Dodoplanin-pozitif mezenkimal kök hücre alt popülasyonlarının dolaylı manyetik boncuk stratejisi kullanılarak izolasyonu ve doğrulanması

Özet

Bu protokol, fikoeritrin (PE) etiketli akış sitometrisi antikorları ve anti-PE mikroboncukları kullanarak yüksek postsort hedef-belirteç pozitifliğine sahip spesifik mezenkimal kök hücre alt popülasyonlarını izole etmek için manyetik boncuk tabanlı bir sıralama yöntemini tanımlar; test edilen koşullarda CCK-8 tabanlı proliferasyon/metabolik aktivite gerektiren bu yöntem pahalı hücre sorgulayıcıları veya hedefe özgü özel boncuklar gerektirmeden izole eder.

Özet

Mezenkimal kök hücrelerde fonksiyonel heterojenliğin incelenmesi, belirli alt popülasyonların (örneğin, podoplanin (PDPN)-pozitif hücreler) verimli izolasyonuna dayanır. Ancak, çoğu membran protein hedefi için, doğrudan erişilebilir ticari manyetik boncuklar sınırlıdır. Bunu çözmek için, laboratuvarımız "phycoerythrin (PE) etiketli akış sitometrisi antikorları/anti-PE manyetik boncukları" dolaylı bağlantı prensibine dayanan standartlaştırılmış manyetik boncuk ayırma protokolü oluşturmuş ve test etmiştir. PDPN-pozitif hücreleri model hedef popülasyon olarak kullanarak, bu protokol pahalı akış sitometrik hücre ayırıcılarına ihtiyaç duymadan hedef hücre fraksiyonunu zenginleştirir.

Araştırmacılar, erişilebilir hücre yüzeyi proteinlerini hedefleyen uyumlu PE etiketli akış sitometri antikorları kullanabilir ve bunları ticari olarak mevcut anti-PE mikroboncuklarıyla birleştirerek hedefe özgü optimizasyondan sonra seçilen hedefler için bir sıralama akışı oluşturabilirler. Bu yaklaşım, her yeni hedef için hedefe özgü manyetik boncukların özelleştirilmesi veya sipariş edilmesinin uzun teslim sürelerini ve yüksek maliyetleri önler; bu da özellikle nadir veya az incelenmiş erişilebilir yüzey işaretleyicileri için uygun olur. Burada test edilen PDPN model sisteminde, protokol hedef alt popülasyonun yüksek post-sıralama PDPN pozitifliğiyle zenginleşmesini ve CCK-8 tabanlı proliferasyon/metabolik aktivitenin korunmasını sağladı, sıralanmamış MSC'lere kıyasla.

Giriş

Ortopedi alanında, menisküsün avasküler bölgesindeki (beyaz bölge) kıkırdak hasarı ve lezyonlar gibi yaralanmalar genellikle geri dönüşü olmayan eklem hasarı ve işlev kaybına yol açar ve nihayetinde osteoartritlere yol açar. Bu büyük ölçüde bu dokuların zayıf rejeneratif kapasitesine bağlanır; bu durum, doğrudan kan ve lenfatik tedarikin eksikliğinden ve sınırlı proliferasyon ve göç kapasitesine sahip yüksek farklılaşmış hücrelerin^{varlığından kaynaklanmaktadır} 1,2,3,4. Bu zorluğu ele almak için,^{ekzosomlar 5,6}, otolog veya allogen kondrosit^{nakli 7,8} ve doku mühendisliği^{yaklaşımları} 9,10,11,12 gibi çeşitli klinik stratejiler araştırılmıştır. Son yıllarda, mezenkimal kök hücreler (MSC'ler), çoklu hatlı farklılaşma potansiyeli ve immünomodülatör özellikleri sayesinde rejeneratif onarım için umut vadeden bir hücre kaynağı olarak ortaya çıkmış ve kıkırdak yenilenmesi^{için yeni umut sunmaktadır} 13,14,15,16.

Terapötik potansiyellerine rağmen, MSC'ler önemli bir heterojenlik sergiler. Kemik iliği veya göbek kordonu gibi tek bir doku kaynağı içinde bile, MSC'lerin farklı alt popülasyonları proliferasyon kapasitesi, çoklu soy farklılaşma potansiyeli (özellikle kondrojenik farklılaşma) ve in vivo rejeneratif fonksiyonda önemli değişkenlik^{gösterebilir.} 17,18,19. Bu nedenle, fonksiyonel olarak tanımlanmış MSC alt popülasyonlarının—örneğin gelişmiş kondrojenik kapasiteye sahip olanların—kesin olarak tanımlanması ve izole edilmesi, biyolojik özelliklerini anlamamızı ilerletmek ve kıkırdak onarımının etkinliğini artırmak için gereklidir. Bu, araştırmamızda kritik bir adımı temsil ediyor.

