyden elde edilen ortalama ± standart hata (SEM) olarak sunulur. İstatistiksel anlamlılık, tek yönlü varyans analizi (ANOVA) kullanılarak değerlendirildi ve ardından Dunnett'in sonradan yaptığı test yapıldı. p < 0.05 değeri istatistiksel olarak anlamlı olarak kabul edildi.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
XTT, LPS VEYA TNF-α uyarılan RAW264.7 makrofajlarında NO ve PGE₂ üretimini inhibe etti
XTT'nin anti-inflamatuar etkilerinin sitotoksisiteden bağımsız olup olmadığını belirlemek için, LPS varlığı veya yokluğunda XTT tedavisi sonrası RAW264.7 hücre canlılığı değerlendirildi. 0,5 ila 8 μM arasındaki konsantrasyonlarda hücre canlılığında kayda değer bir azalma tespit edilmedi; bu da bileşiğin deneysel koşullarda iyi tolere edildiğini gösterir (Şekil 1...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sesquiterpene laktonlar, antiseptik, anti-inflamatuar, ateş önleyici ve detoksifikasyon etkileri dahil olmak üzere çeşitli farmakolojik etkilere sahip doğal ürünlersınıfıdır 15. Önceki çalışmalar, Xanthium sibiricum'dan izole edilen ksantanolid tipi sesquiterpene laktonu olan XTT'nin insan hepatosellüler karsinom hücrelerinde güçlü antiproliferatif ve pro-apoptotik etkiler gösterdiğinigöstermiştir 13. Bu çalışma, LPS ile uyarlanan ...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yazarlar rekabet eden çıkarlar belirtmemektedir.
Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (No. 82004031), Sichuan Eyalet Geleneksel Çin Tıbbı Araştırma Projesi (No. 2024MS566) ve Çin Ulusal Ana Araştırma ve Geliştirme Programı (No. 2023YFC3504402) tarafından desteklendi.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Enhanced chemiluminescence reagent D20A2:D21A2:D22A2:D23A2: D24A2:D25A2:D26A2:D27A2:D28A2: D29A2:D30A2:D29 | Beyotime Biotechnology Co., Ltd | P90720 | luminescent signal detection |
| Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated secondary antibodies | Signalway Antibody (Nanjing) | L30118 | specifically binds to the primary antibody |
| p65 primary antibody | Bioworld | BS4139 | specifically recognizes NF-κB p65 subunit protein |
| Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | NanoDrop 2000 | SCR_018042 |
| 0.45 μM Ployvinylidence fluoride membrane | Millipore | PR05509 | adsorb protein molecules |
| 1β-hydroxyl-5α-chloro-8-epi-xanthatin | Chengdu Institute of Biology | natural monomeric compounds | |
| All-in-One cDNA Synthesis SuperMix | Bimake (Shanghai) | B24408 | reverse-transcribe |
| BAY11-7082 | Beyotime Biotechnology Co., Ltd | SF0011 | IκB/IKK inhibitor |
| Bcl2 antibody | Signalway Antibody (Nanjing) | 32012 | AB_3751037 |
| Bicinchoninic Acid (BCA) kit | Beyotime Biotechnology Co., Ltd | P0010S | total protein quantification |
| CCK-8 agent | Beyotime Biotechnology Co., Ltd | C0038 | cell viability measurement |
| Chemiluminescence detection system | Millipore, Bedford, USA | P90720 | acquire and process luminesence signals |
| COX-2 antibody | Signalway Antibody (Nanjing) | 33345 | AB_3676692 |
| DMSO | Sangon Biotech(Shanghai)Co.,Ltd. | A100231-0500 | solubilize compounds |
| GAPDH antibody | Signalway Antibody (Nanjing) | 41549 | AB_3751036 |
| Gel Imaging Instrument | E-BLOT | Touch Imager Pro | image acquisition and analysis |
| Gradient PCR instrument | Biometra TADVANCED | Biometra Tadvanced 96SG | gradient annealing temperature |
| Griess agent | Beyotime Biotechnology Co., Ltd | S0021S | NO quantification |
| Human cervical carcinoma HeLa cells | The Cell Bank of Chinese Academy of Sciences | SCSP-504 | Human-derived cells |
| Human TNF-α | Novus Biologicals | 210-TA | pro-inflammatory cytokines |
| iNOS antibody | Signalway Antibody (Nanjing) | 48309 | AB_2943634 |
| Laser Confocal Inverted Microscope | Olympus | FV1000 | SCR_016840 |
| LPS ( E.coli 055:B5) | Sigma-Aldrich (Shanghai) Trading Co., Ltd | L6529 | establish inflammatory models |
| Murine macrophage RAW264.7 cells | The Cell Bank of Chinese Academy of Sciences | SCSP-5036 | Mouse-derived cells |
| Nuclear and Cytoplasmic Protein Extraction Kit | Beyotime Biotechnology Co., Ltd | P0027 | separate cytoplasmic and nuclear proteins |
| PD98059 | Selleck Chemicals (Shanghai) | S1177 | MEK inhibitor |
| P-ERK (Thr202/Thr185) antibody | Signalway Antibody (Nanjing) | 12548 | detect the phosphorylation level of ERK protein |
| p-IKKα/β (Ser176/Ser177) antibody | Signalway Antibody (Nanjing) | 11931 | AB_3751034 |
| p-IκBα (phospho-Ser32)antibody | Signalway Antibody (Nanjing) | 13776 | AB_3751033 |
| p-JNK (T183/T221) antibody | Signalway Antibody (Nanjing) | 13371 | AB_3718662 |
| p-p38 MAPK (Thr180) antibody | Signalway Antibody (Nanjing) | 11581 | AB_3751032 |
| Prostaglandin E2 Parameter Assay Kit | R&D Systems | KGE004B | AB_2894942 |
| PS1145 | Selleck Chemicals (Shanghai) | S7691 | specific IKK inhibitor |
| Rapid SDS-PAGE Gel Preparation Kit | Beyotime Biotechnology Co., Ltd | P0018S | protein separation |
| Real-Time PCR System | Bio-Rad | CFX96 | SCR_018064 |
| RIPA buffer | Bimake (Shanghai) | P0013C | cell lysis |
| SB203580 | Selleck Chemicals (Shanghai) | S1076 | p38 MAPK inhibitor |
| SP600125 | Selleck Chemicals (Shanghai) | S1460 | JNK inhibitor |
| SYBR Green | Bimake (Shanghai) | B21202 | For real-time quantitative |
| TRITC-conjugated goat anti-mouse IgG | Beyotime Biotechnology Co., Ltd | A0568 | AB_2893016 |
| TRITC-conjugated second antibody | Beijing Baiao Leibo Technology Co., Ltd. | ZN1992 | AB_3751143 |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596026 | total RNA isolation |
| Vinculin antibody | Signalway Antibody (Nanjing) | 41534 | AB_3751035 |