Canlı hücre görüntüleme ve akış sitometrisi kullanarak kimerik antijen reseptörleri ve terapötik antikorlarla potantize edilen NK-hücre sitotoksisitesinin nicelendirilmesi

Özet

Bu protokol, canlı hücre görüntüleme ve akış sitometrisi kullanılarak insan doğal katil hücrelerinin doğal, kimerik antijen reseptörü aracılı ve antikor bağımlı sitotoksisitesinin tutarlı ölçümü için standartlaştırılmış bir in vitro iş akışı sağlar.

Özet

Doğal katil (NK) hücreleri, çeşitli hücre içi patojenlere ve kanserlere karşı koruyucu bağışıklıkta kritik rol oynayan doğuştan gelen lenfositlerdir. Birincil işlevleri, enfekte olmuş, kötü huylu dönüşümlü veya antikorlarla kaplanmış hedef hücreleri antikor-bağımlı hücresel sitotoksisite (ADCC) yoluyla öldürmektir. NK hücreleri ayrıca genetik olarak modifiye edilip, belirli antijenlerin hedefli tanınmasını sağlayan kimerik antijen reseptörlerini (CAR) ifade edebilirler. NK-hücre sitotoksisitesinin nicel ölçümü, başlangıç fonksiyonelliğini değerlendirmek ve monoklonal antikorların preklinik değerlendirmesi ile CAR mühendisliği stratejileri için gereklidir. Ancak, in vitro fonksiyonel testler, hücre hazırlığı, hedef hücreler, efektör-hedef oranları, birlikte kuluçka süreleri ve okuma yöntemlerindeki farklılıklar nedeniyle laboratuvarlar arasında oldukça değişken olmaya devam etmektedir; bu da tekrarlanabilirlik ve çapraz çalışma karşılaştırmalarını sınırlamaktadır. Bu makale, akış sitometrisi ve gerçek zamanlı canlı hücre görüntüleme kullanılarak NK-hücre sitotoksisitesinin nicel değerlendirmesi için standartlaştırılmış bir protokol sunmaktadır. Birincil insan NK hücreleri ve CAR eksprese eden NK-92 hücreleri, kanser hücrelerini ve antikor kaplı hedef hücreleri 96 kuyruklu plaka formatında öldürme yetenekleri açısından değerlendirildi; bu hücreler doğal sitotoksisite, CAR aracılı öldürme ve ADCC ölçüldü. Hedef hücre hayatta kalma ya canlı hücre görüntülemesi kullanılarak ya da belirli bir zaman noktasında akış sitometrisiyle ölçüldü; bu da NK hücrelerinin ve hedef hücrelerin fenotipik karakterizasyonunu mümkün kılmıştır. Bu protokoller, rutin doku kültürü, görüntüleme ve akış sitometrisi yöntemleri kullanılarak sağlam bir çerçeve sağlar; böylece doğuştan gelen bağışıklık ve NK hücre temelli immünoterapiler çalışmaları için NK-hücre efektör fonksiyonlarının tekrarlanabilir nicelenmesini mümkün kılar.

Giriş

Doğal katil (NK) hücreler, viral enfekte ve kötü huylu hücrelere karşı bağışıklık gözetiminde merkezi rol oynayan doğuştan gelen lenfositlerdir ve hızlı ve güçlü sitotoksisite^sergiler. B ve T hücrelerinin aksine, NK hücreleri antijen-spesifik reseptörleri ifade etmez ve bunun yerine ana histouyumluluk kompleksi sınıf I ekspresyonunun veya hücresel stresin kaybını tespit etmek için bir dizi aktive edici ve inhibitör reseptörlere dayanır. Bu, perforin ve granzim içeren sitotoksik granüller salarak veya bazı durumlarda ölüm^{reseptörleri} 1,2,3,4 aktive ederek doğrudan sitotoksisiteyi aracılık etmelerini sağlar. Doğal sitotoksisiteye ek olarak, NK hücreleri FcγRIII (CD16) ile ifade edilir; bu reseptör immünoglobulin G'nin (IgG) Fc kısmını tanır ve IgG kaplı hedef hücrelere karşı antikor bağımlı hücresel sitotoksisiteyi (ADCC) aracılık eder ^5,6.

Içsel sitotoksik mekanizmaları ve olumlu güvenlik profili sayesinde, NK hücreleri hücresel immünoterapi için umut vadeden adaylar olarak ortaya çıkmıştır. Allogenik kullanım potansiyeliyle birlikte, NK hücreleri greft-konak hastalığı riski minimumla "rafta" bir tedavi olarak işlev görebilir; bu da daha geniş klinik uygulama sağlar ve maliyetleri azaltır⁷. Son gelişmeler, NK hücrelerinin terapötik potansiyelini, genetik mühendislik stratejileri aracılığıyla daha da genişletmiştir; bunlar arasında NK hücrelerini spesifik tümör antijenlerini tanımaya yönlendiren kimerik antijen reseptörlerinin (CAR) tanıtılması da bulunmaktadır. CAR-NK hücreleri, in vivo xenograft modellerinde ve klinik denemelerde antitümör etkinliği göstermiş, CAR-T hücrelerine kıyasla daha düşük toksisite^{ile 8,9,10}. Bu nedenle, mühendislik amaçlı NK-hücre platformları ve antikor tabanlı terapötik stratejiler geliştirmeye yönelik ilgi artmaktadır. Bu bağlamda, NK-hücre öldürme kapasitesinin doğru ve nicel ölçümü, NK-hücre biyolojisini anlamak, CAR veya diğer mühendislik amaçlı NK-hücre tedavilerinin etkinliğini değerlendirmek ve ADCC'ye dayanan monoklonal antikorların değerlendirilmesi için gereklidir.

NK-hücre sitotoksisitesini değerlendirmek için laboratuvarlarda yaygın olarak kullanılan çeşitli in vitro testlerdir. Yaygın yöntemler arasında radyoaktif krom-51 salınım testleri, laktat dehidrojenaz salınım testleri ve kalsein–asetoksimetil salınım^{testleri 11,12} bulunur. Bu geleneksel yöntemler sitotoksisiteyi ölçmek için yaygın olarak kullanılsa da, hücre ölümünün dolaylı okumalarına dayanır, kinetik veriler yerine son nokta ölçümleri sağlar ve sınırlı hassasiyet ile dinamik aralık sunarlar. Ayrıca efektör hücrelerin fenotipi veya aktivasyon durumu hakkında bilgi sağlamazlar. Son zamanlarda, canlı hücre görüntüleme platformları ve akış sitometrisi, hedef hücre hayatta kalmasının doğrudan nicelendirilmesini, zamanla öldürülmenin izlenmesini ve efektör ile hedef hücrelerin eşzamanlı fenotipik analizini mümkün kıldığı için giderek daha fazla benimsenmiştir^13,14. Ancak, bu yeni yaklaşımlar arasında bile, laboratuvarlar ve yayımlanmış çalışmalar arasında önemli değişkenlik vardır; hedef-hücre hazırlığı, efektör-hedef (E:T) oranları ve birlikte kuluçka sürelerinde farklılıklar, özellikle NK hücre tabanlı immünoterapilerin preklinik değerlendirmelerinde tekrarlanabilirliği ve çapraz karşılaştırmaları sınırlamaktadır.

Bu makale, NK-hücre sitotoksisitesinin nicel değerlendirmesi için iki bağımsız, tamamlayıcı platform kullanılarak standartlaştırılmış bir iş akışını sunmaktadır: gerçek zamanlı, canlı hücre görüntüleme (IncuCyte SX5) ve akış sitometrisi tabanlı son nokta testleri. Canlı hücre görüntüleme, efektör hücrelerle birlikte kültür sırasında hedef hücre hayatta kalma süresinin sürekli izlenmesini sağlar ve çoklu E:T oranları ve deneysel koşullar arasında sitotoksisitenin kinetik olarak değerlendirilmesini mümkün kılar ve minimum analiz manipülasyonu^{ile 15}. Buna karşılık, akış sitometrisi hedef-hücre ölümünün son nokta ölçümü ile birlikte, NK hücreleri ve hedef hücrelerin eşzamanlı fenotipik karakterizasyonu ile çoklu belirteç boyama paneli ile sağlanır.

