Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

İnsan Meme Kanseri Organoidlerinin İnşası ve Doksorubisin Kaynaklı DNA Hasarının Kuyruklu Yıldız Testi Temelli Nicelendirilmesi

105 görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/71299

⸱

28 Temmuz 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1College of Life Science, North China University of Science and Technology, 2Jiangsu Province Engineering Research Center of Development and Translation of Key Technologies for Chronic Disease Prevention and Control, Suzhou Vocational Health College, 3School of Chemistry and Life Sciences, Suzhou University of Science and Technology, 4Thyroid and Breast Surgery, Wuzhong People's Hospital of Suzhou City, 5Department of Radiation Oncology, The Affiliated Hospital of Soochow University

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Bu protokol, insan meme kanseri organoidleri (BCO) modelini oluşturur ve kuyruklu yıldız testi kullanarak doksorubisin kaynaklı DNA hasarını nicel olarak değerlendirir. Kuyruklu yıldız testinin BCO'lara uygulanmasının mümkünlüğü gösterilmiş ve BCO'larda DOX kaynaklı DNA hasarını tespit etmek için tekrarlanabilir, ölçeklenebilir ve operasyonel bir iş akışı sağlanmıştır.

Özet

Meme kanseri, dünya genelinde kadınlar arasında en yaygın kanserdir ve önemli bir heterojenlik gösterir. Doxorubisin (DOX), meme kanseri tedavisinde yaygın olarak kullanılır ve birincil etki mekanizması, DNA çift zincir kırılmasını tetiklemek ve hücre ölümünü tetiklemektir. Bu protokolde, DOX kaynaklı DNA hasarını nicel olarak değerlendirmek için bir insan BCO modeli oluşturuldu. Birincil meme kanseri hücreleri, hastadan türetilen tümör dokularından mekanik ve enzimatik ayrıştırma yoluyla izole edildi ve ardından üç boyutlu bir matrikste kültürlenerek BCO'lar oluşturuldu. Organoidler daha sonra 2 saat boyunca 8 μM DOX ile tedavi edildi. 2 saat tedavinin ardından DNA hasarı değerlendirildi. Tedaviden sonra, organoidler tek hücrelere ayrılmış, düşük erime noktasına sahip agaroza gömülü ve alkali koşullarda elektrofore edilmiştir. Elektroforezden sonra, DNA göç desenleri floresan mikroskopisi altında kuyruklu yıldız yapıları olarak görselleştirilmiş ve OpenComet yazılımı kullanılarak kuyruk DNA'sının yüzdesi (% Kuyruk DNA) belirlenmek için nicel olarak analiz edilmiştir. Kuyruklu yıldız testi, BCO'larda DNA hasarını başarıyla tespit etti. Kontrol grubuna kıyasla, 2 saat boyunca 8 μM DOX'a maruz kalan BCO'lar, organoid dissosiyasyon ve elektroforez sonrası uzun kuyruklu yıldız kuyrukları göstermiştir. Kantitatif analiz, tedavi edilen grupta kuyruk DNA'sının yüzdesinin anlamlı şekilde daha yüksek olduğunu ve bunun DNA hasarının indüklenmesini gösterdiğini ortaya koydu. Bu son derece hassas yöntem, DOX'un toksikolojik ve farmakodinamik çalışmalarını destekler ve hasta kaynaklı BCO sistemlerinde DNA hasarını değerlendirmek için sağlam bir teknik platform sağlar.

Giriş

Meme kanseri, genetik değişiklikler, hormonal düzensizlik ve diğer patojenik faktörler nedeniyle meme epitel dokularından kaynaklanan kötü huylu bir tümördür. Dünya genelinde kadınlar arasında en yaygın malignitedir ve benzersiz epidemiyolojik kalıplar ile önemli intratümör heterojenlikgösterir 1,2. DOX, birinci sıradan kemoterapötik bir ajan, DNA'ya interklat, topoizomeraz II aktivitesini inhibe eder ve DNA zinciri kopmalarını indükleyerek nihayetinde tümör hücrelerinde apoptozutetikler 3. Geleneksel iki boyutlu hücre kültür sistemleri, meme tümörlerinin karmaşık hücresel organizasyonunu ve heterojenliğini yeniden yansıtma yetenekleri açısından sınırlıdır. Buna karşılık, BCO'lar, hasta tümör dokularından türetilen ve orijinal tümörün temel özelliklerini koruyan, hücresel bileşim, doku mimarisi ve moleküler fenotipler gibi üç boyutlu yapılardır. Özellikle, BCO modelleri klinik ilaç yanıtlarıyla yüksek uyum gösterir; belirli bir tedavi ajanı için negatif yanıt uyumu %100'e ulaşırken, BCO'lar ile ilgili hasta arasında pozitif yanıt uyumu %98'eulaşır.

