Yöntem makalesi

Sivrisinek Aedes aegypti'de Davranışın Optogenetik Analizi

268 görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/71394

⸱

21 Ağustos 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Genetics, Yale University, 2Kavli Institute for Neuroscience, Yale University, 3Howard Hughes Medical Institute, 4Wu Tsai Institute, Yale University

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Bu protokol, Aedes aegypti sivrisineğinin davranışını anlamak için optogenetiğin kullanımını açıklamaktadır. Konak hayvanlara yönelme ve kan besleme sırasında nöronal işlevleri değerlendirmek için yetiştirme, hazırlık, deneyler ve analiz yöntemleri sunulmuştur. Bu temel teknikler, insan hastalıklarının bu önemli vektörüne yönelik nöral devre ve davranış çalışmalarına olanak sağlayacaktır.

Özet

Aedes aegypti sivrisineği, viral patojenlerin önemli bir vektörüdür ve diğer vektör türleri için bir model görevi görür. Patojenler, bir sivrisinek konak hayvanı ısırdığında bulaşır, ancak arama ve ısırma davranışını kontrol eden nöral devreler henüz bilinmemektedir. Bu makale, nöral devreler ile davranış arasındaki nedensel ilişkiyi belirlemek için temel bir teknik olan optogenetik kullanılarak sivrisineklerde nöral aktivitenin manipüle edilmesine yönelik yöntemleri detaylandırmaktadır. Bu yöntemler, optogenetik için sivrisinek yetiştirmeyi ve uyarılma, çekilme, probosisle yoklama ve konak kanıyla doygunlaşma sırasındaki farklı basamakları ölçmek için tasarlanmış üç deneyi içermektedir. Bu davranışlar farklı mekansal ölçeklerde ve farklı duyusal uyaranlara yanıt olarak ortaya çıkar. Her davranışsal deney, optogenetik aktivasyon için kırmızı (~625 nm) LED'lerle donatılmıştır. Koku uyaranlarına yanıt olarak uyarılmayı tespit etmek için uçuş ve yürüme miktarları belirlenir. Çekilme veya konma davranışını denemek için sivrisineklere geniş bir arenada ısıtılmış kan öğünü sunulur. Probosisle yoklama ve doygunlaşma, eklerin ve abdominal boyutun ölçülmesine olanak tanıyan daha yüksek çözünürlüklü videolarla incelenir. Protokol, davranışın yüksek çözünürlüklü zamansal miktarının belirlenmesini ve beslenmenin uç nokta ölçümlerini sağlayan makine görme modellerini açıklamaktadır. Bu yöntemler, sivrisinek ısırma davranışında genetik olarak erişilebilir herhangi bir nöron popülasyonunun rolünü test etmek için kullanılabilir ve ek davranışlara genişletilebilir.

Giriş

Sivrisinek, vahşeti veya gücü nedeniyle değil, hastalık taşıyıcı bir vektör olarak verimliliği nedeniyle dünyadaki en tehlikeli hayvanlardan biridir. Anopheles sivrisinekleri tarafından yayılan sıtma parazitleri her yıl yüz binlerce ölümden sorumluyken, Aedes aegypti ve Aedes albopictus sarı humma, dang tarafından iletilen ateş, chikungunya, Zika ateşi ve birçok diğer yaşamı tehdit eden hastalığın yayılmasından sorumludur1. Sivrisinekler Antarktika dışındaki her kıtada bulunur ve halk sağlığı açısından büyük bir endişe kaynağıdır2. Kanla beslenme davranışı patojenleri doğrudan iletir, ancak aynı zamanda yumurta bırakmak için bir omurgalı kan öğününe ihtiyaç duyulduğundan, sivrisineğin yaşam döngüsünde temel bir adımdır. Bu nedenle, sivrisinek kaynaklı hastalıkların yayılmasını engellemek, bunların konakçı arama mekanizmalarının anlaşılmasını gerektirir.

Dişi sivrisineklerin konakçıları bulmak için uzun ve kısa mesafeli ipuçlarından yararlandıkları iyi bilinmektedir3,4. Karbondioksit (CO2), insan soluğunda bulunan oldukça uçucu bir gazdır ve genellikle bir sivrisineğin algıladığı ilk ipucudur. Bu gaz, Aedes aegypti olfaktör duyusal nöronlarında, CO2 reseptörünü oluşturan Gr1, Gr2 ve Gr3 proteinleri tarafından tespit edilir5. CO2 maruziyeti, aktivasyon olarak da bilinen kalkış ve uçuş davranışına neden olur6,7; bu durum, daha fazla uyaran olmasa bile 10–15 dk boyunca devam edebilir8. CO2 , aktivasyonu ve çekiciliği artırmak için cilt kokusuyla sinerji oluşturur5,9. CO2 ve cilt kokusunun tespit edilmesinin ardından sivrisinek; ısı, görsel kontrast ve nem gibi, onu uygun bir kan öğünü konakçısına konmaya yönlendiren ek ve daha yakın konakçı ipuçlarını algılamaya hazır hale gelir5,10,11,12,13. Birden fazla duyusal ipucunun entegrasyonu, sivrisineklerin konakçılarını etkili bir şekilde takip etmelerini ve bulmalarını sağlar.

Dişi bir sivrisinek potansiyel bir konağın üzerine konduğunda, bir deri alanı bulana kadar hortumunu yüzeye doğru iter; bu işlem sondaj (probing) olarak bilinir14,15. Sondaj işleminin ardından stillet deriyi deler, bir kan damarı bulur ve aynı anda tükürük enjekte ederken kan emer; bu durum sivrisineğin vücut ağırlığını birkaç dakika içinde iki katına çıkarmasını sağlar16. Kan, proteinlerin yumurta üretimi için sindirildiği orta bağırsağa yönlendirilir. İlginç bir şekilde, sadece sondaj işlemi bile hastalık bulaştırabildiği için, patojen yayılımı için konaktan kanla şişmek gerekli değildir16,17. Bu nedenle, ısırma davranışındaki her bir adımın anlaşılması, dişi sivrisineklerin konak arama ve ısırma süreçlerini bozacak stratejilerin geliştirilmesine ve nihayetinde sivrisinek kaynaklı hastalıkların yayılımının kontrol altına alınmasına olanak tanıyabilir.

Model organizmalarda nöronal aktiviteyi manipüle etmek için çok sayıda araç geliştirilmiştir. İlk araçlar konstritütif olarak veya termal aktivasyon yoluyla çalışmaktaydı18,19,20,21. Yararlı olsalar da, bu genetik reaktiflerin belirli dezavantajları vardır. Konstritütif araçlar gelişimi etkileyebilir ve yalnızca nöronların devre fonksiyonuna bağlı olmayan fenotiplere yol açabilir. Sivrisinekler, konak omurgalıları tanımlamak için vücut ısısını kullanırlar; bu durum, termal olarak aktive edilen kanalları onların davranış çalışmalarında benzersiz şekilde uygunsuz kılar22,23. Davranış çalışmalarında optogenetik, ilgilenilen nöronların aktivasyonunu kontrol etmek için ışığın belirli dalga boylarına yanıt veren genetik araçların kullanımını ifade eder . Bu teknik, farelerde susuzluğun valansının incelenmesinden Drosophila türlerinde kur davranışının çalışılmasına ve insan deneylerinde retinitis pigmentosa kaynaklı görme kaybının geri döndürülmesine kadar birçok sistemde kullanılmıştır24,25,26. Optogenetik kanallar, fotonları absorbe ederek ve belirli iyon türlerinin plazma membranından geçmesine izin vererek nöronu aktive eder veya inhibe eder. Bir organizmaya transgenik ışığa duyarlı protein kodlayan genler aktarılarak, bu teknik, aksi takdirde manipüle edilmesi imkansız olan spesifik nöronları aktive etmek veya inhibe etmek için kullanılabilir. Optogenetik, zamansal ve mekansal kontrolün yanı sıra deneysel çıkarımları mümkün kılan bir dizi kontrol imkanı sağlayarak avantajlar sunar.

Yazarlar yakın zamanda, sivrisinek davranışlarını incelemek için optogenetik araçların ilk kullanımını tanımladılar8. Bu araçlar, kırmızı ışıkla aktive olan katyon kanalı CsChrimson'a, yani kırmızıya kaymış bir channelrhodopsin'e dayanmaktadır27. CsChrimson dahil olmak üzere mikrobiyal opsinlerin, fotonları absorbe edebilmeleri için all-trans retinal adında kimyasal bir kofaktöre ihtiyaçları vardır28. CsChrimson, tdTomato floresan raporerine füzyonlanmıştır ve QF2/QUAS biner ekspresyon sisteminin kontrolü altındadır; bu durum, farklı sürücü hatlarıyla esnek bir şekilde kombine edilmesine olanak tanır29. CO2 duyarlı nöronları hedeflemek için, CO2 reseptörünün Gr3 alt birimini eksprese eden nöronlarda QF2 transkripsiyon faktörünü eksprese eden bir sürücü hattı kullanılmıştır30. Sivrisinekler, yalnızca kırmızı ışığa maruz kaldıklarında minimal davranışsal tepki göstermişlerdir8; ek olarak, kırmızı ışık biyolojik dokulara nüfuz etmede en etkili olan ışık olduğu için, kırmızı ışıkla aktive olan bir opsin optogenetik için idealdir25.

Bu makale, optogenetik stimülasyon ile birleştirilmiş, konakçı arama ve kan besleme davranışının farklı yönlerini ölçen üç deneye ait protokolleri açıklamaktadır (Şekil 1A). İlk olarak, optogenetik sivrisinek hatlarının yetiştirilmesine yönelik bir protokol sunulmaktadır. İkinci bölüm, sivrisinekler sıcaklık ve ışık stimülasyonlarına maruz kaldığında uyanma ve sondalama hareketlerini takip etmek için kullanılabilen, modifiye edilmiş bir PCR termosiklet cihazı olan opto-termosikleti tanımlamaktadır. Opto-termosiklet deneyi, nöronal aktiviteyi optogenetikle kontrol etmek için sürücü suşlar kullanarak, bu arama davranışlarını geniş zaman dilimleri boyunca ölçmek üzere tasarlanmıştır. Üçüncü bölüm, sivrisineklerin modifiye edilmiş bir termosikletin tabanında ince, yapay bir kan öğününe sürekli erişiminin olduğu, böylece değişken ışık ve sıcaklık koşulları altında uçuş, sondalama ve doygunluğun takip edilmesine olanak tanıyan kan battaniyesi deneyini açıklamaktadır. Opto-termosiklet üzerine inşa edilen kan battaniyesi deneyi, yapay bir kan öğünü üzerindeki doygunluğun nicelleştirilmesine imkan tanıyarak, kesin zamanlanmış optogenetik ve ısı stimülasyonları ile sivrisinek beslenme davranışlarının incelenmesini sağlar. Son bölüm, sivrisineklerin bir kanister içinde sıcak bir kan öğünüyle karşı karşıya getirildiği ve böylece hem bir kan kaynağına yönelimin hem de ışık stimülasyonuna maruz kalırken gerçekleşen doygunluğun takip edilmesine olanak sağlayan opto-membran besleyiciyi tanımlamaktadır. Opto-membran besleyici deneyi, serbest uçuş sisteminde konakçı arama ve kan beslemenin tüm davranışsal dizisini araştırmak için kullanılır. Her bir deney için beklenen çıktıların yanı sıra, deneyler sırasında sivrisinek vücut parçalarını takip etmek ve davranışları tanımlamak için kullanılan makine görme modelleri açıklanmıştır. Opto-termosiklet, kan battaniyesi ve opto-membran besleyici deneyleri, ışıkla nöral aktivite manipüle edilirken sivrisinek kan besleme davranışının farklı aşamalarının ölçülmesini sağlar. Bu yenilikçi teknikler, sivrisinek nöral devrelerinin halk sağlığına tehdit oluşturan davranışları nasıl kontrol ettiğinin incelenmesine olanak tanır.

Protokol

Bu protokolde kullanılan sivrisinekler transgenler içermektedir ve Amerika Birleşik Devletleri Tarım Bakanlığı düzenlemeleri uyarınca, Arthropod Containment Level II tesislerinde yetiştirilmelidir32. Sivrisinekler, kaçışlarını önlemek için muhafaza edilir ve biyotehlike atığı olarak imha edilir. Biyogüvenlik ve eklembacaklı muhafaza protokolleri, Yale Environmental Health & Safety tarafından incelenmiş ve onaylanmıştır. Bu çalışma kapsamında insan veya hayvan denekler kullanılmamıştır. Sivrisinek genotipi, floresan belirteçlerle (Gr3-QF2 için 3xP3-dsRed ve QUAS-CsChrimson için 3xP3-CFP) veya eklenen konstrükt için PCR ile doğrulanabilir8. Bu çalışmada kullanılan tüm malzemeler Malzemeler Tablosunda listelenmiştir.

