Osteoartrit için TongBi formülünün ağ farmakolojisi ve moleküler kenetlenme çalışması

Özet

Bu protokol, ağ farmakolojisi ve moleküler kenetlenme kullanarak osteoartritle karşı TongBi Formülünün potansiyel terapötik hedeflerini ve moleküler mekanizmalarını öngörmektedir.

Özet

Bu çalışma, ağ farmakolojisini moleküler kenetlenme ile birleştirerek osteoartritte (OA) TongBi Formülünün (TBF) potansiyel terapötik hedeflerini ve moleküler mekanizmalarını tahmin etmiştir. TBF'nin aktif bileşenleri ve ilgili hedefleri geleneksel Çin tıbbı Systems Pharmacology Database and Analysis Platform'dan alındı, OA ile ilgili hedefler ise Online Mendel Inheritance in Man, GeneCards, DrugBank ve Therapeutic Target Database'den toplandı. Bileşik-hedef ve protein-protein etkileşim (PPI) ağları oluşturmak için bir ağ görselleştirme ve analiz yazılımı kullanıldı. Gen Ontolojisi fonksiyonel açıklaması ve Kyoto Genler ve Genomlar Ansiklopedisi yol zenginleştirme analizleri, Açıklama, Görselleştirme ve Entegre Keşif Veritabanı platformu kullanılarak gerçekleştirildi. Moleküler kenetlenme analizi, anahtar aktif bileşikler ile çekirdek hedef proteinler arasındaki öngörülen bağlanma afinitesini değerlendirmek için moleküler kenetlenme yazılımı kullanılarak gerçekleştirildi. TBF ve OA arasında toplam 47 örtüşen hedef tespit edildi. PPI ağ analizi JUN, RELA, IL6, MAPK1 ve IL10'u potansiyel merkez hedefleri olarak vurguladı. Zenginleştirme analizi, TBF'nin iltihabı, lipid metabolizması ve OA ilerlemesiyle ilişkili çoklu hücre içi sinyal yollarını düzenleyebileceğini gösterdi. Moleküler kenetlenme sonuçları, çekirdek aktif bileşikler ile temel OA ile ilgili protein hedefleri arasında olumlu tahmin edilen bağlanma eğilimlerini göstermiştir. Bu bulgular, TBF'nin OA'ya karşı potansiyel mekanizmalarını anlamak için hesaplamalı bir çerçeve sağlar ve daha fazla deneysel doğrulamayı destekler.

Giriş

Osteoartrit (OA), eklem kıkırdağının dejeneratif bir inflamatuar^{hastalığıdır 1}. Şu anda yaklaşık 58 milyon yetişkin OA'dan etkileniyor ve bu sayının 2040 yılına kadar 78,4 milyona çıkması^{öngörülüyor 2}. OA, dünya genelinde eklem ağrısı ve fonksiyonel bozuklukların yaygın bir^{nedenidir 3}. OA ile ilişkili şiddetli ağrı nedeniyle, hastalar günlük hayatlarında sıklıkla önemli bir engellilik^{yaşarlar 4}. Yaş, kadın cinsiyeti, obezite ve eklem hasarı OA⁵ için başlıca risk faktörleridir. OA'nın yaygınlığı son derece yüksek ve sağlık sistemleri üzerinde önemli bir etkiye sahip olmasına rağmen, mevcut tedavi seçenekleri^{sınırlıdır 6}. Modern tıp, yaygın olarak steroid olmayan anti-enflamatuar ilaçlar ve kıkırdak koruyucuları gibi semptomatik tedavileri benimser. Ancak, uzun süreli uygulama sıklıkla gastrointestinal hasar ve anormal karaciğer ile böbrek fonksiyonu gibi yan^{etkilere yol açar 7}. Bu nedenle, OA için yeni tedavi yöntemleri veya alternatif tedaviler geliştirmeye acil bir ihtiyaç vardır.