Ayrıca, bu protokol, tekrarlanabilirliği artırmak ve laboratuvarlar ile çalışmalar arasında sitotoksisite ölçümlerinin karşılaştırılmasını kolaylaştırmak için E:T oranları, kuluçka koşulları, levha formatı ve analitik iş akışları gibi standartlaştırılmış deneysel parametreleri içermektedir. Bu iş akışı, doğal sitotoksisite, CAR aracılı öldürme ve ADCC dahil olmak üzere birden fazla NK efektör fonksiyonunun nicel olarak değerlendirilmesini sağlar ve birincil insan NK hücreleri ile NK hücre hatlarıyla uyumludur. Bu protokol, NK hücre biyolojisi çalışmaları ve NK hücre tabanlı immünoterapi gelişiminin preklinik değerlendirmesi için pratik bir çerçeve sağlar.

Protokol

İnsan donör örneklerinin araştırma için kullanılması Kurumsal İnceleme Kurulu tarafından onaylanmış ve kurumsal yönergelere (Onay #2022P000699) uygun olarak gerçekleştirilmiştir.

1. Gerçek zamanlı canlı hücre görüntüleme öldürme testi

1. Kaplama plakaları
   1. Düz tabanlı 96 kuyu plakada 6 × 10 ızgaraya 50 μL/well poli-D-lisin (fosfatla tamponlanmış tuzlu süzme [PBS]) 0,1 mg/mL ekleyin. Her kuyunun altının tamamen kapalı olduğundan emin olmak için plakayı nazikçe sallayın.
   2. Plakayı kapağı açık şekilde oda sıcaklığında (RT; 18°C–26°C) 2 saat kuluçka edin.
   3. 3× kuyularını 200 μL/well PBS ile yıkayın ve süpernatantı atın.
      NOT: Kaplı plakalar parafilm ile kapatılabilir ve her kuyuya 200 μL PBS eklenerek 1 haftaya kadar 4°C'de saklanabilir. Plakaların steril kaldığından emin olun, PBS'yi atın ve kullanımdan önce RT ile dengelenmesine izin verin.
2. Hedef hücreleri hazırlayın
   1. 10 mL 2× SYTOX Portakal (200 nM) SYTOX Orange (250 μM) çözeltisini NK-92 kültür ortamına seyreltirerek (toplam hacmi 10 mL içine 8 μL stok ekleyin) 15 mL konik tabanlı santrifüj tüpünde hazırlayın.
      NOT: NK-92 hücreleri için kültür ortamı, İleri RPMI-1640 ortam, %10 fetal sığır serumu (FBS), 2 mM L-alanil-L-glutamin, 100 μg/mL primosin ve 500 U/mL insan IL-2'den oluşur.
      DIKKAT: SYTOX Orange floresan bir boyadır ve cilt veya göz maruziyeti üzerinde risk oluşturabilir. Uygun kişisel koruyucu ekipmanla ve kurumsal güvenlik yönergelerine uygun şekilde müdahale edin.
   2. Hedef hücreleri, boya dışlama tabanlı hücre sayma yöntemi (örneğin, trypan blue) veya eşdeğer doğrulanmış bir yöntem (örneğin otomatik hücre sayacı) kullanarak sayın.
      NOT: Bu testte, hedef hücreler Ramos hücreleriydi; bu B-hücre olgunlaşma antijen-ekspresyonu (BCMA⁺) B-hücreli lenfoma hücre hattı ve yakın kızılötesi (NIR) floresan protein emiRFP670'i ifade etmek için mühendislik olarak geliştirdik.
   3. Gerekli miktarı 15 mL'lik konik tabanlı bir santrifüj tüpüne aktarın.
   4. Santrifüj (5 dk, 300 × g, RT, ivme = maksimum; yavaşlama [fren] = maksimum).
   5. Üst yüzeyi at.
   6. Hedef hücreleri 2× SYTOX Orange ortamında 2,5 × 10⁵ hücre/mL (2,5 ×^{10 4} hücre/100 μL) nihai konsantrasyona yeniden askıya alın.
      NOT: Yeniden askıya alınmış hedef hücreler, efektör hücre seyreltmeleri hazırlanırken tüpte %5 CO₂ ile 37°C'de 30 dakikaya kadar tutulabilir.
      NOT: Bir tam plaka için, 60 kuyu 2.5 × ×10⁴ hücre/kuyu = 1.5 × toplam 10⁶ hedef hücre. Kayıpları karşılamak için 2.0 × 10⁶ hücre hazırlayın. Hücre sayılarını analiz boyutuna ve istenen tohumlama yoğunluğuna göre ayarlayın.
3. Efektör hücreleri hazırla
   1. NK-92 hücrelerinin konsantrasyonunu ve canlılığını, boya dışlama tabanlı hücre sayma yöntemi (örneğin, tripan mavisi) veya eşdeğer doğrulanmış bir yöntemle değerlendirin. Sadece uygulanabilirlik %≥80 ise devam edin, çünkü düşük verimlilik test performansını etkileyebilir.
      NOT: Floresan protein ZsGreen'i stabil şekilde ifade etmek için tasarlanmış NK-92 hücreleri, ya tek başına (kontrol) ya da BCMA'ya yönelik CAR yapılarıyla efektör hücreler olarak kullanılmıştır.
   2. Gerekli hücre sayısını 15 mL'lik konik tabanlı santrifüj tüplerine sayın ve aktarın.
      NOT: Bir çoğaltma için tüm E:T oranlarında gereken hücre sayısını toplayarak, çoğaltma sayısıyla çarparak ve hücre kaybını hesaba katlamak için %50 fazla ekleyerek toplam efektör hücre sayısını hesaplayın. Hazırlık için gerekirse yuvarlak sayılar yapıldı. Örneğin, 2:1 ile 0.25:1 arasında değişen E:T oranları için, her çoğaltma başına 1.5 × 10⁵ NK hücresi kullanılır. Üçlü modeller için, Ek Şekil 1A'da tanımlanan plaka düzenine göre her koşul başına 4,5 ×^{10,5 hücre} hazırlanır.
   3. Santrifüj hücreleri (5 dakika, 300 × g, RT, ivmelenme = maksimum; yavaşlama [fren] = maksimum).
   4. Üst yüzeyi at.
   5. Hücreleri 5.0 × 10⁵ hücre/mL (5.0 × 10⁴ hücre/100 μL) konsantrasyona yeniden süzülür.
4. Efektör hücre seyreltmeleri hazırlanır
   1. Efektör hücre sulandırmaları, yalnızca hedef kontrol dahil, yuvarlak tabanlı 96 kuyu plakasında hazırlayın (üçlü olarak dört koşullu temsil plaka düzeni için Ek Şekil 1A'ya bakınız). Her şart üçlü olarak hazırlanır.
   2. 2:1 E:T oranına karşılık gelen kuyulardan 240 μL/efektör hücre (5.0 ×^{10 5} hücre/mL) eklenir.
   3. Kalan tüm kuyulara 120 μL/well ortam ekleyin.
   4. E:T = 2:1 kuyulardan E:T = 0.25:1 kuyular arasında 2 kat seri seyreltme yapılır. ≥5 kez pipetle iyice karıştırın ve transferler arasında uçları değiştirin.
      NOT: Görüntüleme sisteminde görüntüleme çalışmaları planlanmadıysa, ortak kültür kurulmadan önce bunları planlayın. Hazırlanan efektör hücre seyreltmeleri, canlı hücre görüntüleme sistemi kurarken yuvarlak tabanlı 96 kuyu plakada %5 CO₂ ile 37°C'de tutulabilir.
5. Ortak kültür kurma
   1. Poli-D-lizin kaplamalı düz tabanlı 96 kuyu plakasını edinin.
   2. Tüm kuyulara 100 μL/kuyu hedef hücre süspansiyonu ekleyin. Hedef hücreleri dağıtmadan hemen önce, uygun bir pipet (örneğin 200 μL) ile ≥5 kez pipetle yukarı aşağı pipetle iyice yeniden süzülün ve transfer sırasında baloncuk oluşumunun önlenmesi.
   3. İlgili kuyruklara 100 μL/well efektör hücre süspansiyonu eklenir. Efektör hücreleri dağıtmadan hemen önce, uygun bir pipet (örneğin, 200 μL) ile ≥5 kez pipetle yukarı aşağı pipetle iyice yeniden süzülün ve transfer sırasında baloncuk oluşumunun önlenmesin.
   4. Çevredeki kullanılmayan kuyulara 200 μL/well PBS ekleyin.
   5. Plakayı santrifüj edin (2 dakika, 100 × g, RT, ivmelenme = düşük [örneğin, 2]; yavaşlama [fren] = düşük [ör, 2]).
      NOT: Bu yumuşak spin, IncuCyte SX5'te doğru görüntüleme için hücrelerin kuyunun dibinde hızlı ve eşit şekilde yerleşmesi için kritik öneme sahiptir. Hızlanma ve yavaşlama ayarları 9 üzerinden 2'ye ayarlanmış, salınan kovalı rotorla uyumlu tezgah üstü Eppendorf Santrifüj 5810R kullanıyoruz.
   6. Plakayı canlı hücre görüntüleme sistemine yerleştirin ve 24 saat boyunca her 1 saatte bir görüntü alın (gerekirse 72 saate kadar uzatılabilir). Görüntülemenin standart kuluçka koşullarında (37°C/%5 CO₂) yapıldığından emin olun.
      NOT: t = 0 saat seviyesinde görüntülemenin taban hedef hücre sayılarını doğru yansıtmasını sağlamak için, ko-kültür kurulumu ve santrifüjasyondan sonra 10–15 dakika içinde görüntü alımı başlatılır. Üç görüntüleme kanalı (yani yeşil, turuncu ve NIR) olan tam bir plaka için, tarama süresi yaklaşık saatte 10 dakikadır; 20× büyütmede 3 görüntü/kuyu olur.
   7. İlk taramadan sonra görüntü kalitesini doğrulayın ve gerekirse ayarları ayarlayın.
6. Enstrüman ayarları
   1. SYTOX Turuncu'nun yeşil kanala floresan yayılmasını düzeltmek için spektral karıştırmayı ayarlayın. Yazılımda yeşil ve turuncu kanalları karşılaştırarak karışık çıkarma değerini ayarlayın ve ^Turuncu+ ölü hücrelerinin yanlış olarak Yeşil⁺ olarak tespit edilmediğini doğrulayın. Temsilci deney için (Şekil 1), yeşil kanala turuncu kanal katkısı %8,5 olarak ayarlanmıştır. Bu değerler veri setine özgelidir ve her deney için optimize edilmelidir.
   2. Her görüş alanındaki tüm hücrelerin doğru segmentasyonu ve maskelenmesini sağlamak için yapışmayan Hücre Hücre analizini yapılandırın (temsil kurulumu için Ek Şekil 1B'ye bakınız). Süspansiyon efektörü ve hedef hücre hattı modelleri kullanılarak canlı hücre görüntüleme sistemi için aşağıdaki parametreler önerilir:
      1. Beklenen nesne çapını 15 μm (yaklaşık hücre çapı) olarak ayarlayın.
      2. Eşik ve doku hassasiyetini 5'e ayarlayın.
      3. Hücre kümelerinin ayrılmasını kolaylaştırmak için kenar hassasiyetini 10'a ayarlayın.
      4. Kabul edilen nesne alan alanı aralığını, enkaz ve büyük nesneleri hariç tutmak için 50–2000^{μm 2} olarak ayarlayın.
      5. Hücresel olmayan nesneleri hariç tutmak için eksantriklik maksimumunu 0.95'e ayarlayın.
   3. Sınıflandırma eşiklerini yapılandırın (temsil kapı belirleme için Ek Şekil 1C'ye bakınız). Temel ^NIR+/Orange⁻ canlı hedef hücre popülasyonunu tanımlamak için sadece hedefe yönelik kontrol kuyrukları kullanın. Daha sonra, daha sonraki zaman noktalarında ( örneğin, t = 4 saat) ortak kültür kuyuları kullanılarak ^NIR+/⁻ ve Turuncu⁺/⁻ popülasyonları arasında minimum örtüşme ile net ayrım doğrulanacaktır. Örnek sınıflandırma eşikleri ve analiz parametreleri Ek Şekil 1C'de gösterilmiştir.
      1. Turuncu yoğunluk eşiğini yaklaşık 15'e ayarlayın.
      2. NIR yoğunluk eşiğini yaklaşık 0.1 olarak ayarlayın.
         NOT: Parametre ve eşik değerleri, cihaza, yazılıma, hücre hattı modeline ve floresan sinyal yoğunluğuna bağlı olarak değişebilir.
         NOT: Bu protokol, hedef hücreler NIR floresansını istikrarlı şekilde ifade ederse (örneğin, emiRFP670) birincil insan NK-hücre sitotoksisitesi veya ADCC testleri için uyarlanabilir. Ayrıca, poli-D-lizin kaplaması çıkarılarak ve düz tabanlı veya yuvarlak tabanlı 96 kuyu plakaları kullanılarak akış sitometrisine dayalı öldürme testleri için de uyarlanabilir.