1. Optogenetik yetiştirme

  1. Deneyler sırasında optogenetik hatların yanıtını maksimize etmek için aşağıdaki istisnalarla, standart protokole31 göre sivrisinekleri yetiştirin.
  2. Heterozigot deneysel hatlar olan Gr3-QF2/+, QUAS-CsChrimson/+ ve Gr3>CsChrimson hatlarını oluşturmak için homozigot Gr3-QF2, QUAS-CsChrimson ve vahşi tip Liverpool suşlarını kullanarak çaprazlamalar yapın.
  3. Sivrisinekleri 28 °C ve %80 nemle ayarlanan, 14 saat mavi ışık (450 nm) ve 10 saat karanlık döngüsünde (Şekil 1B), ışık sızdırmaz bir inkübatör içinde yetiştirin.
    NOT: Mavi ışık kullanımı, CsChrimson gibi kırmızı ışıkla aktive olan kanalların aktivasyonunu minimize eder. İnkübatör dışında gerçekleştirilen tüm yetiştirme adımları düşük ışık koşullarında yürütülmelidir.
  4. Yetişkin sivrisineklerle deneylere en erken eklozyondan (çıkıştan) 1 hafta sonra başlayın.
    NOT: Davranışsal deneyler için ideal yaş 2–3 hafta olsa da, eklozyondan sonra 4 haftaya kadar olan sivrisinekler kullanılabilir. Kontrol ve deneysel genotipler aynı yaşta olmalı ve bu yaş eklozyon sonrası gün sayısı olarak kaydedilmelidir. Hayvan yaşlarını standardize etmek için tüm yumurtalar aynı günde açtırılmalıdır.
  5. Deneyden iki gün önce, çiftleşmiş ve kan emmemiş dişi sivrisinekleri kafeslerden nazikçe aspire ederek çekin ve 4 °C'de anesteziye alın. Bir tüy veya aspiratör kullanarak, kullanılan analize göre deneysel kaplara dikkatlice aktarın.
  6. -20 °C'de saklanan, dimetil sülfoksit (DMSO) içinde 0.2 M all-trans retinal (ATR) alikotu hazırlayın. Kabın ağındaki emdirilmiş pamuk fitiller aracılığıyla %10 sükroz ve 400 µM ATR sağlayın. Hayvanlar bu besinle karanlıkta 1–3 gün boyunca beslenebilir.
    NOT: Mavi ışık altında değil de karanlıkta besleme yapmak, ATR'nin ağarmasını önler (Şekil 1B). Ayrıca, protokolün tüm adımlarında sivrisinekler, artık hareket etmeyene kadar 5–10 dk boyunca 4 °C'ye maruz bırakılarak anestezi altına alınmıştır. Her deneyin sonunda, sivrisinekler 24 saat boyunca -20 °C'ye maruz bırakılarak ötanize edilmiştir.
    UYARI: All-trans-retinal cilt ve gözle temas ettiğinde şiddetli irritasyona neden olabilir. İşlem sırasında laboratuvar önlüğü, eldiven ve göz koruması gibi uygun kişisel koruyucu donanım (KKD) kullanın. Dimetil sülfoksit, temas halinde cilt yoluyla emilebilen yanıcı bir sıvıdır ve uygun KKD ile göz koruması eşliğinde kuru bir ortamda taşınmalıdır. DMSO ayrıca yangına dayanıklı kimyasal depolama kaplarında saklanmalıdır.
  7. Deneyden bir gün (20–24 sa) önce, sükroz besleyicileri distile su ve 400 µM ATR içeren yeni besleyicilerle değiştirin. Hayvanlar deneye kadar karanlıkta kalır (Şekil 1B). Bölüm 2, 3 veya 4'e geçin.
    NOT: Yanıt oranını maksimize etmek için deneyler, sivrisineklerin gündüz fotoperiyodu sırasında yürütülmelidir.

2. Opto-termosikletleyici

  1. Analiz bileşenlerinin birleştirilmesi
    1. Sivrisinekleri hapsetmek için akrilik plakaları hazırlayın (Şekil 2). Bakınız Şekil 2A bir diyagram için, Şekil 2B elektronik bileşenler için, ve Şekil 2C ... için bir görüntüde akrilik plaka. Şablonlar için (https://github.com/sorrellslab/opto-thermocycler/releases/tag/v1.0.0) adresindeki dosyalara bakınız.
      1. Duvarları oluşturmak için, 3 mm'lik bir akrilik plakayı lazerle dört adet 10 cm x 1 cm'lik ve altı adet 7 cm x 1 cm'lik dikdörtgenlere kesin. Dikdörtgenleri, her bir birimin 17 mm x 17 mm x 10 mm boyutlarında bir hazne olduğu beş x üçlük bir matris şeklinde akrilik yapıştırıcı ile sabitleyin. Bu parçaların şablonu “... file dosyandadır.14_hayvan_kalın_v3.ai”.
        ​DİKKAT: Akrilik yapıştırıcı yanıcıdır; solunum yolu tahrişine ve göz tahrişine neden olabilir. Akrilik yapıştırıcı ile çalışırken eldiven, laboratuvar önlüğü ve koruyucu gözlük gibi uygun kişisel koruyucu donanımlar (KKD) kullanılmalı ve bu çözücü, açık alevden uzak, iyi havalandırılan bir alanda kullanılmalıdır.
      2. Hazne tabanı için, sağ alt kuyucuğu çıkarılmış olacak şekilde, 1,5 mm kalınlığındaki bir akrilik levhayı 6,985 cm x 10,16 cm ölçülerinde kesin. Kapak için, 1,5 mm kalınlığındaki bir akrilik levhayı 6,985 cm x 10,16 cm boyutlarında bir dikdörtgen şeklinde kesin. Bu parçaların şablonu “14_hayvan_ince_v3.ai”.
    2. UV dirençli siyah gözenekli bir levhayı, alt akrilik parçayla aynı boyutta olacak şekilde kesin (Şekil 2C). Izgarayı plaka duvarları ile alt parça arasına yerleştirin, ardından akrilik yapıştırıcı ile sabitleyin. Deliğin açık kalması için ızgarayı sağ alt kuyucuktan çıkarın.
  2. Kamerayı ve LED'leri tutacak bir çerçeve oluşturun (Şekil 2A).
    1. 60,96 cm uzunluğunda, 25 mm kare optik konstrüksiyon rayları kullanarak termosikletörün her köşesine dört direkli bir iskelet kurun. Tezgahtan 30 cm uzaklıkta, ön sağ direği arka sağ direğe ve ön sol direği arka sol direğe bağlamak için iki adet 22,86 cm, 25 mm konstrüksiyon rayı kullanın.
    2. Önde sağ ve sol sütunları, tezgahtan 24 cm yükseklikte 30,48 cm uzunluğunda ve 25 mm'lik bir konstrüksiyon rayı ile; arkada ise tezgahtan 42 cm yükseklikte 30,48 cm uzunluğunda ve 25 mm'lik bir konstrüksiyon rayı ile birbirine bağlayın.
    3. Çerçevenin sol ve sağ tarafındaki konstrüksiyon rayına 1 fit uzunluğundaki optik destekleri takın. Seri bağlanan altı adet 627 nm (kırmızı) LED'i, termosayklının PCR bloğunun 24 cm üzerine gelecek şekilde her bir desteğe bağlayın.
      NOT: CsChrimson'un pik aktivitesine neden olan ışık dalga boyu ~590 nm olsa da, ~625 nm civarındaki dalga boyları, CsChrimson'u aktive etme gereksinimi ile genetik kontrollerdeki ışığa karşı verilen davranışsal tepkilerden kaçınma ihtiyacı arasında bir denge sağlar27Işığı termosiklet bloğuna doğru odaklamak için her bir LED'e bir soğutucu ve mercek bantlayın.
    4. 30,48 cm'lik bir optik postu, öndeki iki konstrüksiyon ray sütununun üst kısmına sabitleyin. Optik postun orta kısmına bir dik açı klempi kullanarak, termosiklatör bloğunun üzerinde içe bakacak şekilde 15,24 cm'lik bir optik post takın. Bloğun 40 cm üzerine, ucu aşağı bakacak şekilde, kızılötesi uzun geçiren filtreli bir kamerayı sabitleyin.
    5. Optik postlar kullanarak, konstrüksiyon rayından uzanan ve PCR bloğunun etrafında, yüzeyin hemen üzerinde yükselen dikdörtgen bir çerçeve oluşturun. Sivrisinekleri kameraya dik açıyla aydınlatmak için, PCR bloğuna bakan bir kızılötesi LED şeridi sabitleyin.
      NOT: Video görüntüleme için kullanılan kızılötesi aydınlatma, termosiklet yüzeyi 24°C'de tutulduğundan arenayı ölçülebilir düzeyde ısıtmaz. °deney boyunca C.
    6. Ortam ışığının girişimini önlemek için yapının üzerine ışık geçirmez bir perde örtün.
    7. Koyu bir arka planla beraber düz ve eşit bir yüzey oluşturmak için PCR bloğunun yüzeyini ve yanlarını tek bir katman ışık geçirmeyen bantla kaplayın.
    8. Termokupl sensörünü PCR bloğunun sağ alt köşesine yerleştirin ve ışık sızdırmaz bantla sabitleyin. Bir güç ölçer kullanarak PCR bloğu boyunca ışık dağılımının homojen olduğunu doğrulayın. Işığı 12 düzeyinde iletmek için güç kaynağı voltajını veya akımını ayarlayın. µW/mm2.
    9. PCR bloğunun kenarına, videoyu stimülasyon verme çıktısıyla senkronize etmek için bir kızılötesi LED yerleştirin (Şekil 2C). Kamerada parlama oluşturmadan ışığın tespit edilebilmesi için yüzeyi siyah bantla kapatın.
    10. Termokuplu, senkronizasyon LED'ini ve kırmızı ışık LED'lerini şemadaki şekilde bağlayın Şekil 2BGerekli yazılımları indirin (SpinView (versiyon 1.27.0.48), CoolTerm (versiyon 2.0.1), Arduino IDE (versiyon 1.8.12)). Arduino kodunu ve termosiklatör programını GitHub deposundan indirin.
      ​NOT: Arduino kodu; kırmızı ışık, vücut sıcaklığında ısı ve her iki uyarıcının kombinasyonunu sunacak şekilde programlanmıştır. Kaynak olarak sunulan, uyarıcı sırasının kendi aralarında rastgele belirlendiği yedi adet uyarıcı programı bulunmaktadır. Bunlar, farklı uyarıcılar sunmak için modifiye edilebilir. Deney başına dokuz uyarıcı uygulanır: üçü sadece ısı, üçü sadece ışık ve üçü ise eş zamanlı olarak ısı ve ışıktır. Uyarıcı iletimi, Arduino'nun termokupl aracılığıyla PCR bloğunun yüzey sıcaklığındaki değişimleri tespit etmesi ve ardından belirlenen zamanlarda ışık uyarıcılarını iletmesiyle gerçekleşir. Ek ayrıntılar, uyarıcı programlarının içindeki açıklamalarda bulunabilir.
  3. Deney hazırlığı
    1. Sivrisinekleri optogenetik yetiştirme protokolüne göre yetiştirin; bkz. Bölüm 1 ve Şekil 1B.
    2. Deneyden iki gün önce, 14 dişi sivrisineği bir aspiratör yardımıyla ayrı bir kaba aktarın. Sivrisineklere adım 1.6'ya uygun olarak ATR sağlayın. Eğer birden fazla genotip karşılaştırılıyorsa, bunları deney yapana karşı körleyin.
      ​NOT: Sivrisinekler ATR aldıktan sonra loş ışık altında tutulmalıdır.
    3. Deneyden bir gün önce (20–24 sa), akrilik plaka başına 14 dişi sivrisineği aspire edin ve 4°C'de anesteziye tabi tutun °C. Her bir kuyucuğa, bir tüy veya aspiratör kullanarak her seferinde bir sivrisinek gelecek şekilde dikkatlice yerleştirin.
    4. Kapağı sabit tutmak için akrilik plakanın yan tarafını Scotch bant ile bantlayın. Kameranın görüş alanını engelleyeceği için bandı akrilik plakanın üst veya alt kısmına katlamayın.
    5. Akrilik plakayı, 400 µL ile ıslatılmış üç adet pamuk fitilin üzerine yerleştirin. µSaf su içindeki M ATR (bkz. Adım 1.6), paralel olarak yerleştirilmiştir. Üçünün her birini hizalayın tüm sivrisineklerin su-ATR çözeltisine erişebilmesi için fitillere sıralar halinde yerleştirin. Akrilik plakayı gece boyunca karanlık bir inkübatöre yerleştirin.
  4. Deneyin yürütülmesi
    1. Kamerayı, LED'leri ve Arduino'yu bilgisayara bağlayın. Güç kaynağını açın. Opto-termosaykler yüzeyini %70'lik etanol ile silin ve kurumasını bekleyin.
      ​DİKKAT: Etanol yanıcıdır ve ciddi göz tahrişine neden olabilir. Etanol ile çalışırken uygun kişisel koruyucu donanım (KKD) kullanılmalıdır. Ayrıca, açık alevden kaçınılmalıdır.
    2. Karanlık bir kap kullanarak, sivrisineklerin bulunduğu akrilik plakayı PCR bloğunun ortasına aktarın. Opto-termosaykler'in üzerini ışık geçirmeyen bir perde ile örtün.
    3. Bilgisayarda SpinView'i açın. Kamera görünümünü açmak için kamera adına tıklayın. Kızılötesi ışıkları takın ve PCR bloğu ile akrilik plakanın kamera görünümünde göründüğünden emin olun.
    4. Gerekirse, akrilik plakayı hizalı ve merkezli olacak şekilde ayarlayın ve termokuplun akrilik plakanın sağ alt köşesinde göründüğünden emin olun. Senkronizasyon ışığının çerçeve içinde olduğundan emin olun (Şekil 2C).
    5. Akrilik plakayı gösteren net ve kırpılmış bir video elde etmek için kamera ve SpinView üzerindeki ayarları düzenleyin. Görüntü Formatı sekme, ayarla Genişlik, Boy, Ofset Xve Y Ofseti akrilik plakanın ve senkronizasyon ışığının görünür olduğundan emin olmak için seçenekler. Şuradaki Ayarlar sekme, set Kazanım Kare Hızı Etkinleştir Bu bölüme; doğru ve Kazanım Kare Hızı Siz henüz bir kaynak metin sağlamadınız. Lütfen çevirmemi istediğiniz İngilizce metni gönderin. 30 fps.
    6. Döndürün Otomatik Pozlama ve Otomatik Kazanç kapatın. Şunu ayarlayın Pozlama Süresi ve Kazanç Siyah arka plan ile sivrisinekler arasında net bir kontrast oluşturmak için değerleri ayarlayın. Video dosyasını kaydetmek için ayrı bir pencere açmak amacıyla sağ üst köşedeki kırmızı kayıt düğmesine tıklayın.
    7. Açılır pencerede, üst kısımdaki dosya yolunu ayarlayın: Tıklayın Göz Atdeney klasörüne gidin, tıklayın Yeni klasörve bunu deneme adıyla etiketleyin. Kaydedilecek kare sayısını deney için uygun sayıya (örneğin 43.500) veya kaydı manuel olarak durdurmak için 0'a ayarlayın.
    8. Videolar sekmesinde, şu alanları ayarlayınVideo Kayıt Türü: MJPG, Video Dosyası Bölme Boyutu: 1000 MB, JPEG Sıkıştırma Kalitesi: 65. ‘...’ kısmını açın.optotermo_isikisi_rastgele1termosaykler üzerindeki programı seçin ve başlatın. Termosaykler, 25°C'deki bir bekleme adımıyla başlamalıdır. °C.
    9. Uygun programı açın, ‘TC_optothermo_isikisitma_rastgele1.ino', Arduino IDE üzerinden karta yükleyin. Seri monitörü açın ve sıcaklığın yaklaşık 25 olduğundan emin olun °C.
    10. Arduino IDE'deki seri monitörü kapatın. Arduino seri monitör çıktısını almaya başlamak için CoolTerm'i açın. Seri portun ve kanalın Arduino IDE'dekilerle eşleştiğinden emin olun. Çıktı, CoolTerm penceresinde görünmeye başlayacaktır.
    11. Arduino çıktısının bir Metin/İkili dosyaya kaydedilmesine başlayın. Spinview üzerinde video kaydını başlatın. Tıklayın Özgeçmiş termosaykletörün bekletme aşamasını sonlandırmak için. Sıcaklığın 18'e düşüp düşmediğini kontrol etmek için CoolTerm'deki Arduino çıktısını izleyin °C ve uyaran sayacı 1'e yükselerek denemeyi başlatır. Deneme tamamlanana kadar analizin çalışmasına izin verin.
  5. Temizlik
    1. Video kaydını ve CoolTerm çıktı alımını durdurun. Her iki programı da kapatın. Termosiklör programını sonlandırın. Sivrisineklerin bulunduğu akrilik plakayı termosiklorden çıkarın ve -20°C'ye yerleştirin. °Sivrisinekleri ötanize etmek için gece boyunca dondurucuda bekletin.
      ​DİKKAT: Transgenik sivrisinekleri itlaf ederken, -20°C'de kaldıklarından emin olun °Ölümü sağlamak için biyogüvenlik tehlike kutusuna atmadan önce en az 24 saat boyunca C ortamında bekletin.
    2. Başka bir denemeye başlanacaksa, bölüm 2.3 tekrarlanır. Kamera ve Arduino kabloları çıkarılır. Güç kaynağı kapatılır. Kızılötesi LED'lerin bağlantısı kesilir. Scotch bantlar çıkarılıp ölü sivrisinekler atılarak akrilik plakalar temizlenir.
    3. Kapağa ve akrilik plakaya %70'lik etanol püskürtün ve kuyucukların ve gözenekli yapının tüm kenarlarını eldivenli bir parmakla dikkatlice silin. Deiyonize su ile iyice durulayın, ardından çizilmeleri önlemek için kapakları kağıt havlu ile ayırarak akrilik plakaları saklama için üst üste dizin.

