Farelerde Beyin Endotel NAD+ metabolizmasının Gerçek Zamanlı İki Fotonlu Görüntülemesi

Özet

Bu protokol, yaşayan farelerde beyin endotelial nikotinamid adenin dinükleotid metabolizmasının endotel hedefli biyosensör ekspresyonu, kraniyal pencere hazırlığı ve iki foton görüntüleme kullanılarak gerçek zamanlı izlenmesini sağlar.

Özet

Beyin mikrovasküler endotel hücrelerinde yaşayan farelerde nikotinamid adenin dinükleotid (^NAD+) biyosensör kanalı yanıtlarının gerçek zamanlı görselleştirilmesi için kraniyal pencereli iki foton mikroskopisi ve endoteliyal hedefli floresan ^NAD+ sensörü kullanarak tekrarlanabilir bir iş akışı sunuyoruz. Protokol, (1) adeno-ilişkili virüs (AAV) aracılı olarak ^NAD+ sensörünün serebrovasküler endotelde seçici olarak ifade edilmesini, Cdh5promotor (vasküler endotel kadherin) altında AAV-X1.1 kullanılarak serebrovasküler endotelde seçici olarak ifade edilmesini, (2) stabil 3 mm × 3 mm kortikal kraniyal pencerenin cerrahi olarak hazırlanmasını ve (3) 920 nm uyarılmış yeşil sensör kanalı sinyalini ve 1040 nm uyarılmış intravasküler tetrametilrhodamin (TMR)–dekstranı aynı anda yakalamak için çift dalga boyunda iki foton görüntülemeyi içerir referans kanalı. TMR–dekstran kanalı, damar lümenine referans sağlar ve damar seçimi, hareket değerlendirmesi ve damar bütünlüğü değerlendirmesini destekler. Uygulama örneği olarak, içme suyu, ağızdan gavaj veya damar yoluyla teslimat sonrası endotel sensör kanalı floresansında nikotinamid mononükleotit ile ilişkili değişiklikleri tanımlıyoruz. Bu protokol, kritik adımları, önerilen viral dozlama ve titer değerlendirmelerini, sorun giderme ve nicel analiz stratejilerini vurgularak, laboratuvarların sağlık ve hastalıkta nörometabolizma çalışmaları için beyin vasküler NAD⁺ biyosensör kanalı dinamiklerinin in vivo izlemesini sağlamasını sağlar. 

Giriş

Nikotinamid adenin dinükleotid (NAD⁺), redoks dengesi, mitokondriyal aktivite, DNA onarımı ve strese duyarlı sinyal göndermesi için merkezi bir kofaktördür. Beyin damarlarında endotel ^NAD+ homeostazı, pasif metabolik bir okuma yerine bariyer bütünlüğünü, vasküler tonust ve nörovasküler bağlılığı aktif bir düzenleyici olarak giderek daha fazla kabul^{edilmektedir.} Endotel ^NAD+ metabolizmasının bozulması, yaşlanmaya bağlı kan-beyin bariyeri (BBB) sızıntısı ve nörovastar homeostazın bozulmasıyla ilişkilendirilmiştir; bu da canlı beyin dokusunda endotel metabolik dinamiklerini doğrudan çözebilecek yöntemlere olan ihtiyacı ortaya^{koymaktadır 2}.

Şu anda kullanılan çoğu yöntem, NAD⁺ ölçülmesi için son nokta biyokimyasal ölçümleri, sabit doku boyama veya ex vivo sensör okumalarına dayanır. Bilgilendirici olmalarına rağmen, bu yaklaşımlar sağlam mikrovasküler mimariyi korumaz, hayvan içi hızlı değişiklikleri zamanla kolayca ayırt edemez ve heterojen beyin dokusuna uygulandığında sınırlı hücre tipi özgüllük sağlar. Buna karşılık, kronik kraniyal pencere iki foton görüntüleme, canlı farelerde kortikal mikrodamarların yüksek mekansal ve zamansal çözünürlükle tekrar tekrar görselleştirilmesini sağlar ve bu da tanımlanmış fizyolojik veya farmakolojik müdahaleler altında metabolik olarak yanıtlı endotel sinyallerinin izlenmesi için^{çok uygundur 3,4,5}.

Bu protokolün genel amacı, in vivo beyin endotel ^NAD+ dinamiklerinin gerçek zamanlı izlenmesi için uçtan uca bir iş akışı sağlamaktır. Yöntem, adeno-ilişkili virüs (AAV)-X1.1 içinde paketlenmiş ve Cdh5 promotoru tarafından yönlendirilen endotel hedefli, geliştirilmiş yeşil floresan protein (eGFP) tabanlı NAD⁺ sensörünün sistemik teslimatını, optik erişim için stabil 3 mm × 3 mm kraniyal^{pencere 6,7,8} ve çift dalga boylu iki foton görüntülemeyi intravasküler tetrametilrhodamin (TMR)–dextran referans^{kanalı 1} ile birleştirir . Sensör mekanizması şu şekilde netleştirilmiştir: Cambronne ve diğerleri. LigA-cpVenus sitoplazmik ^NAD+ biyosensörü, ters yanıtlı cpVenus tabanlı bir sensördür. NAD⁺ bağlanması, standart 488 nm uyarılma okumasında cpVenus/eGFP benzeri floresansı azaltırken, 405 nm uyarılma kanalı orantımetrik normalizasyon için referans işlevi görür. Bu nedenle, ham yeşil floresans doğrudan NAD⁺ konsantrasyonunun pozitif bir ölçümü olarak yorumlanmamalıdır. Bu iki fotonlu uygulamada, yeşil sensör kanalı sinyalini almak için 920 nm uyarılma kullanılırken, TMR–dextran vasküler referans kanalı için 1040 nm uyarılma kullanılır; Bu nedenle, mevcut 920/1040 nm alımı, kalibre edilmiş 488/405 nm oranlı metrik ölçüme eşdeğer değildir. Cambronne ve arkadaşlarının biyosensörü, hücre içi ^NAD+ dinamiklerinin izlenmesi için kapsamlı şekilde doğrulanmış olması ve mevcut çift dalga boylu görüntüleme konfigürasyonuyla uyumlu olması nedeniyle seçilmiştir. FiNad gibi yeni göstergeler NAD⁺ dinamiklerini izlemek için alternatif yaklaşımlar sunsa da, uygulamaları TMR–dextran vasküler referans etiketleme için şu anda kullanılan kırmızı floresans kanalının değiştirilmesini gerektirir. Cambronne sensörü, sonlu dinamik aralıkta ^NAD+ kullanılabilirliğinde göreceli değişiklikleri rapor eder ve hücresel ve alt hücresel uygulamalarda doğrulanmıştır; ancak sinyal yorumu ifade seviyesi, pH, foto ağartma ve optik yol değişkenliği tarafından etkilenebilir ve mutlak ^NAD+ niceltmesi kalibrasyon veya ortogonal biyokimyasal doğrulama gerektirir. AAV-X1.1, endotelyal-tropik AAV varyantlarının merkezi sinir sistemi damarlarını verimli şekilde aktardığı^{bildirildiği için seçilmiştir 6,7}. AAV9, AAV-BR1, AAV-ENT ve AAV-X1.1 dahil olmak üzere birkaç AAV serotipinin ön karşılaştırmasında, CAG veya Cdh5 odaklı geliştirilmiş yeşil floresan protein ekspresyonunu raporlayıcı olarak kullanarak, AAV-X1.1 test edilen serotipler arasında en uygun vasküler ilişkili ekspresyon desenini üretmiştir. Cdh5 promotoru daha sonra, damarlı endotel hücrelerine transgen ekspresyonunu daha da sınırlamak için kullanıldı; bu, önceki raporlarda endotelyal-seçici transgen ekspresyonunu in vivo⁶ gösteren raporlarla uyumludur.