Şekil 1. Gerçek zamanlı canlı hücre görüntülemesi kullanılarak kimerik antijen reseptörü (CAR) NK-92 hücre aracılı sitotoksisitesinin kinetik ve potensiyesinin niceliklendirilmesi. (A) NK-hücre aracılı sitotoksisitenin izlenmesi için IncuCyte canlı hücre görüntüleme testinin şematik genel görünümü. ^BCMA+ Ramos hedef hücreleri, emiRFP670 (yakın kızılötesi [NIR] kanalı) ifade eden NK-92 efektör hücreleriyle birlikte kültürlenir ve hücre ölümü SYTOX Orange (turuncu kanal) kullanılarak tespit edilir. (B) 12 saat içinde efektör-hedef (E:T) oranında bir ortak kültür kuyusunun temsili floresans görüntüsü. Canlı hedef hücreler (emiRFP670⁺) mavi, NK-92 efektör hücreleri (ZsGreen⁺) yeşil ve ölü hücreler (SYTOX Orange⁺) kırmızı renkte gösterilmiştir. Görüntüler, yapışmayan Hücre Hücre Analiz modülü kullanılarak 20× büyütmede alındı. Ölçek çubuğu = 100 μm. (C) Kontrol ve CAR eksprese eden NK-92 hücreleri için farklı E:T oranlarında hedef hücre büyüme ve hayatta kalma süresinin nicelendirilmesi. (D) Hedef hücre hayatta kalma oranının birden fazla zaman noktasında (4, 8, 16 ve 24 saat) E:T oranının bir fonksiyonu olarak nicelendirilmesi. Hedef hücre sayıları, her zaman noktasında sadece hedef kuyruklarına (E:T = 0:1) normalleştirildi. (E) Sitotoksisiteyi değerlendirmek için kullanılan nicel metriklerin şematik temsili: KR₅₀, 12 saatte %50 öldürme sağlamak için gereken öldürücü-hedef oranı; KT₅₀, %50 öldürme için gereken süre, E:T oranı 1:1; ve IKI₅₀, %50 hayatta kalma izoklininin altında olan ısı haritası alanı olarak tanımlanan entegre katil indeksi. (F) Her efektör koşulunun E:T oranı ve zamanına bağlı olarak hedef hücre büyüme ve hayatta kalmasını gösteren ısı haritaları. Her koşul için KR₅₀, KT₅₀ ve IKI₅₀ için nicel değerler belirtilmiştir. IncuCyte 2021C yazılımında Hücre Hücre Hücre Sınıflandırma analizi kullanılarak kapalı NIR⁺/SYTOX Orange^– popülasyonundan ham canlı hedef hücre sayıları alındı. Tüm koşullar üçlü olarak (n = 3) gerçekleştirildi. Veriler ortalama ± standart sapma olarak sunulur. D ve F panellerinde sitotoksisite eğilimlerini modellemek için doğrusal olmayan regresyon analizi kullanıldı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