3. Kan battaniyesi testi

  1. Analiz bileşenlerinin birleştirilmesi (Şekil 3)
    1. Opto-termosiklet analiz düzeneğini bölüm 2.1'de açıklandığı şekilde kurun. Analiz düzeneği (Şekil 3A), termal stimülasyon (Şekil 3B) ve alüminyum plaka (Şekil 3C) için şekillere bakın.
    2. Şekil 3C'de görüldüğü gibi bir alüminyum kan besleme plakası hazırlayın.
      1. Bir lazer kesici veya su jeti kesici kullanarak plakanın üst ve alt kısmını oluşturun. Plakanın alt kısmını, 0,8 mm kalınlığındaki bir alüminyum levhayı 90 mm x 134 mm boyutlarında keserek hazırlayın. Üst kısmı, 1,6 mm kalınlığındaki bir alüminyum levhayı 90 mm x 134 mm boyutlarında keserek hazırlayın. Üst plakaya 15 adet dikdörtgen delik (17,2 mm x 18,6 mm) açın. Şablon dosyaları, blood blanket GitHub deposunda (https://github.com/sorrellslab/bloodblanket) “Aluminum plate templates” başlığı altında bulunabilir.
      2. Sızıntıyı önlemek için alüminyum parçalar arasına ince bir silikon conta (0,5 mm kalınlığında) yerleştirin. Alüminyum üst kısmın şekline uygun olarak bir lazer kesici ile kesin.
      3. Katmanları sekiz adet 0,47625 cm, kubbe başlı hex 4–40 standart cıvata ile birbirine tutturun. Metal parçalarda cıvatalar için diş açmak üzere bir kılavuz kullanın. Termosiklet bloğunun üzerine yerleştirildiğinde ek güvenlik sağlamak için bunları plakanın alt kısmındaki yuvarlak ve “W” pullar aracılığıyla bağlayın.
    3. Blood blanket analizi için gerekli Arduino kodunu ve termosiklet programını GitHub deposundan (https://github.com/sorrellslab/bloodblanket) indirin.
    4. 25 mM NaHCO3 içinde 20 mM ATP aliquotları hazırlayın ve kullanıma kadar -20 ˚C'de saklayın.
      ​NOT: Her altı ayda bir taze ATP çözeltisi hazırlayın. Tekrarlanan dondurma-çözme döngülerinden kaçının. 1 M NaHCO3 ve 5 M NaCl hazırlayın (her birini oda sıcaklığında saklayın). NaHCO3 çözeltide sadece 7 gün boyunca stabildir.
  2. Deney hazırlığı
    1. Sivrisinekleri bölüm 1 ve 2.2'de açıklandığı şekilde yetiştirin ve akrilik plakalara aktarın. Farklı genotipler arasında karşılaştırmalar yapılacaksa, bunları deneyciye karşı körleştirin.
    2. Deney günü, 8,83 mL deiyonize suya 750 µL 20 mM ATP, 220 µL 5 M NaCl ve 200 µL 1 M NaHCO3 stok çözeltileri ekleyerek 10 mL minimal yapay kan öğünü (110 mM NaCl, 20 mM NaHCO3 ve 1,5 mM ATP) hazırlayın. Ters çevirerek iyice karıştırın.
      NOT: Yapay kan öğününü her deneyden önce taze olarak hazırlayın.
    3. SpinView kaydını 2.3.4 ile 2.3.8 arasındaki adımlara göre kurun.
    4. Deney için “Red-light-Only__BB_.ino” Arduino dosyasını (veya istenen stimülasyon dosyasını) açın.
  3. Denemelerin yürütülmesi
    1. Minimal yapay kan öğününün 650 µL'sini, her kuyucuğun tamamen dolduğundan ve taşma yapmadığından emin olarak plakanın her bir kuyucuğuna pipetleyin.
    2. 10,2 cm x 10,2 cm boyutlarında bir parafilm karesini 20,3 cm çapındaki bir halka üzerinde gerin. Parafilmi, kenarları yapışana kadar bastırarak plakanın üzerine yerleştirin. Bir skapel kullanarak, plakanın etrafında 1,3 cm genişliğinde bir kenar kesin ve kan öğününü mühürlemek için fazla parafilmi altına kıvırın.
    3. Maksimum ısı transferini sağlamak için plakayı doğrudan PCR bloğunun üzerine yerleştirin (Şekil 3A).
      NOT: Opto-termosiklet için PCR bloğunun yüzeyinde karartma bandı kullanılır, ancak blood blanket için kullanılmaz.
    4. Termokuplu, alüminyum plakanın sağ alt köşesindeki parafilm yüzeyine yerleştirin. Kamerayı, LED'leri ve Arduino'yu bilgisayara bağlayın. Güç kaynağını açın. Termosikletteki “BB_thermocycler_program.x50prog” programını başlatın.
      NOT: Sıcaklık değişim hızı, bir sivrisineğin beslenmek için bir konak üzerine konmasını en iyi şekilde taklit etmek amacıyla seçilen termosikletin maksimum rampalama hızıdır.
    5. Işık maruziyetini minimize etmek için karanlık bir kap ve loş oda ışıkları kullanarak, sivrisineklerin bulunduğu akrilik plakayı, her kuyucuğun sivrisineklerle hizalandığından emin olarak alüminyum plaka üzerine aktarın. Yapay kan öğününün sıcaklığını ölçmek için termokuplun plakanın sağ alt köşesinde ve parafilmle temas halinde olduğundan emin olun.
    6. “Red-light-Only__BB_.ino” programını Arduino IDE'de yeniden yükleyerek programı başlatın. Seri monitörü kapatın. Güncel sıcaklığı görmek için CoolTerm'de Connect düğmesine basın. Bu başlangıç sıcaklığını kullanarak, Arduino betiğindeki tetikleme sıcaklığını bunun yaklaşık 0,6 °C altına ayarlayın.
    7. CoolTerm penceresinde Capture to Text/Binary File seçeneğini belirleyin ve veri toplamayı başlatın. SpinView'deki kayıt penceresinde video kaydını başlatın. Termosikletin bekletme aşamasını sonlandırmak için Resume düğmesine tıklayın. Isı düşüşünün tespit edildiğinden ve denemenin başladığından emin olmak için CoolTerm üzerindeki Arduino çıktısını izleyin.
    8. Deneme süresi dolduğunda Stop Recording düğmesine tıklayın. CoolTerm'deki Capture to Text/Binary File sekmesinde, seri çıktıyı yazmayı durdurmak için Stop seçeneğini belirleyin.
    9. Sivrisinek plakasını blood blanket plakasından çıkarın ve onları anestezi altına almak için soğuk odaya taşıyın. Yapay kan öğünü içeren, karınları şişmiş sivrisinekleri, kısmen beslenmiş olanlar da dahil olmak üzere, doygun olarak sayın.
    10. Denemeler arasında, PCR bloğunun yüzeyini %70 etanol ile nemlendirilmiş bir Kimwipe ile silerek temizleyin. Parafilmi çıkarın ve alüminyum plakayı deiyonize su ile durulayın. Sonraki denemeler için 3.3 bölümünü tekrarlayın. Sirkadiyen aktivite döngülerinin etkisini minimize etmek için denemelerin sırasını günler arasında döndürün.
  4. Temizlik
    1. Tüm programların kaydını durdurun ve çıkış yapın. Kameranın, Arduino'nun ve kızılötesi ışıkların USB kablolarını çıkarın. Bilgisayarı kapatın. Termosiklette çalışan “thermocycler_program.x50prog” programını durdurun.
    2. Sivrisinekleri öldürmek için sivrisinek plakalarını bir gece boyunca -20 °C'lik dondurucuya yerleştirin. Alüminyum plakayı deiyonize su ile yıkayın. Akrilik plakayı %70 etanol ile yıkayın, ardından deiyonize su ile durulayın ve daha fazla sivrisinek yüklemeden önce kuruması için bir gece bekletin.
      NOT: Nem kalmadığından emin olmak için plakalar yıkandıktan sonra bir gece boyunca kurutulmalıdır. Nem kalması durumunda, bu durum kapakta yoğuşmaya neden olacak ve videoyu etkileyecektir.