Ex vivo NAD⁺ testleriyle karşılaştırıldığında, bu yaklaşım sağlam damar ağını korur, aynı hayvanda boylamasına ölçümler yapılmasını sağlar ve endotel metabolik sinyallerin eşzamanlı olarak değerlendirilmesine ve damar lümenine referans verilmesine olanak tanır. Bu iş akışı özellikle yaşlanma, inflamatuar stres, BBB disfonksiyonu ve nikotinamid mononükleotid (NMN) uygulaması gibi metabolik müdahalelere hızlı yanıtlar^{için faydalıdır 9,10,11,12,13}. Bu yöntem, deneysel soru yaşayan farelerde kortikal mikrodamarların tekrar tekrar görselleştirilmesi ve endotel sensör kanalı sinyalindeki göreceli değişiklikler gerektirdiğinde en uygundur. Ek oran metrik kalibrasyon veya biyokimyasal doğrulama olmadan mutlak ^NAD+ nicelendirme için daha az uygundur. Pratik sınırlamalar arasında kortikal optik erişilebilirlik, görüntüleme derinliği kısıtlamaları, başarılı endotel AAV transdüksiyonuna bağımlılık, potansiyel kraniyal pencere ilişkili iltihap ve çift dalga boyunda iki fotonlu mikroskop gerekliliği yer alır. Kronik kraniyal pencere implantasyonu, lokal iltihap, damar reaktivitesi, glioz, opaklık veya doku yeniden şekillendirilmesine neden olabilir; bunların tümü endotel fizyolojisini ve sensör kanalı ölçümlerini^{etkileyebilir 1,3,4}. Bu karıştırıcı faktörleri en aza indirmek için protokol, aseptik cerrahi, sık soğutma ile aralıklı sondama, dikkatli hemostaz, dura ile yapışkan temasın önlenmesi, ameliyat sonrası analjezi, günlük izleme ve kalıcı opaklık, inflamatuar kalıntı, enfeksiyon, kararsız vasküler morfolojisi veya zayıf taban sinyal stabilitesi olan hayvanların dışlanması gerektirir.

Protokol

Tüm prosedürler, "Kan-Beyin Bariyer Bütünlüğünün Metabolik Prob Tabanlı Gözleminin Mekanistik Çalışması" (onay numarası KFDX: NO. 2023-1023) kapsamında Sağlık ve Rehabilitasyon Bilimleri Üniversitesi Hayvan Etik Komitesi tarafından onaylanmıştır. Tüm ameliyatları aseptik koşullarda yapmak ve onaylanmış hayvan protokolüne göre perioperatif analjezi ve destekleyici bakım sağlamak sağlanmaktadır. Temsilci iş akışında, ameliyattan önce veya hemen ardından buprenorfin hidroklorür (0,05–0,1 mg/kg, deri altı olarak) ve ardından gerektiğinde her 8–12 saatte bir 24–48 saat boyunca uygulanır. Fareleri ısıtılmış bir kafeste kurtarın ve normal duruş, kendiliğinden hareket ve stabil solunum sağlanana kadar izleyin.

1. Deneysel genel bakış

1. Temsilci deneyler için 10–12 haftalık ve 23–25 g ağırlığında yetişkin C57BL/6J fareleri kullanın.
2. Fareleri belirli patojenlerden arınmış koşullarda, 12 saat ışık/karanlık döngü, 22°C–24°C ortam sıcaklığı, %40–%60 göreli nem ve yiyecek ile suya imkansız erişim ile bakıma devam edin.
3. İşlemlerden önce hayvanları en az 7 gün boyunca aklimatize edin.
4. Deneysel tasarım için uygun şekilde her iki cinsiyeti kullanın. Her deney için cinsiyet, hayvan sayıları ve grup dağılımı rapor edin. Burada gösterilen temsil görüntüleme veri seti N = 3 fare kullanmıştır.
5. Önce sistemik AAV uygulanır ve görüntülemeden önce 3–4 haftalık bir ifade süresi bekleyin.
6. Görüntülemeden 3–5 gün önce kraniyal pencere ameliyatı yapılabilir.
7. Görüntüleme gününde fareleri anestezi edin, damardan TMR–dextran enjekte edin ve yeterli iz dolaşımından sonra görüntüleme yapın.
8. NMN'yi seçilmiş müdahale programına göre uygulayın. Görüntülemeden önce 5 gün içme suyu takviyesi verin, görüntülemeden önce önceden belirlenmiş aralıkta oral gazaj yapın veya başlangıç alımı sonrası görüntüleme seansında damar içi NMN uygulanın.
   NOT: AAV uygulamasından sonra protokolü 3–4 haftalık ifade döneminde duraklatın ve hayvanları rutin sağlık izleme ve standart barınma koşulları altında tutun. Kafatası penceresi ameliyatından sonra protokolü 3–5 günlük iyileşme döneminde durdurun. Görüntülemeye başlamadan önce, sabit vücut ağırlığı, normal bakım ve aktivite, enfeksiyon veya aşırı iltihaplanma olmaması ve kafa beyninde net bir pencere olduğunu doğrulayın.

