MCID stratejisi ve DNA belirteçleri kullanılarak 61 yağlı çay (Camellia oleifera abel) çeşitleri için etkili tanımlama teknikleri

Özet

Bu çalışma, Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) bantlama desenlerinden türetilen manuel bir kültü tanımlama diyagramı (MCID) kullanarak germplazma kaynaklarının kullanımı ve yağlı çay çeşitlerinin tanımlanması için 61 Camellia oleifera Abel çeşidini verimli ve tekrarlanabilir şekilde tanımlamıştır.

Özet

Camellia oleifera Abel [Yağlı çay (Ot)] germ plazma materyalleri ve çeşitlerini belirlemek çok önemlidir; bu nedenle germ plazma kaynaklarını değerlendirmek ve Ot çeşitlerini koruma mekanizmalarını değerlendirmek için gereklidir. Bu çalışma, RAPD primer uzunluğunu artırarak optimize edilmiş bir RAPD tekniği kullandı ve çeşitli bölgelerden 61 Ot çeşidi tespit etti. Ayrıca, kültü tanımlaması için verimli RAPD işaretleyicileri tasarlamak amacıyla bir MCID geliştirildi. 80 RAPD rastgele 11-nt primerinden, 61 çeşitin PCR analizi için şeffaf polimorfik bantlar (PB) üreten 10 primer seçildi. Ayrıca, MCID stratejisi, DNA parmak izlerinde gözlemlenen PB'lere dayanarak 61 çeşidi 10 primerden manuel olarak ayırt etmek için kullanıldı ve bu da Ot kültü tanımlama diyagramını (Ot-CID) oluşturdu. Bu OT-CID, her bir çevrimi ayrı ayrı gösterdi; kültü tanımlaması için PB'ler kullanıldı ve uygun primerler Ot-CID'ye doğru şekilde yerleştirildi. MCID stratejisi, DNA belirteçleri kullanılarak bitki tanımlaması için basit ve pratik bir yaklaşım sunar. Ayrıca, bu yaklaşım kültü tanımlama için pratik ve etkili bir yöntem sağlar. Ortaya çıkan 61 Ot çeşitlerinin Ot-CID'si, RAPD işaretleyicileri kullanarak Ot varyantlarını etkili bir şekilde ayırt etti ve böylece fidanlık endüstrisinde çeşit hakkı koruması ve erken fide tanımı için kültü farklılaştırmasını kolaylaştırdı.

Giriş

Camellia oleifera Abel [Yağlı çay (Ot)] dünyadaki en önemli odunsu yenilebilir yağlı yağ ağacı^{türlerinden biridir 1}. Çin, Ot'un köken ve çeşitlilik merkezi olarak kabul edilir ve bol miktarda germ kaynağı^{vardır 2}. Ot geleneği, vejetatif çoğaltma ve çeşitli küresel yetiştirme programları, çok sayıda çalın ortaya çıkmasına yol^{açmıştır 3}. Ot kültürünün küresel olarak yaygın olarak yetiştirilmesi, eşanlamlı (aynı isimli farklı kültivarlar) ve eşanlamlı (birden fazla isimli kültivarlar) çeşitlerin ortaya çıkmasına yol ^{açmıştır4}. Bu nedenle, geniş bir Ot germ plazması yelpazesini yönetmek ve çeşitli çeşitleri doğru şekilde ayırt etmek için teknikler geliştirmek^{çok önemlidir 3,5}.

DNA tabanlı moleküler belirteçlerin kültivar karakterizasyonu, genetik araştırma ve Ot tanımlamasında uygulanmasına rağmen, bu da genetik çeşitliliği aydınlatabilir ve bitki bireylerini ayırt edebilir, ancak hiçbir çalışma önemli sayıda Ot kültü başarılı bir şekilde tanımlamamış veya kültivar farklılaşması için güvenilir bir temel^{sağlamamıştır} 6,7,8,9 . Güvenilir yöntemlerin eksikliği, bitki ürünü tanımlamasında DNA belirteçlerinin uygulanmasının temel kısıtlamasıdır. Bunun nedeni, DNA parmak izleri için kullanılan analitik tekniklerin, tanımlama gerektiren çeşitleri ayırt etmek için primerleri ve polimorfik işaretleyicileri açıkça belirten ilgili bilgileri sağlayamaması olabilir. DNA bantlama desenleri için analitik teknikler (küme analizleri olarak adlandırılır), çeşitleri veya türleri etkili şekilde ayırt etmek için uygun değildir.