4. Opto-membran besleyici deneyi

  1. analiz bileşenlerinin birleştirilmesi (Şekil 4)
    1. Opto-mekanik bileşenler ve 30,48 cm boyutlarında bir... kullanarak bir çerçeve oluşturun 30,48 cm boyutlarında, siyah, 0,635 cm kalınlığında akrilik platform. Bir lazer kesici kullanarak akriliğin merkezinde 11,43 cm çapında bir delik açın. Akriliğin, tabanın yaklaşık 23,495 cm üzerinde bulunan çerçeve destekleri üzerine oturmasını sağlamak için her köşeden 2,54 cm uzaklıkta delikler kesin.
    2. Merkeze, 19,05 cm iç çaplı ve 20,32 cm dış çaplı siyah akrilik bir halka takın (Şekil 4A). Tüm akrilik bileşenlerin şablonları, Arduino programlarıyla birlikte opto-membrane feeder GitHub deposunda (https://github.com/sorrellslab/opto-membranefeeder/releases/tag/v1.0.0) yer almaktadır. Genel düzeneği görmek için şekle bakınız (Şekil 4A), uyaran (Şekil 4B), devre şeması (Şekil 4C), ve video durgun görüntüsü (Şekil 4D).
      ​NOT: Bu platformun kurulumunda kullanılan spesifik malzemeler kritik öneme sahip değildir, bu nedenle daha maliyet etkin seçenekler mevcut olabilir.
    3. Kızılötesi uzun geçiren filtreli bir kamerayı, orta deliğin altına, sivrisinek tüpüne doğru yukarı bakacak şekilde yerleştirin. Tüpün ağ kısmındaki örgüye seçici odaklama yapabilmek için diyaframı tamamen açık konuma getirin (Şekil 4A).
    4. Kanisterleri hazırlamak için 11,43 cm çapındaki şeffaf polikarbonat bir tüpü 12,7 cm'lik silindirik segmentler halinde kesin.
      1. 0,3175 cm kalınlığındaki akrilikten 11,43 cm çapında daireler lazerle kesilerek kanisterlerin tabanları oluşturun. Dairelerin kenarları, tüpün içine yerleşebilmeleri için lazerle oyulmuştur. Plastik epoksi ile tüplere sabitleyin.
      2. Siyah 0,635 cm ve 0,3175 cm akrilik ve UVye dayanıklı siyah ağ kullanarak bir ara kapak oluşturun. İç halkanın çapı 10,795 cm, dış halkanın çapı ise 12,065 cm'dir; siyah ağ küçük halkanın üzerine gerilmelidir. Ağ, lazerle kesilmiş deliklerden mumlu iple dikilmelidir.
        ​NOT: Videonun kaydedildiği akrilik tabanların çizilmesini önlemek için kanisterler her zaman kağıt havlu üzerine yerleştirilmelidir.
    5. Kan öğünü iletimi için akrilik kapların yapımı (Şekil 4A).
      1. 0,15875 cm kalınlığındaki şeffaf akrilikten, 5,08 cm iç çap ve 6,6 cm dış çapa sahip bir halka kesin. Bunu, akrilik yapıştırıcı kullanarak 5,842 cm iç çap ve 6,604 cm dış çapa sahip başka bir şeffaf halkaya sabitleyin.
      2. 13,97 cm yüksekliğinde ve 19,05 cm çapında metal örgü bir silindiri, platformun merkezindeki siyah akrilik halkanın içine yerleştirin.
      3. Metal örgü içerisine, kanisterin dış yüzeyinden 3,81 cm uzaklıkta konumlandırılmış ve siyah akrilik platform üzerinde duran bir Arduino Uno kartı ile kontrol edilecek olan bir RGB LED ışık bobini yerleştirin (Şekil 4C).
      4. Bir güç ölçer kullanarak silindirin içindeki ışık yoğunluğunu ölçün ve arena 3,5–6 arasında aydınlanacak şekilde ışıkların konumunu ayarlayın. µW/mm2Metal tel örgünün dış kısmına, 850 nm kızılötesi LED'lerden oluşan bir halkayı, içe bakacak şekilde plastik kelepçelerle çerçeveye sabitleyin.
    6. Bir USB kablosunu Arduino Uno kartına takın ve bilgisayara bağlayın. Kameradan bilgisayara bir USB kablosu bağlayın. İnternet bağlantısını kapatın.
    7. Opto-membran yapısını 26°C'de karanlık bir inkübatöre veya çevreleme odasına yerleştirin. °deneyler boyunca %80 bağıl nem ve C sıcaklığında.
  2. Sivrisinek kanisterlerinin hazırlanması
    1. Deneyden önce, sivrisinek kanisterlerini %70'lik etanol püskürterek yıkayın ve yumuşak bir süngerle nazikçe silin. Kanisterleri deiyonize su ile durulayın ve gece boyunca hava yoluyla kurumaya bırakın.
    2. Deneyden iki gün önce, erkek ve dişi sivrisinekleri soğuk anestezi altında ayırın ve her bir kanistere 20 dişi yerleştirin. Adım 1.6'ya göre ATR'ye erişim sağlayın.
    3. Bu aşamada, genotipler deney yapan kişiye karşı körlenmiş olmalıdır. Deney zamanlamasından kaynaklanan davranışsal sonuç farklılıklarını en aza indirmek için denemelerin sırası günler arasında değiştirilmelidir.
  3. Denemelerin yürütülmesi
    1. Kan öğününü hazırlamak için, 45 derecelik bir [cihaz/su banyosuna] 119 mL'lik su şişeleri yerleştirin. °C ısı banyosu, her deney için bir adet. Bu hacim ve sıcaklık, kan öğününü deney boyunca vücut sıcaklığına yakın tutar.
    2. Defibrine edilmiş koyun kanından 5 mL'lik alikotlar hazırlayın. 4°C'de saklayın. °Kullanmadan önce ayrışmayı önlemek için C ve ters çeviriniz. Her deneyden önce kan öğününü taze olarak hazırlayınız.
      DİKKAT: Patojen maruziyetini en aza indirmek için defibrine koyun kanı, uygun KKD (kişisel koruyucu donanım) kullanılarak işlenmelidir. Kanla temas eden yeniden kullanılabilir malzemeler %10'luk çamaşır suyunda bekletilmeli ve DI (deiyonize) su ile durulanmalıdır. Çamaşır suyu ciltte ve gözlerde şiddetli irritasyona neden olabileceğinden, işlem boyunca uygun KKD giyilmelidir.
    3. İlk kan alikotunu 45'lik bir tüpe yerleştirin °denemeden önce en az 20 dakika boyunca C derecelik su banyosunda ısıtın. ATP'yi buz üzerinde çözdürün. 5,08 cm boyutunda bir... akrilik kapağın üzerindeki daha büyük, düz dairenin bulunduğu tarafa 5,08 cm kare şeklinde parafilm yerleştirerek kan öğünü için bir kuyucuk oluşturun (Şekil 4A).
    4. İnsan kokularını gidermek için bilgisayarı %70'lik etanol ile silin. Bilgisayarı harici bir sabit sürücüye bağlayın. Kamerayı ve Arduino'yu bağlayın. RGB ve kızılötesi ışıkları bir güç kaynağına takın.
    5. SpinView yazılımını ve uygun stimülasyon için Arduino dosyasını açın. Deney verilerini saklamak için harici sabit sürücüde bir klasör oluşturun. Şunu yükleyin: “blue_only.ioRGB LED'lerden arenaya 471 nm'de sönük mavi ışık sağlamak için Arduino dosyası (şuna göre: Şekil 4B).
    6. Sivrisinekleri aşırı CO2'ye maruz bırakmadan2 nefesten sonra, deneme için kullanılan kanisteri inceleyin ve deney öncesindeki ölümleri kaydedin. Kanisteri merkeze yerleştirin ve uyaran maruziyeti öncesinde, loş mavi ışık altında 10 ila 20 dakika boyunca aklimatizasyona izin verin.
      ​NOT: Alıştırma adımı ve deney, tam karanlık sivrisinek uçuşunu engellediği için loş mavi ışık altında gerçekleştirilir.
    7. Video yakalamayı etkinleştirin
      1. SpinView programında kamerayı seçin. Ayarlar sekmede, açık renkli böcekler ile koyu arka plan arasında yüksek kontrastı korumak için gerektiği gibi pozlamayı ve kazancı ayarlayın (Şekil 4D).
      2. Video yakalama ayarlarını düzenlemek için üst çubuktaki kırmızı kayıt düğmesine tıklayın. Şuraya tıklayarak dosya yolunu belirleyin Göz Atardından harici sabit sürücüye gidin. Her deneme için tanımlayıcı bir isme sahip yeni bir klasör oluşturun. Klasör isminde boşluk bırakmayın.
      3. İçinde Kaydetme Seçenekleri sekme, seçin 0 kare yakalayınvideonun manuel olarak durdurulana kadar kaydedilmesini sağlayacaktır. Altında Kayıt Modu, seçin TamponlanmışVideolar sekmesinde şu alanları ayarlayın: Video Kayıt Türü: MJPG, Video Dosyası Bölme Boyutu: 1000 MBve JPEG Sıkıştırma Kalitesi: 65.
    8. Uyaran maruziyetinden hemen önce, 500 pipetleyin µhazırlanan 5 mL'lik kan alikotuna, 2 mM nihai ATP konsantrasyonu elde edecek şekilde 20 mM ATP'den [miktar belirtilmemiş] L ekleyin. Karıştırmak için tüpü birkaç kez ters yüz edin.
    9. ATP-kan çözeltisini kan öğünü kabına dökün. Kan öğününün üzerine, içi 45 ml ile doldurulmuş ters çevrilmiş 119 ml'lik bir şişe yerleştirin. °Deney boyunca kanın sıcaklığını insan vücut sıcaklığına yakın tutmak için C suyu kullanılır.
    10. SpinView yazılımında, Kaydı Başlat'ı seçin. Sivrisinekleri nefesle uyarmadan, sivrisineklerin parafilm membranı delip geçebilmeleri için kan öğününü kanisterin gözenekli kapağının üzerine yerleştirin.
    11. Yükle belirli olan/o Arduino program için “1sON_10sOFF.io” (Şekil 4B), veya istenen stimülasyon. Bu işlem, “ şeklinde belirtilen süreye kadar her 10 saniyede bir 1 saniye boyunca 624 nm kırmızı ışık sağlayacaktır.blue_only.io” dosyası manuel olarak yüklenir. 624 nm dalga boyu, CsChrimson'u optogenetik olarak aktive etmek için yeterlidir.
    12. Bir sonraki deneme için kan alikotunu ısı banyosuna yerleştirin. Deneme 15 dakika boyunca sürdükten sonra, seçin Kaydı Durdur. “ yükleyinblue_only.iokırmızı ışık stimülasyonunu durdurmak için ” dosyası.
    13. Kan öğünü tutucusunu ve su şişesini çıkarın. Kanisteri çıkarın ve sivrisinekleri 4 derecede anesteziye alın. °C. Ek denemeler gerçekleştirmek için bölüm 4.3'e geri dönün. Kanla dolmuş karın bölgelerini kontrol ederek, anestezi uygulanmış sivrisinekleri görsel olarak inceleyin ve kanla beslenenlerin sayısını belirleyip kaydedin.
  4. Temizleme
    1. Tüm programları kapatın. Harici sabit sürücüyü çıkarın ve bilgisayar ile bağlantısını kesin. Bilgisayarı kapatın.
    2. Sivrisinek kanisterlerini, daha önce adım 4.2.1'de açıklandığı gibi temizleyin. Akrilik kan öğün tutucularını temizleyin. Yarım boyutlu bir polikarbonat tepsiyi 2/3 oranında suyla doldurun, ardından 100 mL çamaşır suyu ekleyin.
    3. Akrilik kan öğünü tutucularını ve plastik şişeleri kaba ekleyin. Bir kapakla kapatın ve 10 dakika boyunca bekletin. Çamaşır suyunu durulayın ve parafilmi çıkarın. Kan kalıntılarını temizlemek için nazikçe fırçalayın ve durulayın.

