Akut Solunum Sıkıntısı Sendromu'nda Yaşa Özgü Piroptozlu Biyomarker Analizi ve Farmakolojik Olmayan Müdahale

Özet

Bu protokol, akut solunum sıkıntısı sendromunda (ARDS) yaşa göre tabakalanmış piroptozis biyobelirteçlerini belirlemek için entegre bir biyoinformatik ve makine öğrenimi iş akışını ortaya koyar; ayrıca spektrum enerjisi, su ve uzak kızılötesi radyasyonun ön etkinliğini deneysel olarak doğrulamak için LPS kaynaklı fare modeli kullanan in vivo bir metodoloji ile birleştirilir.

Özet

Akut solunum sıkıntısı sendromu (ARDS), yüksek morbidite ve ölüm oranına sahip, hayatı tehdit eden bir akciğer hastalığıdır ve piroptozun kritik bir patojenik mekanizma olarak ortaya çıktığı bir hastalıktır. Yaşa bağlı bağışıklık ve moleküler farklılıkların piroptozu ve terapötik yanıtı etkileyebileceği göz önüne alındığında, bu çalışma yaşa özgü piroptozla ilişkili biyobelirteçleri belirlemeyi ve spektrum enerjili suyun (SEW) uzak kızılötesi radyasyon (FIR) ile birleşiminin terapötik potansiyelini değerlendirmeyi amaçladı. Protokolün kapsamlı iş akışı, transkriptomik veri seti işleme, yaş tabakalama, makine öğrenimi ve yaşa özgü hub genlerini belirlemek için bağışıklık sızma analizini kapsar. Bu hesaplama aşaması, LPS kaynaklı ARDS fare modeli kullanılarak in vivo deneysel doğrulama ile takip edilir; histolojik değerlendirme, ELISA ve Western blotting kullanılarak SEW+FIR müdahalesini titizlikle değerlendirir ve hub gen ifadesini doğrular. On altı piroptozla ilişkili gen tanımlandı; bunlar arasında AXL ve GSDME ağırlıklı olarak yaşlı hastalarda ARDS şiddetiyle ilişkilendirilirken, SPP1 genç bireylerde daha önemliydi. Yaşlı hastalarda M2 makrofaj zenginleştirmesi ve immünosupresyon ile karşılaştırıldığında belirgin bağışıklık imzaları gözlemlendi; gençlerde ise pro-inflamatuar aktivasyon ile karşılaştırıldı. Fonksiyonel analizler, bu genlerin metabolik, iltihaplayıcı ve bağışıklık düzenleyici yollarda rol oynadığını ortaya koymuştur. In vivo, SEW+FIR tedavisi akciğer hasarını hafifletti, inflamatuar sitokinlerin (IL-1β, IL-18, IL-6, TNF-α) üretimini bastırdı ve AXL, GSDME ve SPP1 ifadesini modüle etti. Bu bulgular ARDS'deki piroptozla ilgili mekanizmalardaki yaşa bağlı farklılıkları vurguluyor ve AXL, GSDME ve SPP1'i daha fazla klinik doğrulama gerektiren ön biyobelirteç adayları olarak belirliyor. Mevcut fare deneysel modelinde, SEW+FIR sistemik iltihabı hafifleterek ve piroptozla ilgili sinyalleri modüle ederek koruyucu etkiler göstererek, farmakolojik olmayan bir yardımcı strateji olarak potansiyeline temel in vivo destek sağlamıştır.

Giriş

Akut akciğer hasarı (ALI)/akut solunum sıkıntısı sendromu (ARDS), ağırlıklı olarak diffuz alveolar hasardan kaynaklanan şiddetli hipoksemi ve kardiyojenik olmayan akciğer ödemiyle karakterize edilen şiddetli bir solunum yolu^{hastalığıdır.} Çeşitli akciğer ve ekstrapulmoner hakaretlerle tetiklenebilir. Pulmoner nedenler arasında enfeksîyoner zatürre, mide içeriğinin aspirasyonu ve şiddetli torakal travma bulunurken, ekstrapulmoner tetikleyiciler sepsis, pankreatit, torasik olmayan travma, şiddetli yanıklar, büyük transfüzyon ve akciğer nakli veya trombektomi sonrası reperfüzyon yaralanması gibi sistemik inflamatuar yanıtlardan kaynaklanır ^1,2. Destekleyici bakımdaki gelişmelere rağmen, ARDS kritik bakım tıbbında önemli bir klinik zorluk olmaya devam ediyor ve dünya genelinde yüksek hastalık ve ölüm^{oranları 3}. Bu nedenle, ALI/ARDS'nin patogenezini anlamak, etkili tedaviler geliştirmek için çok önemlidir.