2. Antikor-bağımlı hücresel sitotoksisitenin akış sitometrisiyle nicelendirilmesi

1. Birincil insan NK hücrelerini hazırlayın
   NOT: Birincil insan NK hücreleri, sağlıklı yetişkin bağışçılardan alınan lökositle zenginleştirilmiş periferik kandan, daha önce belirtildiği gibi NK hücre zenginleştirme yöntemi ve ardından yoğunluk gradyanı santrifüjasyonu ile izole^{edildi 3}. Arıtılmış NK hücreleri, dondurma çözeltisinde (%90 FBS ve %10 dimetil sülfoksit [DMSO]) 5 × 10⁶ hücre/mL kriyokonserasyonda kriyoviallerde 0,5 mL alikot olarak 0,5 mL alikot olarak saklandı ve³. kullanıma kadar −150°C'nin altında saklandı.
   1. 5 × 10-6 birincil insan NK hücresi içeren bir şişe, kriyovialı 37°C su banyosunda yaklaşık 1 dakika boyunca nazikçe çalkalayarak eritin, ta ki geriye sadece küçük bir buz kristali kalana kadar.
      DIKKAT: Kurumsal yönergelere uygun biyolojik güvenlik prosedürleri ve kişisel koruyucu ekipmanlarla tüm insan kaynaklı örnekleri ele alın.
      DIKKAT: DMSO, kimyasalların ciltte emilimini kolaylaştırır. Uygun koruyucu ekipman giyin ve doğrudan temastan kaçının.
   2. Çözülen hücreleri, içinde 10 mL önceden ısıtılmış (37°C) NK-hücre kültür ortamı içeren 15 mL konik tabanlı santrifüj tüpüne aktarın ve nazik bir dönme ile karıştırın.
      NOT: NK-hücre kültürü ortamı %10 FBS, %10 insan AB serumu, 2 mM L-alanil-L-glutamin, 100 μg/mL primocin ve 50 U/mL insan IL-2 takviyesi içeren Advanced RPMI-1640'tan oluşur.
   3. Santrifüj hücreleri (5 dakika, 300 × g, RT, ivmelenme = maksimum; yavaşlama [fren] = maksimum).
   4. Üst yüzeyi at.
   5. Pellet, 5 mL önceden ısıtılmış (37°C) NK-hücre kültür ortamında yeniden süzülür.
   6. Santrifüj hücreleri (5 dakika, 300 × g, RT, ivme = maksimum; yavaşlama [fren] = maksimum).
   7. Üst yüzeyi at.
   8. Pelleti 1 mL önceden ısıtılmış NK-hücre kültür ortamında yeniden süzülür.
   9. Süspansiyonu 24 kuyruklu bir doku kültür plakasının bir kuyusuna aktarın.
   10. Buharlaşmayı en aza indirmek için çevredeki kuyulara 1 mL steril PBS ekleyin.
   11. 24 kuyuluklu plakayı 45° açıda (açıyı korumak için plaka rafı veya destek kullanarak) %5 CO₂ ile 37°C'de, 16–24 saat boyunca kuluçka için, böylece NK hücresi geri kazanılabilir.
       NOT: Birincil insan NK hücreleri, maksimum hayatta kalma ve iyileşme için yakın hücre-hücre temasına ihtiyaç duyar; bu, 24 kuyu plakasını eğip kuyunun kenarında birikmeye izin verilerek sağlanabilir. Deneyler arasında tutarlı kuluçka süresi korun.
       NOT: İyileşme süresinin ardından doğrudan hedef hücre hazırlığı ve ortak kültür kurulumuna geçin.
2. Karboksifloressein süksinimidil ester (CFSE) ile hedef hücreleri boyandırın.
   1. 5 × 10⁵ hedef hücre alın ve 15 mL'lik konik tabanlı santrifüj tüpüne aktarın.
      NOT: Hedef hücreler¹⁶ olarak hastadan köken bir lenfoma hücre hattı kullanılmıştır.
   2. Hücreleri bir kez 10 mL PBS ile yıkayın.
   3. Santrifüj hücreleri (5 dakika, 300 × g, RT, ivme = maksimum; yavaşlama [fren] = maksimum).
   4. 5 mM stok çözeltisi kullanarak PBS'de 0,5 μM CFSE çalışma çözeltisi hazırlayın; 1 μL 5 mM CFSE stokunu 15 mL konik tabanlı santrifüj tüpünde 10 mL PBS'ye seyreltirerek.
      DIKKAT: CFSE, reaktif amin bağlayan floresan boyadır ve cilt veya göz maruziyeti üzerinde risk oluşturabilir. Uygun kişisel koruyucu ekipmanla ele alın ve kullanılmayan reaktifi yerel biyogüvenlik yönergelerine göre bertaraf edin.
   5. Üst yüzeyi at.
   6. Pelleti CFSE çözeltisinde yaklaşık 1 ×^{10 6} hücre/mL olarak yeniden süskü altına alın.
   7. Tüpü alüminyum folyoya sararak veya ışıktan korumak için opak bir kapta koyarak 37°C'de 15 dakika kuluçka yapın.
   8. Reaksiyonu 5–10 cilt kültür ortamı ekleyerek söndürebilirsiniz.
   9. 37°C'de 5 dakika kuluçka yapın.
   10. Santrifüj hücreleri (5 dakika, 300 × g, RT, ivme = maksimum; yavaşlama [fren] = maksimum).
   11. Üst yüzeyi at.
   12. Hücreleri 2.5 × 10⁵ hücre/mL ile yeniden süspansiyona alır, böylece 100 μL 2.5 × 10⁴ hücre içerir.
       NOT: CFSE sinyal yoğunluğunu ve hedef-hücre yaşamını korumak için doğrudan kaplamaya geçin.
3. Plaka hedef hücreleri
   1. Yuvarlak tabanlı 96 kuyu plakası alın.
   2. Çok kanallı pipet kullanılarak belirlenmiş kuyruklara 100 μL/kuyu (2,5 ×^{10 5} hücre/mL) hedef hücre ekleyin (bkz. Ek Şekil 2). Her koşul üçlü olarak kaplanır.
      NOT: Kaplamadan önce hücre süspansiyonunun homojen olduğundan emin olun.
4. Antikor hazırlayın ve ekleyin
   1. Her test antikoru ve eşleşen izotip kontrolü için NK-hücre kültür ortamında 200 μL 4× antikor çözeltisi (100 μg/mL) hazırlanır.
      NOT: Bu adım modülerdir ve seçilen hedef hücre hattına karşı ADCC aracılığı eden herhangi bir antikora uyarlanabilir. Antikor stok konsantrasyonları ve formülasyonları değişkenlik gösterebilir; Sulandırmaları buna göre ayarlayın. Azide gibi koruyucular hedef hücre hayatta kalma ve NK-hücre işlevselliğini etkileyebilir. Çeşitli antikor konsantrasyonları test edilebilse de, burada nihai konsantrasyon 25 μg/mL olarak kullanılır.
   2. Antikor çözeltilerini derin bir kuyulu plakaya aktarın.
   3. Hedef hücrelere 50 μL/well antikor çözeltisi ekleyin ve ≥5 kez pipetle iyice karıştırın.
   4. Antikorsuz kontrol kuyularına 50 μL NK-hücre kültür ortamı ekleyin ve ≥5 kez pipetle iyice karıştırın.
   5. %5 CO₂ ile 37°C'de 25–30 dakika kuluçka yapın.
5. NK hücrelerini hazırlayın ve ekleyin
   1. Boyadan çıkarılan hücre sayma yöntemi (örneğin, trypan blue) veya eşdeğer doğrulanmış bir yöntemle 2 × 10⁵ NK hücresi sayın ve elde edin. Bu sayı, üç NK hücresi içeren üç durum için yeterlidir; üçlü kaplama ile pipetleme kaybını açıklayan fazlalık (bkz. Ek Şekil 2). Eğer uygulanabilirlik %≥75 ise, daha düşük performans test performansını etkileyebilir.
   2. Hücreleri 2,5 × 10⁵ hücre/mL ile 800 μL birincil insan NK-hücre kültür ortamında (nihai konsantrasyon = 1,25 × 10⁴ hücre/50 μL) yeniden süzülür.
   3. İlgili kuyruklara 50 μL NK hücresi ekleyin ve ≥5 kez pipetle iyice karıştırın.
      NOT: Kaplamadan önce hücre süspansiyonunun homojen olduğundan emin olun.
   4. Kuyular kontrol etmek için 50 μL/well kültür ortamı ekleyin ve ≥5 kez pipetle iyice karıştırın.
6. Son ortak kültürü kurmak
   1. Daire tabanlı 96 kuyu plakasını dikkatlice inceleyin ve tüm kuyruklarda 200 μL içerdiğini, menisküs seviyelerinin eşit olup olmadığını ve kabarcık olmadığını doğrulayın.
   2. Plakayı santrifüjle yapın (2 dakika, 100 × g, ivme = düşük [ör, 2]; yavaşlama [fren] = düşük [ör. 2]).
      NOT: Bu yumuşak spin, hücrelerin hızla yerleşmesi ve hücre-hücre temasını artırmak için önemlidir. Hızlanma ve yavaşlama ayarları 9 üzerinden 2'ye ayarlanmış, salınan kovalı rotorla uyumlu tezgah üstü Eppendorf Santrifüj 5810R kullanıyoruz.
   3. Gece boyunca 37°C'de %5 CO₂ ile 16–18 saat boyunca kuluçka yapın.
      NOT: Bu kuluçka süresi, degranülasyon yerine sitotoksisite okuması için optimize edilmiştir; bu da CD107a ekspresyonunun daha erken zaman noktalarında (2–6 saat) ölçülmesiyle en iyi şekilde değerlendirilir. Bu nedenle, zirve degranülasyon yanıtları hafife alınabilir.
      NOT: Kuluçkasyonu 18 saatten fazla uzatmayın, çünkü uzun süreli ortak kültür, kontrol kuyularında aşırı hedef hücre ölümüne ve deneysel koşullar arasında dinamik aralığın azalmasına yol açabilir.
7. Akış sitometrisi gerçekleştirin
   1. Santrifüj (5 dakika, 300 × g, ivme = maksimum; yavaşlama [fren] = maksimum).
   2. Üst yüzeyi at.
   3. Tüm kuyular 200 μL/well FACS tamponu ile yıkayın (%2 FBS, 2 mM EDTA PBS).
   4. FACS tamponunda yüzey antikor master karışımı hazırlayın; CD56-BV421'i 1:50 seyreltmede, CD16-BV785'i 1:50 seyreltmede ve CD107a-PE-Cy7'yi 1:25 seyreltmede ekleyin.
      NOT: Deneysel plaka tasarımına göre toplam master karışım hacmi hesaplayın (kuyu sayısı 50 μL/kuyu + %20 fazlalık× Antikor klonları boyama yoğunluğu ve epitop erişimi açısından farklılık gösterebilir. Temsilci verilerde kullanılan klonlar Materyal Tablosu'nda listelenmiştir ve alternatif klonlar titrasyon gerektirebilir. NK-hücre alt kümesi fenotipi (örneğin, KIR, NKG2A/C/D ve CD57) ve aktivasyon belirteçleri (örneğin, CD69 ve HLA-DR) için ek antikorlar dahil edilebilir.
   5. Hücreleri 50 μL/kuyu antikor master karışımında yeniden süzülün ve ≥5 kez pipetle iyice karıştırın.
   6. Plaka alüminyum folyoya sarılmış veya ışıktan korumak için opak bir kapta koyarak 4°C'de 15 dakika kuluçka yapın.
   7. 150 μL/well FACS buffer ekleyin.
   8. Santrifüj (5 dakika, 300 × g, ivme = maksimum; yavaşlama [fren] = maksimum).
   9. Üst yüzeyi at.
   10. Hücreleri FACS tamponunda 5 μM 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) 100 μL/well içinde yeniden süzülün ve hemen akış sitometrisi alımına geçin. Önceden satın alma kuluçka gerektirmez.
   11. Akış sitometrisi ile veri edinin ve CFSE, BV421, BV785, PE-Cy7, DAPI ve ek floroforlar için floresan kanallarını kaydedin.
       NOT: Algılama ayarları (örneğin, dedektör voltajları, telafi ve gating) optimizasyon gerektirebilir. Dengeleme ve kapaj kurulumu için lekelenmemiş ve tek boyalı kontroller kullanın; uygun olduğunda telafi boncuklar veya temsilci hücreler kullanın. Sürekli veya loş ifadeye sahip belirteçler için floresans-eksi bir kontroller (örneğin, CD107a) göz önünde bulundurulmalıdır. Deneyler arasında canlı/ölü kapı ve hedef ile efektör popülasyonların tanımlanması gibi tutarlı ayarlar ve kapı stratejisini koruyun.
       NOT: Hem Adım 1 hem de Step 2 yapışkan hedef hücreler için uyarlanabilir. Tohum hücrelerini (ilgili kültür ortamlarıyla birlikte) birlikte kültürden bir gün önce, yaklaşık %70 birleşme oranına ulaşan yoğunlukta birlikte kültür öncesinde düz tabanlı 96 yuvalı bir plakada hedef alın. Yapışma doğrulandıktan sonra, hedef hücre ortamını atıp yerine 100 μL yeni NK-hücre ortamı ekleyin, ardından efektör hücreler eklenerek ortak kültür başlatılır. Hücre boyutu ve morfolojisindeki farklılıklar nedeniyle, IncuCyte Hücre Hücre analiz parametreleri her yapışkan hücre hattı için optimize edilmelidir.
       NOT: Yapışkan hücrelerle akış sitometrisine dayalı testler için, ortak kültür sonrası, plakayı santrifüj (300 × g, 5 dakika) santrifüjle yapın ve süpernatantı atın. 100 μL/well TripLE ekleyin ve hücreleri ayırmak için %5_CO2 ile yaklaşık 5–15 dakika boyunca 37°C'de kuluçka yapın. 100 μL/well FACS tamponu ekleyin, pipetle yukarı aşağı yuvarlak hareketle karıştırın ve tüm hücreleri yuvarlak tabanlı 96 kuyu plakaya aktarın. Boyamaya geçmeden önce kuyuları mikroskobik olarak inceleyerek tam ayrılmayı doğrulayın (Adım 2, Alt adım 7). Tek hücreli süspansiyon elde etmek için TrypLE kuluçka süresini gerektiği kadar optimize edin.