5. Davranış analizi

  1. Videoları ffmpeg (sürüm 8.0.1) kullanarak .mp4 dosyaları şeklinde sıkıştırarak analiz için hazırlayın. Video dosyaları bölünmüşse, herhangi bir video düzenleme yazılımını kullanarak bunları tek bir videoda birleştirin. Eğitim videolarını SLEAP (sürüm 1.4.1) içinde gri tonlamalı olarak açın.
    ​NOT: Video kayıt ayarları uygunsa, her şey çerçeve içinde olmalı ve hareket eden sivrisinekler bulanık görünmemelidir. Diğer vücut bölümü takip yazılımları da kullanılabilir. Bu çalışmada kullanılan SLEAP versiyonu 1.4.1'dir. Güncel protokoller için SLEAP dokümantasyonuna bakınız.
  2. değerlendirilen davranışlara göre hayvanların ilgili bölümlerini etiketleyen bir iskelet oluşturun (Şekil 2D, Şekil 3Dve Şekil 4E).
  3. “ şeklinde kullanımıRastgele kare” seçeneği altındaki Önerilen kare rastgele 10 kare seçin ve her sivrisineği bir örnek olarak etiketleyin. Sivrisineğin belirli bölümleri engellenmişse (örneğin, sondaj sırasında hortum ucu ağın içine girmişse), vücut parçasının yaklaşık konumunu etiketleyin. Etiketlenen kareler üzerinde bu ayarları kullanarak bir model eğitin.
    1. Yukarıdan Aşağıya çoklu hayvan modeli için (Opto-termosiklet ve kan battaniyesi modeli için kullanılır): Eğitim Hattı sekme, set Maksimum Örnek Sayısı e 14Centroid Model Configuration (Sentroid Model Yapılandırması) sekmesinde, şunları ayarlayın: Kırpma Boyutu Bu belgeye erişmek için lütfen giriş yapın. Otomatikve ayarlayın Plato Min. Delta -(me/ma)mak için / -e/-a / -ye/-ya 1e-04, set Plato Sabrı e 10set Adım genişliği -e / -a 8ve şu Sabitleme Parçası Lütfen çevrilecek metni sağlayın. toraks.
    2. Aşağıdan Yukarıya (Bottom-Up) çoklu hayvan modeli için (Opto-membran besleyici için kullanılır): Şurada/Şurada yer alan... Eğitim İş Akışı sekme, set Maksimum Örnek Sayısı Kime / -e, -a (yönelme durumu eki) maksimum yokBottom-Up Model Configuration sekmesinde, şunları ayarlayın: Kırpma Boyutu e Otomatikve ayarla Minimum Plato. Delta Sadece "to" ifadesini paylaştınız. Lütfen çevirmemi istediğiniz metnin tamamını gönderin. 1e-04, set Plateau Patience Sadece "to" kelimesini içeren bir metin ilettiniz. Bu kelime İngilizcede bir yönelme eki (-e/-a), mastar eki veya bir bağlaç olarak kullanıldığı için, bağlam olmadan tek başına çevrilmesi mümkün değildir. Lütfen çevrilmesini istediğiniz tam metni paylaşın. 10ve ayarla Adım uzunluğu şuna / -e / -a 16.
  4. Şu ayarlarla belirlenmiş sayıda kare üzerinde tahmin yapın: Inference Pipeline sekmesinde, opto-termosikletör ve kan battaniyesi için şunları ayarlayın: Maksimum Örnek Sayısı Lütfen çevirmemi istediğiniz metni sağlayın. 14, Takipçi e Basit, Maksimum iz sayısı ...e / ...a (yönelme durumu eki) 14ve Tek İz Kırılmalarını Bağlama e Doğru.
  5. Opto-membran besleyici için ayarlayın Maksimum yok için Maksimum Örnek Sayısı ve Maksimum kanal sayısı, İzleyici ve Basitve Tek Kanallı Kırılmaları Birleştirme ile / -e / -a DoğruTahmin edilen kareleri düzeltin ve yeniden eğitin. Eğitim veri kümesi üzerinde tahmin, etiketleme ve eğitim döngülerini tekrarlayın.
    NOT: Doğrulama, etiketli karelerin rastgele örneklenerek kontrol edilmesi ve (örneğin yanlış sivrisinek tespitleri, yinelenen tahminler, yanlış yönelim veya yanlış vücut parçası atamaları gibi) tutarlı hataların belirlenmesiyle, bu uç durumları içeren karelere odaklanılarak gerçekleştirilmiştir. Hata sıklığına bağlı olarak, 150 adede kadar etiketli kare gerekebilir. SLEAP, ek model doğrulaması için GUI tabanlı değerlendirme metrikleri de sunmaktadır. Görsel inceleme yeterli doğruluk ve kesinliği onayladığında, modeli deneysel videolara uygulayın ve davranış analizi için sonuçları .csv veya .h5 formatında dışa aktarın. Daha öncedde açıklandığı gibi, poz kestirimi çıktıları kullanılarak davranış sınıflandırıcıları eğitilebilir.8Davranışlar şu şekilde tanımlanmıştır: yürüme, bacak hareketiyle birlikte gerçekleşen translasyonel vücut hareketi; uçma, kanatlar açıkken gerçekleşen hızlı translasyonel hareket; temizlenme, vücut bölümleri (antenler, probosis, kanatlar veya bacaklar) üzerinde tekrarlayan bacak hareketleri ve araştırma, probosisin kabın altındaki gözenekli yapıdan içeri sokulması. Davranış sınıflandırıcıları şunları başarmalıdır: >İnsan tarafından yapılan açıklamalarla karşılaştırıldığında %90 doğruluk.
  6. Veriler tipik olarak normal dağılım göstermediğinden, non-parametrik testler seçilerek istatistiksel analiz gerçekleştirin. Çoklu karşılaştırmalar için düzeltme yaparak uygun post-hoc testleri uygulayın. Şişkinlik verileri için deneysel tekrarlar sivrisinek gruplarıyken, davranış verileri için tekrarlar bireysel sivrisineklerdir.

Sonuçlar

Şekil 1A'da gösterildiği gibi, sivrisineklerde konak arama ve kan beslenme davranışlarını gözlemlemek için üç davranış deneyi kullanılmıştır. Sirkadiyen ritimleri senkronize etmek ve deneylerin uyanıklık dönemlerinde yürütülmesini sağlamak amacıyla sivrisinekler mavi ışık-karanlık döngüsü altında (14:10 LD; Şekil 1B) yetiştirilmiştir. Deneylerden iki gün önce sivrisinekler tamamen karanlığa aktarılmış ve opsin kofaktörü ATR ile beslenmişlerdir. Sivrisinekler asenkron ise veya ATR ile beslenmemişlerse, davranış deneylerinde düşük aktivite gösterirler. Her deney için kullanılan genotipler Gr3>CsChrimson ve iki genetik kontrol olan sürücü hattı Gr3-QF2 ile efektör hattı QUAS-CsChrimson idi.

Opto-termosaykler deneyi (Bölüm 2), ısı ve ışık uyaranlarına yanıt olarak sivrisineklerin uzun süreler boyunca uyanıklık ve sokma davranışlarının değerlendirilmesine olanak tanır. Isı iletimi, sivrisineğin sıcakkanlı bir konakçıya yaklaşmasını taklit ederken, 5 saniyelik ışık iletimi uzun bir nefes verme işlemini taklit eder33. Bir termosaykler kullanımı, bir termokupl ve mikrodenetleyici aracılığıyla optogenetik aktivasyonla senkronize edilmiş hızlı yüzey ısıtma ve soğutmaya imkan sağlar (Şekil 2A, B). Üç sivrisinek genotipi, yürüme, uçma ve sokma davranışları sergiledikleri, altı gözenekli olan izole kuyucuklu akrilik plakalara yerleştirilmiştir (Şekil 2C). Sivrisinek vücut bölümlerinin konumu, SLEAP34 ve DeepLabCUT35 gibi poz takip algoritmaları kullanılarak tespit edilmiştir (Şekil 2D, E). Davranış sınıflandırma algoritmaları, poz takibi (örneğin, SimBA36, A-SOiD37) veya video (örneğin, FERAL38) girdilerinden başlayarak kullanılabilir. Şekil 2E, temel konakçı arama ve beslenme davranışları olan uçma, yürüme ve sokma sırasındaki SLEAP etiketlerini göstermektedir. Bu davranışlar, toraks hızı ve probosisin tabanı ile ucu arasındaki mesafe ile sınıflandırılabilir. Burada, APT ve JAABA kullanılarak yapılan davranış takibinin çıktısı gösterilmiştir39. Sivrisinekler ya bir ısı artışına, bir ışık uyaranına veya eş zamanlı olarak hem ısı hem de ışık uyaranlarına maruz bırakılmış, ardından bir sonraki uyarandan önce 20 dk'lık bir ara verilmiştir8. (Şekil 2F). Isıya maruz kaldıklarında, her üç genotip de kısa bir sokma süresi sergiler (Şekil 2G). Önemli olan şudur ki, 5 saniyelik bir ışık uyaranına maruz kaldıklarında, Gr3>CsChrimson sivrisinekleri uyanır veya "aktive olur" ve 10–15 dk'ya kadar süren artmış yürüme ve uçma davranışı gösterirler. Sivrisinekler ayrıca, probosisin plakaların gözenekli tabanına tekrarlı olarak sokulması olarak tanımlanan sokma davranışını da sergilerler. Veriler, bireysel sivrisinek davranışı (Şekil 2G) ve zaman içinde her bir davranışı sergileyen tüm sivrisineklerin oranı (Şekil 2H) olarak çizilmiştir. Opto-termosaykler, birden fazla bireyde tekrarlanan, hassas optogenetik ve ısı stimülasyonuna olanak tanıyarak, uyanıklık ve sokma davranışlarının incelenmesi için faydalı bir araç haline gelir.

Kan örtüsü deneyi (Bölüm 3), opto-termosikletör deneyine dayanmaktadır ancak sivrisinek doygunluğunun nicelendirilebilmesi için uygun bir yapay minimal kan öğünü sağlar (Şekil 3A). CO2 duyusal nöronlarını optogenetik olarak aktive etmek için 5 saniyelik bir kırmızı ışık darbesi (~627 nm) uygulanmış ve yapay kan öğününün ince tabakası 25 °C'den ~35 °C'ye ısıtılmıştır (bir termokupl ile yüzeyden ölçüldüğü gibi; Şekil 3B). Üç genotipin her birine alüminyum bir besleme plakası içinde yapay kan öğünü sunulmuştur (Şekil 3C). Gr3-QF2, QUAS-CsChrimson ve Gr3>CsChrimson sivrisineklerine (genetik grup başına n = 10 deneme, her birinde 14 sivrisinek) alüminyum bir besleme plakası içinde yapay kan öğünü sunulmuştur (Şekil 3C). Deney boyunca sivrisineklerin zaman içindeki doygunluğunu ölçmek için, sivrisinek vücudu üzerindeki noktaları takip etmek amacıyla SLEAP kullanılmıştır. Bu işlem, sivrisineğin abdomeninde 5 düğüm içeren bir iskelet oluşturularak gerçekleştirilmiştir (Şekil 3D). Her denemenin sonunda, doygunluğa ulaşmış sivrisinek sayısı manuel olarak sayılmıştır. Kontrol sivrisinek hatları olan Gr3-QF2 ve QUAS-CsChrimson, benzer bir ortalama doygunluk göstermiştir (Şekil 3E, p = 0.401). Buna karşılık, Gr3>CsChrimson hattı, %53'lük bir ortalama doygunluk oranı ile önemli ölçüde daha yüksek beslenme oranları göstermiştir (Şekil 3E, Gr3-QF2'ye kıyasla p = 0.00078 ve QUAS-CsChrimson'a kıyasla p = 0.00097). Veriler keman grafikleri ve kutu grafikleri (medyan, çeyrekler arası aralık ve menzil) olarak çizilmiş ve p < 0.05 anlamlılık eşiğinde Kruskal-Wallis testi ve Holm düzeltmeli Dunn Testi kullanılarak analiz edilmiştir. Bireysel hayvan doygunluğu zaman içinde, 5 düğümle çevrili abdominal alandaki değişim olarak tanımlanmıştır (Şekil 3F). Bu sonuçlar, kan örtüsü deneyinin, CO2-duyarlı nöronal popülasyonların optogenetik aktivasyonunun, sivrisineklerin yapay kan öğünü üzerindeki doygunluk davranışı üzerindeki etkilerini değerlendirmek için kullanılabileceğini göstermektedir.

Sivrisineklerin silindirik bir arenada sıcak bir kan öğününe erişiminin sağlandığı opto-membran besleyici deneyi (Bölüm 4), sivrisineklerin bir kan kaynağına duydukları çekimin ve doygunluğun incelenmesine olanak tanır. CO2 duyusal nöronlarının optogenetik aktivasyonunun, bir kan kaynağına çekim ve beslenme oluşturmak için yeterli olup olmadığını belirlemek amacıyla, Gr3>CsChrimson ve kontrol sivrisinekleri (her genotip için n = 10; burada n, her denemede her kanister başına 20 sivrisinekle gerçekleştirilen deneme sayısını ifade eder), 15 dakikalık bir süre boyunca her 10 saniyede bir tekrarlanan 1 saniyelik parlak kırmızı ışık darbelerine maruz bırakılarak opto-membran besleyicide sıcak bir kan öğününe erişime sunulmuştur (Şekil 4B). Membran besleyiciye olan çekimi ölçmek için, konmuş sivrisineklerin baş, toraks ve abdomenini takip etmek amacıyla üç noktalı bir SLEAP modeli kullanılmış ve ilgi bölgesindeki sivrisinekler sayılmıştır (Şekil 4D, Şekil 4E). Gr3>CsChrimson sivrisinekleri, Gr3-QF2 kontrolüne kıyasla zamanla kan öğünü bölgesine karşı artan bir çekim göstermiştir (Şekil 4F, p = 0.027). Gr3>CsChrimson sivrisinekleri, QUAS-CsChrimson grubundan istatistiksel olarak daha yüksek bir çekim göstermemiştir (Şekil 4F, p = 0.310). Anlamlılık grupları Kruskal-Wallis testi ile belirlenmiş ve ardından Holm düzeltmeli Dunn Testi uygulanmıştır. Anlamlılık eşiği p < 0.05 olarak belirlenmiştir. Veriler, kan öğününe çekilen sivrisineklerin ortalama yüzdesi olarak çizilmiştir ve gölgeli bölge standart hatayı göstermektedir. Kontrol genotipleri olan Gr3-QF2 ve QUAS-CsChrimson, tarif edildiği şekilde manuel olarak puanlandığında sırasıyla %26 ve %29 ile benzer doygunluk oranları göstermiştir (Şekil 4G, p = 0.351). Buna karşın, Gr3>CsChrimson sivrisinekleri, her iki kontrolden de anlamlı derecede daha yüksek bir doygunluk oranı sergileyerek ortalama %61 oranına ulaşmıştır (Şekil 4G, Gr3-QF2'ye karşı p < 0.001 ve QUAS-CsChrimson'a karşı p = 0.002). Veriler keman grafikleri ve kutu grafikleri (medyan, çeyrekler arası aralık ve menzil) olarak çizilmiş; Kruskal-Wallis testi ve p < 0.05 anlamlılık eşiğinde Holm düzeltmeli bir Dunn Testi kullanılarak analiz edilmiştir. Bu sonuçlar, opto-membran besleyici deneyinin, CO2 nöronlarının optogenetik aktivasyonunun sivrisineklerin kan öğününe çekimi ve doygunluğu üzerindeki etkilerini değerlendirmek için uygun bir yöntem olduğunu göstermektedir.