Tümör baskılanması ve onkolojik tedaviler bağlamında kapsamlı şekilde karakterize edilmiş programlanmış hücre ölümünün inflamatuar bir formu olan piroptoz^, artık ARDS patofizyolojisinde önemli bir oyuncu^{olarak kabul edilmektedir 5}. Apoptozun aksine, piroptoz inflamasom aktivasyonu ve ardından gasdermin D'nin (GSDMD) bölünmesiyle gerçekleşir; bu da membran gözenek oluşumuna, hücre lizisine ve interlökin-1β (IL-1β) ile interlökin-18 (IL-18⁾⁶ gibi pro-inflamatuar sitokinlerin salınmasına yol açar. ARDS'de, alveolar makrofajlar, epitel hücreler ve endotel hücrelerinde aşırı piroptoz aktivasyonu, abartılı inflamatuar yanıtta, alveolar-kapiller bariyer bozulmasına, pulmoner ödeme ve hipoksemi 7 ilerlemesine katkıda bulunur^. Artan kanıtlar, piroptoz yolunda önemli düzenleyicileri hedeflemenin, ARDS ^8,9'da iltihabı azaltmak ve klinik sonuçları iyileştirmek için yeni bir strateji olabileceğini göstermektedir. Ancak, ARDS hassasiyeti ve prognozunu belirleyen temel bir faktör olan yaşlanmanın piroptotik ortam üzerindeki etkisiyle ilgili kritik bir bilgi eksikliği hâlâ devam etmektedir. Güncel çalışmalar genellikle ARDS'yi monolitik bir durum olarak ele almakta ve kişiselleştirilmiş terapötik yanıtları yönlendirebilecek yaşa özgü moleküler faktörlerin potansiyelini göz ardı etmektedir.

Son yıllarda, SEW ve uzak kızılötesi radyasyon (FIR) yayıcıları gibi yeni biyofiziksel müdahaleler ve gelişmiş fonksiyonel malzemelerin uygulanması, bağışıklık yanıtlarını modüle etmek ve iltihabı bastırmak için farmakolojik olmayan stratejiler olarak^{popülerlik kazanmıştır 10,11}. Bu tedavilerin lökosit çoğalmasını ve fagositik aktiviteyi artırdığı, doku ödemini azalttığı ve endotoksin kaynaklı mikro sirkülatör bozuklukları azalttığı bildirilmiştir—lökosit yapışması, eritrosit agregasyonu, trombosit aktivasyonu ve endotel hasarı 12,13,14. Lipopolisakkarit (LPS) ile indüklenen ARDS sıçanlarında, SEW ve FIR kombinasyonu, hem serum hem de bronkoalveolar lavaj sıvısında (BALF) piroptotik kaskadın imza aşağı akım efektörleri olan IL-1β ve IL-18 seviyelerini önemli ölçüde azaltmıştır. Bu kanıt, SEW+FIR'ın koruyucu etkilerinin enflamatuar kaynaklı hücre ölümünün bastırılması yoluyla aracılık edilebileceğini güçlü bir şekilde göstermektedir. Ayrıca, SEW'nin bağımsız veya çözücü ortam olarak uygulandığında, interlökin-8 (IL-8) ve tümör nekroz faktörü-α (TNF-α) ekspresyon seviyelerini düşürdüğü, kan serumunda interlökin-4 (IL-4) ve interlökin-10 (IL-10) ekspresyon seviyelerini yükselttiği ve histopatolojik akciğer^{hasarını (}15,16,17,18) hafiflettiği bulunmuştur.