BCO'lar, primer tümörlerin temel yapısal ve fonksiyonel özelliklerini özetleyen gelişmiş bir in vitro model olarak hizmet verir ve tümöroluşum, hastalık ilerlemesi ve terapötik direnci araştırmak için yaygın olarakuygulanmıştır 5. Meme kanserinde tümör başlatma genellikle TP53, PTEN, RB1 ve NF1 gibi birden fazla tümör baskılayıcı genin işbirlikçi inaktivasyonuna dayanır; çünkü tek gen değişiklikleri normal meme epitelinin kötü niyetli dönüşümünü tetiklemek için yeterli değildir. Bu süreç, hücre polaritesinin kaybı, mimari düzensizlik ve kontrolsüz yayılma ile birlikte gelir 6,7,8.

Kuyruklu yıldız testi (aynı zamanda tek hücreli jel elektroforezi, SCGE olarak da adlandırılır), tek hücre düzeyinde DNA hasarını değerlendirmek için klasik bir yöntemdir. Bu teknik, ilk olarak 1978'de Rydberg ve Johanson tarafından tanıtıldı ve ardından DNA çift zincirli kırmalarını tespit etmek için nötr kuyruklu yıldız testini kuran Ostling ve Johanson tarafından geliştirildi. 1988'de Singh ve meslektaşları, alkalin elektroforez koşullarını dahil ederek DNA tek zincirli kırıkların, baziz sitelerin ve alkali-labile lezyonların tespit edilmesini mümkün kılarak testin uygulanabilirliğini önemli ölçüdegenişletti9. Kuyruklu yıldız testinin temel ilkesi, DNA elektroforetik hareketliliğinin DNA bütünlüğüne bağlı olduğudur. Agaroz gömülmesi ve hücre zarları ile proteinlerin ayrılması için lizizden sonra, hasar görmüş DNA parçaları elektroforez sırasında anoda doğru hareket ederek "kuyruklu yıldız kuyruğu" oluşturur; sağlam DNA ise yükleme noktasına yakın kalarak "kuyruklu yıldız başı"nı oluşturur10. Kuyruk uzunluğu, kuyruk DNA'sının yüzdesi (% kuyruk DNA'sı) ve Zeytin kuyruk momenti gibi parametreler, DNA hasarının yarı nicel veya nicel değerlendirmesine olanak tanır ve zaman süresi deneysel tasarımları DNA onarım kapasitesini değerlendirmek için kullanılabilir. Yüksek hassasiyeti, düşük örnek girintisi gereksinimi ve göreceli prosedürel basitliği nedeniyle, kuyruklu yıldız testi genetik toksikoloji, kanser biyolojisi ve ilaç yanıt çalışmalarında, özellikle kemoterapi ve radyoterapi ile tümör hücre direnç mekanizmalarının DNA hasarını değerlendirmek için yaygın olarak kullanılmıştır. Test, deneysel koşullara ve prosedürel değişkenliğe karşı son derece hassastır ve tekrarlanabilirlik ile laboratuvarlar arası karşılaştırılabilirlik standartlaştırılmış iş akışlarına ve otomatik görüntü analizine bağlıdır11. Son yıllarda, yüksek verimli görüntüleme yazılımları, organoid modeller ve gen düzenleme sistemlerinin dahil edilmesi, kuyruklu yıldız testinin DNA hasarı ve onarım mekanizmalarını araştırmada ve tümör tedavi yanıtlarının değerlendirilmesinde faydasını daha da artırmıştır.

γ-H2AX immünoflüoresans boyama veya akış sitometrisi gibi geleneksel DNA hasar testleriyle karşılaştırıldığında, kuyruklu yıldız testi tek hücre düzeyinde fiziksel DNA zinciri kırıklarını doğrudan niceltmek için bir yöntem sunar. Bu yöntem, spesifik protein ifadesinden veya antikor özgüllüğünden bağımsız çalıştığı için, hücre döngüsü durumlarındaki değişikliklerden veya DNA hasar yanıtyollarındaki anormalliklerden kaynaklanan yanlış negatif sonuçları etkili bir şekilde ortadan kaldırır 12. Ayrıca, geleneksel iki boyutlu tek katmanlı kültürlerin aksine, bu çalışmada kullanılan üç boyutlu organoid model, in vivo tümörlerin karmaşık mekansal mimarisini, hücre dışı matris etkileşimlerini ve ilaç geçirimli gradyanlarını daha sadık bir şekilde özetlemektedir. Geleneksel hücre hattı modelleri yapay ilaç aşırı maruziyeti nedeniyle genotoksisiteyi sıkça fazla tahmin etse de, organoid platform, klinik fizyolojik koşulları yakından yansıtan bir mikro ortamda DOX kaynaklı DNA hasarını değerlendirerek bu tarama paradigmasının güvenilirliğini ve translasyoneldeğerini önemli ölçüde artırır 13.