Sivrisinek davranış deneyi şeması; yöntemler: opto-termosikletör, kan battaniyesi; uyaranlar: ısı, CO2.
Şekil 1: Sivrisineklerde optogenetik için deneyler ve yetiştirme. (A) Sunulan davranış deneylerinin özellikleriyle birlikte sivrisinek konakçı arama davranışlarının şeması. Her bir davranış deneyi ile ölçülen konakçı arama adımları gri çubuklarla belirtilmiştir. (B) Optogenetik deneyler için sivrisineklerin yetiştirme zaman çizelgesi. Şekil 1, yazarlar tarafından bu yayın için Adobe Illustrator kullanılarak oluşturulmuştur ve kullanımı için herhangi bir lisans gerekmemektedir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayınız.

Sivrisinek davranışı, kızılötesi termosikler, LED-kırmızı ışık düzeneği, grafik analizi, uyarana yanıt.
Şekil 2: Opto-termosikler, optogenetik aktivasyon sırasında uyarılma ve arama davranışlarını nicelleştirir. (A) Üstten LED'ler ve bir kamera ile birlikte, bir PCR termosiklerinin bloğu üzerindeki sivrisinek plakalarından oluşan opto-termosikler deneyinin şeması. (B) Termosikler sıcaklığını algılayan ve LED'leri kontrol eden mikrodenetleyicinin devre şeması. Devre şeması, CC-BY-SA 3.0 lisansı (https://github.com/fritzing/fritzing-app/blob/develop/README.md) altında Fritzing ile oluşturulmuştur. Bu lisans, uygun atıf yapılması şartıyla görüntünün tamamen yeniden kullanımına da izin verir. (C) Deneyden alınan, 14 adede kadar sivrisineği tutan akrilik plakayı gösteren durağan görüntü. Termokupl sağ alt kuyucuktadır. (D) Pozları tahmin etmek için SLEAP modelinde kullanılan sivrisinek iskeleti. Vücut üzerinde işaretlenen noktalar şunlardır: sondaj davranışını tespit etmek için kullanılan hortumun ucu ve tabanı (kırmızı ile gösterilmiştir); ön bacakların toraksa bağlandığı yer, femurun tibiayla birleştiği yer ve tibianın tarsusla birleştiği yer (mavi ile gösterilmiştir) ve abdomenin ucu (sarı ile gösterilmiştir). Yukarıdan aşağıya çoklu hayvan modeli kullanılmıştır. Sivrisinek uyarılmasını ve sondaj davranışını nicelleştirmek için poz tahmin ediciler ve davranışsal sınıflandırıcılar kullanılmıştır. (E) Üzerine SLEAP tahminleri bindirilmiş sivrisinek yürüme, uçma ve sondaj örnekleri. Yürüme ve uçma, uyarılma için davranışsal metrikler olarak kullanılır. (F) Uyaran iletiminin çıktısı. Sarı dalgalı çizgiler vücut sıcaklığı ısı uyaranlarını, kırmızı LED'ler ise kırmızı ışık uyaranlarını belirtir. (G) Uyaran iletimini takiben Gr3-QF2, QUAS-CsChrimson ve Gr3>CsChrimson sivrisineklerinin (genotip başına n = 22–23 birey sivrisinek) yürüme, uçma ve sondaj davranış etogramları. (H) Gr3>CsChrimson sivrisineklerinde (n = 68–70 birey sivrisinek) optogenetik aktivasyonu takiben uzun süreli davranış. Şekil panelleri A–E, yazarlar tarafından bu yayın için Adobe Illustrator kullanılarak oluşturulmuştur ve kullanımı için herhangi bir telif hakkı lisansı gerekmemektedir. (F–H) bölümlerindeki veriler, CC BY 4.0 lisansı ile Sorrells et al, 2022'den yeniden üretilmiştir8. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Sivrisinek besleme deneyi düzeneği, veri analiz grafikleri, yapay kan öğünü diyagramı, sıcaklık grafiği.
Şekil 3: Kan battaniyesi deneyi, optogenetik aktivasyona bağlı doygunluğu nicelleştirir. (A) Kan battaniyesi deneyinin şeması. Sivrisinek, erişilebilir yapay kanın bir gözenekli ekran altında sunulduğu akrilik bir kafes içinde tutulur. (B) Deneyden elde edilen sıcaklık ve kırmızı ışık stimülasyonu okuması. (C) Alüminyum kan battaniyesi besleme plakası düzeneğinin şeması. (D) Poz tahmini için kullanılan SLEAP iskeleti, Şekil 2D'de tanımlanan noktalara ek olarak, abdomenin toraks ile birleştiği yanlar boyunca dört nokta ve abdomenin en kalın kısmının kenarlarını içeriyordu. Doygunluk, yukarıdan aşağıya çoklu hayvan modelinden gelen tahminler kullanılarak abdomen çevresi boyunca beş nokta arasındaki alan olarak ölçüldü. (E) Genotip başına yapay kan öğününde ortalama yüzde doygunluğu gösteren keman grafiği (her genotip için deneme başına 14 sivrisinekle 10 deneme, n = 10). Anlamlılık, Kruskal-Wallis testi ve ardından Holm düzeltmeli Dunn Testi kullanılarak belirlendi. Farklı harfler gruplar arasında p < 0.05 anlamlılığını gösterirken, aynı harfe sahip gruplar birbirlerinden anlamlı şekilde farklı değildir. (F) Bir Gr3>CsChrimson hayvanında abdominal alan ile ölçülen zamanla doygunluk değişimi. Kırmızı trend çizgisi, denemenin sekiz dakikası üzerinden 30 saniyelik kayan bir pencereyi göstermektedir; x = 0 doygunluğun başladığı zamanı işaret eder. Şekil 3'teki tüm şemalar, yazarlar tarafından bu yayın için Adobe Illustrator kullanılarak oluşturulmuştur ve kullanımları için telif hakkı lisansı gerekmemiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayınız.

Sivrisinek optogenetik düzeneği; RGB ışık kontrolü; Arduino; kan öğünü; çekim yüzdesi grafiği; sonuçlar.
Şekil 4: Opto-membran besleyici deneyi çekimi ve kan beslenmesini ölçer. (A) Bireysel bileşenlerle birlikte opto-membran besleyicinin şeması. (B) Deney denemelerinin zaman çizelgesi. Mavi çizgi, alışma dönemi ve deney boyunca loş mavi ışığı temsil eder. Deneysel stimülüsün, 10 s ara ile verilen 1 saniyelik kırmızı ışık darbelerini temsil eden bir bölümü gösterilmiştir. (C) Opto-membran besleyicinin kablolamasını gösteren diyagram. Devre diyagramı yazarlar tarafından CC-BY lisansı altında Fritzing ile oluşturulmuştur. (D) Opto-membran besleyici videosundan örnek bir kare. Çekim yüzdesini belirlemek için kırmızı daire içindeki sivrisinekler sayılır. (E) Opto-membran besleyici için SLEAP takip modeli tarafından baş, toraks ve abdomen kısımları etiketlenmiş beslenmemiş bir sivrisinek ve karnı doymuş bir sivrisineğe ait örnekler. Kan öğününün yerleştirildiği ilgi bölgesine olan çekimi ölçmek için aşağıdan yukarıya çoklu hayvan SLEAP modeli kullanılmıştır. (F) Genotiplere göre (genotip başına 20 sivrisinekten oluşan n = 10 deneme), kan öğünü bölgesindeki ortalama yüzde doluluk oranının (konma için davranışsal bir metrik olarak kullanılır) zaman içindeki değişimini gösteren çizgi grafiği. Ortalama her 30 s'de bir çizilmiştir. Gölgeli bölgeler standart hatayı temsil eder. Anlamlılık, Kruskal-Wallis testi ve ardından Holm düzeltmeli Dunn Testi ile belirlenmiştir. Farklı harfler anlamlı grupları temsil eder; eşik değer p < 0.05 olarak tanımlanmıştır. (G) Genotiplere göre kan öğünü ile karnı doymuşların ortalama yüzdesini gösteren keman grafiği. (F, G) bölümlerinde anlamlılık, Kruskal-Wallis testi ve ardından Holm düzeltmeli Dunn Testi ile belirlenmiştir. Aynı harfle listelenen genotipler birbirlerinden anlamlı derecede farklı değildir. Anlamlılık eşiği p < 0.05 olarak tanımlanmıştır. Şekil 4, Adobe Illustrator kullanılarak oluşturulmuştur, verileri bu yayın için yazarlar tarafından toplanmıştır ve kullanımı için herhangi bir telif hakkı lisansı gerekmemiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Bu makale, nöronal hücre tiplerinin konakçının çekilmesi ve ısırma süreçlerindeki basamakları yürütmek için yeterliliğini değerlendirmeye yönelik ayrıntılı protokolleri açıklamaktadır. Isırma davranışı, uzun menzilli tespitle başlayıp kısa menzilli çekilmeye, cildin delinmesine ve ardından doyurucu beslenmeye kadar uzanan bir dizi davranışsal basamaktan oluşur. İlke olarak, nöronal tipler belirli eylemleri veya basamakları kontrol edebilir, davranışı belirli diziler yönünde eğilimli hale getirebilir, tüm davranışın süresini artırabilir veya başka birçok rol oynayabilir. Bu nedenle, sunulan çoklu analizler, bu süreçteki nöronal fonksiyonu çözümlemek için gereklidir.

Bu deneylerde, sivrisineklerin yetersiz tepki vermesine neden olabilecek birkaç yaygın hata mevcuttur. Düşük aktivite ve beslenmenin önüne geçmek için deneyler, inkübasyon odalarındaki ışık ve karanlık döngüleri arasındaki geçiş saatlerine yakın, sivrisineklerin en aktif olduğu zamanlarda yürütülmelidir. Kan battaniyesi ve opto-membran besleyicideki düşük beslenme oranları, düşük kaliteli yapay kan öğününden veya yanlış sıcaklıktan kaynaklanabilir. Tüm reaktiflerin (NaHCO3, ATP, defibrine edilmiş koyun kanı) son kullanma tarihinin geçmediğinden ve uygun şekilde saklandığından emin olun. Maksimum tazeliği sağlamak için tüm çözeltilerin deney günü hazırlanması önerilir. Kan battaniyesi plakasının, PCR termosaykler bloğunun yüzeyine doğrudan temas ettiğinden emin olun. Opto-termosaykler ve kan battaniyesi plakalarında, kalıntı nem varsa yoğunlaşma oluşabilir. Deneylerden önce, nemi emmesi için plakaları kağıt havlu üzerine yerleştirin. Yetersiz bir optogenetik yanıt alındığında, sivrisineklerin en az bir haftalık olduğundan ve CsChrimson kanalları için gerekli bir kimyasal kofaktör olan ATR ile beslenmek için yeterli süreye sahip olduklarından emin olun.