Bu gözlemlere dayanarak, ARDS'de birleşik SEW ve FIR'ın (SEW+FIR) terapötik etkinliğinin, yaşa özgü piroptotik yolları modüle etme yeteneğine dayandığını ve böylece pulmoner immün homeostazını hedefli bir şekilde yeniden tesis ettiğini öne sürdük. Şu anda ARDS yönetiminin temel dayanağı, ventilatör kaynaklı akciğer hasarı veya sistemik immünosupresyon riski taşıyan kortikosteroidler gibi sınırlı farmakolojik ajanlara^{dayanmaktadır 19}. Bu geleneksel tedavilerle karşılaştırıldığında, SEW+FIR, erken evre inflamatuar kaskadları ikincil organ toksisitesi olmadan güvenli bir şekilde zayıflatabilecek invaziv olmayan, farmakolojik olmayan bir alternatif sunar. Pratikte, bu protokol hafif ve orta dereceli ARDS için erken bir yardımcı müdahale olarak en uygundur. Başlıca sınırlaması, şiddetli, geç evre fibrotik ARDS'deki etkinliğinin kanıtlanmamış olması ve kritik bakım ortamında temel yaşam destek önlemlerinin yerini alabilmesidir. Hipotezimizi test etmek için, yaşa göre katmanlanmış transkriptomik profilleme ile makine öğrenimini vivo doğrulama ile birleştiren entegre bir boru hattının öncüsü olduk. Bu yaklaşım, AXL, GSDME ve SPP1'i yeni, yaşa özgü terapötik hedefler olarak tanımlamakla kalmaz, aynı zamanda ARDS için hassas farmakolojik olmayan bir müdahale olarak SEW+FIR'in klinik potansiyeline dair ilk mekanik kanıtı sunar.

Protokol

Tüm hayvan deney prosedürleri, çalışmanın başlamasından önce Pekin Çin Tıp Üniversitesi Dongzhimen Hastanesi Deneysel Hayvan Refahı ve Etik Komitesi tarafından onaylanan yönergelere (Onay No. 19-54) uygun olarak sıkı bir şekilde gerçekleştirilmiştir.

Veri kaynağı ve veri işleme
İki gen ifade veri seti (GSE89953 ve GSE116560) Gen İfadesi Omnibus (GEO)^{veritabanından alındı 20}. Farklı yaş gruplarındaki ARDS hastalarından alınan tam alveolar makrofaj transkriptomik verilerini içeren GSE89953 veri seti, farklı yaş gruplarında farklı ifade ve ağ analizi için kullanıldı. Mekanik ventilasyon durumu gibi klinik bilgileri içeren GSE116560 veri seti, makine öğrenimi ve prognostik modelleme için kullanıldı. Ayrıca, piroptozla ilişkili 608 gen, tarama kriteri olarak 1'den büyük korelasyon puanı kullanılarak kapsamlı bir insan gen notlama veritabanından çıkarıldı. Gen ekspresyonu verileri R'deki limma paketi kullanılarak normalleştirildi. Klinik çalışma numarası: geçerli değil.

DEG'lerin Tanımlanması
GSE89953 veri setindeki hastalar iki yaş grubuna ayrıldı: düşük yaş (<45 yaş) ve yüksek yaş (≥45 yaş). Bu kesinti, ARDS başlangıç medyan yaşının yaklaşık 45^{yıl 21} olduğunu gösteren epidemiyolojik kanıtlara dayanarak seçilmiştir. Bu eşiğin sağlamlığını sağlamak için, alternatif yaş sınırları (50 ve 55 yaş) kullanılarak duyarlılık analizleri yapıldı. Bu analizler, hub gen tanımlaması ve modül kümelenmesinde tutarlı kalıplar göstererek, sonraki sonraki analizler için 45 yıllık kesim süresini istatistiksel olarak doğruladı. Veri seti, R'deki limma paketi kullanılarak normalleştirildi. Yaş grupları arasında farklı olarak ifade edilen genler (DEG), ampirik Bayes moderasyonu ile lineer modelleme kullanılarak tanımlandı. P değeri 0.05 < ayarlanmış genler ve |log₂ katlama değişimi| ≥ 0.5 istatistiksel olarak anlamlı DEG'ler olarak kabul edildi. R'deki ggplot2 paketi kullanılarak DEG'leri görselleştirmek için volkan grafikleri ve ısı haritaları oluşturuldu.

Piroptozla ilişkili gen tanımlama ve zenginleştirme analizi
Piroptozla ilgili genler, "pyroptosis" anahtar kelimesi kullanılarak gen açıklama veritabanından alındı. DEG'ler ile piroptozla ilişkili genlerin kesişimi, farklı şekilde eksprese edilen piroptozla ilişkili genler (DEPG'ler) olarak tanımlandı. Gen Ontolojisi (GO) ve Kyoto Genler ve Genomlar Ansiklopedisi (KEGG) DEPG'lerin yol zenginleştirme analizleri, R^22'deki clusterProfiler paketi kullanılarak gerçekleştirildi. Biyolojik Süreç (BP), Hücresel Bileşen (CC) ve Moleküler Fonksiyon (MF) kategorileri notanslandı, Z-skoru 1 ≥ ve ayarlanmış P değerleri < 0.05 anlamlı olarak kabul edildi.