Geleneksel Çin Tıbbı (TCM), OA tedavisinde kapsamlı deneyim biriktirmekte, sendrom farklılaşması ve bütüncül düzenlemeye vurgu yapmaktadır. TongBi Formülü (TBF), ağırlıklı olarak Danggui, Danshen, Jixueteng, Haifengteng, Tougucao, Duhuo, Weilingxian ve Xiangfu'dan oluşan klasik bir reçetedir. TCM açısından bakıldığında, OA'nın patolojik doğası esas olarak rüzgar-soğuk-nemli istila ve qi ile kanın durgunluğundan^{kaynaklanır8}. TBF'nin bitkisel uyumluluğu, tüm tıbbi bileşenlerin sinerjik olarak hareket ederek rüzgar ve nemi dağıttığı, meridyenleri taraması ve kan dolaşımını teşvik ettiği bu temel patolojik mekanizmaya uyacak şekilde tasarlanmıştır; böylece OA'nın tipik TCM sendromu özelliklerine karşılık gelir. Artan klinik araştırmalar, modifiye TBF'nin OA⁹ hastalarında eklem ağrısını hafifletebileceğini ve uzuv motor fonksiyonunu iyileştirebileceğini göstermektedir. Daha fazla klinik gözlem, OA^{vakası 10'da} inflamatuar yanıtları düzenleme potansiyelini de göstermiştir; yakın zamanda yapılan bir meta-analiz ise OA^{müdahalesi 11} için klinik uygulanabilirliğini daha da desteklemiştir.

TBF geleneksel olarak rüzgarı dağıtmak, kanalları açmak, soğuğu dağıtmak, nemi ortadan kaldırmak ve kan dolaşımı ile beslenmeyi teşvik etmek için kullanılır. Ancak, TBF'nin OA'ya karşı potansiyel terapötik etkiler yarattığı spesifik mekanizmalar henüz belirsizdir ve aktif bileşenleri ile ana hedefleri henüz belirlenmemiştir. Bu mekanizmaları daha sistematik ve kapsamlı bir şekilde incelemek için, ilaç ve hedefler arasındaki ilişkileri gösteren bir ağ haritası oluşturmak için ağ farmakolojisi yaklaşımı^{kullandık 12}. Ayrıca, TBF^13'ün farmakolojik etkisinde yer alan potansiyel moleküler mekanizmalar ve sinyal yolları incelenmek için Gen Ontolojisi (GO) ve Kyoto Genler ve Genomlar Ansiklopedisi (KEGG) zenginleştirme analizleri yapıldı. TCM reçetelerinin farmakolojik mekanizmalarını sistematik olarak incelemek için bu çalışma, aktif bileşen taraması, hedef tahmini, ağ inşası, fonksiyonel zenginleştirme analizi ve moleküler kenetlenmeyi kapsayan tam bir analitik iş akışı oluşturdu. Böyle bir araştırma çerçevesi, TCM formüllerinin moleküler mekanizmalarını OA^14'e karşı incelemek için standartlaştırılmış ve tekrarlanabilir bir paradigma olarak kabul edilmiştir. Mevcut metodolojik çalışmalar, bu araştırma stratejisinin bilimsel rasyonalitesini ve pratik uygulanabilirliğini daha da^{desteklemiştir 15}. Metodolojik standartlaştırmanın ötesinde, bu çalışma OA'da TBF'nin maddi temelini ve temel düzenleyici hedeflerini tanımlamaya yardımcı olmaktadır. Ayrıca, TBF'nin klinik uygulaması ve gelecekteki deneysel doğrulaması için teorik referanslar sağlarken, diğer TCM reçetelerinin mekanik olarak incelenmesi için uygulanabilir bir metodolojik çerçeve de sunar.