Araştırmalar ilerledikçe, fonksiyonel olarak farklı MSC alt popülasyonlarının belirteçleri olarak giderek artan sayıda yeni membran proteini tespit edilmiştir. Ancak, bu keşifleri etkili hücre ayırma stratejilerine dönüştürmek teknik olarak hâlâ zordur. Geleneksel floresansla aktiflenen hücre ayırma (FACS) güçlü olmasına rağmen, özel enstrümantasyon ve teknik uzmanlık gerektirir, bu da birçok laboratuvarda erişilebilirliğini sınırlar. Öte yandan, immünomanyetik hücre ayırma—daha yaygın olsa da—ticari reaktiflerin sınırlı bulunabilirliği nedeniyle kısıtlanır; bu reaktifler öncelikle birkaç iyi köklü zar hedefi için tasarlanmıştır. Sonuç olarak, potansiyel biyolojik öneme sahip birçok yeni keşfedilen işaretleyici için ticari olarak mevcut manyetik boncuklar yoktur ve bu değerli MSC alt popülasyonlarını özel olarak zenginleştirmeyi zorlaştırır.

Bu sınırlamayı aşmak için, mevcut çalışma pozitif hücre seçimi için esnek, maliyet etkin ve verimli bir protokol oluşturmayı ve standartlaştırmayı amaçlamaktadır. Bu yaklaşım, ticari olarak mevcut fikoeritrin (PE) ile konjuge edilmiş antikorların anti-PE immünomanyetik boncuklarla dolaylı konjugasyonuna dayanır. Önceki raporlar, podoplanin pozitif (^PDPN+) MSC'lerin PDPN-muadillerine kıyasla üstün kök koruma ve farklılaşma kapasitesine sahip olduğunu^{göstermiştir 20}. Ayrıca, ^PDPN+ MSC'lerin kıkırdak rejenerasyonu ve osteoartritin (OA) ilerlemesinde rolü, literatürde^{belgelenmiştir 21,22}. Fonksiyonel MSC alt popülasyonlarının yakın zamanda belirlenmiş aday belirteji olan podoplanin (PDPN) kullanılarak model hedefi olarak, kemik iliği kaynaklı MSC'lerden PDPN pozitif hücreleri ayırdık. Tek hücreli süspansiyon hazırlığı, antikor ve manyetik boncuk etiketleme ile manyetik ayrımı kapsayan ayrıntılı adım adım bir protokol sunuyoruz. Ayrıca, sıralanmış hücrelerin verimini, sıralama sonrası PDPN pozitifliğini ve CCK-8 tabanlı proliferasyon/metabolik aktivitesini değerlendiriyoruz. Bu protokolü standartlaştırarak, araştırmacılara erişilebilir hücre yüzeyi belirteçlerine karşı uyumlu antikorlar kullanarak hedef hücre alt popülasyonlarını izole etmek için çok yönlü ve erişilebilir bir yöntem sunmayı hedefliyoruz; böylece temel kök hücre araştırmalarını ve rejeneratif tıpta gelecekteki translasyonel uygulamaları kolaylaştırıyor.

Protokol

İnsan kemik iliği kaynaklı MSC'ler ticari olarak elde edilmiştir ( bkz. Materyaller Tablosu). Tedarikçi, CD73, CD90 ve CD105'in pozitif ifadesiyle MSC kimliğini doğruladı; CD34, CD45 ve HLA-DR'nin negatif ekspresyonu; ve üçlin farklılaşma potansiyeli. Hücreler kültürde genişletilmiş ve 3–5. geçişlerde kullanılmıştır. Tüm insan kaynaklı hücre çalışmaları, steril koşullarda Sınıf II biyolojik güvenlik kabininde gerçekleştirilmiştir. Hücreler ticari olarak edinildiği ve bu protokolde doğrudan insan denek alınmadığı veya örneklenmediği için doğrudan IRB onayı gerekmemiştir.

1. Tek hücreli süspansiyonun hazırlanması

NOT: Tek hücreli süspansiyonun kalitesi, sıralama verimliliğini doğrudan etkiler. Hücrelerin iyi dağılmış, yüksek canlı ve kümesiz olduğundan emin olun. Görünür kümeler, tekrar tekrar nazik pipetleme ile yayılmalıdır ve ta ki kümeler artık görünmez hale gelene kadar.