Ağırlıklı gen ortak ifade ağı analizi (WGCNA)
Piroptozla ilişkili gen modüllerini belirlemek için WGCNA, WGCNA R paketi kullanılarak gerçekleştirildi. Ölçeksiz^{topolojinin 23} olmasını sağlamak için 26'lık yumuşak eşik kuvveti (β) kullanılarak imzalı bir ağ inşa edilmiştir. Modüller, minimum modül boyutu 30, derin bölünme 2 ve birleştirme eşiği (kesme yüksekliği) 0.25 olan dinamik ağaç kesme algoritması ile tanımlandı. Modül özgenleri ile piroptoz özellikleri arasındaki korelasyon hesaplandı. Gen kümesi varyasyon analizi (GSVA), MsigDB ^24,25'ten indirilen tipik gen setleri kullanılarak seçilen modüller üzerinde gerçekleştirildi.

Makine öğrenimi
GSE116560 veri seti, 45 yaş sınırı kullanılarak yüksek ve düşük yaş gruplarına ayrıldı ve her iki grup da makine öğrenimi algoritmaları kullanılarak analiz edildi. En Küçük Mutlak Küçülme ve Seçim Operatörü (LASSO) regresyon analizi, R dilinde glmnet paketi (sürüm 4.1-2) kullanılarak uygulandı ve optimal ceza parametresi (λ) 10 kat çapraz doğrulama ile belirlendi (1-SE kriterler). Rastgele Orman (RF) algoritması için 500 ağaç (ntree = 500) oluşturuldu ve model kararlılığını sağlamak için her bölünmede (mtry) örneklenen özellik sayısı, toplam tahmin cihazının karekökü olarak ayarlandı. Her iki yöntemden çakışan genler, yaşa özgü imza genleri olarak tanımlandı.

Tanı modellerinin inşası ve değerlendirilmesi
Tanımlanan imza genlerine dayanarak bir tanısal tahmin modeli oluşturuldu. Modeli geliştirmek için lojistik regresyon kullanıldı ve öngörücü gücünü görselleştirmek için bir nomogram oluşturuldu. Modelin performansı, alıcı çalışma özelliği (ROC) eğrisi kullanılarak değerlendirildi ve eğriyi altındaki alan (AUC) tanı doğruluğunu değerlendirmek için hesaplandı. İç doğrulama, bootstrap yeniden örnekleme ile gerçekleştirildi. Model kararlılığı ve klinik faydasının daha ileri değerlendirilmesi, kalibrasyon grafikleri ve karar eğrisi analizi (DCA) kullanılarak gerçekleştirildi.

İmmün infiltrasyon analizi
Yüksek ve düşük yaş gruplarında bağışıklık hücresi bileşimi, LM22 imza matrisine dayalı CIBERSORT algoritması kullanılarak tahmin edilmiştir. 22 bağışıklık hücre tipinin göreli oranları gruplar arasında karşılaştırıldı. Bağışıklık hücresi alt kümeleri arasında hub genlerinin diferansiyel ekspresyonu, tek örnek verileriyle analiz edildi ve ısı haritaları ile histogramlarda görselleştirildi.

Gen seti zenginleştirme analizi (GSEA)
GSEA, yüksek ve düşük yaş gruplarından hub genlerinde ayrı olarak gerçekleştirildi. Gen Seti Zenginleştirme Analizi (GSEA), Kyoto Genler ve Genomlar Ansiklopedisi (KEGG) gen setleri kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Genler, yüksek ve düşük ekspresyonlu gruplar arasındaki sinyal-gürültü oranına (veya katlama değişimine) göre sıralandı. Zenginleştirme ve normalleştirilmiş zenginleştirme skorları (NES), 1.000 permütasyon kullanılarak anlamlı zenginleştirilmiş yollar belirlenerek hesaplandı. Yanlış keşif oranı (FDR) 0,25'ten az ve nominal P değeri 0,05'ten az olan yollar önemli ölçüde zenginleştirildi. Bu analiz, her hub geninin düzenlenebilen biyolojik yolları çıkarmak için kullanıldı.