2. Uzunlamasına kortikal görüntüleme için kraniyal pencere cerrahisi

1. Ameliyat öncesi hazırlık
   1. Tüm cerrahi aletleri sterilize edin ve anestezi indüksiyonundan önce steril bir alan oluşturun.
   2. Homeotermik ısıtma sistemini vücut sıcaklığını 36,5°C–37,5°C arasında tutacak şekilde ayarlayın; tercihen rektal problu geri besleme kontrolcüsü kullanın.
   3. Ameliyattan önce solunum izleme ekipmanını hazırlayın ve stabil operasyonu onaylayın.
   4. İşleme başlamadan önce steril salin, emici sürüntüler, hemostatik malzemeler, steril No. 1.5 cam kapak örtüsü, metal başlık plakası ve diş çimentosu hazırlayın.
   5. 3 mm × 3 mm kranial pencereyi tamamen kapatacak steril No. 1.5 cam kaplama kullanabilirsiniz ve kafatası kenarına düz oturun.
   6. 0,5–1,0 mm burrlu yüksek hızlı bir mikromatkap hazırlayın.
   7. Matkapı maksimum hızın yaklaşık yarısı kadar çalıştırın ve kafatası inceltme sırasında steril tuzlu sulamanın hemen uygulanabileceğinden emin olun.
   8. Delme sırasında oda sıcaklığında steril tuzlu suyu, pamuklu çubuk veya damlacı ile uygulayarak kafatasını soğutup kemik tozunu temizleyin.
2. Anestezi, saç derisi hazırlığı ve kafatası maruziyeti
   1. Fareleri, taze hazırlanmış Avertin çalışma çözeltisi (%1,25, 12,5 mg/mL) ile intraperitoneal enjeksiyonla 200–250 mg/kg oranında anestezi yapın.
      1. 2,2,2-tribromoetanol ve 2-metil-2-butanolden oluşan Avertin çalışma çözeltisini kurumsal standart işletim prosedürlerine göre hazırlamak, çözeltiyi ışıktan korumak ve çökeltme veya renk değişikliği gösteren preparatları atmak.
   2. Pedal çekilme refleksini kaybederek stabil bir cerrahi düzlem doğrulanın.
   3. Anestezi indüksiyonundan hemen sonra her iki göze oftalmik merhem uygulayın.
   4. İnhalasyon anestezisi kullanılırsa, %3–%4 isofluran ile anestezi indük edilsin.
   5. Anestezi, oksijende %1–2 izofluran ile 0,5–1,0 L/dakika oranında sürdürün ve solunum ile reflekslere göre ayarlama yapın.
      DIKKAT: Anestezi maddelerini kurumsal güvenlik prosedürlerine göre kullanın ve inhalasyon anestezisi uygularken uygun temizlik sistemleri kullanın.
   6. Fareyi sırt kafasına stabil erişim sağlayan stereotaksik bir çerçeve veya özel kafa tutucuya sabitleyin.
   7. Vücut sıcaklığını 36,5°C–37,5°C arasında tutun, mevcut olduğunda geri besleme kontrollü ısı pedi ve rektal prob kullanın.
   8. Saç derisini tıraş edin ve cerrahi alandaki gevşek saçları çıkarın.
   9. Üç döngü boyunca alternatif povidon-iyot veya iyodofor solüsyolu ve %70 etanol kullanarak saç derisini dezenfekte edin.
   10. Dezenfektanı gözlere veya kafatası açıklığına girmekten kaçının.
   11. Orta hat saç derisi kesisi yapın ve cildi nazikçe geri çekin.
   12. Kafatasını hem kranial pencere oluşumuna hem de baş plakasına sabitlemeye olanak tanıyacak kadar açık bırakın.
   13. Periost ve kalıntı bağ dokusunu ince forseps veya bistüri bıçağı kullanarak çıkarın.
   14. Kafatasını steril pamuk çubuklarıyla yaklaşık 10–20 saniye boyunca nazikçe kurutarak yüzey ıslak değil mat görünene kadar.
   15. Açıkta kalan dokunun aşırı susuz kalmasından kaçının.
3. 3 mm × 3 mm kraniotominin işaretlenmesi
   1. Bregma ve lambda'yı cerrahi mikroskop altında tanımlayın.
   2. Bu anatomik işaretleri orta hattın yönlendirilmesi ve kortikal bölgeyi hedeflemek için kullanın.
   3. Dorsal somatosensorik korteksin bir yarımküresi üzerinde 3 mm × 3 mm kare işaretleyin.
   4. Ön kenarı bregma'ya yaklaşık 0,5 mm arkada, medial kenarı ise orta hatta yaklaşık 1,0 mm lateral konumlandırın.
   5. Mümkün olduğunca büyük kafatası dikişlerinden ve büyük yüzey damarlarından kaçının.
4. Sondaj ve kemik kapak çıkarımı
   1. Belirgin çevre boyunca kafatasını sürekli basınç yerine aralıklı matkap temasıyla inceltin.
   2. Termal hasarı önlemek için sondaj sırasında steril salin defalarca uygulayın.
   3. Her uygulamada yaklaşık 20–50 μL steril salin verin veya kafatası yüzeyini nemli ve serin tutacak kadar olsun.
   4. Her 10–20 saniyede bir veya kemik tozu biriktiğinde veya ısı birikimi şüphesi olduğunda tekrar sulama yapın.
   5. Kemik eşit şekilde saydam ve hafif esnek hale gelene kadar inceltmeye devam edin.