Bu çalışmada DNA hasarını değerlendirmek için organoid-entegre kuyruklu yıldız testinin önemli avantajlarına rağmen, pratik uygulaması örnek girişiyle ilgili birkaç teknik sınırlama ve uygulama parametrelerinin dikkatlice değerlendirilmesini gerektirir. Protokol, organoidlerin kapsamlı ama nazik enzimatik ayrıştırmasını gerektirir ve böylece son derece uygulanabilir tek hücreli süspansiyon elde edilir. Temel zar matriksinin 100 μL'si başına 15.000–20.000 birincil meme kanseri hücresi (~200 hücre/1 μL) tohumlama yoğunluğu, sağlam küre oluşumu için gerekli hücreler arası parakrin sinyalini desteklerken, hiper-yoğunluk ve hızlı besin tükenmesiyle oluşan merkezi nekrozu önler. Terapötik pencere açısından, bu test aşırı hücre ölümünü önlemek için DOX konsantrasyonu ve maruziyet süresinin dikkatli kalibrasyonunu gerektirir (>%220–30). Ölümcül aşırı ilaç maruziyeti, gerçek DNA hasar sinyallerini ve veri yorumunu karıştıran bolca "kirpi" kuyruklu yıldızı üretir. Test sınırlamaları açısından, standart alkali kuyruklu yıldız testinin doğası gereği düşük verimliliği, yüksek verimli ilaç taraması için yetersiz hale getirir. Ayrıca, bu teknik, jel yapışma stabilitesi, alkali çözülme süresi ve elektroforetik düzen gibi deneysel prosedürlerin titiz standartlaştırılmasını gerektirir; çünkü küçük operasyonel sapmalar bile önemli sistemik hatalara yol açabilir.

Sonuç olarak, bu protokol insan BCO'larını belirler ve DOX kaynaklı DNA hasarını niceliklendirmek için kuyruklu yıldız testinin uygulanabilirliğini gösterir. Tam yerleşik BCO'ların 8 μM DOX tedavisinden sonra, DNA hasarı kuyruklu yıldız testi kullanılarak değerlendirildi. Bu yaklaşım, DOX kaynaklı DNA hasarının kararlı ve doğrudan değerlendirilmesini sağlar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Çalışma, Suzhou Wuzhong Halk Hastanesi Etik Komitesi tarafından onaylanmış (Onay No. 20251w03) ve tıbbi etik standartlara uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Bu araştırmadaki tüm denekler yazılı bilgilendirilmiş onay vermiştir.