Bu çalışmada, aktif bileşenleri taramak ve OA ile ilişkili hedef genlerle birleştirilmiş bileşik-hedef ağı oluşturmak için ağ farmakolojisi yaklaşımı kullandık. Daha sonra mekanik keşif için fonksiyonel zenginleştirme analizi ve moleküler kenetlenme gerçekleştirildi. Ağ farmakolojisi, biyolojik ve farmakolojik bilgileri entegre ederek ilaç–hedef–hastalık ilişkilerini kapsamlı ve çok yönlü bir bakış açısıyla^inceler. Bu yaklaşımın TBF'nin potansiyel farmakolojik mekanizmalarını netleştirmeye ve sonraki deneysel araştırmalar için teorik bir temel sağlayabileceğine inanıyoruz. Çalışmanın iş akışı Şekil 1'de sunulmaktadır.

Şekil 1. Ağ farmakolojisi ve moleküler kenetlenme çalışma tasarımının iş akışı. TongBi Formülünün (TBF) osteoartritlere (OA) karşı potansiyel mekanizmalarını incelemek için kullanılan analitik iş akışının şematik genel bakışı. İş akışı aktif bileşik taraması, hedef tahmini, OA ile ilgili hedef toplama, kesişim analizi, ağ yapımı, protein-protein etkileşimi (PPI) analizi, Gen Ontolojisi (GO) ve Kyoto Genler ve Genomlar Ansiklopedisi (KEGG) zenginleştirme analizleri ile moleküler kenetlenme doğrulamasını içeriyordu. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Protokol

Bu çalışmada insan katılımcılar, omurgalı hayvanlar veya doku örnekleri yer almamıştır. Tüm analizler, halka açık biyoinformatik veri tabanları ve moleküler kenetlenme yaklaşımları kullanılarak gerçekleştirildi; bu nedenle etik onay gerekmiyordu.

TBF'nin bileşenleri ve ilgili hedeflerinin taraması
TBF'nin tüm bitkisel bileşenleri, Danggui, Danshen, Jixueteng, Haifengteng, Tougucao, Duhuo, Weilingxian ve Xiangfu dahil olmak üzere, TCM Systems Pharmacology Database and Analysis Platform (TCMSP) (TCMSP) (erişim tarihi) kapsamında (erişim tarihi Ocak 2026) tarafından incelendi. Tam arama terimleri, her bitkisel ilacın standartlaştırılmış Latince isimlerine karşılık geliyordu: Angelicae Sinensis Radix (Danggui), Radix Salviae (Danshen), Spatholobus suberectus Dunn (Jixueteng), Caulis Piperis Kadsurae (Haifengteng), Impatiens balsamina (Tougucao), Radix Angelicae Biseratae (Duhuo), Radix Clematidis (Weilingxian) ve Cyperi Rhizoma (Xiangfu). Kimyasal bileşenler, sabit ağız biyoyararlanılım (OB) eşiklerine göre %30 ≥ ve ilaç benzerliği (DL) ≥ 0,18'e göre tarandı. Bu kesme değerleri, potansiyel in vivo aktiviteye sahip biyolojik kullanılabilir ve ilaç benzeri aktif bileşiklerin belirlenmesi için TCM ağ farmakoloji çalışmalarında yaygın olarak kullanılır. Veritabanında açık OB veya DL değerleri olmayan bileşikler, aktif bileşik taramasının güvenilirliğini ve tutarlılığını korumak için hariç tutuldu.

Taramaya uğrayan aktif bileşiklerin ilgili protein hedefleri daha sonra TCM farmakoloji veritabanından alındı. Hedef gen standartlaştırması, Universal Protein Resource (UniProt) protein açıklama veritabanı kullanılarak gerçekleştirildi ve tür yalnızca Homo sapiens ile sınırlandırıldı (erişim tarihi Ocak 2026). Orijinal protein isimleri resmi insan gen sembollerine dönüştürülürken, gereksiz ve insan dışı hedef girişleri manuel olarak hariç tutuldu. Tekrarlanan hedefler, nihai TBF hedef veri seti oluşturmak için manuel karşılaştırma ve derleme yoluyla kaldırıldı.