Deneysel hayvanlar
Bu çalışmada on sekiz erkek SPF Sprague Dawley faresi (6-7 haftalık, 180 g ± 10 g) kullanıldı. Detaylı tedarikçi bilgileri Malzeme Tablosu'nda listelenmiştir.

Reaktifler ve aletler
Spektrum enerjisi suyu (SEW) ve uzak kızılötesi radyasyon (FIR) sağlamak için deneysel müdahalelerde elektromanyetik alan ile arıtılmış su hazırlama cihazları ve uzak kızılötesi emisyon aletleri kullanıldı. ARDS modellemesinde lipopolisakkarit (LPS) kullanıldı. Sitokin seviyeleri (IL-1β, IL-18, IL-6, TNF-α) belirli ELISA kitleri kullanılarak nicelendirildi. Protein ekspresyon seviyeleri (AXL, SPP1, Caspase-3, GSDME, GAPDH) spesifik primer antikorlar ve ilgili HRP ile konjuge ikincil antikorlar kullanılarak değerlendirildi. Örnek işleme ve analiz, biyomikroskop, mikrotom, yüksek hızlı santrifüj, ultra düşük sıcaklıklı dondurucu ve mikroplaka okuyucu gibi standart laboratuvar ekipmanlarıyla gerçekleştirildi. Tüm reaktifler, antikorlar ve aletler ile ilgili üreticilerin tam detayları Malzeme Tablosu'nda yer almaktadır.

Hayvan grupları ve modelleme
On sekiz Sprague-Dawley faresi rastgele olarak Kontrol, Model ve SEW+FIR gruplarına atandırıldı ve her grupta altı fare vardı. Her grup günlük olarak tartıldı ve belgelendi. SEW+FIR grubu, sıcaklık kontrollü ortamda (22 °C ± 2 °C) günde 20 dakika boyunca (dalga boyu 4 μm–14 μm, dorsal yüzeyden 20 cm ışınlanma mesafesi) FIR tedavisi aldı ve aynı zamanda oral gavaj 7 ile 1 mL/100 g/d dozda SEW aldı^. Distile su, Kontrol ve Model gruplarına 1 mL/100 g/gün eşdeğer dozda ağız yoluyla verildi. SEW ve damıtılmış su, 60 °C sıcak banyoda ısıtıldıktan sonra 7 gün boyunca günde bir kez verildi. Yedinci günde, beslenmeden 6 saat sonra, Model ve SEW+FIR gruplarına kuyruk damarından ağırlık açısından 2 mg/kg dozda LPS solüsyolu enjekte edilirken, Kontrol grubu %0,9 fizyolojik salin ile 2 mg/kg dozda tedavi edildi. Modelleme tekniği, kuyruk veninden tek bir LPS enjeksiyonuyla sistemik inflamatuar yanıt tetiklemek için olgun ve stabil bir yöntem olarak kabul edildi. Modellenen gruplarda akciğer patolojisinden alınan akciğer dokusu ARDS^{özellikleri 25} ile tutarlıydı. Kontrol noktası: Başarılı ARDS indüksiyonu, görünür halsizlik, takipne ve enjeksiyondan sonraki 16 saat içinde vücut ağırlığında ~%10 azalma ile^{gösterilir 26}.

Farelerle ilgili göstergelerin toplanması
On altı saat sonra, üç gruba da vücut ağırlığı için %30 mg pentobarbital sodyum intraperitoneal enjekte edildi ve anestezi başlatıldı. KRITİK: Anestezi derinliği, herhangi bir prosedürel müdahaleden önce pedal çekilme refleksinin kaybı ile kesin olarak doğrulanmalıdır. Ayrıca, sıkı biyogüvenlik protokolleri korundu; tüm LPS ile kirlenmiş maddeler, biyolojik sıvılar ve hayvan leşleri, uygun yakma için belirlenmiş biyolojik atık konteynerlerine atıldı. Karın aortasından steril tüplere beş mililitre kan toplandı ve serum, 4 °C'de 20 dakika boyunca 1.000 x g ölçüsünde santrifüjle izole edildi. Serum daha sonra daha fazla analiz için −80 °C'de saklandı. Sağ akciğer hilumunun torakotomi ve ligasyonu sonrasında, bronkoalveolar lavaj sıvısı (BALF), sol akciğerin endotrakeal kanül aracılığıyla önceden soğuttulan fosfat-tamponlu salin (PBS) ile üç kez yıkanmasıyla alındı. BALF daha sonra 10 dakika boyunca 4 °C'de 1.000 x g ile santrifüjlendi ve süpernatant −80 °C'de depolandı. Sağ akciğerin üst lobu çıkarıldı ve kan alınması için soğuk fizyolojik salinle temizlendi. Doku ağırlığına göre dokuz cild fizyolojik salin eklendi ve örnek, oftalmik makasla buz banyosunda doğrandı. %10 akciğer dokusu homojenatı bir homojenizatla hazırlanmış, ardından 700 x g ile 15 dakika boyunca 4 °C'de santrifüj yapılmıştır. Üst yüzey toplandı ve daha fazla biyokimyasal analiz için −80 °C'de depolandı. Ayrıca, her sıktan alınan sağ akciğer dokusunun bir kısmı histolojik inceleme için %4 paraformaldehit ile sabitlendi.