1. İnsan BCO'larının İnşası

  1. Meme kanseri dokusunun taşınması ve depolanması
    1. Taze rezek edilmiş insan meme kanseri dokusunu hemen önceden soğutulmuş doku koruma çözeltisine (4 °C) yerleştirin.
      NOT: Taşınma sırasında dokunun tamamen suda kaldığından emin olun.
  2. Meme kanseri dokusunun mekanik ayrışması
    1. Tüm işlemleri bir biyogüvenlik dolabında gerçekleştirin. Meme kanseri dokusunu 6 cm boyutunda bir kültür kabına yerleştirin ve steril skalpel ve pens kullanarak görünür yağ dokusunu çıkarın.
    2. 6 cm kültür kabına 3 mL PBS ekleyin ve dokuyu üç kez yıkayın.
    3. Fosfatla tamponlanmış tuzlu su (PBS) aspirasyonu ve atılması sağlanır.
    4. 1.2.2 ve 1.2.3 adımlarını iki kez daha tekrarlayın.
    5. Meme kanseri dokusunu steril cerrahi makas kullanarak 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve dokuyu yaklaşık 2 x 5 mm boyutunda küçük parçalara ayırın.
  3. Meme kanseri dokusunun enzimatik sindirimi
    1. 1.5 mL mikrosantrifüj tüpüne 1 mL organoid dissosiyasyon çözeltisi ekleyin ve süspansiyonu 15 mL'lik santrifüj tüpüne aktarın.
    2. 15 mL'lik santrifüj tüpüne ek 8 mL organoid dissosiyasyon çözeltisi ekleyin.
    3. 15 mL santrifüj tüpünü 37 °C'de 40 dakika boyunca kuluçka edin.
    4. Sindirim sırasında tüpü her 10 dakikada bir shaker üzerinde 1 dakika boyunca çaltın.
    5. 40 dakika sonra, sindirimi sonlandırmak için 15 mL santrifüj tüpüne 6 mL PBS ekleyin.
      NOT: PBS'yi doğrudan sindirim karışımına ekleyin, böylece enzimatik aktiviteyi durdurun.
  4. Birincil meme tümörü hücrelerinin izolasyonu ve organoid gömülmesi
    1. 100 μm hücre süzgecini 50 mL'lik santrifüj tüpünün üzerine yerleştirin.
    2. Hücre süzgecisine 1 mL tam hücre kültürü ortamı ekleyin.
      NOT: 500 mL bazal ortam, 50 mL fetal sığır serumu ve 5 mL penisillin-streptomisin kullanarak tam hücre kültürü ortamı hazırlayın.
    3. 15 mL'lik santrifüj tüpünden sindirilmiş doku süspansiyonundan 1 mL aspirasyon alın ve hücre süzgecisine uygulanın.
    4. 1.4.3 adımını tekrarlayın, tüm süspansiyon süspansiyondan geçene kadar.
    5. Hücre süzgecini ek olarak 1 mL tam hücre kültürü ortamı ile durulayın.
    6. 50 mL'lik santrifüj tüpünü 350 × g'de 4 °C'de 3 dakika boyunca santrifüjleyin.
    7. Süpernatantı aspire edin ve atın.
    8. Hücre peletini 1 mL tam hücre kültür ortamında yeniden süspansiyona alın ve 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
    9. Süspansiyonu 370 × g'de 5 dakika boyunca 4 °C'de santrifüjle yapın.
    10. Süpernatantı aspire edin ve atın.
    11. 1.5 mL mikrosantrifüj tüpüne bazaz membran matrisinden 100 μL ekleyin ve iyice karıştırın.
      NOT: Temel zar matriksinin 100 μL'si başına 15.000–20.000 primer meme kanseri hücresi (200 hücre/1 μL) tohumlama yoğunluğunu koruyun. Bu, hücreler arası parakrin sinyal ilemini sağlam küre oluşumu için destekler ve merkezi nekrozu önler.
    12. 24 kuyruklu bir plakanın her kuyusuna bazal membran matris-hücre karışımından 25 μL dağıtın.
    13. 24 kuyu plakasını ters çevirin ve 37 °C'de 10 dakika kuluçka yapın, böylece bazal membran matris polimerizasyonu sağlansın.
    14. 24 kuyu tabakasının her kuyusuna 500 μL BCO kültür ortamı ekleyin.
      NOT: Ticari kullanıma hazır bir ortam ve özel formülasyonlu kültür BCO'ları.
    15. Plakayı nemli bir kuluçka makinesinde, %5 CO₂ ile 37°C'de kuluçka yapın.
      NOT: Ekstraselüler matrikste tohumlandıktan sonra, BCO'lar doğru 3D yapısal gelişim için 7–10 gün kültürlendi. Organoidler, yoğun, küresel 3D morfolojiler sergilediklerinde ve ortalama çapları yaklaşık 50–100 μm olduğunda, merkezi nekroz belirtisi olmadan tamamen yerleşik ve ilaç tedavisine hazır olarak kabul ediliyordu. Bu son nokta kriterleri karşılandıktan sonra, BCO'lar DOX ile tedavi edildi.

2. BCO'larda DOX kaynaklı DNA hasarının kuyruklu yıldız testi kullanılarak tespiti

Deneysel protokol, belirlenmiş yönergelerden uyarlanmış ve belirli laboratuvar koşullarına uygun hale getirilerek daha da optimizeedilmiştir 14.

DIKKAT: Kuru toz tartımı, stok çözeltisi hazırlama ve çalışma çözeltilerinin seri seyreltilmesi dahil olmak üzere tüm DOX işlem prosedürlerini yalnızca sertifikalı Sınıf II biyolojik güvenlik kabini veya kimyasal duman davlumbazı içinde uygulayın. Açık laboratuvar tezgahlarında herhangi bir manipülasyondan kesinlikle kaçının. Çift katmanlı nitril eldivenler giyin ve ilacı tüm işlemler boyunca ışıktan koruyun. Son olarak, DOX ile kirlenmiş tüm tüketim malzemelerini (örneğin, pipet uçları ve mikrosantrifüj tüpleri) özel bertaraf için sıkı bir şekilde 'sitotoksik atık' olarak ayırmak; Bu ürünleri rutin biyolojik tehlike atıklarıyla asla karıştırmayın.