   6. Görünür dural damarları, korunmuş dural pulsasyonu ve kortikal sıkıştırma veya termal renk değişiminin olmaması ile yeterli incelenmeyi doğrulayın.
   7. Aşırı ısı birikimi, kanama veya azalmış dural darbe oluşursa derhal sondajı durdurun.
   8. Alanı sulayıp devam etmeden önce tekrar değerlendirin.
   9. Kemik kapağını ince forseps veya iğne ucu kullanarak bir köşeden nazikçe kaldırın.
   10. Direnç kalırsa çevreyi yeniden inceltin.
   11. Kemik kapağı çıkarırken durayı sağlam tutun.
   12. Kemik tozunu steril salin ile durulayın.
   13. Hafif kanamayı nazik tuzlu sulama ve emici sürüntlerle kontrol edin.
   14. Sulama ve emici sürüntü temasından sonra 1–2 dakika içinde geçerse kanamayı kabul edilebilir olarak değerlendirin.
   15. Hayvanı dışlayın veya kanama yaklaşık 5 dakikadan fazla devam ederse işlemi sonlandırın.
   16. Dura yırtılırsa, kortikal sıkıştırma olursa veya kan görüntüleme alanını gizliyorsa hayvanı hariç tutun veya işlemi sonlandırın.
       NOT: İşlem, tam hemostazdan sonra ve örtü slip yerleştirilmeden önce geçici olarak duraklatılabilir. Açık durayı steril salin kullanarak nemli bir durumda tutun ve aktif kanamanın olmadığı doğrulandıktan sonra devam edin.
5. Pencere sızdırmazlığı ve başlık plakası sabitleme
   1. Açıkta kalan duranın temiz, nemli ve aktif kanamadan arınmış olduğundan emin olun.
   2. Kraniotominin üzerine steril bir örtü koyun.
   3. Coverslip'i, kraniotomiyi çevreleyen kafatası kenarına dura sıkıştırmadan yerleştirin.
   4. Doğru konumu doğrulayarak düz bir örtü kaydırma yüzeyi, hapsedilmiş hava kabarcıklarının yokluğu, korunmuş dural darbe ve net bir optik yol ile doğrulayın.
   5. Üreticinin talimatlarına göre diş çimentosu veya Super-Bond C&B tipi yapıştırıcı hazırlayın.
      1. Temsilci Süper-Bağ C&B hazırlığı için, 1 kepçe toz, 1 damla katalizör ve 4 damla monomer, uygulamadan hemen önce yaklaşık −20°C sıcaklıkta tutulan önceden soğutulmuş seramik bir kabda karıştırın.
   6. Yapıştırıcı sadece örtü yüzeyinin çevresindeki dış kafatası kenarına uygulayın.
   7. Dura ile yapışkan temasından kaçının ve camın altına kapiller fitil geri girmesini engelleyin.
   8. Yapıştırıcının oda sıcaklığında yaklaşık 5–10 dakika sertleşmesine izin verin.
      DIKKAT: Diş çimento ve yapışkan bileşenler uçucu veya tahriş edici kimyasallar içerebilir. Onları kurumsal güvenlik prosedürlerine göre ele alın ve uygun havalandırma kullanın.
   9. Kafatası penceresinin etrafına özel bir titanyum başlık örtüsü yerleştirin.
   10. Görüntüleme başlığı tutucusuyla uyumlu yaklaşık 10 mm ortada bir açıklık içeren bir başlık plakası kullanın.
   11. Kafatasısı penceresini başlık açıklığında ortalayın.
   12. Diş çimentosunu yalnızca optik pencerenin dışındaki kafatası temas bölgelerine uygulayın.
   13. Hayvanı hareket ettirmeden önce çimentonun yaklaşık 5–10 dakika boyunca tamamen sertleşmesine izin verin.
6. Ameliyat sonrası iyileşme ve pencere kalite kontrolü
   1. Ameliyat sonrası hayvan protokolüne uygun olarak analjezi uygulanır.
   2. Temsilci iş akışında, buprenorfin hidroklorüri her 8–12 saatte bir deri altı olarak 0,05–0,1 mg/kg aralığında, 24–48 saat boyunca verin.
   3. Isıtılmış kafeste fareleri kurtarın.
   4. Solunum, duruş, hareket, bakım ve vücut ağırlığını günlük olarak takip edin.
   5. Şeffaf cam yüzeyi, görünür kortikal damar, sağlam dura, minimum kan kalıntısı, örtü altındaki yapışkan olmadan, enfeksiyon olmayan ve stabil baş plakası fiksasyonu olan kranial pencereleri kabul edin.
   6. Belirgin opaklık, kalıcı kanama, iltihap kalıntıları, enfeksiyon, pencere yerinden kayması, ciddi kilo kaybı (%>15) veya kötü bakım ve aktivite ile davranışı olan hayvanları hariç tutun.
   7. İyileşmeden 3–5 gün sonra görüntülemeye geçin.
   8. Normal aktivite, normal bakım davranışı, sabit vücut ağırlığı, ağrı veya enfeksiyon olmaması ve görüntülemeden önce net görünen damarları olan şeffaf kafa penceresi doğrulamak.
      NOT: Protokol, ameliyat sonrası iyileşme döneminde duraklatılabilir. Fareleri standart barınma koşullarında tutun, vücut ağırlığını ve pencere netliğini günlük olarak izleyin ve görüntülemeye ancak tüm iyileşme kriterleri sağlandıktan sonra devam edin.