Sonuçlar

NK-hücre sitotoksisitesini gerçek zamanlı olarak niceltmek için, anti-BCMA CAR'ları ifade etmek üzere tasarlanmış NK-92 efektör hücreleri, BCMA⁺ Ramos hedef hücreleriyle siyah, şeffaf, düz tabanlı 96 kuyu plakasında birlikte kültürlendi ve canlı hücre görüntüleme ile izlendi (Şekil 1A ve Ek Şekil 1A). Efektör hücreler, 0:1 (sadece hedef), 0.25:1, 0.5:1, 1:1 ve 2:1 E:T oranlarında eklendi ve her koşul üçlü olarak gerçekleştirildi. Üç farklı CAR NK-92 yapısı değerlendirildi: CAR1 ko-uyarıcı domaini olmadan, CAR2 4-1BB (CD137) ko-stimulatör domaini ile ve DAP10 ko-stimulatör domaini olan CAR3 ile kontrol NK-92 hücreleri ile sadece ZsGreen vektörünü ifade ediyor. Tüm efektör hücreler, daha önce tanımlandığı gibi lentiviral transdüksiyon^{yoluyla üretilmiştir; 4} daha önce ZsGreen-P2A-CAR transgen kasetleri kullanılmıştır. Ramos hedef hücreleri de benzer şekilde emiRFP670 kodlayan lentiviral vektörle transdüksiyon yapıldı. Hedef hücre büyümesi ve hayatta kalmaları, canlı hücre görüntüleme cihazı kullanılarak 24 saat boyunca her saat takip edildi; ZsGreen⁺ NK-92 hücreleri için yeşil floresans, SYTOX Orange⁺ ölü hücreler için turuncu floresans ve emiRFP670⁺ hedef hücreler için NIR floresansı ölçüldü (Şekil 1A ve Ek Şekil 1B ve 1C).

Mikroskobik görüntüler, ko-kültür sırasında efektör hücreleri, canlı hedef hücreleri ve ölü hücreleri görselleştirmek için belirli zaman aralıklarında alınmıştır (Şekil 1B). Hedef hücre büyüme ve hayatta kalma miktarının nicelendirilmesi, CAR2 ve CAR3 NK-92 hücrelerinin, özellikle daha erken zaman noktalarında 1:1 E:T oranında CAR1 NK-92 hücrelerine göre daha hızlı öldürme kinetik gösterdiğini göstermiştir. Hedef hücre öldürme, doğal sitotoksisite gösteren kontrol içindeki NK-92 hücreleri dahil olmak üzere daha yüksek E:T oranlarıyla arttı (Şekil 1C). Bu ölçümler, canlı hücre görüntülemenin sitotoksik aktivitedeki dinamik değişiklikleri yakalama yeteneğini ortaya koymaktadır. Hedef hücre hayatta kalma ayrıca, CAR NK-92 potensiyesi karşılaştırmak için belirlenmiş zaman noktalarında E:T oranının bir fonksiyonu olarak analiz edilmiştir. CAR2 ve CAR3 NK-92 hücreleri, sonraki zaman noktalarında daha düşük E:T oranlarında (örneğin, 24 saat içinde E:T = 0.25:1) ve daha erken zaman noktalarında ara E:T oranlarında (örneğin, 4 saat içinde E:T = 1:1) daha yüksek güç göstermiştir (Şekil 1D). CAR2 ve CAR3 NK-92 efektör hücreleri arasında analizler arasında öldürmede önemli bir fark gözlemlenmedi.