SNP^{belirteçleri} 2,3,10,11 kullanılarak 200'den fazla Ot çeşidi için DNA moleküler kimlik kartları (ID'ler) geliştirilmiş olsa da, hâlâ birkaç zorluk vardır: (1) Ot genomu karmaşıktır; yetiştirilen kamelyaların çoğu heksaploiddir; DNA moleküler kimliklerinin oluşturulmasında kullanılan referans genom ise triploiddir; bu da bazı yanlışlıklara yol açabilir 3 . (2) Tüm genom dizileme, özellikle sınırlı tesislere sahip laboratuvarlar için pahalıdır ve büyük ölçekli çeşit analizinde yaygın uygulanmasını engeller. Ayrıca, PCR amplifikasyon ürünleri dizileme veya floresan tespitini gerektirir ve bu da süreci^{daha da karmaşıklaştırır.} (3) Yeni çeşitler için ayırt edici işaretleyiciler olmadığından, mevcut tipler için kimlik kartı kodlarının yeniden kodlanmasını da gerektiren yeni işaretleyici primerleri geliştirilmesi gereklidir. Bu durum, çok sayıda kod pozisyonuna yol açar ve çeşitlilik farklılaştırmasının etkinliğini azaltır. Bu nedenle, fidanlık sektörü, tarım işletmeleri, bitki patent koruması ve genetik kaynakların korunması ile değerlendirilmesi için Ot çeşitlerinin kolay, güvenilir, referans verilebilir ve pratik doğrulanmasını sağlayan tekniklerin kullanılması^şarttır.

Geleneksel kültivar tanımlama stratejileri morfolojik, fizyolojik ve tarımsal özelliklere dayanırken, bu özelliklerin sınırları vardır; çünkü çevresel etkilere duyarlıdırlar ve tam gelişmiş bitkilerin kapsamlı bir değerlendirmesini^{gerektirirler 13,14}. Ayrıca, moleküler belirteçlerin çevresel değişkenlerden etkilenmemesi gibi belirgin bir avantaja sahiptir; bu da çeşitlerin doğru karakterizasyonu^{için etkili bir araç olarak hizmet eder 14,15}. Son zamanlarda, parmak izi, genetik çeşitlilik, çeşitlilik ve saflık değerlendirmeleri için çeşitli DNA tabanlı^{indeksler oluşturulmuştur: 16,17,18,19,20,21,22}. RAPD belirteci, basitliği, verimliliği ve önceki dizi verilerinin gereksizliği nedeniyle kültü analizinde^{avantajlıdır 23,24}. RAPD yaklaşımı, bitki parmak izi kullanımı için 11-nükleotid (nt) primerleri ve belirtilen PCR tavlama sıcaklığı ile seçilerek geliştirilebilir; böylece RAPD, bitki çeşidi tanımlaması ve genetik çeşitlilik değerlendirmesi için tercih edilen bir yöntem olarak^{belirlenir 25,26}. Bu belirteçler, kayısı²⁷, süs^{şeftali 28}, nar²⁹, toprak ırtıkları²⁰ ve ceviz³⁰ gibi çeşitli bitki türlerinin ürün farklılaşması ve genetik korelasyon çalışmalarında yaygın olarak kullanılmıştır (Çilesiz ve ark., 2025). Yaygın kullanımlarına rağmen, birçok DNA işaretleyici tabanlı yaklaşım rutin bitki çeşidi tanımlaması için yeterince pratik veya sade değildir.

Bu nedenle, bu çalışma çeşitli Ot çeşitlerinin tekrarlanabilir tanımlanması için yeni bir analitik teknik kullanmıştır. RAPD bantlama desenlerinden türetilen MCID, germplazma kaynaklarının kullanımı ve kültü tanımlaması için 61 OT çeşidini ayırt etti.