  1. BCO'ların DOX tedavisi
    1. Tüketilmiş kültür ortamını aspire edin ve atın.
    2. Her kuyuya 500 μL taze BCOs kültür ortamı ekleyin
    3. Her kuyidan 4 μL ortamı çıkarıp atın
    4. Her kuyuya 4 μL 1 mM DOX stok çözeltisi ekleyin.
      NOT: Nihai çalışma konsantrasyonu 8 μM'yi belirlemek için, standart seyreltme denklemi kullanılarak gerekli stok hacmini belirleyin: C1V1 = C2V2. Burada C1 , başlangıç DOX stok konsantrasyonunu (1 mM), C2 hedef konsantrasyonu (8 μM) ve V2 ise nihai kuyu hacmini (500 μL) temsil eder. V1 için çözüldüğünde 4 μL elde edilir. Sonuç olarak, protokol, her kuyu başına kalan 496 μL kültür ortamına 1 mM DOX stokundan 4 μL eklenmesini ve ardından homojen dağılımın sağlanması için iyice karıştırılmasını gerektirir.
    5. Plakayı %5 CO₂ ile 37°C bir kuluçka makinesinde 2 saat kuluçka yapın.
  2. BCO'ların ayrışması
    1. 24 kuyuklu plakadan BCO kültür ortamını aspire edip at.
    2. Her kuyuya 500 μL organoid dissosiyasyon çözeltisi ekleyin.
    3. Bazaz zar matrisi ve organoid yapılarını tamamen bozmak için tekrar tekrar yukarı aşağı pipet yapın.
    4. Plakayı %5 CO₂ ile 37 °C'de 10 dakika kuluçka edin.
    5. Her kuyidan elde edilen süspansiyonun 500 μL'sini 15 mL'lik santrifüj tüpüne aktarın.
    6. Süspansiyonu 350 × g'de 4 °C'de 3 dakika boyunca santrifüj yapın.
    7. Süpernatantı aspire edin ve atın.
    8. 15 mL santrifüj tüpüne 1 mL tam kültür ortamı eklenerek hücre peletini yeniden süspansiyona yerleştirin ve ardından ortaya çıkan süspansiyon 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarılır.
    9. Süspansiyonu 350 × g'de 4 °C'de 3 dakika boyunca santrifüj yapın.
    10. Süpernatantı aspire edin ve atın.
      NOT: Santrifüjlemeden sonra, organoid pellet santrifüj tüpünde kalır.
  3. Hücre yeniden süspansiyonu ve agaroz gömülümesi
    1. Metal ısıtma bloğunu 95 °C'ye kadar önceden ısıtın.
    2. 1 mL düşük erime noktasına sahip (LMP) agarozu metal ısıtma bloğuna yerleştirin ve tam erimeyi sağlamak için 10 dakika kuluçka yapın.
    3. 100 μL erimiş %0,5 düşük erime noktasına sahip agarozu 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne (BCO) içeren pipetle.
    4. Örnekleri hemen 37 °C su banyosuna aktarın ve 10 dakika boyunca dengelenmelerine izin verin.
    5. 50 μL hücre–agaroz süspansiyonunu iyice karıştırın ve hemen mikroskop slaytına pipetleyin.
  4. Hücre lizisi ve DNA çözülmesi
    1. Slaytları soğuk lizis çözeltisine batırın ve 4 °C'de karanlıkta 12 saat kuluçka yapın.
    2. Slaytları liz çözeltisinden çıkarın ve hemen alkalin çözme çözeltisine daldırın.
      NOT: Alkalin sarma çözeltisini hazırlamak için, 0.6 g NaOH'u 4.975 mL ultrasaf suda çöz, ardından 250 μL 200 mM EDTA ekleyin. Alkalin elektroforez tamponunu hazırlamak için, 12 g NaOH'u 995 mL ultra saf suda çözün, ardından 5 mL 200 mM EDTA ekleyin.
      DIKKAT: Kuyruklu yıldız testi tamponu içindeki NaOH, şiddetli deri ve göz yanıklarına yol açabilecek son derece korozif ve güçlü bir bazdır. Çözelti hazırlığı sırasında, katı NaOH peletlerini suya yavaş, kademeli ve sürekli manyetik karıştırma altında ekleyin. Suyu asla doğrudan kuru pelletlerin üzerine dökmeyin, çünkü şiddetli ekzotermik reaksiyon kostik sıvının kaynamasına ve sıçramasına neden olabilir. Ayrıca, tüm kuru toz tartımı yalnızca kimyasal bir duman davlumbağı içinde uygulayarak aşındırıcı tozun solunmasını önleyin.
    3. Slaytları liz çözeltisine batırın ve 4 °C'de karanlıkta 1 saat kuluçka yapın.
  5. Elektroforez
    1. Alkalin çözme çözeltisinden slaytları elektroforez odasına aktarın.
    2. Elektroforez tankına 1 L alkalin elektroforez tamponu eklenerek slaytların tamamen batmasını sağlar.
    3. 25 V ve 300 mA'da 30 dakika elektroforez yapın.
  6. Sürgü yıkama ve fiksasyon
    1. Slaytları %70 etanol içeren 5 mL içine batırın ve oda sıcaklığında 5 dakika kuluçka yapın.
      NOT: Etanol ciddi bir yanma riski taşır. Büyük hacimli preparatlar veya doku dehidrasyonu yapılırken, deneysel ortamda sağlam havalandırma sağlanır. Açık alevler (örneğin alkol yakıcıları) ve elektrostatik kıvılcımlar dahil olmak üzere tüm ateşleme kaynaklarından operasyon alanını sıkı bir şekilde izole edin. Kullanımdan sonra, reaktif kaplarını hemen mühürleyin ve onları özel patlamaya dayanıklı yanıcı bir saklama dolabına sabitleyin.
    2. Slaytları 37 °C inkubatöre yerleştirin ve 15 dakika kurumasına izin verin.
  7. DNA boyama ve görüntüleme
    1. 10 mL ultrasaf suya 1 μL nüklein asit floresan leke ekleyin.
      DIKKAT: Bu nükleik asit interkalasyon ajanlarını potansiyel mutajen olarak ele alın ve sıkı önlemlerle ele alın. Rutin çalışma alanlarında çapraz kontaminasyonu önlemek için, özel pipetlerle donatılmış özel bir 'nükleik asit boyama bölgesi' oluşturun. Erimiş agarozu boyalarla takviye ediyorsanız, jelin eklenmeden önce yaklaşık 60 °C'ye kadar soğumasına izin verin; böylece tehlikeli, boya dolu buharların solulmasını önleyin. Son olarak, tüm harcanmış boyama çözeltilerini ve atık jelleri kesinlikle belirlenmiş nukleik asit tehlikeli yuvalarına atabilirsiniz.
    2. Slaytları 2.7.1. Adımda hazırlanan boyama çözeltisine batırın ve oda sıcaklığında karanlıkta 30 dakika kuluçka yapın.
    3. 5 mL ultra saf suyla tek bir 5 dakikalık yıkama yapın.
    4. Slaytları 37 °C inkubatörde 15 dakika boyunca hava kurutmasında yapın.
    5. Yeşil uyarılma filtresiyle floresan mikroskobu kullanarak kuyruklu yıldız yapılarını görselleştirin ve kırmızı floresansı tespit edin.