1. %80–90 birleşimine ulaşmış MSC'leri seçmek (3–5. pasajlar). Kültür ortamını at.
2. Hücreleri 2 × 10 mL önceden ısıtılmış PBS ile yıkayın. Kabı nazikçe sallayın ve PBS'yi atın.
3. 2 mL %0,25 Tripsin-EDTA ekleyin ve 37 °C'de 3–5 dakika kuluçka yapın. Hücreleri mikroskop altında inceleyin, yuvarlanıp ayrılmaya başlayana kadar.
4. Tripsini nötralize etmek için %16,5 FBS içeren 4 mL kültür ortamı ekleyin (bkz. Malzeme Tablosu). Hücreleri nazikçe pipetleyin ve tam ayrılmayı garanti edin. Hücre süspansiyonunu 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın.
   NOT: Tüm hücrelerin toplandığını doğrulamak için mikroskop altında kontrol edin.
5. 300 × g seviyesinde 3 dakika santrifüj yapın ve süpernatantı atın.
6. Hücre pelletini 1 mL Buffer içinde yeniden askıya alın (bkz. Malzemeler Tablosu). Hücre sayımı aşamasına geçin.

2. Hücre sayımı ve konsantrasyon ayarlaması

NOT: Toplam hücre sayısı 1 × 10^7'den küçükse, etiketleme verimliliğini sağlamak için 1 × 10.7 hücre için standart hacme göre antikor ve manyetik reaktifleri ekleyin.

1. Hücre süspansiyonunu 300 × g ile 3 dakika boyunca tekrar santrifüj edin ve üst süspansiyonu atın.
2. Hücreleri Buffer'daki yeniden süzülerek 1 ×^{10 8} hücre/mL yoğunluk elde edilir.
   NOT: Örneğin, 1 ×^{10 7} hücreyi işlemek için, pelleti 100 μL tamponla yeniden askıya alın.
3. Hücre süspansiyonunu 5 mL'lik polistiren yuvarlak tabanlı bir tüpe aktarın.

3. Antikor etiketleme

1. 1 ×^{10 7} hücre başına 10 μL Fc gamma RII Blokörü (Malzeme Tablosu'na bakınız) ekleyin. Nazikçe karıştırın ve oda sıcaklığında 10 dakika kuluçka yapın.
2. Üreticinin önerdiği konsantrasyona uygun olarak, 1 × 107^{hücre başına} 5 μL PE ile konjuge edilmiş insan karşıtı PDPN antikoru (Malzeme Tablosu'na bakınız) ekleyin. Nazikçe karıştırın ve ışıktan korunarak oda sıcaklığında 15–20 dakika kuluçka yapın.
   NOT: Antikor hacmi, kullanılan spesifik akış sitometri antikorunun veri sayfasına göre ayarlanmalıdır, çünkü konsantrasyonlar ürünler arasında değişebilir.

4. Manyetik boncuk etiketleme

NOT: Tüm reaktifleri kullanmadan önce buzda tutun ve her eklemeden sonra hemen buza geri getirerek aktivite ve tutarlılığı koruyun.

1. 1 ×¹⁰⁷ hücreye 10 μL Seçim Kokteyli ekleyin (bkz. Malzeme Tablosu). Nazik karıştırın ve oda sıcaklığında 15 dakika kuluçka yapın.
2. 1 ×¹⁰⁷ hücreye 5 μL manyetik boncuk ekleyin (bkz. Malzeme Tablosu). Nazikçe karıştırın ve oda sıcaklığında 10 dakika kuluçka yapın.
   NOT: Manyetik boncukları şişeleri 30 saniye boyunca güçlü bir şekilde girdabla kullanarak eşit dağılımı sağlamak için.

5. Manyetik ayrım

1. Manyetik ayırma standına etiketlenmiş hücre örneğini içeren 5 mL polistiren yuvarlak tabanlı bir tüp yerleştirin (bkz. Malzemeler Tablosu).
2. Tüpe tampon ekleyerek toplam hacmi 2,5–3 mL'ye düşürür. Oda sıcaklığında 5 dakika kuluçka yapın.
3. Ayırma işlemini yapın: Mıknatıs ve tüpü tek bir ünite olarak tutarak, onları ters çevirerek süpernatantı yeni bir toplama tüpüne dökersiniz. Bu toplanan fraksiyon PDPN-negatif hücreleri içerir; Bu tüpü buzda tutun.
   NOT: Bu aşamada tüpü manyetik standdan çıkarmayın, çünkü bu ayrımı bozur ve işlemin başarısız olmasına neden olur.
4. 5.1–5.3 adımlarını 3 kez tekrarlayın. Her seferinde, mıknatıstaki orijinal tüpe tampon ekleyin, 5 dakika bekleyin ve üst gövdeyi 5.4. adımda kullanılan aynı negatif fraksiyon toplama borusuna dökürün.
5. Son yıkamadan sonra, manyetik olarak bağlı hücreleri içeren tüpü standtan çıkarın. Bu tüp, PDPN-pozitif hücre fraksiyonunu içerir.
6. Pozitif hücreleri yeniden süspansiyona almak için 3 mL tampon ekleyin. Bu süspansiyonu taze, etiketli bir tüpe (pozitif fraksiyon tüpü) aktarın.