Burada açıklanan RAPD-MCID stratejisi (Şekil 1), standart PCR ve jel elektroforez altyapısına sahip laboratuvarlarda küçük ve orta ölçekli germplazma karakterizasyonu için en uygun, ancak dizileme tesislerine sınırlı erişime sahiptir. Ayrıca, daha ayrıntılı genetik analizden önce hızlı ve maliyet etkin ön tarama için de uygundur. Yöntemin birincil operasyonel sınırları arasında, baskın belirteçlere olan bağımlılığı ve laboratuvarlar arasında tekrarlanabilirliği sağlamak için PCR koşullarının dikkatli standartlaştırılması gerekliliği yer alır. Büyük ölçekli germplazma bankaları veya yasal çeşit kaydı için, SSR'ler veya SNP'ler gibi ko-dominant belirteçlerin tamamlayıcı kullanımı önerilir.

Protokol

1. Bitki Materyali

1. Her yağlı çay çeşidinin sağlıklı, aktif olarak büyüyen sürgünlerinden genç yaprakları Anhui Eyaleti, Shucheng İlçesi'ndeki Ulusal Kamelia Germ Plazma Deposu'ndan toplayın.
2. Bu çeşitlerin isimleri ve kökenleri için Tablo 1'e bakınız.

2. Genomik DNA çıkarımı

1. Üreticinin talimatlarına göre bitki DNA'sı çıkarma kiti kullanarak toplam genomik DNA çıkartın.
2. DNA 1× TE tamponu ile elüasyon edildi. Elusyondan sonra, çıkarılan DNA çözeltinin berrak ve renksiz göründüğünü doğrulayın. DNA konsantrasyonunu mikrohacimli spektrofotometre kullanarak ölçün.
3. DNA konsantrasyonunu 1× TE tampon ile 30 ng·^μL-1'e ayarlayın ve ayarlanmış DNA çözeltisini -20 °C'de saklayın.

3. RAPD primer seçimi

1. RAPD analizi için 80 rastgele başlangıç geliştirin ve birkaç genotip kullanarak analiz edin. Test edilen tüm genotiplerde net ve kesin bantlama desenleri üreten 11-nt RAPD primerleri seçin.
2. Seçilen primerleri genotipleme için kullanarak amplifikasyonlu parçaların güvenilirliğini artırın. Daha fazla analiz için tekrarlanabilir bantlara sahip 10 iyi çözümlenmiş primer seçin; Tablo 2'de listelendiği gibi.

4. Rastgele Amplifikasyonlu Polimorfik DNA (RAPD) PCR

1. Amplifikasyon reaksiyonlarını, daha önce tarif edilen^{yöntemi hafifçe değiştirerek hazırlayın 23}. Reaksiyon çözeltilerini, Tablo S1'de listelenen bileşime göre hazırlayın.
2. Termal döngücü kullanarak PCR işlemi şu koşullarda yapılmaktadır: 94 °C'de 5 dakika boyunca önceden denatürasyon; 94 °C'de 30 saniye boyunca 42 denatürasyon döngüsü, Tablo 2'de belirtilen optimize sıcaklıkta 1 dakika tavlama ve 2 dakika boyunca 72 °C'de uzatma; ve 72 °C'de 10 dakika boyunca son uzatma yapıldı.

5. PCR ürünlerinin tespiti ve analizi

1. Amplifikasyon DNA parçalarını, pH 8.0'da 0.001 M EDTA ve 0.04 M Tris-asetat içeren 1×.3 %'lik agarozda (w/v) 100 V'da jel elektroforezi ile ayırın. Jelleri 0.5 μg·^μL-1 etidiyum bromid ile boyayın.
   DIKKAT: Ethidium bromid güçlü bir mutajendir. Etidyum bromid çözeltileri veya lekelenmiş jellerle çalışırken uygun kişisel koruyucu ekipman giyin.
2. Jeli 100 V sabit voltajda 45–60 dakika boyunca veya bromofenol mavi boya ön kısmı jel uzunluğunun yaklaşık üçte ikisini hareket ettirene kadar çalıştırın. Boyama ve detenasyon yaptıktan sonra, jelin UV transilluminasyonu altında gözlemleyin.
   NOT: UV transilluminasyonu altında belirgin DNA bantlarının net şekilde görüldüğünü doğrulayın. DNA merdiveninde 100 bp-2.000 bp arasında keskin, iyi ayrılmış bantlar bulunduğundan emin olun.
3. Çeşitlerin polimorfik bantlarını (PB) ultraviyole ışık altında varlıkları veya yokluklarına göre kaydedin.
4. Tekrarlanabilirliği sağlamak için her PCR amplifikasyonunu üç kez gerçekleştirin. Sadece üç bağımsız replikada tutarlı olarak var olan veya olmayan bantları puanlayın, böylece sonraki analiz için puanlayın. Replikalar arasında bant puanlama oranının %95'i aştığını doğrulayın.