OA ile İlgili Hedeflerin ve TBF'nin OA için Potansiyel Terapötik Hedeflerinin Belirlenmesi
OA ile ilgili hedefler, Online Mendel Mirası (OMIM), GeneCards, DrugBank ve Therapeutic Target Database (TTD) veritabanlarında (Ocak 2026'da erişildi) tam olarak "Osteoartrit" arama terimi kullanılarak elde edildi. Farklı veritabanlarından elde edilen tekrarlanan hedefler, veri toplama ve karşılaştırma yoluyla manuel olarak kaldırılarak OA ile ilgili hedef veri seti oluşturuldu. GeneCards için sadece 3 ≥ alaka puanına sahip hedefler korundu. OMIM, DrugBank ve TTD'den "Osteoartrit" anahtar kelimesiyle alınan hedefler ek filtreleme kriterlerine tabi tutulmadı. Aktif bileşik ile OA ile ilgili hedefler arasında örtüşen hedefler, Venny 2.1.0 çevrimiçi Venn analiz aracı kullanılarak belirlendi. Kesişim analizi, TBF'nin OA'ya karşı potansiyel terapötik hedeflerini belirlemek için gerçekleştirildi.

TBF–Bileşen–Hedef Ağı'nın İnşası
Bileşen–hedef etkileşim verileri, TBF–Bileşen–Hedef ağını oluşturmak için Cytoscape 3.10.2 ağ görselleştirme ve analiz yazılımına aktarıldı (erişim tarihi Ocak 2026). Oluşturulan ağda, düğümler bitkisel bileşikleri ve hedef genleri temsil ederken, kenarlar aktif bileşikler ile karşılık gelen hedefler arasındaki etkileşimleri temsil ederdi. Tekrarlı analizi önlemek için, birden fazla bitki arasında paylaşılan çoğaltıcı bileşikler tek bir benzersiz düğümde birleştirildi. Daha sonra ağ topolojik analizi birincil değerlendirme parametresi olarak derece değeri kullanılarak gerçekleştirildi. Çekirdek aktif bileşikler derece derecesine göre belirlendi ve sonraki moleküler ikişlenme analizi için ligand adayları olarak seçildi.

PPI Ağ İnşası
Potansiyel terapötik hedefler, PPI analizi için STRING PPI veritabanına ithal edildi (erişim tarihi Ocak 2026). Tür parametresi Homo sapiens ile sınırlıydı ve minimum gerekli etkileşim güven puanı 0.9 olarak ayarlandı, kalan tüm parametreler varsayılan ayarlarda korundu. Oluşturulan etkileşim verileri, ağ görselleştirme ve analiz yazılımı kullanılarak dışa aktarıldı ve daha da görselleştirildi. PPI ağının topolojik analizi CytoHubba ağ topoloji analiz eklentisi kullanılarak gerçekleştirildi. Derece, aralık merkezilik ve yakınlık merkeziliği, etkileşim ağı içindeki düğüm önemini değerlendirmek için hesaplandı. Çekirdek hedef proteinler, entegre topolojik özelliklere göre belirlendi ve sonraki moleküler kenetlenme analizi için seçildi. Merkez hedeflerini taramak için Maximal Clique Centrality algoritması benimsendi. Etkileşimde bulunmayan ortakları olmayan düğümler hariç tutuldu; bu da nihai ağda orijinal ithal hedef veri setine göre daha az düğüm sayısına yol açtı.

GO ve KEGG
GO fonksiyonel zenginleştirme analizi ve KEGG yolu zenginleştirme analizi, OA'ya karşı belirlenen TBF'nin terapötik hedefleriyle ilişkili potansiyel biyolojik fonksiyonları ve sinyal yollarını incelemek için gerçekleştirildi. GO analizi, biyolojik süreç (BP), hücresel bileşen (CC) ve moleküler fonksiyon (MF) olmak üzere üç standart ontoloji kategorisini içeriyordu ve biyolojik süreç yorumun birincil odağı olarak belirlendi.