3. AAV aracılı endotel ^NAD+ sensör ekspresyonu

1. Viral yapı ve hazırlık
   1. Endotel Cdh5 promotoru tarafından yönlendirilen eGFP/cpVenus tabanlı genetik olarak kodlanmış NAD⁺ biyosensör kullanın.
   2. Cambronne ve diğerlerini kullanın. LigA-cpVenus sitoplazmik NAD⁺ biyosensör dizisi (örneğin, Addgene plazmid #186787 veya eşdeğer dizisi doğrulanmış bir ek).
   3. Cdh5 promotorunu NAD⁺ biyosensör kodlama dizisinin yukarısında, CV232 vektör omurgasını kullanarak klonlayın.
   4. İfade kasetini AAV-X1.1 kapsidine özel bir viral preparat olarak paketleyin.
      1. Her AAV hazırlığı için viral üretim sağlayıcısını, arıtma yöntemini, viral-genom nicelendirme yöntemini, üretim parti numarasını ve analiz sertifikasını kaydedin.
   5. Her viral preparat için plazmid haritasını, dizi doğrulama sonuçlarını, viral üretim bilgilerini, arıtma bilgilerini, viral-genom titresini ve analiz sertifikasını kaydedin.
      1. Çalışmada kullanılan her viral preparat için yapı haritası, dizisi doğrulama raporu, viral üretim parti numarası, nicel polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) titre raporu, arıtma dokümantasyonu ve analiz sertifikasını kaydedin.
   6. Tüm yapı detayları için Materyaller Tablosu'na bakınız.
   7. Genellikle 2 ×¹³ vg/mL'den fazla olan lota özgü qPCR titrleri yüksek yüksek titrli AAV preparatları kullanın.
   8. Tek kullanımlık aliquotları −80°C'de sakla.
   9. Tekrarlayan donma–erime döngülerinden kaçının.
   10. Kullanım öncesi üretim partisini, qPCR titrini, depolama süresini ve kabul edilebilir parti varyasyonunu kaydedin.
2. Sistemik AAV yönetimi
   1. Buzda viral bir aliquot erit.
   2. Virüsü steril fosfatla tamponlanmış tuzlu (PBS) ile fare başına 100–200 μL nihai enjeksiyon hacmine kadar seyreltirin.
   3. Hayvanlar arasında fare başına son dozu 2 × 10¹² vg olarak kalın.
      1. Lota özgü viral-genom titresinden enjeksiyon hacmini hesaplayın. 1.39 × 10¹³ vg/mL qPCR titriyle temsil edilen preparat için, fare başına 2 × 10¹² vg doz vermek için yaklaşık 144 μL enjekte edilir.
   4. Virüs, steril 29 G insülin şırıngası kullanılarak retro-orbital venöz sinüs enjeksiyonu ile iletiniz.
   5. Viral süspansiyonu yaklaşık 10–20 saniye boyunca yavaşça enjekte edin.
   6. Başarılı doğumu doğrulamak için sızıntı, aşırı kanama ve göz yaralanması yokluğunu doğrulayın.
   7. Alternatif yönetim yollarını ayrı ayrı onaylayın ve bildirin.
   8. Fareyi normal duruş ve spontan hareket geri kazanana kadar gözlemleyin.
   9. Stabil solunum ve kanama ya da sıkıntı olmadığını doğrulayın.
   10. Hayvanı ancak tam iyileşmeden sonra ev kafesine geri döndürün.
   11. Sensör ifadesi için görüntülemeden önce 21–28 gün beklen.
   12. Her karşılaştırma kümesi içinde tutarlı bir ifade aralığı kalın.
   13. 21–28 günlük aralık dışındaki ifade aralıklarını ayrı ayrı doğrulayın.
       NOT: Protokol, AAV-ifade döneminde duraklatılabilir. Rutin bakım ve sağlık takibi sürdürülür ve ancak planlanan ifade aralığı dolduktan ve hayvan sağlıklı kaldıktan sonra kranial pencere ameliyatına geçin.
3. Endotel kısıtlamasının doğrulanması
   1. Resmi veri toplamadan önce hayvanları taranın.
   2. Yeşil sensör kanalı sinyali algılanabilir ve damar ağını takip ettiğinde hayvanları kabul edin.
   3. Sinyalin TMR–dekstran–pozitif lümenin bitişiğindeki damar duvarları boyunca zenginleştiğini doğrulayın.
   4. Baskın dağınık parenximal floresansın yokluğunu doğrulayın.
   5. Tüm deneysel gruplar için aynı kabul kriterlerini uygulayın.
   6. PBS içeren farelerde perfüze ve ardından sonradan doğrulama gerektiğinde %4 paraformaldehit uygulanır.
   7. Beyni toplayın ve 30–40 μm koronal veya sagital kesitler hazırlanın.
   8. Domates lektin, CD31 veya vasküler endotel kadherin (VE-kadherin) gibi endotel işaretleyicilerle boyama kesitleri.
      1. Her doğrulama deneyi için antikor kaynağını, katalog numarasını, parti numarasını, konak türünü, seyreltme, kuluçka koşullarını ve tespit yöntemini kaydedin.
   9. Gerektiğinde nikotinamid fosforibosiltransferaz (NAMPT) ve poli(ADP-riboz) polimeraz 1 (PARP1) ekspresyonunu değerlendirin.
   10. Doku hazırlığı için optimize edilmiş birincil antikor seyreltmeleri kullanın.
   11. Gruplar arasında aynı alma ayarlarıyla floresans veya konfokal görüntüler elde edin.
   12. Kolokalizasyonu, sensör-pozitif sinyalin vasküler belirteç-pozitif bölgelerle örtüşmesi veya hemen bitişiği olarak nicel olarak nicelleştirin.
   13. En fazla algılanabilir sinyal damar yapılarının dışında yer aldığında hayvanları hariç tutun.
   14. Damar duvarı zenginleştirmesi olmadığında hayvanları hariç tutun.
   15. Hedef dışı parenximal floresans güvenilir ilgi alanı seçimini engellediğinde hayvanları hariç tutun.
   16. Başlangıç alımı sırasında sensör kanalı floresansı doygun veya kararsız olduğunda hayvanları hariç tutun.