3. Veri işleme

  1. Fiji'deki (resmi dağıtım) OpenComet eklentisini kullanarak kuyruklu yıldız testi görüntülerinin otomatik nicel analizini gerçekleştirerek DNA hasarıyla ilgili parametreler elde edin.
    NOT: İstatistiksel analiz açısından, bu çalışma yalnızca yüksek çözünürlüklü, net imimselli kuyruklu yıldızları içeriyordu; morfolojisi sağlam ve örtüşme yoktu. Buna karşılık, tarama protokolü 'kirpi' veya 'hayalet' kuyruklu yıldızları (küçültülmüş baş ve geniş kuyruk gösteren, şiddetli apoptoz veya nekroz gösteren) ile bulanık kenarları, hücre kümelenmesi veya arka plan artefaktları olan görüntüleri hariç tutuyordu.
    1. Fiji yazılımını açın (Ek Şekil 1A).
    2. Menü çubuğundaki Eklentiler sayfasına tıklayın (Ek Şekil 1A).
    3. OpenComet'i seçin (Ek Şekil 1B).
    4. Input files altında Browse (Bak) seçeneğine tıklayın ve analiz için kuyruklu yıldız testi görüntülerini seçin (Ek Şekil 1C).
    5. Çıktı dizininden Gözat'a tıklayın ve çıktı dosyaları için hedef klasörü tanımlayın (Ek Şekil 1C).
    6. Otomatik analizi başlatmak için Çalıştır tuşuna tıklayın (Ek Şekil 1C). Bu adım, veri işleme ve analiz iş akışını sonlandırır.
      NOT: Her deneysel grup için, bu çalışma en az 50 hücreden oluşan rastgele bir seçimden kuyruk DNA'sının (%Kuyruk DNA) yüzdesini nicelemiştir. Sonraki istatistiksel analizde, grup ortalamalarını karşılaştırmak için tek yönlü varyans analizi (ANOVA) kullanıldı ve p < 0.05 istatistiksel olarak anlamlı olarak kabul edildi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