Fonksiyonel zenginleştirme analizi, Açıklama, Görselleştirme ve Entegre Keşif Veritabanı (DAVID) ve R istatistiksel analiz yazılımı (sürüm 4.3.1; erişim tarihi Ocak 2026) kullanılarak gerçekleştirildi. Zenginleştirme sonuçları, clusterProfiler paketi kullanılarak işlenip görselleştirildi; dotplot ve barplot fonksiyonları zenginleştirme diyagramları oluşturmak için kullanıldı. Tüm hedef genler Homo sapiens arka planına göre annotlandı. Benjamini–Hochberg yöntemi çoklu test düzeltmesi için uygulandı ve ayarlanmış bir P-değeri < 0.05 istatistiksel olarak anlamlı olarak kabul edildi.

GO ve KEGG zenginleştirme sonuçlarının görselleştirilmesi, MicrobiomeAnalyst/MicrobiomeNet çevrimiçi analiz platformu kullanılarak gerçekleştirildi (erişim tarihi Ocak 2026). En önemli şekilde zenginleştirilmiş GO terimlerini ve KEGG yollarını göstermek için çubuk grafikler ve balon grafikleri oluşturuldu.

Moleküler Kenetlenme
En üst çekirdek hedeflerin resmi gen isimleri ve ilgili Protein Veri Bankası (PDB) tanımlayıcıları protein açıklama veritabanından alındı17 ve üç boyutlu kristal yapıları RCSB PDB'den indirildi (erişim tarihi Şubat 2026). Her hedef protein için Zincir A reseptör yapısı olarak korunurken, reseptör hazırlığı sırasında gereksiz protein zincirleri, heteroatomlar ve ilişkisiz yapısal parçalar çıkarıldı. Çekirdek aktif bileşiklerin üç boyutlu yapıları PubChem veritabanından (erişim tarihi: Şubat 2026) alındı. Bu çalışmada, quercetin bileşen-hedef ağında en yüksek topolojik merkeziyeti gösterdiği ve OA patogenezine karşı koruyucu etkileri bildirilen iyi karakterize edilmiş bir flavonoid olduğu için temsilli ikiştirme ligandı olarak seçildi.

Reseptör ve ligand ön işleme, su moleküllerinin çıkarılması, hidrojen atomu eklemesi, proton tedavisi ve Gasteiger yükü ataması dahil olmak üzere moleküler kenetlenme hazırlık yazılımı kullanılarak gerçekleştirildi. Moleküler kenetlenme analizi daha sonra moleküler kenetlenme yazılımı 1.5.7 sürümü kullanılarak gerçekleştirildi. Grid kutusu boyutları, her hedef proteinin öngörülen bağlanma bölgelerini kapsayacak şekilde ayarlandı. Grid kutusu, her hedef proteinin doğal ligand bağlama cebinin ortasında duruyordu; 40 ş× 40 ş× 40 şboyutlarında ve 0.375 şızgara aralığında bulunuyordu. Düğümleme hesaplamaları 8 tükeniklilik parametresi ile yapıldı ve her ligand–hedef çifti için dokuz aday bağlanma konformasyonu oluşturuldu. En düşük tahmin edilen bağlanma enerjisine sahip kenetlenme konformasyonu, sonraki yapısal yorumlar için temsil edici bağlanma pozu olarak seçildi. Bu çalışmada yeniden dikerleme doğrulaması ve pozitif kontrol ligand karşılaştırması yapılmadı. Tüm kenetlenme prosedürleri ve parametre ayarları, tahmin edilen bağlanma modlarının güvenilirliğini desteklemek için ağ farmakolojisi araştırmalarında yaygın olarak benimsenen standart protokollere uyarlanmıştır. Kenetlenme konformasyonları, moleküler görselleştirme yazılımı 2.5.4 sürümü kullanılarak görselleştirildi. ≤−5.0 kcal/mol bağlanma enerjisi, kararlı ligand-reseptör bağlanmasının göstergesi olarak kabul edildi.