Gözlem göstergeleri ve tespit yöntemleri
Sağ akciğerin alt lobu standart gömme, doku dilimleme, waxdan arındırma, HE boyama, renk ayrımı, dehidrasyon ve fiksasyondan sonra %4 paraformaldehit ile film kapaması ile işlendi. Her grubun akciğer dokularında ışık mikroskobu altında gözlemlenen patolojik değişiklikler görüldü.

Alveolar mimari ve septumda patolojik anormallikler, inflamatuar hücre infiltrasyonu derecesi, hiperemî ve akciğer kapiller ödem ışık mikroskobu altında tespit edildi. Pekin Çin Tıp Üniversitesi Patoloji Bölümü gözleme yardımcı oldu. Histolojik akciğer yaralanması puanı şu şekilde hesaplandı: yaralanma yok = 0, yaralanma %25'ten az = 1, yaralanma %25–50 = 2, yaralanma %50–75 = 3 ve yaralanma %75'ten fazla yaralanma = 4. On alan rastgele seçildi ve gruplamaya kör olan araştırmacılar tarafından değerlendirildi.

ELISA, üreticinin talimatlarına göre daha önce toplanan BALF süpernatantı, akciğer dokusu homojenatı ve kan serumu örnekleri üzerinde gerçekleştirildi. Kısa süreliğine, örnekler önceden kaplanmış kuyularda 37 °C'de 90 dakika boyunca kuluçka içindeydi. Yıkama tamponu ile beş kez yıkandıktan sonra, biotinile tespit antikorları (1:100 seyreltme) 37 °C'de 60 dakika uygulandı. Başka bir yıkama adımından sonra, HRP-konjugat eklendi ve 37 °C'de 30 dakika boyunca karanlıkta kuluçka edildi. Daha sonra, örnek konsantrasyonları hesaplanmak için mikroplaka okuyucu kullanılarak 450 nm soğurma ölçümü yapıldı.

Western blot analizi, −80°C'de depolanan akciğer dokusu ve BALF örneklerinde AXL, SPP1, kaspaz-1, GSDMD, kaspaz-3, GSDME ve GAPDH ifade seviyelerini değerlendirmek için gerçekleştirildi. Proteinler, Protein Ekstraksiyon Kit'indeki talimatlara göre toplanıp lizediliyordu. Her şerit başına eşit miktarda protein ekstraktı (40 μg) yüklenir ve SDS-PAGE ile çözülürdü. Polipeptitler daha sonra ayrılarak PVDF membranlarına aktarıldı. Zarlar, oda sıcaklığında 1 saat TBST'de %5 yağsız kuru sütle tıkanmış ve ardından 4 °C'de spesifik birincil antikorlarla (1:1000 seyreltilmiş) gece boyunca kuluçka salınmıştır. TBST ile üç kez 10 dakika boyunca yıkandıktan sonra, zarlar karşılık gelen HRP ile konjuge edilmiş ikincil antikorlarla (1:5000 seyreltilmiş) oda sıcaklığında blok çözeltisinde 1 saat kuluçka edildi. GAPDH iç referans protein olarak kullanıldı. Protein bantları, 1–5 dakika pozlama süresine sahip geliştirilmiş kemilyüminsans (ECL) kiti kullanılarak görselleştirildi ve sonuçlar görüntü işleme yazılımı kullanılarak analiz edildi. Hedef proteinlerin göreli ifade seviyeleri, hedef proteinin GAPDH oranı olarak hesaplandı.