4. İki fotonlu görüntüleme ve nicel analiz

1. Görüntüleme günü hazırlığı ve damar içi referans etiketleme
   1. Fareleri, taze hazırlanmış Avertin çalışma çözeltisi (%1,25, 12,5 mg/mL) ile intraperitoneal enjeksiyonla 200–250 mg/kg oranında anestezi yapın veya kurumsal hayvan protokolü tarafından onaylanan anestezi rejimini kullanın.
   2. Pedal çekilmesinin ve stabil solunumun kaybıyla stabil bir cerrahi düzlem doğrulan.
   3. Indüksiyondan hemen sonra oftalmik merhem uygulayın.
   4. İnhalasyon anestezisi kullanılırsa, %3–%4 isofluran ile anestezi indük edilsin.
   5. Anestezi, oksijende %1–2 izofluran ile 0,5–1,0 L/dakika oranında sürdürün ve solunum ile reflekslere göre ayarlama yapın.
   6. 70 kDa TMR–dextran ile steril PBS içinde 10–25 mg/mL olarak hazırlanır.
   7. TMR–dextran çözümünü ışıktan koruyun ve kurumsal uygulama gerektirdiğinde çözümü filtreleyin.
   8. TMR–dextran damar yoluyla 20 mg/kg enjekte edilsin.
   9. Enjeksiyon hacmini stok konsantrasyonuna göre ayarlayın. 25 g fare için yaklaşık 0,5 mg toplam boya verin.
   10. İzleyiciyi taze hazırlayın veya aliquotları üreticinin önerilerine göre ışıktan korunarak saklayın.
   11. TMR–dextran'ın görüntü almadan önce 5–10 dakika dolaşmasına izin verin.
2. Mikroskop konfigürasyonu
   1. eGFP tabanlı sensör kanalının 920 nm uyarılması için yapılandırılmış çift dalga boylu iki fotonlu mikroskop kullanın.
   2. TMR–dextran vasküler referans kanalı için 1040 nm uyarılma yolu kullanın.
   3. Temsil görüntüleme, NIS-Elements AR/AR Analiz yazılımı (sürüm 5.42.06) tarafından kontrol edilen Nikon A1 MP/A1R MP+ çoklu foton mikroskobu üzerinde gerçekleştirildi.
   4. Her görüntüleme sistemi için lazer kaynaklarını, darbe parametrelerini, ışın kombinasyonu konfigürasyonunu, dedektör tipini ve yazılım sürümünü kaydedin.
   5. Sensör-kanal sinyalini TMR–dekstran sinyalinden ayıracak şekilde algılama kanallarını yapılandırın.
   6. Descanlanmamış fotomultiplier tüpü (PMT) veya galyum arsenit fosfit (GaAsP) dedektörleri kullanın.
   7. Yaklaşık 500 ile 550 nm arasında yeşil sensör kanalı emisyonu toplayın.
   8. TMR–dekstran emisyonunu yaklaşık 570 ile 650 nm arasında toplayın.
      1. Temsilci veri setinde, 525/50 nm emisyon filtresi kullanarak yeşil sensör kanalı emisyonu toplayın ve 575/25 nm veya 610/75 nm emisyon filtresi kullanılarak TMR–dextran emisyonu toplayın.
   9. Kanallar arasında spektral kanama en aza indirin.
   10. Her karşılaştırma setinde dedektör kazancı ve ofset ayarlarını sabit tutun.
   11. Kanal ayrımını tek kanallı kontrollerle doğrulayın.
   12. Nikon CFI75 Apochromat 25XC W 1300 suya batma objektif veya eşdeğeri (25×, sayısal diyafram 1.10, çalışma mesafesi 2.0 mm) kullanın.
   13. Bifurkasyonlar ve lümenli kenarlar gibi sabit damarlar işaretleriyle kanal ortak kaydını doğrulayın.
   14. Herhangi bir optik yol ayarlamasından sonra tekrar ortak kayıt doğrulaması yapılmalıdır.
   15. Görüntülemeden önce örnek düzleminde lazer gücünü ölçün.
   16. Her karşılaştırma setinde 920 nm lazer gücünü sabit tutun.
   17. Her karşılaştırma setinde 1040 nm lazer gücünü sabit tutun.
   18. 920 nm'de yaklaşık 10–20 mW ve 1040 nm'de 8–18 mW temsil edici çalışma menzilleri olarak kullanılır.
   19. Lazer gücünü görüntüleme derinliği ve kafatası penceresi kalitesine göre ayarlayın.
   20. 120 saniyelik temel dönemde %20'den fazla sinyal kaybı gösteren alanları hariç tutun.
   21. Görünür fototoksik değişiklikleri gösteren alanları hariç tutun.
3. Satın alma ayarları
   1. Net optik pencere, keskin odaklı mikrodamarlar ve minimum hareketle seçilen görüş alanları.
   2. Şeffaf örtülü pencereler, görünür kortikal damarlar, sağlam dura, minimum kan kalıntısı, örtü altındaki yapışkan yok, enfeksiyon yok ve stabil baş plakası sabitlenmesi kabul edin.
   3. Belirgin opaklık, kalıcı kanama, iltihap kalıntıları, enfeksiyon, pencere yerinden kayması, ciddi kilo kaybı (%>15) veya kötü bakım/aktivite olan hayvanları hariç tutun.
   4. 512 × 512 piksel aralığında zaman geçişli görüntüler elde edin.
   5. Daha yüksek uzamsal detay gerektiğinde 1024 × 1024 piksel aralığında temsil eden durağan görüntüler elde edin.
   6. Her karşılaştırma setinde piksel boyutunu, yakınlaştırma, tarama hızını ve görüş alanını sabit tutun.
   7. 1–3 μm adım boyutu kullanarak z-yığınları elde edinin.
   8. Pial yüzeyinin yaklaşık 200–250 μm altında kortikal mikrodamarlar görüntülenmesi.
   9. Pencere kalitesi izin verdiğinde görüntüleme derinliğini yaklaşık 400 μm'ye çıkarın.
   10. Eşleştirilmiş karşılaştırmalar için görüntüleme derinliğini sabit tutun.
   11. Akut müdahalelerden önce 1 saniye aralıklarla 120 saniyelik bir başlangıç seviyesi elde edin.
   12. Önceden belirlenmiş müdahale sonrası dönem için satın almaya devam edin.
   13. Enjeksiyondan sonra yaklaşık 10–30 dakika boyunca damar içi NMN yanıtlarını kaydedin.
   14. İçme suyu ve ağızdan geçiş veri setlerini önceden belirlenmiş deneysel uç noktalarda edinin.
   15. Tüm karşılaştırma gruplarında aynı satın alma ayarlarını koruyun.
4. NMN müdahalesi (uygulama örneği)
   1. NMN'yi steril içme suyunda çöz.
   2. NMN konsantrasyonunu yaklaşık 100 mg/kg/gün verecek şekilde ayarlayın.