Sonuçlar

TBF'nin Kimyasal Bileşimi ve Hedef Taraması
Tarama sonrası Danggui'den 2, Danshen'den 65, Jixueteng'den 24, Haifengteng'den 21, Tougucao'dan 6, Duhuo'dan 9, Weilingxian'dan 7 ve Xiangfu'dan 18 aktif bileşen tespit edildi. Taramalı aktif bileşikler hakkında ayrıntılı bilgiler Ek Tablo 1'de verilmiştir. Başlangıçta toplam 2672 potansiyel hedef alındı; bunlar arasında Danggui için 266, Danshen için 689, Duhuo için 236, Haifengteng için 188, Jixueteng için 545, Tougucao için 192, Weilingxian için 102 ve Xiangfu için 454 hedef bulunuyordu. Ayrıntılı hedef bilgileri Ek Tablo 2'de sunulmaktadır. Tekrarlanan kayıtlar kaldırıldıktan sonra, TBF ile ilişkili 258 tekrarsız hedef elde edildi.

TBF–Bileşen–Hedef Ağı
TBF–Bileşen–Hedef ağı, TCM farmakoloji veritabanından alınan veriler kullanılarak oluşturulmuştur; bunlar arasında 152 aktif bileşik, 258 yedeksiz hedef ve 8 bitkisel ilaç düğümü bulunmaktadır. Bu veriler iki dosyaya dönüştürülmüştü; bunlar "ağ" ve "Tür" olarak adlandırıldı (Ek Tablo 3). Dosyalar ağ görselleştirme ve analiz yazılımına aktarıldıktan sonra, 578 düğüm ve 3022 kenardan oluşan kapsamlı bir ağ oluşturuldu (Şekil 2). Oluşturulan ağda, düğümler bitkisel ilaçları, biyoaktif bileşikleri ve ilgili hedef proteinleri temsil ederken, kenarlar bileşikler ve hedefler arasındaki öngörülen etkileşimleri temsil ediyordu. Daha büyük düğüm boyutu ve daha koyu renk yoğunluğu, daha yüksek derece değerlerini ve artan ağ bağlantısını gösteriyordu. Ağ topolojik analizinden elde edilen derece sıralamasına dayanarak, en iyi beş aktif bileşik quercetin (A7-MOL000098), beta-sitosterol (B8-MOL000358), luteolin (A1-MOL000006), kaempferol (C1-MOL000422) ve stigmasterol (C2-MOL000449) olarak belirlendi.

Şekil 2. TBF–Bileşen–Hedef etkileşim ağı. TBF, aktif bileşikler ve tahmin edilen hedef genler arasındaki etkileşimlerin ağ görselleştirmesi. Düğümler bitkisel ilaçları, aktif bileşikleri veya hedef proteinleri temsil ederken, kenarlar bileşikler ve hedefler arasındaki öngörülen etkileşimleri temsil eder. Daha büyük düğüm boyutu ve daha koyu renk yoğunluğu, daha yüksek derece değerlerini ve artan ağ bağlantısını gösterir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

OA ile ilgili hedef bilgileri ve TBF'nin potansiyel terapötik hedefleri
"Osteoartrit" anahtar kelimesi dört veritabanında aranmış ve 428 potansiyel hastalıkla ilgili hedef ortaya çıkmıştır; bunlardan 9'u OMIM'den, 349'u GeneCards'tan, 32'si DrugBank'tan ve 38'i TTD'den bulunmuştur. Dört veritabanı arasındaki hedef dağılımını gösteren bir Venn diyagramı Şekil 3'te sunulmaktadır. Tekrarlanan girişler birleştirilip kaldırıldıktan sonra, 398 benzersiz OA ile ilgili hedef elde edildi. OA ile ilgili hedefler ile TBF aktif bileşik ilişkili hedefler arasındaki kesişim analizi, TBF'nin OA'ya karşı potansiyel terapötik hedefleri olarak kabul edilen 47 örtüşen hedef tespit etti. Çevrimiçi Venn analiz aracı kullanılarak oluşturulan ilgili Venn diyagramı Şekil 4'te gösterilmiştir.