6. Hedef hücrelerin toplanması, kültürü ve doğrulanması

1. Hem pozitif hem de negatif fraksiyon tüplerinden hücreleri say. Her fraksiyon için hücre verimini kaydedin.
2. Pozitif fraksiyon hücre süspansiyonunu 300 × g ile 3 dakika boyunca santrifüjleyin. Üst yüzeyi at.
3. Hücre pelletini %16,5 FBS içeren MEM Alfa kültür ortamında yeniden süzülür. Hücre yoğunluğunu gerektiğinde ayarlayın ve hücreleri kültür plakalarına veya şişelere tohumlayın.
4. Hücreleri %5 CO₂ içeren bir kuluçka makinesinde 37 °C'de kuluçka yapın.

7. Saflık ve işlevsel doğrulama için örnek hazırlığı

1. Hücreleri sayın ve 12 mL kültür ortamında her tabak başına 3 ×^10-6 hücre yoğunluğunda 100 mm kültür kabına tohumlayın. Tohumlamadan yirmi dört saat sonra hücre tutumunu gözlemleyin. Kültür ortamını, kalıntı manyetik boncukları ve yapışmayan hücreleri çıkarmak için taze ortamla değiştirin.
2. Hücreleri tripsizasyon yoluyla hasat edin. Manyetik boncukları ve kalıntı antikorları yerinden çıkarmak için 10–15 kez yukarı ve aşağı nazikçe pipet yapın.
3. PDPN-PE-pozitif hücrelerin yüzdesini akış sitometrisine göre değerlendirin (ayrıntılı protokol için Ek Dosya 1'e bakınız).
4. Logaritmik büyüme aşamasında hücreleri toplayın. Onları 96 kuyuyla bir tabağa tohumlayın. Farklı zaman noktalarında (0 saat, 24 saat, 48 saat, 72 saat) CCK-8 reaktüsü eklenin ( Malzeme Tablosu'na bakınız) ve üreticinin talimatlarına göre soğurucu ölçün. Verilere dayalı bir yayılma eğrisi çizin.

Sonuçlar

Deneyin genel prensibi ve iş akışı Şekil 1'de gösterilmiştir. Tüm sonraki deneysel veriler 5. geçiş hücrelerine dayanmaktadır. Manyetik ayrımdan sonra, elde edilen PDPN⁺ hücreleri 24–48 saat boyunca kültürlendi. Yapışmayan hücreleri ve potansiyel kalıntı manyetik boncukları çıkarmak için kültür ortamı değiştirildikten sonra (Şekil 2A), ayırma verimliliği ve hücre verimini değerlendirdik. Başlangıçta 1...

Tartışma

Bu çalışmada, kemik iliğinden türetilen MSC'lerden PDPN+ hücrelerini izole etmek için manyetik boncuk tabanlı bir protokol oluşturduk. Bu yaklaşım, test edilen koşullarda CCK-8 tabanlı proliferasyon/metabolik aktiviteyi korurken PDPN pozitif alt popülasyonun verimli zenginleşmesini sağlar.

Geleneksel doğrudan immünomanyetik ayırma yöntemleriyle karşılaştırıldığında, bu stratejinin en önemli avantajı çok yönlülüğündedir. Geleneksel yaklaşımlar, ilgi çekici her ...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
7-AAD Hücre Canlılık Test Kiti	KeyGEN	KGD1202-50
Anti-insan CD32 Engelleyici (Fc gamma RII Engelleyici)	STEMCELL Technologies	18520
Tampon	STEMCELL Technologies	20104	Tampon
CCK-8	Meilunbio	MA0218-5
Dekstran Manyetik Parçacıklar	STEMCELL Technologies	50100	Manyetik Parçacıklar
Fetal Boğa Serumu	Gibco	16050-122
Mıknatıs	STEMCELL Technologies	18000	manyetik ayırma standı
MEM Alpha Ortamı	Gibco	C12571500BT	MEM Alpha Ortamı (%82,5) + FBS (%16,5) + Penisilin-Streptomisin (%1,0)
MSC'ler	KeyGEN	KGG5575-1	İnsan kemik iliği kökenli mezenkimal kök hücreler
PE-konjuge Anti-İnsan PDPN Antikoru	ABclonal	A26770	PDPN-PE
PE Seçimi Kokteyli	STEMCELL Technologies	18151	Seçim Kokteyli
Penisilin-Streptomisin	Gibco	15140122
Tripsin-EDTA	Gibco	25200-072