Görünür spektrumu kapsayan, maviden (~450 nm) kırmızıya (~650 nm) kadar olan dalga boylarına duyarlı optogenetik araçlar geliştirilmiştir. Kırmızı ışık, böceklerin genellikle bu dalga boylarına karşı düşük duyarlılığa ve/veya davranışsal tepkilere sahip olması nedeniyle özellikle yararlıdır40. İlginç bir şekilde, sivrisinekler uçuş sırasında insan cilt tonlarında bulunan uzun dalga boylu görsel uyaran alanlarına karşı çekim göstermektedir41. Bu nedenle, kırmızı ışık kullanımı, sivrisineklerin konakçıya çekilme deneylerinde optogenetik aktivasyonun yorumlanmasını karıştıran bir sınırlama olabilir. Bununla birlikte, genetik kontrol sivrisinekler, güçlü yoğunluklarda bile geniş kapsamlı uygulanan kırmızı ışığa karşı minimal tepki göstermiştir (Şekil 2–4). Davranışsal etkilerin doğru yorumlandığından emin olmak için, ya sürücü ya da efektör konstrüktlardan yoksun olan genetik kontrollerin ve ışık uygulanmayan kontrollerin kullanılması önerilir. Diğer türlerdeki optogenetik deneyler için genellikle rhodopsin kofaktörü ATR'den yoksun bir kontrol kullanılır; ancak sivrisinek larvalarını beslemek için kullanılan balık yemi, ATR'nin öncüsü olan A vitamini içerdiğinden, bu kontrol bu sistemde daha az etkilidir.

Burada sunulan optogenetik uyaranlar, ayarlanabilir ışık yoğunluğuna sahip sürekli uyaranlarla sınırlıdır. Doğal nöronal aktivite modellerini yakından taklit eden optogenetik uyaranların, hedeflenen davranışı ortaya çıkarma olasılığı en yüksektir. Bu nedenle, nöral kayıtlar mevcutsa, uyaran gözlemlenen yoğunluğa ve zamansal dinamiklere uygun şekilde tasarlanabilir. Bunun bilinmediği durumlarda, sonuçların doğal davranışlardaki nöron fonksiyonlarını yansıtmayabileceği uyarısıyla, farklı uyaranlar ve davranışsal bağlamlar kullanılarak nöronların fonksiyonları taranabilir. Yine de, tıpkı elektrofizyolojinin hücresel özellikleri incelemek için kullanılabildiği gibi, nöron aktivitesini doğal aralığın dışına çıkarmak, devreleri veya davranışsal özellikleri benzersiz şekillerde incelemek için kullanılabilir. Şu an için optogenetik araçlar sivrisineklerde yalnızca duyusal nöronlarda kullanılmıştır; bu uygulama, doğal uyaranların verilmesine kıyasla bazı avantajlar sağlar. Sivrisineklerin konakçı arama davranışını ölçmeye yönelik geleneksel stratejiler, gerçek CO2 gazı verilmesine dayanır. Gerçek CO2 kullanımı, filtrelenmiş ve nemlendirilmiş bir hava akışı gerektirir; bu da gazın kısa zaman aralıklarıyla hassas bir şekilde verilmesini ve uzaklaştırılmasını sağlamak için karmaşık deneysel düzenekler gerektirir9,10,42,43. Hava akışı ve nem, sivrisineklerin çekimi ve navigasyonu için ipuçları olduğundan, optogenetikle uyaran verme yöntemi, koku uyaranlarının etkilerini bu diğer uyaranlardan ayrı olarak incelemek için cazip bir yöntemdir. Optogenetik araçlar ayrıca daha önce cinsiyetin ve fizyolojik durumun davranış üzerindeki etkisini incelemek için kullanılmış8 ve sivrisinek biyolojisindeki bu önemli sorulara dair içgörüler sağlamıştır.

Optogenetik dışında, bu protokoller sivrisinek davranışlarını değerlendirmek için kullanılan standart deneylerden yararlanmaktadır ve bazı sınırlamalar içermektedir. Temizliğin kolaylaştırılması amacıyla, kan battaniyesi (blood blanket), yalnızca sivrisineklerin kan emmesi için gerekli olan tatlandırıcıları içeren yapay bir öğün kullanır. Bu sınırlama, kan kullanımıyla (opto-membran besleyiciyle olduğu gibi) veya konakçı doku özelliklerini yeniden oluşturan biyomimetik materyallerle aşılabilir. Opto-termosiklet ve kan battaniyesindeki ısı, uçan sivrisineklerden ziyade yürüyen veya duran sivrisineklerle etkileşime girer ve PCR termosikletinin ısı artış hızıyla sınırlıdır. Bu nedenle, bu deneyler sondaj ve kan emme davranışlarını tespit edebilir ancak çekiciliği tespit edemez. Laboratuvar tabanlı deneylerin bir başka sınırlaması da, belirli uyaranların davranışsal etkisini anlamak için sivrisineklerin kullandığı diğer uyaranların dışlanmasıdır. Sivrisineklerin konakçılarıyla beslendikleri doğal ortamların ek yönlerini incelemek için giderek daha karmaşık laboratuvar deneyleri ve yarı-alan deneyleri oluşturulabilir.

Sivrisineklerde optogenetiğin bir diğer sınırlaması, duyusal nöronlar dışındakile ilgili çok az sürücü hattının oluşturulmuş olmasıdır. Bu nedenle, optogenetiğin tüm potansiyeli, diğer yaklaşımlarla doğrudan uyarılması mümkün olmayan internöronlarda eksprese edilen sürücülerle birleştirildiğinde ortaya çıkacaktır. Aedes aegypti Sivrisinek Hücre Atlası gibi yeni ortaya çıkan kaynaklar, sivrisinek nörogenetiğindeki ilerlemelere44 kapı açmaktadır. Sivrisinek nöral devrelerini incelemek için bu tür sürücülerin geliştirilmesine yönelik gelecekte çalışmalar yapılması gerekecektir. Benzer şekilde, bir nöron tipinin belirli bir davranış için gerekli olup olmadığını belirlemek amacıyla inhibisyon için ek optogenetik araçlara ihtiyaç duyulmaktadır. Bu makalede sunulan deneyler konakçı çekimini ve kan beslenmesini ölçmek için tasarlanmış olsa da, bu yaklaşımlar konakçı arayışının ek aşamalarını ve çiftleşme, yumurtlama ve nektar beslenmesi gibi davranışları incelemek için genişletilebilir. Optogenetik çalışmalar, sivrisinek davranışının nöral devre düzeyinde nasıl kontrol edildiğine dair yeni bilgiler sağlayacak ve sivrisinek kaynaklı hastalıkların yayılmasını önlemek için yeni yaklaşımlara yol açabilecektir.

Açıklamalar

Yazarların beyan edeceği herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Taslak üzerindeki yorumları için Kim Lezon-Geyda, Fernanda Medeiros Contini ve Yaoyu Jiao'ya teşekkür ederiz. Bu araştırma, NIH hibelemesi DP2AI177891 tarafından finanse edilmiştir. Teknik destekleri için Yale Kavli Institute for Neuroscience tarafından finanse edilen Neurotechnology Core'a teşekkür ederiz. T.S., bir HHMI Freeman Hrabowski Scholar'dır.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
1⁄8 İnç Siyah AkrilikMcMaster-Carr8650K32Opto-membran besleyici yapısı
1⁄8 İnç Şeffaf AkrilikMcMaster-Carr8536K134Opto-membran besleyici kanisteri
¼ İnç Siyah AkrilikMcMaster-Carr8560K259Opto-membran besleyici yapı
AC AdaptörüJameco ReliaPro2197581Opto-membran besleyici yapı
Akrilik YapıştırıcıUnited States Plastic Corp 97562Opto-membran besleme kanisteri, kan örtüsü kafesi
Adenozin 5′-trifosfat disodyum tuzu hidratSigma AldrichA6419-1GYapay kan öğünü
Tüm Trans-RetinalSpectrum ChemicalR3041-1GMOptogenetik yetiştirme
Alüminyum BreadboardThorlabsMB12Opto-membran besleyici yapı
Alüminyum Levha 0,03125 inMcMaster-Carr89015K11Kan battaniyesi besleme plakası
Alüminyum Levha 0,0625 inçMcMaster-Carr89015K37Kan örtüsü besleme plakası
Hayvan Parçası Takipçisi (APT)HHMI Janelia Farm'daki Branson laboratuvarıLütfen çevirisini yapmamı istediğiniz metni sağlayın.Sürüm 3.0, Opto-termosiklet ile tekrarlanan veriler (Şekil 2), 9 Temmuz 2020'de indirildi
Arduino IDEArduinoLütfen çevirmemi istediğiniz metni sağlayın.Opto-termosikletör ve kan battaniyesi için stimulus kontrolünde kullanılan Versiyon 1.8.12, & opto-membran besleyici
Arduino Uno Rev3 Mikrodenetleyici KartıArduinoA000066 Opto-membran besleyici programlama
Siyah Fiberglas Pencere SinekliğiÇığır Açan Üst Segment Ürünler IHLRS3684BLKan battaniyesi kafesi
Siyah BantThorlabsT137-2.0Opto-termosikletleyici
Siyah Plastik Kelepçeler Kablo Bağları ve Daha Fazlasıct242Opto-membran besleyici yapısı
Karartma PerdesiSet Atölyesi6520SFOpto-termosaykler ve kan battaniyesi
Mavi LED Işıklar21LEDUSARB5730BLWPSivrisinek yetiştirme
ŞişeSKS Şişe & Paketleme0604-07Opto-membran beslemeli kan ısıtıcı
Dip Besleyici PeletlerAPI5352983Larvaların beslenmesi
KameraKarahisarcık sineğiU3-13S2M-CS, FLIAnalizler için video kaydı yapılması
Tıklama SayacıULineH-7350Larvaların seyreltilmesi
BilgisayarAsus X1407QAnalizlerin Çalıştırılması
Konsantre Çamaşır Suyu (%8,25 Sodyum Hipoklorit)VWR89501-620Opto-membran besleyici temizliği
CoolTermRoger Meier'in Ücretsiz YazılımlarıLütfen çevrilecek metni sağlayın.Opto-termosikletleyici ve kan battaniyesi için seri port kaydı amacıyla kullanılan Versiyon 2.0.1, & opto-membran besleyici
Defibrine Edilmiş Koyun Kanı Hemostat Laboratuvarları DSB100Opto-membran besleyici için kan öğünü
Kubbe başlı altıgen 4-40 civataMcMaster-Carr92949A105Kan örtülü besleme plağı
EpoksiLoctite1363118Opto-termosikletör akrilik plaka, Opto-membran besleyici yapısı
EtanolDecon Labs2716Sanitasyon
Harici Sabit SürücüLaCieLAC9000298Video Depolama
ffmpegFFmpegÇevrilecek metin sağlanmamıştır. Lütfen çevrilmesini istediğiniz kaynağı giriniz.Sürüm 8.0.1, video ön işleme
Dört İnçlik Pamuk FitilRichmond Dental201226Yetişkin sivrisineklerin beslenmesi
GitHubGitHub, Inc.Lütfen çevirilecek kaynak metni sağlayın.opto-thermocycler (v1.0.0, https://github.com/sorrellslab/opto-thermocycler/releases/tag/v1.0.0), blood blanket (v1.0.0, https://github.com/sorrellslab/bloodblanket/releases/tag/v1.0.0) ve opto-membrane feeder (v1.0.0, https://github.com/sorrellslab/opto-membranefeeder/releases/tag/v1.0.0) için kod, parça dosyaları ve SLEAP modelleri depoları
Gr3>CsChrimsonLütfen çevrilmesini istediğiniz metni sağlayın. Metni paylaştığınızda, JoVE standartlarına uygun, akademik ve teknik terminolojiye sadık bir şekilde Türkçe çevirisini gerçekleştireceğim.Girdi sağlanmadı. Lütfen çevrilmesini istediğiniz metni giriniz.Adım 1.2'de açıklanan, bu çalışma için oluşturulmuş
Gr3-QF2 SivrisinekleriLütfen çevirmemi istediğiniz metni sağlayın.Lütfen çevrilmesini istediğiniz metni sağlayın.Genetik reaktif, DOI: 10.1016/j.cell.2013.12.044
Opak Kapaklı İnkübatörCaron7340-25Sivrisinek yetiştirme
Kızılötesi LED IşığıAdafruit387Opto-termosiklör ve kan battaniyesi
Kızılötesi LED ŞeritWaveform Aydınlatma7031.85Opto-termosikletleyici, kan battaniyesi ve opto-membran yapısı
Kızılötesi Geçiş FiltresiEdmund Optics65-796Analizler için video kaydı 
Böcek KafesiBugdormDP1000Yetişkin sivrisinek kafesi
Janelia Otomatik Hayvan Davranışı Anotatörü (JAABA)HHMI Janelia Farm'daki Branson laboratuvarıGirdi sağlanmadı. Lütfen çevrilmesini istediğiniz metni giriniz.Opto-termosayklör ile yeniden üretilen veriler (Şekil 2); Versiyon 0.5.0
Büyük Çorba KabıWebstaurantStore50016SOUPPLASivrisinek yetiştirme
LED SoğutucusuLuxeon StarN25-15BOpto-termosikletör ve kan battaniyesi
LED LensiLuxeon Star10209Opto-termosikletleyici ve kan battaniyesi
LED Lens TutucuLuxeon Star10235Opto-termosikletleyici ve kan battaniyesi
LED Lens BandıLuxeon StarLT-01Opto-termosaykler ve kan battaniyesi
LED IşıkLuxeon StarSP-01-D9Opto-termosayklet ve kan battaniyesi için kırmızı ışık stimülasyonu
LED Termal BantLuxeon StarLXT-S-12Opto-termosikletleyici ve kan battaniyesi
Optik Kurulum RaylarıThorlabsXE25L12, XE25L24, XE25L09, XE25T4, RA90, TRA6, TR12Opto-termosikler ve kan battaniyesi yapısı
Optik Direk ThorlabsTR12Opto-membran besleyici yapı
Kağıt HavlularPacific Blue27385Kanister temizliği
ParafilmAmcorPM-996Kan örtü membranı, opto-membranlı öğün kabı
PCR termal döngüleyiciEppendorf2231001196Opto-termosiklet ve kan battaniyesi
Plastik Porsiyon KabıSeçim999P2CYetişkin sivrisineklerin beslenmesi
Plastik Porsiyon Kabı KapağıSeçim999PL2Yetişkin sivrisineklerin beslenmesi
Polikarbonat KapCambroLütfen çevirisini istediğiniz metni gönderin. Sadece "21410CWCHCL" şeklinde bir kod ilettiniz; çevrilecek İngilizce kaynak metni paylaştığınızda, belirttiğiniz tüm akademik ve teknik standartlara uygun olarak Türkçe çevirisini gerçekleştirebilirim.Larvaların yetiştirilmesi 
Yarım Boy Polikarbonat TepsiCambro24CW135 Opto-membran öğün temizliği
Polikarbonat Yarım Boy Gastronom Küvet KapağıCambro20CWCH135 Opto-membran yüzey temizliği
Polikarbonat Kap KapağıCambro10CWCH135Larvaların yetiştirilmesi
Polikarbonat TüpMcMaster-Carr8585K56Opto-membran besleme kanisteri 
Güç ÖlçerUyumlu1299161Tüm analizler
QUAS-CsChrimson SivrisineklerLütfen çevrilecek metni sağlayın. Metni gönderdiğinizde, belirttiğiniz tüm akademik standartlara, teknik terminolojiye ve JoVE protokol formatına sadık kalarak profesyonel Türkçe çevirisini gerçekleştireceğim.Sistemde herhangi bir metin bulunmamaktadır. Lütfen çevrilmesini istediğiniz İngilizce kaynak metni sağlayınız.Genetik reaktif, DOI: 10.7554/eLife.76663
RGB IşıklarDigikey 289-1189-NDOpto-membran besleyici stimülasyon iletimi
Dik Açılı KelepçeThorlabsRA90Opto-membran besleyici yapısı
Scotch Magic Tape3M104Opto-termosaykler ve kan battaniyesi akrilik kapağı
Silikon Conta, 0,5 mmMcMaster-Carr1460N22Kan örtülü besleme plağı
SLEAPTalmo LaboratuvarıLütfen çevirisini yapmamı istediğiniz kaynak metni sağlayın. Metni gönderdiğinizde, belirttiğiniz akademik standartlara ve bilimsel terminolojiye uygun olarak profesyonelce Türkçeye çevireceğim.Versiyon 1.4.1a2, her bir deneydeki sivrisineklerin poz takibi
Sodyum Bikarbonat, 1M tampon çözeltisi, pH 8.0Thermo ScientificJ62495.APYapay kan öğünü
Sodyum Klorür çözeltisiSigma-AldrichS5150-1L 100 3532552Yapay kan öğünü
SpinViewTeledyne Vision SolutionsGirdi sağlanmadı. Lütfen çevirmek istediğiniz metni giriniz.Versiyon 1.27.0.48, her üç analiz için de video kayıt yazılımı
Sprey ŞişesiUlineS-11686Sanitizasyon
SakkarozSigma AldrichS0389-500GYetişkin sivrisineklerin beslenmesi
Termokupl (Tip T)Harold G Schaevitz Industries LLCCPTC-120-X-NOpto-termosikletleyici ve kan battaniyesi
Termokupl amplifikatörüAdafruitMAX31856Opto-termosiklet ve kan battaniyesi
ZamanlayıcıEnduraLightRAC-MTSivrisinek yetiştirmede ışık döngüsünün kontrolü
Transfer Pipeti Thermo ScientificSAM-225Larvaların seyreltilmesi
Çöp TorbasıUlineS-23040Böcek taşıma
UV Dirençli FileMcMaster-Carr 87655K13Opto-membranlı besleyici kanister
SuSigma AldrichW4502-1LKan battaniyesi için yapay kan öğünü
Mumlu İplikMcMaster-Carr6356K91Opto-membran kanister kapağı
Tel ÖrgüMcMaster-Carr9322T65Opto-membran besleyici yapısı