Şekil 3. Birden fazla veritabanından alınan OA ile ilgili hedeflerin Venn diyagramı. OMIM, GeneCards, DrugBank ve Therapeutic Target Database (TTD) veritabanlarından tespit edilen OA ile ilgili hedefler arasındaki örtüşmeyi gösteren Venn diyagramı. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4. TBF ve OA arasında örtüşen hedeflerin tanımlanması. TBF'nin aktif bileşik ile ilgili hedefleri arasındaki kesişimi gösteren Venn diyagramı. Örtüşen hedefler, TBF'nin OA'ya karşı potansiyel terapötik hedefleri olarak kabul edildi. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

PPI Ağı'nın İnşası ve Analizi
47 örtüşen hedefin PPI ağ analizi PPI veritabanı kullanılarak yapıldı (Şekil 5) ve ardından ağ görselleştirme ve analiz yazılımı kullanılarak görselleştirildi. Ağ inşası sırasında, protein-protein etkileşimleri (PPI) olmayan izole hedefleri temsil eden bağlantısız düğümler standart ağ topoloji prosedürlerine göre kaldırıldı ve böylece 39 düğüm ve 108 kenardan oluşan rafine bir ağ elde edildi (Şekil 6). Düğüm boyutu ve renk yoğunluğu, ağ içindeki hedeflerin göreceli önemini gösteren derece değerlerini yansıtıyordu.

Şekil 5. STRING PPI ağı örtüşen hedefler. TBF ve OA arasındaki örtüşen hedefler için STRING veritabanı kullanılarak oluşturulan PPI ağı. Düğümler hedef proteinleri, kenarlar ise tahmin edilen PPI'leri temsil eder. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 6. Çekirdek PPI ağ analizi. Bağlantısı kesilen düğümlerin kaldırılmasından sonra PPI ağı iyileştirildi. Düğüm boyutu ve renk yoğunluğu derece değerlerini temsil eder ve ağ içindeki hedeflerin göreceli önemini gösterir. JUN, RELA, IL6, MAPK1 ve IL10 gibi temel hedefler yüksek ağ bağlantısı gösterdi. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

PPI ağının topolojik analizi, düğüm topolojik özelliklerini hesaplamak için Degree algoritmalı ağ topoloji analiz eklentisi kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Derece değerine göre sıralanmış en iyi 10 hedef Tablo 1'de sunulmaktadır. JUN, RELA, IL6, MAPK1 ve IL10 dahil olmak üzere en yüksek sıradaki beş hedef, derecelik değeri, yakınlık merkezi ve aralık merkezi yapısına dayalı moleküler kenetlenme analizi için temel hedefler olarak seçildi.

OA'da TBF'nin GO Biyolojik Fonksiyonu ve KEGG Yolu Analizi
GO zenginleştirme analizi, sitokin aktivitesi, transkripsiyon faktörünün bağlanması ve büyüme faktörü aktivitesi gibi OA ile ilgili birkaç biyolojik fonksiyonu tespit etmiş; bu da TBF'nin iltihaplanma, transkripsiyonel aktivite ve kıkırdak homeostazının düzenlenmesinde potansiyel rol almasını önermektedir. En iyi 20 zenginleştirilmiş GO terimi, sayım değerlerine göre sıralanmış ve bir çubuk grafik kullanılarak görselleştirilmiştir (Şekil 7). KEGG yolu zenginleştirme analizi, OA ile ilgili sinyal yolları gibi gelişmiş glikasyon son ürünleri–gelişmiş glikasyon son ürünleri için reseptör, interlökin-17 (IL-17) sinyal yolu, tümör nekroz faktörü (TNF) sinyal yolu ve T hücresi reseptör sinyal yolu gibi inflamatuar düzenleme, kondrosit katabolizmi ve OA'da bağışıklık yanıtlarıyla ilişkili olan T hücresi sinyal yollarına odaklandı. Zenginleştirme analizi sırasında tespit edilen enfeksiyon hastalıklarıyla ilgili yollar, mevcut çalışmada doğrudan OA mekanizmaları olarak yorumlanmamıştır. KEGG yol analizi, istatistiksel analiz yazılımı kullanılarak yapılarak bir baloncuk grafik görselleştirmesi oluşturuldu (Şekil 8). Toplamda 20 önemli şekilde zenginleştirilmiş sinyal yolu tanımlandı. Bu sonuçlar, TBF'nin OA ile ilgili biyolojik süreçleri ve sinyal yollarını çoklu hedefli farmakolojik mekanizma aracılığıyla düzenleyebileceğini gösterdi.