   3. Şişeyi ışıktan koruyun.
   4. NMN içeren içme suyunu her 24–48 saatte bir değiştirin.
   5. Şişe ağırlığı ölçümleriyle su tüketimini izleyin.
   6. Su tüketimi ve vücut ağırlığı kullanılarak tahmini NMN alımını hesaplayın.
   7. Görüntülemeden önce 5 gün takviye almaya devam edin.
   8. Oral garaj için 1 mg/mL NMN hazırlayın.
   9. Fare başına 200 μL ver, 20G, yuvarlak uçlu bir iğne ile kullanın.
   10. Gavajdan 30–60 dakika sonra görüntüleme yapıldı.
   11. Damar içi doğum için 1 mg/mL NMN hazırlayın.
   12. Retro-orbital venöz sinüs veya kuyruk venüsü üzerinden fare başına 100 μL enjekte edilir.
   13. Enjeksiyonu 10–20 saniye boyunca yavaşça yapın.
   14. Enjeksiyondan hemen sonra veya 5 dakika içinde görüntülemeye başlayın.
   15. 5 günlük takviye kullanımından sonra içme suyu veri setleri edinin.
   16. Sabit bir gawage sonrası zaman noktasında ağızdan gawage veri setleri edinin.
   17. Damar içi enjeksiyondan hemen önce bir taban noktası alın.
   18. Damar içi enjeksiyondan sonra yaklaşık 10–30 dakika boyunca akut yanıtlar kaydedilir.
5. Görüntü işleme ve sinyal çıkarma
   1. Hareket artefaktları olduğunda hareket düzeltmesi yapın.
   2. Fiji/ImageJ (sürüm 1.8.0 veya daha sonrası) ile StackReg, TurboReg veya eşdeğer bir rigid-body kayıt algoritması kullanın.
   3. Kaydı yönlendirmek için TMR–dextran kanalındaki damarlar işaretleri kullanın.
   4. Veri setlerini yalnızca düzeltmeden sonra kalıntı yer değiştirme yaklaşık 1–2 pikselden küçük olduğunda kabul edin.
   5. Damarların ilgi alanı (ROI) sınırlarının satın alma boyunca sabit kaldığını doğrulayın.
   6. TMR–dextran kanalını kullanarak damar lümenlerini segmente geçirin.
   7. Lümenin hemen bitişiğinde endotel ROI'larını tanımlayın.
   8. Stabil lümen etiketleme, minimum hareket ve görünür sensör kanalı sinyali mikrodamarları seçin.
   9. Yaklaşık 5–80 μm çaplı kap çaplarını analiz edin.
   10. Endotel ROI'larını, yaklaşık 2–5 μm genişliğinde damar duvarı bağlantılı bölgeler olarak tanımlayın.
   11. Görüş alanı başına 3–5 gemi analiz etmek mümkün olduğunda.
   12. Mümkün olduğunda fare başına 1–3 görüş alanını analiz edin.
   13. İzleyici ve sensör sinyali olmayan doku bölgelerinde arka plan yatırım getirisi oranlarını tanımlayın.
   14. Arka plan yatırım getirisini analiz edilen kaplardan ve görüntü artefaktlarından en az 20 μm uzaklığa yerleştirin.
   15. Normalizasyondan önce her kanaldan ortalama arka plan yoğunluğunu çıkarın.
   16. Tüm örneklere aynı arka plan çıkarma stratejisini uygulayın.
   17. F_sensor(t) için zaman serisi ortalama yoğunluk değerleri alın.
   18. F_ref(t) için zaman serisi ortalama yoğunluk değerlerini çıkarın.
   19. NIS-Elements AR/AR Analizi veya Fiji/ImageJ kullanarak ölçümler yapın.
   20. Ham görüntü dosyalarını ND2 dosyası olarak dışa aktarın.
   21. Mümkün olduğunda analiz kopyalarını 16-bit TIFF yığınları olarak dışa aktarın.
   22. ROI zaman serisi verilerini CSV dosyaları olarak dışa aktarın.
   23. Normalizasyondan önce arka plan çıkarılmış floresans değerlerini hesaplayın.
   24. ΔF/F₀ = (F(t) − F₀)/F₀ kullanarak ΔF/_{F 0} hesaplayın.
   25. F_0'ı , 120 saniyelik bazal dönemdeki ortalama sinyal olarak tanımlayın.
   26. Vasküler referans normalizasyonunu F_sensor(t)/F_ref(t) olarak hesaplayın.
   27. Satın alma süresi izin verdiğinde zirve değişimi, zirveye ulaşma süresi, eğri altı alanı ve geri kazanım kinetiklerini bildirin.
   28. 920 nm sensör kanalı sinyalini kalibre edilmiş bir NAD⁺ konsantrasyonu olarak yorumlamayın.
   29. Nicel ^NAD+ ölçümleri gerektiğinde ek orantımetrik kalibrasyon veya biyokimyasal doğrulama yapın.
6. İstatistikler ve raporlama
   1. Fareyi biyolojik deneysel birim olarak tanımlayın.
   2. Her fare içinde grup düzeyinde analizden önce ortalama gemi seviyesi ölçümleri veya iç içe istatistiksel bir model uygulanmasını sağlar.
   3. Fare içi normal dağıtılmış karşılaştırmalar için çiftli iki kuyruklu t-testleri kullanın.
   4. Normallik varsayımları karşılanmadığında Wilcoxon eşleştirilmiş çiftler imzalı sıralama testlerini kullanın.
   5. İkiden fazla ilişkili durumu içeren analizler için tekrarlanan ölçümlü ANOVA veya karışık etki modelleri kullanın.
   6. Uygun çoklu karşılaştırma düzeltmeleri uygulayın.
   7. GraphPad Prism veya eşdeğer yazılım kullanarak istatistiksel analizler yapın.
   8. İstatistiksel anlamlılığı p < 0.05 olarak tanımlayın.
   9. Her figür efsanesinde tam istatistiksel testi raporlayın.
   10. Mümkün olduğunda ROI seçimi ve niceliklendirme öncesi kod görüntü dosyaları.
   11. Yatırım getirisi ölçümleri ve kalite kontrol kararları tamamlanana kadar analistlerin kör olmasını sürdürün.
   12. Temsil eden veri setinde biyolojik deneysel birim olarak N = 3 fare kullanın.
       NOT: Aktif zaman geçişli görüntüleme sırasında görüntü alımını durdurmayın. Ham veri ihracatından sonra görüntü işleme ve nicel analiz duraklatılabilir. ND2 dosyalarını, TIFF analiz dosyalarını, ROI dosyalarını, meta verileri ve CSV ölçüm tablolarını yedeklenmiş bir arşivde depolayın. Her görüntüleme seansı için lazer gücü, dedektör ayarları, görüntüleme derinliği, hayvan kimliği, tedavi ataması ve dışlama kararlarını kaydedin.