BCO'ların Kurulması

Bu çalışma, primer tümör dokusu örneklerinden meme kanseri organoidlerini başarıyla ortaya koymuştur. Kültürün başlangıç aşamasında, hücrelerin nispeten dağınık bir şekilde dağıtılmış ve belirgin üç boyutlu küresel organizasyonu olmadığı çok sayıda tek hücre veya küçük hücre kümesi açıkça gözlemlenmiştir. Bazı hücreler yuvarlak veya neredeyse yuvarlak morfolojiler sergilemiştir; bu da tümör kaynaklı hücrelerin ekstrasellüle...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Kuyruklu yıldız testi, genotoksisite değerlendirme yöntemlerinde önemli bir ilerlemeyi temsil eder. Tek hücre çözünürlüğü ve elektroforetik göçe dayalı DNA hasar desenlerinin doğrudan görselleştirilmesi sayesinde, bu teknik, geleneksel genotoksisite testlerine kıyasla açık avantajlar sunar15.

Deneysel süreç sırasında birkaç kritik adım, tekrarlanabilirliği ve veri yorumunu etkiler. Birincisi, lizin koşulları ve liz süresi tutarlı kalmal...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların beyan edecek çıkar çatışmaları yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışma, Jiangsu Eyaleti Mühendislik Araştırma Merkezi Moleküler Hedef Tedavi ve Onkolojide Eşlik Tanı Projesi (SGK2202319), Jiangsu yükseköğretim kurumu bilim ve teknoloji için yenilikçi araştırma ekibi (2021), Jiangsu meslek fakültesi mühendislik teknolojisi araştırma merkezi programı (2023), Çin Jiangsu Yükseköğretim Kurumları'nın Doğa Bilimleri Temel Vakfı (Hibe No. 24KJA310008) tarafından desteklenmiştir. Suzhou Mesleki Sağlık Koleji'nin Ana Programları (szwzy202406), Soochow Üniversitesi Radyasyon Tıbbı ve Koruma Devlet Ana Laboratuvarı Projesi (No. GZK1202506), Dongwu Sağlık Yetenek Programı (DWWS2024002, DWWS2025009, DWWS2025013).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
100 μm cell strainerBIOLOGIX15-1100
15 mL centrifuge tubesBIOFILNone15 mL centrifuge tubes
1 mL pipette tipsZhejiang Baidi Biotechnology Co., LTDH808633
200 μL pipette tipsZhejiang Baidi Biotechnology Co., LTDH808214
24-well platesCorning Incorporated3524
50 mL centrifuge tubesBIOFILNone50 mL centrifuge tubes
Breast Cancer Organoid Kit PlusMogenel Biotechnology MA-0807T011LPBCO culture medium
Comet SlideR&D SYSTEMS4250-050-03
Dry-bulb thermostatHangzhou Ruiyi Science and Technology Trading Co., Ltd.DH100-2Heating block
Dulbecco’s Modified Eagle MediumgibcoC11995500BTComplete cell culture medium
EDTATREVIGEN4250-050-04
Electric Constant-Temperature Water BathShanghai Mulang Instrument Manufacturing Co., Ltd.MSY-24Water bath
Electrophoresis apparatusBIO-RAD1645052
Fetal bovine serumEallBio03.U16001DC
Fluorescence microscopeWEIDAIM-300LD4
ForcepsBeyotimeFS019
GelRedBeyotimeD0140
GraphPad Prism 8.0GraphPad SoftwareStatistical analysis software
ImageJNational Institutes of Health, NIH1.54pImage processing software / image
LMA garoseR&D SYSTEMS4250-050-02Low-melting-point agarose 
Low-temperature high-speed centrifugeAnhui Zhongke Zhongjia Scientific Instrument Co., LTDKDC-40Centrifuge
Lysis SolutionTREVIGEN4250-050-01Lysis solution
MatrigelMogenel Biotechnology82755The basement membrane matrix
NaOHDAMAO1588
OpenComet softwareOpen-source ImageJ plugin, National University of Singapore, Singaporev1.3.1
Organoid Dissociation SolutionMogenel BiotechnologyMB-0818L01L
Penicillin – StreptomycinBeyotimeCO22
Phosphate-buffered saline (1x PBS)Fdbio Science Biotech Co.,LtdFD7032PBS
PipettesRaininPipet-Lite XLS
ScissorsBeyotimeFS001
Tissue Digestion SolutionMogenel BiotechnologyMB-0818L06L/MB-0818L06SOrganoid dissociation solution