E:T oranı, birlikte kuluçka süresi ve hedef hücre hayatta kalma süresini entegre eden bir ısı haritası, tüm efektör popülasyonlarda doğal ve CAR aracılı sitotoksisitenin kapsamlı bir görselleştirilmesini sağlar ve nicel değerlendirmeyi mümkün kılar. Güç ve kinetik olarak nicelendirilmek için üç parametre tanımlandı: KR₅₀, 12 saatte %50 öldürme sağlayan öldürücü-hedef oranı; KT₅₀, %50 öldürme için gereken ortak kuluçka süresi (E:T oranı 1:1); ve IKI₅₀, %50 sağ kalma izolini tanımlayan ve %50 sağ kalma izolini tanımlayan entegre katil endeksi. Bu metrikler, CAR NK-92 hücre potensiyi (KR₅₀), öldürme kinetik (KT₅₀) ve entegre sitotoksik performansın (IKI₅₀) karşılaştırılmasını mümkün kılar (Şekil 1F). Bu analiz, testin tek bir deney içinde birden fazla parametre üzerinden mühendislik edilmiş NK-hücre platformlarını niceliksel olarak nasıl karşılaştırabileceğini göstermektedir.

Akış sitometrisi, hücre sayımı ile ADCC'yi ölçmek için kullanıldı; terapötik antikorların varlığı veya yokluğunda birincil insan NK hücreleriyle floresan işaretli hedef hücreler birlikte kültürlenerek ve 16–18 saatlik kuluçkadan sonra kalan canlı hedef hücre popülasyonunu niceltilmiş (Şekil 2A). Cytek Aurora, BD Symphony veya BD Fortessa gibi yüksek verimliliğe sahip örnekleyici akış sitometreleri kullanılabilir. Temsilci düzende (Ek Şekil 2), CD38⁺ hasta kaynaklı lenfoma hedef hücreleri yuvarlak tabanlı 96 kuyu plakasında kaplandı ve uygun kuyulara daratumumab (veya izotip antikor) eklendi. NK hücreleri daha sonra 0,5:1 E:T oranında birlikte kültürlendi; bu oran, bu hedef hücreler için optimize edilmiş, doğal öldürmeyi en aza indirirken ADCC'nin tespitini mümkün kılmıştır. İnkubasyon sonrası, hücre popülasyonlarını ileri ve yan saçılımla çözmek, DAPI kullanılarak uygulanamayan olayları dışlamak ve paralel analiz için ^CFSE+ hedef hücrelerini CD56⁺CD16⁺ NK hücrelerinden ayırmak için akış sitometrisi yapıldı (Şekil 2B). Bu tasarım, sitotoksisite ölçümü ve fenotipik karakterizasyonun eşzamanlı olmasını sağlar.

Şekil 2. Akış sitometrisi tabanlı antikor bağımlı hücresel sitotoksisite (ADCC) testi, hedef-hücre hayatta kalma ve NK-hücre aktivasyonunun eşzamanlı nicelendirilmesini sağlar. (A) ADCC testinin şematik özeti. CFSE etiketli CD38⁺ lenfoma hedef hücreleri, her kuyu başına 2,5 ×^10,4 hücre olarak kaplandı ve beş koşulda kültürlendi: sadece hedef hücreler; daratumumab (25 μg/mL) ile hedef hücreler; NK hücrelerine sahip hedef hücreler (E:T = 0.5:1); NK hücreleri ve daratumumab ile hedef hücreler; ve NK hücreleri ile izotip kontrol antikoru (25 μg/mL) hedef hücreler. (B) Temsilci akış sitometrisi kapı stratejisi. Olaylar önce ileri saçılma ve yan saçılma ile kapatıldı, ardından DAPI kullanılarak yaşanamaz hücreler dışlandı. Hedef hücreler ^CFSE+ olayları olarak, NK hücreleri ise CD56⁺ ve CD16⁺ olayları olarak tanımlandı. NK-hücre degranülasyonu CD107a ekspresyonuyla değerlendirildi. (C) Hedef hücre sağ kalma oranının nicelendirilmesi, yalnızca hedef kontrol koşuluna göre yüzde olarak ifade edilir (%100 olarak ayarlanmıştır). (D) NK-hücre degranülasyonunun niceliklendirilmesi, NK-hücre popülasyonundaki CD107a⁺ hücrelerinin yüzdesi olarak gösterilir. Barlar ortalama ± standart sapmayı temsil ederken, üst üste bükülmüş noktalar bireysel çoğaltma kuyularını temsil eder (n = 3). İstatistiksel analiz, Tukey'nin sonradan yapılan çoklu karşılaştırma testiyle tek yönlü varyans analizi kullanılarak gerçekleştirildi. İstatistiksel anlamlılık şu şekilde belirtilmiştir: *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Ana son nokta, canlı ^CFSE+ kapısında hesaplanan ve %100 hayatta kalmaya ayarlanan hedef hücre sağkalımı için normalleştirilen hedef hücre sağlıktır. Bu normalizasyon, spontan hedef hücre kaybını kontrol eder ve koşullar arasında doğrudan karşılaştırma imkanı sağlar. Temsilci verilerde (Şekil 2C), daratumumab eklemesi tek başına hedef hücre hayatta kalma durumunu azaltmadı ve bu da antikorun efektör hücreler olmadan hedef hücre canlılığı üzerinde doğrudan etkisi olmadığını doğrulamaktadır. Sadece NK hücreleriyle birlikte kültür, hedef hücre hayatta kalma süresini yaklaşık %70'e düşürdü ve bu da başlangıç doğal sitotoksisitesini gösterdi. Daratumumab eklenmesi, antikor aracılı öldürme ile yaklaşık %37'ye kadar hayatta kalma süresini azalttı; izotip kontrol durumu ise sadece NK ile karşılaştırıldığında yaklaşık %62 sağlıktı. Başarılı deneyler, antikor ile tedavi edilen ve kontrol koşulları arasında yüksek tekrarlanabilirlikle açık bir ayrım göstermektedir.

NK hücrelerinin ikincil fenotiplemesi, hedef-hücre öldürme ile efektör aktivasyonu arasındaki bağlantıyı tamamlayıcı olarak doğrular. CD107a⁺ NK hücrelerinin yüzdesi olarak ölçülen NK-hücre degranülasyonu, antikorsuz NK hücre-hedef hücre ko-kültüründe en düşük ve daratumumabla tedavi edilmiş durumda en yüksek oranı (yaklaşık %31) gösterdi; izotip kontrol ise ara degranülasyon gösterdi (yaklaşık %19), antikor aracılı aktivasyonu destekledi (Şekil 2D). Bu sonuçlar, testin hedef hücre öldürmesini efektör aktivasyonundan ayırt edebildiğini göstermektedir. Degranülasyon ve hayatta kalma eğilimleri genellikle örtüşse de, tamamen örtüşmemektedir; bu da ilişkili ama farklı biyolojik süreçleri temsil ettiklerini gösterir.

Optimal olmayan deneyler genellikle koşullar arasında ayrımın azaldığını, kuyular arasında hücre sayısındaki değişkenlik, kontrol kuyularında yüksek hedef hücre ölümü, zayıf CFSE boyama veya artan arka plan degranülasyonunu gösterir. Bu sonuçlar, kötü hedef hücre canlılığı, tutarsız NK hücre iyileşmesi, yetersiz karışım veya boyama ve alım değişkenliğinden kaynaklanabilir. Analiz hedef ve efektör bölmelerini bağımsız olarak tanımladığı için, hedef hücrelerin ek fenotiplenmesini (örneğin, antijen yoğunluğu veya ligand ifadesi) ve daha geniş NK-hücre karakterizasyonunu içerecek şekilde genişletilebilir. "Sadece NK" bir koşulun dahil edilmesi, başlangıç degranülasyonu ve NK-hücre yaşamlılığını daha da nicelikleştirebilir. Bu çok parametreli tasarım, fonksiyonel sitotoksisitenin mekanik bağışıklık fenotipleriyle birlikte yorumlanmasını sağlayan önemli bir avantajdır.