İstatistiksel analiz
Kantitatif indeksler ortalama ± standart sapma olarak ifade edildi ve istatistiksel analiz istatistiksel yazılım kullanılarak gerçekleştirildi. Kruskal–Wallis testi veya tek yönlü ANOVA, verilerin normal dağılımına bağlı olarak birkaç grup arasındaki farkları karşılaştırmak için kullanıldı. Tüm istatistikler iki taraflı bir hipotez testi kullanılarak değerlendirildi. Farklı gen ekspresyonları ve bağışıklık hücresi infiltrasyon profili gibi çoklu karşılaştırmalar içeren analizler için, P değerleri Benjamini-Hochberg yanlış keşf oranı (FDR) yöntemiyle ayarlandı. 0,05 veya daha düşük ayarlanmış P değeri istatistiksel olarak anlamlı olarak kabul edildi. Grafik çizim için grafik yazılımı kullanıldı.

Sonuçlar

Farklı yaş gruplarında DEG'lerin GSE89953 tanımlanması ve buna uygun fonksiyonel zenginleştirme analizi
GSE89953 veri setinden ham ifade verileri, limma paketindeki normalizeBetweenArrays fonksiyonu kullanılarak normalize edildi (Şekil 1A) ve normalizasyon öncesi ve sonrası kutu grafikleri, örnekler arasında daha iyi tutarlılığı doğruladı. Normalize matrisle yapılan diferansiyel ifade analizi, yüksek yaş grubunda 16 önemli şekilde yukarı ...

Tartışma

İltihap yaralanma ve bağışıklık düzensizliğinin birikimi, akut solunum sıkıntısı sendromunun (ARDS) ayırt edici özelliğidir ve ciddi akciğer hasarına ve yüksek ölüme yol açar. Karmaşık patogenez ve etkili tedavilerin eksikliği nedeniyle, sonuçları iyileştirmek için kesin terapötik hedeflerin belirlenmesi kritik öneme sahiptir. Ortaya çıkan kanıtlar, programlanmış hücre ölümünün bir formu olan piroptozun ARDS ilerlemesinde merkezi bir rol oynadığını göstermektedir. Yaşın ARDS'nin başlangı...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Anti-AXL antikor	Abcam	ab215205
Anti-Kaspaz-3 antikor	Abcam	AB184787
Anti-GAPDH antikor	Abcam	ab8245
Anti-GSDME antikor	Abcam	ab215191
Anti-SPP1 antikor	Abcam	ab307994
Biyomikroskop	OLYMPUS, Japonya	BH2
FIR aleti	Guangdong JFC Grubu	JF-802
Keçi Anti-Tavşan IgG H&; L (HRP)	Abcam	AB6721
GraphPad Prism 10.1.2	GraphPad Yazılımı	-
Yüksek hızlı santrifüj	Thermo, ABD	Sorvall ST16R
IL-18 ELISA kiti	Jiangsu Meibiao Biyoteknoloji Şirketi, Ltd.	MB-1735B
IL-1β ELISA kiti	Jiangsu Meibiao Biyoteknoloji Şirketi, Ltd.	MB-1588B
IL-6 ELISA kiti	Jiangsu Meibiao Biyoteknoloji Şirketi, Ltd.	MB-50054A
ImageJ	NIH	-
Lipopolisakkarit (LPS)	Sigma, ABD	L6511
Erkek SPF Sprague Dawley fareleri (6-7 hafta)	Pekin HFK Bioscience Co., Ltd., Çin	SCXK(Pekin)2019-008 (Lisans)
Mikroplaka okuyucu (Varioskan Flash)	Termo Bilimsel	Varioskan Flash
Mikrotom	LEICA	RM2235
R software (limma, clusterProfiler, WGCNA, glmnet, randomForest)	R İstatistiksel Hesaplama Vakfı	-
SEW hazırlık cihazı	Guangdong JFC Grubu	JF-139
SPSS 26.0	IBM	-
Tablo dengesi	Şanghay Cany Hassas Aletler Şirketi, Ltd.	HC· TP11· 10
TNF-α ELISA kiti	Jiangsu Meibiao Biyoteknoloji Şirketi, Ltd.	MB-50051A
Ultra düşük sıcaklıklı dondurucu	Thermo, ABD	Forma 900 Serisi