Kaynaklar

  1. Xiong X, Zheng LW, Ding Y, Chen YF, Cai YW, Wang LP, et al. Breast cancer: pathogenesis and treatments. Signal Transduct Target Ther. 2025;10(1):49.
  2. Giaquinto AN, Sung H, Newman LA, Freedman RA, Smith RA, Star J, et al. Breast cancer statistics 2024. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 2024;74(6):477-95.
  3. Kciuk M, Gielecińska A, Mujwar S, Kołat D, Kałuzińska-Kołat Ż, Celik I, et al. Doxorubicin—An Agent with Multiple Mechanisms of Anticancer Activity. Cells. 2023;12(4):659.
  4. Glibetic N, Bowman S, Skaggs T, Weichhaus M. The Use of Patient-Derived Organoids in the Study of Molecular Metabolic Adaptation in Breast Cancer. International Journal of Molecular Sciences. 2024;25(19):10503.
  5. Leung D, Kaur J, Richardson G, Jardé T. Breast cancer organoids: Advancements and applications in precision medicine. Critical Reviews in Oncology/Hematology. 2025;214:104914.
  6. Nik-Zainal S, Davies H, Staaf J, Ramakrishna M, Glodzik D, Zou X, et al. Landscape of somatic mutations in 560 breast cancer whole-genome sequences. Nature. 2016;534(7605):47-54.
  7. Hua Z, White J, Zhou J. Cancer stem cells in TNBC. Semin Cancer Biol. 2022;82:26-34.
  8. Neal JT, Li X, Zhu J, Giangarra V, Grzeskowiak CL, Ju J, et al. Organoid Modeling of the Tumor Immune Microenvironment. Cell. 2018;175(7):1972-88.e16.
  9. He X, Chen F, Zhou L, Sun Y, Liu Q, Chen W, et al. The comet assay: A contemporary approach for detecting genomic instability. DNA Repair (Amst). 2025;154:103899.
  10. Ladeira C, Moller P, Giovannelli L, Gajski G, Haveric A, Bankoglu EE, et al. The Comet Assay as a Tool in Human Biomonitoring Studies of Environmental and Occupational Exposure to Chemicals-A Systematic Scoping Review. Toxics. 2024;12(4):270.
  11. Moller P, Gajski G, Geric M, Giovannelli L, Azqueta A, Haveric A, et al. The comet assay as a tool in human biomonitoring studies: Effects of confounding factors. Mutat Res Rev Mutat Res. 2025;796:108566.
  12. Collins A, Moller P, Gajski G, Vodenkova S, Abdulwahed A, Anderson D, et al. Measuring DNA modifications with the comet assay: a compendium of protocols. Nat Protoc. 2023;18(3):929-89.
  13. Caipa Garcia AL, Phillips DH. Organoids for Genotoxicity Assessment. Methods Mol Biol. 2026;2986:491-510.
  14. Cardoso R, Dusinska M, Collins A, et al. In vivo mammalian alkaline comet assay: method adapted for genotoxicity assessment of nanomaterials. Front Toxicol. 2022;4:903896.
  15. Kyrylenko S, Chorna I, Klishchova Z, Yanko I, Roshchupkin A, Deineka V, et al. Elucidation of Potential Genotoxicity of MXenes Using a DNA Comet Assay. ACS Applied Bio Materials. 2024;7(12):8351-66.
  16. Rodrigues D, Coyle L, Fuzi B, Ferreira S, Jo H, Herpers B, et al. Unravelling Mechanisms of Doxorubicin-Induced Toxicity in 3D Human Intestinal Organoids. Int J Mol Sci. 2022;23(3):1286.
  17. Bankoglu EE, Schuele C, Stopper H. Cell survival after DNA damage in the comet assay. Arch Toxicol. 2021;95(12):3803-13.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Kanser AraştırmalarıSayı 233Sayı 233Boş DeğerSayı
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.