Ek Şekil 1. Canlı hücre görüntüleme sitotoksisite testi için temsilli plaka yerleşimi ve analiz iş akışı. (A) CAR NK hücresi öldürme testi için temsilci 96 kuyu plaka düzeni. Dört efektör hücre durumu dörtlükler halinde düzenlenmiştir; her biri 0:1 (sadece hedef kontrol), 0.25:1, 0.5:1, 1:1 ve 2:1 E:T oranlarında test edilir ve her koşul üçlü olarak gerçekleştirilir (toplamda 60 test kuyusu). (B) IncuCyte 2021C yazılımında tutuksuz hücre baz-hücre analizinin temsil konfigürasyonu; bireysel efektör ve hedef hücreleri tanımlamak için kullanılan spektral karışıklama, segmentasyon ve maskeleme parametrelerini göstererek, döküntü ve agregaları hariç tutmaktadır. (C) Canlı hedef hücre popülasyonunu tanımlamak için NIR ile SYTOX Orange floresansı kullanılarak temsil hücre hücre sınıflandırma kapı stratejisi. Sadece hedef için kullanılan kuyular ve örnek zaman noktasında (t = 4 saat) birlikte kültür kuyuları, canlı ve ölü hücre popülasyonları arasındaki ayrımı doğrulamak için kullanılır. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 2. Akış sitometrisi tabanlı ADCC testi için temsil plaka düzeni. B–D satırları ve 2–6 sütunları boyunca üçlük olarak kaplanmış beş deneysel durumu gösteren temsil edici 96 delikli plaka düzeni (toplam analiz yuvaları = 15): (1) sadece hedef kontrol, (2) daratumumab içeren hedef hücreler, (3) NK hücreleri ile hedef hücreler, (4) NK hücreleri ve daratumumab ile hedef hücreler ve (5) NK hücreleri ve izotip kontrol antikoru içeren hedef hücreler. Hedef hücreler kuyu başına 2,5 × 10,4 hücre olarak kaplandı ve NK hücreleri 1,25 × 10⁴ hücre kuyu başına eklenerek 0,5:1 E:T oranı elde edildi. Antikorlar son konsantrasyon olarak 25 μg/mL olarak kullanıldı. Çevredeki kuyular buharlaşmayı en aza indirmek için PBS ile dolduruldu. Sadece hedef koşulu, hedef hücre hayatta kalma normalleşmek için kullanıldı ve izotip kontrolü, antijen özgüllüğünden bağımsız antikor formülasyon etkilerini hesaba kattı. E:T oranının optimize edilmesi, hedef hücre hattının hassasiyetine bağlı olarak gerekebilir. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Bu protokoller, NK-hücre sitotoksisitesini standartlaştırılmış 96 kuyu plaka formatında nicelendirmek için iki tamamlayıcı yaklaşım sunar. Step 1 , hedef-hücre kaybını sürekli izlemek için gerçek zamanlı canlı hücre görüntüleme kullanır ve çoklu E:T oranlarında doğal ve CAR aracılı öldürme kinetiklerini değerlendirmek için oldukça uygundur. Adım 2 , tanımlanmış bir birlikte kuluçka döneminden sonra ADCC'yi nicellendirmek için akış sitometrisi kullanırken, fenotipik analiz için hedef ve efektör bölmeleri aynı anda ayırır^{. 17}. Bu yöntemler, farklı biyolojik süreçleri modellemek için kullanılabilecek tamamlayıcı test platformları olarak sunulur ve kolayca birbirinin yerine kullanılabilir. Birincil insan NK hücreleri, canlı hücre görüntüleme tabanlı ADCC testleri için kullanılabilir ve akış sitometri testlerinde CAR aracılı öldürme için de mühendislik yapılabilir. Ayrıca, vahşi tip NK-92 hücrelerinde CD16^{ekspresyonu 18} olmasa da, CD16'nın (örneğin lentiviral transdüksiyon yoluyla) girilmesi NK-92 hücrelerinin güçlü ADCC'yi kolayca aracılık etmesini sağlar. Bu nedenle, her iki test de bireysel bilimsel ve translasyonel ihtiyaçlara göre uyarlanabilir.

Her iki testte de tekrarlanabilirlik açısından özellikle önemli olan birkaç adım vardır. Efektör hücre sayısı ve fenotipindeki küçük değişiklikler, hedef hücre hayatta kalma durumunu büyük ölçüde değiştirebilir. Hücre sayımında doğru sayım ve kaplama sırasında kapsamlı yeniden süspansiyon, hücre sayılarındaki sapmaları ve eksik karışımı en aza indirmek için gereklidir. Benzer şekilde, hücre hazırlığı deneyler arasında tutarlı tutulmalıdır; uygulanabilirlik, iyileşme süresi ve önceki sitokin maruziyeti dahil olmak üzere, efektör işlevselliğinin düzgün olmasını sağlamak için. Levha geometrisi, test performansının bir diğer önemli belirleyicisidir. Canlı hücre görüntüleme iş akışında, düz tabanlı kaplamalı plakalar stabil görüntü alımını ve tutarlı alan analizini desteklerken, akış sitometrisi iş akışında yuvarlak taban plakaları hücre-hücre temasını teşvik eder ve uç noktada yapışmayan ko-kültürlerin geri kazanılmasını kolaylaştırır. Ayrıca, floresan etiketleme kalitesi testten önce doğrulanmalıdır; çünkü görüntüleme ile zayıf hedef hücre ayırımı veya akış sitometrisiyle zayıf CFSE ayrımı, niceleme ve yorumlamayı tehlikeye atacaktır.

Bu iki iş akışı farklı teknik konular sunar. Canlı hücre görüntüleme testinde, düşük veri kalitesinin yaygın nedenleri arasında eşit olmayan hücre kaplaması, yoğun hücre kümelenmesi veya topaklanması ve optimal olmayan görüntü analizi eşikleri bulunur ve bunların hepsi kolayca düzeltilebilir. Bu sorunlar hücre sayılarını çarpıtabilir ve zaman içinde tutarsız takip oluşmasına yol açabilir. Akış sitometrisine dayalı testte, optimal olmayan sonuçlar genellikle yüksek arka plan hedef hücre ölümü, hedef ve efektör popülasyonlarının zayıf ayrılması, kötü antikor boyama veya çoğaltma kuyuları arasında tutarsız pipetlemeden kaynaklanır. Bu testler karşılaştırmalı analiz için tasarlandığından, uygun iç kontrollerin yorumlama için gereklidir; normalleşme için yalnızca hedef kontroller ve antikor veya CAR spesifik durumlar için eşleşen negatif kontroller dahil.

Bu yöntemlerle ilgili birkaç ortak ve teste özgü sınırlama göz önünde bulundurulmalıdır. Canlı hücre görüntüleme testi zamansal çözünürlük sağlar ancak doğru floresan etiketleme ve görüntü analizi parametrelerine bağlıdır; bu parametreler hücre kümelenmesi, spektral örtüşme veya ortak kültür¹⁵ sırasında morfoloji değişiklikleri tarafından etkilenebilir. Bazı durumlarda, özellikle testler birincil efektör hücreleri içerdiğinde, öldürme dinamiklerini değiştirmeden yeterli floresan etiketleme elde etmek zor veya mümkün değildir. Akış sitometrisine dayalı test, belirli bir uç noktada daha yüksek fenotipik çözünürlük sağlar, ancak birden fazla eşleşen zaman noktası toplanmadıkça erken ve geç öldürmeyi bağımsız olarak ayırt etmez; bu da maliyetli ve zaman alıcı olabilir^. Ayrıca, son nokta ölçümleri sadece hedef hücre ölümünü değil, aynı zamanda hedef hücre çoğalması, efektör kaybı veya örnek işleme sırasında iyileşme farklılıklarını da yansıtabilir. Bu nedenle, CD107a gibi mekanistik okumalar, hedef-hücre eliminasyonu için doğrudan ikame olmaktan ziyade, efektör hücre aktivasyonunun tamamlayıcı^{göstergeleri} olarak en iyi şekilde yorumlanabilir. Daha geniş anlamda, her iki platform da NK-hücre işlevini in vivo şekillendiren mekansal mimari, stromal etkileşimler, sitokin gradyanları veya trafik kısıtlamalarını tam olarak yeniden üretemez.