Kaynaklar

  1. UNICEF, UNDP, World Bank, WHO Special Program for Research and Training in Tropical Diseases. Global vector control response 2017-2030. Geneva: World Health Organization; 2017.
  2. Knight KL, Stone A. A catalog of the mosquitoes of the world (Diptera: Culicidae). Lanham (MD): Entomological Society of America; 1959.
  3. Raji JI, DeGennaro M. Genetic analysis of mosquito detection of humans. Curr Opin Insect Sci. 2017;20:34-38.
  4. Coutinho-Abreu IV, Riffell JA, Akbari OS. Human attractive cues and mosquito host-seeking behavior. Trends Parasitol. 2022;38(3):246-264.
  5. McMeniman CJ, Corfas RA, Matthews BJ, Ritchie SA, Vosshall LB. Multimodal integration of carbon dioxide and other sensory cues drives mosquito attraction to humans. Cell. 2014;156(5):1060-1071.
  6. Gillies MT. The role of carbon dioxide in host-finding by mosquitoes (Diptera: Culicidae): a review. Bull Entomol Res. 1980;70(4):525-532.
  7. Geier M, Bosch O, Boeckh J. Influence of odor plume structure on upwind flight of mosquitoes towards hosts. J Exp Biol. 1999;202(Pt 12):1639-1648.
  8. Sorrells TR, Pandey A, Rosas-Villegas A, Vosshall LB. A persistent behavioral state enables sustained predation of humans by mosquitoes. eLife. 2022;11:e76663.
  9. Dekker T, Geier M, Cardé RT. Carbon dioxide instantly sensitizes female yellow fever mosquitoes to human skin odors. J Exp Biol. 2005;208(15):2963-2972.
  10. van Breugel F, Riffell J, Fairhall A, Dickinson MH. Mosquitoes use vision to associate odor plumes with thermal targets. Curr Biol. 2015;25(16):2123-2129.
  11. Liu MZ, Vosshall LB. General visual and contingent thermal cues interact to elicit attraction in female Aedes aegypti. mosquitoes. Curr Biol. 2019;29(13):2250-2257.e4.
  12. Chandel A, DeBeaubien NA, Ganguly A, et al. Thermal infrared directs host-seeking behavior in Aedes aegypti. mosquitoes. Nature. 2024;633(8030):615-623.
  13. Tang R, Busby R, Laursen WJ, Keane GT, Garrity PA. Functional dissection of mosquito humidity sensing reveals distinct Dry and Moist Cell contributions to blood feeding and oviposition. Proc Natl Acad Sci U S A. 2024;121(35):e2407394121.
  14. Burgess L. Probing behavior of Aedes aegypti. (L.) in response to heat and moisture. Nature. 1959;184(4703):1968-1969.
  15. Hol FJ, Lambrechts L, Prakash M. BiteOscope, an open platform to study mosquito biting behavior. eLife. 2020;9:e56829.
  16. Martin-Martin I, Williams AE, Calvo E. Determination of mosquito probing and feeding time to evaluate mosquito blood feeding. Cold Spring Harb Protoc. 2023;2023(6):pdb.top107659.
  17. Boyd MF, Stratman-Thomas WK. Studies on benign tertian malaria. VII. Some observations on inoculation and onset. Am J Epidemiol. 1934;20(2):488-495.
  18. Swanson MM, Poodry CA. The shibire(ts) mutant of Drosophila: a probe for the study of embryonic development. Dev Biol. 1981;84(2):465-470.
  19. Sweeney ST, Broadie K, Keane J, Niemann H, O'Kane CJ. Targeted expression of tetanus toxin light chain in Drosophila specifically eliminates synaptic transmission and causes behavioral defects. Neuron. 1995;14(2):341-351.
  20. Baines RA, Uhler JP, Thompson A, Sweeney ST, Bate M. Altered electrical properties in Drosophila neurons developing without synaptic transmission. J Neurosci. 2001;21(5):1523-1531.
  21. Hamada FN, Rosenzweig M, Kang K, et al. An internal thermal sensor controlling temperature preference in Drosophila. Nature. 2008;454(7201):217-220.
  22. Corfas RA, Vosshall LB. The cation channel TRPA1 tunes mosquito thermotaxis to host temperatures. eLife. 2015;4:e11750.
  23. Greppi C, Laursen WJ, Budelli G, et al. Mosquito heat-seeking is driven by an ancestral cooling receptor. Science. 2020;367(6478):681-684.
  24. Allen WE, DeNardo LA, Chen MZ, et al. Thirst-associated preoptic neurons encode an aversive motivational drive. Science. 2017;357(6356):1149-1155.
  25. Inagaki HK, Jung Y, Hoopfer ED, et al. Optogenetic control of Drosophila courtship using a red-shifted channelrhodopsin reveals experience-dependent influences. Nat Methods. 2014;11(3):325-332.
  26. Sahel JA, Boulanger-Scemama E, Pagot C, et al. Partial recovery of visual function in a blind patient after optogenetic therapy. Nat Med. 2021;27(7):1223-1229.
  27. Klapoetke NC, Murata Y, Kim SS, et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nat Methods. 2014;11(3):338-346.
  28. Deisseroth K. Optogenetics. Nat Methods. 2011;8(1):26-29.
  29. Potter CJ, Tasic B, Russler EV, Liang L, Luo L. The Q system: a repressible binary system for transgene expression, lineage tracing, and mosaic analysis. Cell. 2010;141(3):536-548.
  30. Herre M, Goldman OV, Lu TC, et al. Non-canonical odor coding in the mosquito. Cell. 2022;185(17):3104-3123.e28.
  31. Wohl MP, McMeniman CJ. Batch rearing Aedes aegypti. Cold Spring Harb Protoc. 2023;2023(3):pdb.prot108017.
  32. American Committee of Medical Entomology, American Society of Tropical Medicine and Hygiene. Arthropod containment guidelines, version 3.2. Vector Borne Zoonotic Dis. 2019;19(3):152-173.
  33. Pleil JD, Wallace MAG, Davis MD, Matty CM. The physics of human breathing: flow, timing, volume, and pressure parameters for normal, on-demand, and ventilator respiration. J Breath Res. 2021;15(4):042002.
  34. Pereira TD, Tabris N, Matsliah A, et al. SLEAP: a deep learning system for multi-animal pose tracking. Nat Methods. 2022;19(4):486-495.
  35. Mathis A, Mamidanna P, Cury KM, et al. DeepLabCut: markerless pose estimation of user-defined body parts with deep learning. Nat Neurosci. 2018;21(9):1281-1289.
  36. Goodwin NL, Choong JJ, Hwang S, et al. Simple Behavioral Analysis (SimBA) as a platform for explainable machine learning in behavioral neuroscience. Nat Neurosci. 2024;27(7):1411-1424.
  37. Tillmann JF, Hsu AI, Schwarz MK, Yttri EA. A-SOiD, an active-learning platform for expert-guided, data-efficient discovery of behavior. Nat Methods. 2024;21(4):703-711.
  38. Skovorodnikov P, Zhao J, Buck F, et al. FERAL: a video-understanding system for direct video-to-behavior mapping. bioRxiv. 2025. doi:10.1101/2025.11.16.688666.
  39. Kabra M, Robie AA, Rivera-Alba M, Branson S, Branson K. JAABA: interactive machine learning for automatic annotation of animal behavior. Nat Methods. 2013;10(1):64-67.
  40. Autrum H, Bennett MF, Diehn B, et al. Comparative physiology and evolution of vision in invertebrates. A: Invertebrate photoreceptors. Berlin: Springer; 1979.
  41. Alberto DAS, Rusch C, Zhan Y, Straw AD, Montell C, Riffell JA. The olfactory gating of visual preferences to human skin and visible spectra in mosquitoes. Nat Commun. 2022;13(1):555.
  42. Dekker T, Cardé RT. Moment-to-moment flight maneuvers of the female yellow fever mosquito (Aedes aegypti. L.) in response to plumes of carbon dioxide and human skin odor. J Exp Biol. 2011;214(Pt 20):3480-3494.
  43. Demir M, Kadakia N, Anderson HD, Clark DA, Emonet T. Walking Drosophila navigate complex plumes using stochastic decisions biased by the timing of odor encounters. eLife. 2020;9:e57524.
  44. Goldman OV, DeFoe AE, Qi Y, et al. A single-nucleus transcriptomic atlas of the adult Aedes aegypti. mosquito. Cell. 2025;188(25):7267-7290.e26.

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

Sivrisinek DavranışıNöral DevrelerOptogenetik AktivasyonDavranışsal DeneylerKonak AramaKanla BeslenmeMakine GörüşüDuyusal Uyaranlar
Sivrisinek Aedes aegypti'de Davranışın Optogenetik Analizi
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.