6. Veri analizi

1. Çeşitlerin tanımlanması için bantları, varlıkları veya yokluklarına göre puanlayın; "+ o" açıkça görünür bantlara ve "−" ile ilgili moleküler boyut konumunda bulunan bantlara "−" atayın. Yalnızca üç bağımsız kopya arasında tutarlı şekilde gözlemlenen bantları dahil edin.
2. Tek bir primer ile üretilen parmak izinde belirgin bantlara sahip çeşitleri bağımsız olarak sınıflandırın. Aynı bantlama desenlerine sahip çeşitleri aynı alt gruba ayırın. Tüm yağlı çay çeşitlerini bu parametrelere göre aşamalı ve tamamen ayırt edin.

7. Diyagramın kültü tanımlamasında uygulaması ve verimliliği

1. 61 yağlı çay çeşidini gösteren diyagramın uygulanabilirliğini ve işlevselliğini doğrulamak için, gruplar içi ve gruplar arasındaki iki yağlı çay çeşidi rastgele seçilir. Seçimi Ot-CID diyagramının farklı dallarına başvurarak manuel olarak gerçekleştirin, hiçbir yazılım kullanmadan.
   NOT: 61 Ot çeşidini gösteren diyagramın uygulanabilirliği ve işlevselliği doğrulanmak için 2 OT kült grubu rastgele seçildi.
2. Seçilen iki grubu "A" ve "B" olarak adlandırın. Her grup için ilgili primerleri Ot-CID'den tara.

8. Tehlikeli atık bertaraf rehberliği

1. Tüm etidiyum bromid çözeltilerini belirlenmiş bir alanda hazırlayın ve işleyin. Tüm etidiyum bromid ile kirlenmiş katı atık ve sıvı atıkları kurumsal tehlikeli atık yönergelerine uygun olarak ayrı-ayrı toplayarak bertaraf edilmesini sağlar.
2. Tüm etidiyum bromid ile kirlenmiş maddeleri belirlenmiş tehlikeli atık konteynerlerine atıyor. Emin değilseniz, onaylanmış bertaraf prosedürleri için kurumsal çevre sağlığı ve güvenliği ofisiyle iletişime geçin.

Sonuçlar

Burada sunulan Temsilci Sonuçlar, RAPD-MCID stratejisinin tüm iş akışını gösterir; ilk primer taramasından hiyerarşik külçe ayrımcılığına ve nihai doğrulamaya kadar. Adım adım ayırt etme süreci, Şekil 2, Şekil 3, Şekil 4, Şekil 5, Şekil 6'da belgelenmiştir;...

Tartışma

DNA belirteçleri, bitki çeşitlerini ve^{türlerini tanımlamak için kullanılan güçlü araçlardır 24}. Bu belirteçler, genetik analiz, kültivar tanımlama vb. üzerine binlerce çalışmada geliştirilmiş ve kullanılmıştır; ancak genotiplemede ne kolay ne de^{yaygın olarak kullanılmamaktadır 24,31}. Bunun nedeni, kültü tanımlama, filogenetik ağaçlar veya parmak izleri için DNA belirteçlerini kullanan verimli ve k...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Santrifüj	Eppendorf,Almanya	5427R	Yağ çayı yapraklarından genomik DNA ekstraksiyonu için kullanılır
Hi-DNAsecure Plant Kit	Tiangen, Çin	DP350	Yağ çayı yapraklarından genomik DNA ekstraksiyonu için kullanılır
PCR gen amplifikasyon cihazı	Monad, Çin	MP60901	PCR amplifikasyonu için kullanılır
SolarRed Agarose LE	Solarbio, Çin	A8202	PCR fragman elektrofezi için kullanılır
TAE	Tsingke, Çin	TSG001	PCR fragman elektrofezi için kullanılır
TaKaRa Ex Taq	Takara, Japonya	RR001A	PCR amplifikasyonu için kullanılır
Thermo Scientific NanoDrop 2000C spektrofotometre	ABI,ABD		RNA konsantrasyonunu belirlemek için kullanılır