Sonuçlar

Başarılı bir hazırlık, boylamasına görüntülemeye uygun, şeffaf ve mekanik olarak stabil bir kranial pencere sağlar. Şekil 1A , anestezi ve kafatası maruziyetinden kranioomi, örtü kaydırma yerleştirme, baş plakası sabitleme ve ameliyat sonrası iyileşmeye kadar prosedürel iş akışını özetlemektedir. Şekil 1B, ana cerrahi adımların temsil seri fotoğraflarını sunar. Görüntülemeye uygun pencereler net optik yol, görünür kortikal damar...

Tartışma

Bu protokol, in vivo beyin endotel ^NAD+ metabolizmasını izlemek için uçtan uca bir iş akışı sağlar. Başarının temel belirleyicileri şunlardır: (i) pencere netliği ve stabilitesi, sondaj sırasında termal hasarın en aza indirilmesi ve kanamanın kontrolü; (ii) AAV kapsid, promotor, doz ve ekspresyon aralığının uygun seçimiyle elde edilen endotel özelliği ve yeterli sensör ekspresyonu sağlamak; ve (iii) özellikle uzunlamasına karşılaştırmalar yapılırken tutarlı görüntülem...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
2,2,2-Tribromoetanol (Avertin)	Sigma-Aldrich	T48402	DİKKAT: Toksik/zararlı kimyasal. Kranial pencere cerrahisi için Avertin anestezi çözeltisi hazırlamada kullanılır. Tipik çalışma çözeltisi: %1,25 (12,5 mg/mL), intraperitoneal yoldan 200–250 mg/kg uygulanır.
2-Metil-2-bütanol	Sigma-Aldrich	152463	DİKKAT: Toksik/zararlı kimyasal. Konsantre Avertin stoka çözeltisi hazırlanmasında kullanılan solvent. Işıktan koruyun ve çökeltme veya renk değişimi gösteren preparatları atın.
Absorban çubuklar	Winner Medical	Steril tıbbi pamuklu çubuklar	Hemostaz, kafatası kurutma, irrigasyon ve cerrahi alan bakımı için kullanılır.
AAV-X1.1-Cdh5-sitoplazmik NAD+ biyosensör-SV40 pA	Shanghai GeneChem Co., Ltd.; plazmitler için Addgene kaynakları	GeneChem yapısı GCPV5052075; Addgene #186787; Addgene #196836	AAV-X1.1'de paketlenmiş endotel-hedefli NAD+ biyosensör. Ekspresyon kaset: Cdh5 promotörü–sitoplazmik NAD+ biyosensörü–SV40 poli(A). Temsili enjeksiyon dozu: 2 × 10¹² vg/fare. Alikotları −80 °C'de saklayın ve tekrarlanan dondurma-çözme döngülerinden kaçının. Parti özgü qPCR titresini, parti numarasını, plazmit haritasını, dizi doğruluğunu ve analiz sertifikasını kaydedin.
Ağrı kesici madde (buprenofin hidroklorür)	MCE	HY-B0071	Perioperatif ve postoperatif analjezi. Temsili doz: 8–12 saatte bir 24–48 saat boyunca subkutan 0,05–0,1 mg/kg.
Anestezi uygulama sistemi	RWD Life Science	R500 ve R580 buharlaştırıcı	Görüntüleme sırasında izofluran uygulamasında kullanılır. Tipik oksijen akışı: 0,5–1,0 L/dak.
Anestezik ajan (izofluran)	RWD Life Science	R510-22 serisi	Görüntüleme anestezisinde kullanılır. Tipik ayarlar: %3–%4 indüksiyon ve %1–%2 sürdürme.
Kapaç	Özel yapım	Katalog numarası yok	Kafatasının kenarından çıkıntı yapmadan tamamen kaplayan ve 3 × 3 mm krainal pencereyi örten steril No. 1,5 cam kapaç.
Diş çimentosu/yapıştırıcı	Sun Medical	Super-Bond C&B; VZB/JAP8147	Kraniaal pencere sızdırmazlığı ve titanyum başlık sabitlemesi için kullanılır. Temsili hazırlık: 1 ölçü toz, 1 damla katalizör ve 4 damla monomer. Oda sıcaklığında yaklaşık 5–10 dakika sertleştirin.
Diş matkabı	RWD Life Science	78001 mikromatkap	Kafatası inceltme ve kraniyostomi için yüksek hızlı matkap. Maksimum hızın yaklaşık yarısını kullanın ve sıkça salin soğutma yapın.
Dezenfektan solüsyon	Winner Medical	Povidon-iyot/iyodofor ve %70 etanol	Cerrahinin öncesinde saç derisi hazırlanmasında kullanılır. Üç döngü boyunca alternatif dezenfektanları uygulayın.
İnce forseps	JZ Marka	JD1050/JD1070	Periostun çıkarılması, doku manipülasyonu ve kemik kapak kaldırma için kullanılır.
Gavaj iğnesi	RWD Life Science	20G, 38 mm, bilye uçlu	Oral NMN uygulamasında kullanılır.
Başlık	Özel yapım	Katalog numarası yok	Görüntüleme tutucusuna uyumlu yaklaşık 10 mm merkezi açıklığa sahip titanyum başlık.
Isıtma pedi/homeotermik kontrolör	RWD Life Science	69020 ve 69023 ped	Cerrahinin ve görüntülemenin yapıldığı süre boyunca vücut sıcaklığını yaklaşık olarak 36,5–37,5 °C'de tutmak için kullanılır.
Görüntü alım yazılımı	Nikon	NIS-Elements AR/AR Analysis v5.42.06	Mikroskop kontrolü ve görüntü alımı için kullanılır. Temsili ayarlar arasında 512 × 512 veya 1024 × 1024 piksel, 1–3 µm z-adımı ve 1 s zaman aşımı aralığı bulunur.
Görüntü analiz yazılımı	NIH	Fiji/ImageJ v1.8.0 veya daha yeni	Hareket düzeltme, ROI seçimi, arka plan çıkarma, yoğunluk çıkarma ve CSV dışa aktarma için kullanılır.
Intravenöz enjeksiyon malzemeleri	BD	329461	AAV, TMR–dekstran ve NMN enjeksiyonları için 29G iğneli 1 mL steril insülin şırıngası.
NMN (nikotinamid mononükleotid)	Selleck Chemicals	S5259	İçme suyu, oral gavage ve intravenöz uygulama deneylerinde kullanılan NAD+ öncüsü.
Oftalmik merhem	Yerel sertifikalı eczane	Uygulanmaz	Anestezi sırasında kornea kurumasını önlemek için kullanılır.
Fosfat tamponlu salin (PBS)	Servicebio	G4202-100ML veya G4202-500ML	Viral seyreltme, izleyici hazır