NK hücresi öldürme testleri yorumlanırken birkaç biyolojik faktör de dikkate alınmalıdır. Donör-donöre değişkenlik, birincil insan NK hücreleriyle yapılan deneylerde de özgüdür; bu deneyler, donör yaşı, cinsiyet, enfeksiyon hastalık öyküsü ve reseptör polimorfizmleri nedeniyle sitotoksik potansiyel ve alt küme bileşimi açısından farklılık gösterir²⁰. NK-92 hücrelerinin kullanımı değişkenliği büyük ölçüde azaltır, ancak bu hücreler yine de kaynak ve geçişle ilgili değişiklikler^{gösterebilir 18}. Protokolümüz, bu biyolojik faktörleri daha doğru değerlendirmek için standartlaştırılmış parametreler ve aynı plaka karşılaştırmalarıyla teknik veya deneysel farklılıkları azaltmaktadır. Mümkünse, sabit yaşama eşiklerine sahip tanımlanmış NK-92 geçiş aralıklarının kullanılmasını öneririz. Birincil NK hücreleri için, testler her durum için birden fazla donörden alınan NK hücrelerini kullanmalı, istatistiksel analizler bağışçıdan donöre değişkenliği (örneğin, çift veya karışık etkiler modelleri) hesaba katmalıdır; çünkü koşullar arasındaki göreli farklılıklar genellikle bağışçılar arasında korunur. Ayrıca, ek NK-hücre belirteçleri (örneğin KIR'ler, NKG2A/C/D ve CD57) akış sitometrisi için kullanılan antikor panellerine dahil edilerek, bağışçılar arasında alt küme sıklıklarını karşılaştırmak ve alt kümeye özgü NK-hücre aktivasyonunu (yani CD107a ve CD69 ifadesi) değerlendirmek için sonuçların yorumlanmasını daha da kolaylaştırabilir. Son olarak, tüm NK-hücre öldürme testleri için belirli ek senaryolar dikkate alınmalıdır. NK hücrelerinde hedef antijenlerin ekspresyonu, ya endogen ekspresyon yoluyla ya da trogositoz yoluyla hedef hücrelerden antijen edinimle, NK hücresi fratrisidine ve karmaşık sonuçlara yol açabilir. Örneğin, daratumumab NK hücrelerinde ifade edilen CD38'i hedef alabilir ve^21'i indükleyerek ADCC'nin hedeflenen hedeflere karşı büyüklüğünü sınırlayabilir. Neyse ki, canlı hücre görüntüleme ve akış sitometrisi testleri, NK hücrelerinin nicelendirilmesine ve fratrisidin değerlendirilmesine olanak tanır.

Bu sınırlamalara rağmen, canlı hücre görüntüleme ve akış sitometrisinin birleşik kullanımı, temel ve preklinik uygulamalarda tekrarlanabilir NK-hücre fonksiyonel testleri için pratik bir çerçeve sağlar. Görüntüleme iş akışı, zamansal davranışın önemli olduğunda avantajlıdır; örneğin hızlı ve gecikmeli sitotoksik tepkileri ayırt etmek veya CAR tasarımlarında öldürme kinetiklerini karşılaştırmak^gibi. Akış sitometrisine dayalı iş akışı, fonksiyonel okumaların aynı örneklem içinde efektör ve hedef hücre fenotipleriyle birlikte yorumlanması gerektiğinde avantajlıdır. Bu yaklaşımlar birlikte, doğal öldürme, CAR aracılı sitotoksisite ve ADCC'nin geniş çapta erişilebilir deneysel platformlar kullanılarak nicel olarak değerlendirilmesini sağlar. Standartlaştırılmış ve ölçeklenebilir bir çerçeve oluşturarak, bu sistem NK hücre tabanlı modaliteler arasında titiz kıyaslama ve mekanik sorgulamaları kolaylaştırır, yeni nesil immünoterapilerin geliştirilmesini ve klinik çevrilmesini hızlandırır.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Advanced RPMI-1640 medium	Thermo Fisher Scientific	12633020	NK-92 ve primer insan NK-hücre kültür ortamı için bazal ortam (tam formülasyon için protokolü görün)
Anti-human CD107a antibody, PE-Cy7 conjugated (clone H4A3)	BioLegend	328618	Akış sitometrisi için degranülasyon markörü
Anti-human CD16 antibody, BV785 conjugated (clone 3G8)	BioLegend	302046	Akış sitometrisi
Anti-human CD56 antibody, BV421 conjugated (clone HCD56)	BioLegend	318328	Akış sitometrisi
Benchtop centrifuge with swinging bucket rotor compatible with 15-mL tubes and 96-well plates (Eppendorf Centrifuge 5810R)	Eppendorf	5811000015	Hücre peletleme ve plaka santrifüjlendirme için kullanılır (100–300 × g)
Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)	Thermo Fisher Scientific	C34554	Hedef hücre etiketleme için hücre proliferasyon boyası
Cytek Aurora spectral flow cytometer (or equivalent)	Cytek Biosciences	N7-00003	Akış sitometrisi edinimi ve analizi için kullanılır
DAPI (4′,6-diamidino-2-fenilindole)	BioLegend	422801	Canlı/ölü ayrımı için nükleer leke
Derin kuyu 96-kuyulu plaka	USA Scientific	1896-2110	Antikor hazırlığı için kullanılır
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Fisher Scientific	BP231-100	Kriopreservasyon reaktifi
Fetal bovine serum (FBS)	Avantor	76419-584	Bazal ortam takviye etme; FACS tamponunda kullanılır (%2 FBS)
General Purpose Water Bath, 10 L (37 °C)	PolyScience	WBE10	Hücre eritme için
GlutaMAX (L-alanil-L-glutamin takviyesi)	Thermo Fisher Scientific	35050061	Kararlı glutamin kaynağı
Human AB serum	Sigma-Aldrich	H4522-100ML	Primer insan NK-hücre kültür ortamı takviyesi
IncuCyte SX5 canlı hücre görüntüleme sistemi	Sartorius	4816	Gerçek zamanlı canlı hücre görüntüleme ve Hücre-Hücre analizi
LUNA-FL çift floresanlı hücre sayacı (veya eşdeğeri)	Logos Biosystems	L20001	Otomatik hücre sayımı
Parafilm M (4 in × 250 ft rulo)	Genesee	16-101	Plaka mühürleme ve depolama
Phosphate-buffered saline (PBS), steril (pH 7.2–7.4)	Corning	21-020-CV	Yıkama ve FACS tamponu hazırlanması için kullanılır
Poly-D-lizin (0.1 mg/mL)	Thermo Fisher Scientific	A3890401	Plaka kaplama reaktifi
Primocin	InvivoGen	ant-pm-2	Antibiyotik
Recombinant human interleukin-2 (IL-2)	R&D Systems	202-IL-500	Sitokin
RosetteSep Human NK-cell enrichment kit	STEMCELL Technologies	15065	İnsan NK-hücre zenginleştirme kokteyli
SYTOX Orange dead cell stain	Thermo Fisher Scientific	S34861	Canlı hücre görüntüleme için canlılık boyası
Trypan Blue 0.4%	Gibco	15250-061	Hücre sayımı için canlılık boyası
TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red	Thermo Fisher Scientific	12604039	Yapışkan hücre ayrılması için
UltraPure EDTA (0.5 M, pH 8.0)	Thermo Fisher Scientific	15575020	FACS tamponu hazırlanması için kullanılır
15-mL konik tabanlı santrifüj tüpleri	Corning	352097	Steril
24-kuyulu doku kültürü plakası (doku kültürü–tedavi edilmiş)	Corning	3524	NK-hücre geri kazanımı için kullanılır
96-kuyulu düz yuvarlak tabanlı berrak plaka (doku kültürü–tedavi edilmiş)	Corning	3799	Eş-kültür ve akış sitometri analizleri için kullanılır
96-kuyulu düz berrak tabanlı siyah polistiren plaka (doku kültürü–tedavi edilmiş)	Corning	3603	Canlı hücre görüntüleme sistemleri ile uyumlu