Şekil 7. Potansiyel terapötik hedeflerin GO zenginleştirme analizi. TBF'nin OA'ya karşı potansiyel terapötik hedefleriyle ilişkili en zenginleştirilmiş 20 GO terimini gösteren çubuk grafik. Zenginleştirilmiş terimler arasında biyolojik süreçler, moleküler fonksiyonlar ve iltihaplanma, transkripsiyonel düzenleme ve kıkırdak homeostazı ile ilgili hücresel bileşenler yer alır. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 8. Potansiyel terapötik hedeflerin KEGG yol zenginleştirme analizi. OA'ya karşı TBF'nin potansiyel terapötik hedefleriyle ilişkili en zenginleştirilmiş KEGG sinyal yollarının baloncuk grafik görselleştirmesi. Balon büyüklüğü, zenginleştirilmiş genlerin sayısını, renk yoğunluğu ise zenginleşme önem seviyesini yansıtır. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Moleküler Kenetlenme Doğrulaması
TBF'nin ana aktif bileşiği ile PPI ağından tanımlanan çekirdek hedefler arasındaki potansiyel bağlanma etkileşimlerini daha fazla incelemek için, bileşen-hedef ağında en üst sırada yer alan quercetin ile beş temel hedef JUN, RELA, IL6, MAPK1 ve IL10 arasında moleküler kenetlenme analizi yapıldı (Tablo 2). Quercetin, bileşen-hedef ağında en yüksek topolojik önemi göstermiş olup, anti-inflamatuar aktivite ve kıkırdak metabolizması düzenlemesi ile ilişkili temsil edici biyoaktif bileşik olarak^{yaygın olarak bildirilmiştir 18,19}. Tahmin edilen bağlanma enerjileri JUN için −8,4 kcal/mol, RELA için −7,6 kcal/mol, IL6 için −6,9 kcal/mol ve hem MAPK1 hem de IL10 için −6,7 kcal/mol olup, quercetin ile seçilen çekirdek hedefler arasında olumlu tahmin edilen bağlanma eğilimlerini gösteriyordu. Ligand–reseptör bağlanma konformasyonlarının görselleştirilmesi, potansiyel moleküler etkileşimlerin yorumlanmasını kolaylaştırdı. Moleküler görselleştirme yazılımı sürüm 2.5.4, quercetin ile beş çekirdek hedef arasındaki optimal kenetlenme konformasyonlarını görselleştirmek için kullanılmıştır (Şekil 9–13).

Şekil 9. JUN ile quercetinin moleküler kenetleme modeli (PDB ID: 1JNM). JUN'a bağlı quercetinin üç boyutlu moleküler kenetleme konformasyonu. Quercetin'in JUN'un bZIP alanında bağlanıp hidrofobik bağlanma boşluğuna yapısal tamamlayıcılık ile uyduğu öngörüldü. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 10. RELA (PDB ID: 7LEU) ile quercetinin moleküler kenetlenme modeli. RELA'ya bağlı quercetinin üç boyutlu moleküler kenetlenme konformasyonu. Quercetin'in, RELA Rel homoloji alanının aktif bölgesiyle kovalent olmayan etkileşimler yoluyla etkilendiği öngörülmüştür. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 11. IL6 ile quercetinin moleküler kenetleme modeli (PDB ID: 1ALU). IL6'ya bağlı quercetinin üç boyutlu moleküler kenetlenme konformasyonu. Quercetin'in IL6'nın korunan reseptör bağlama yivini işgal ettiği öngörüldü. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 12. MAPK1 ile quercetinin moleküler kenetlenme modeli (PDB ID: 6D5Y). MAPK1'e bağlı quercetinin üç boyutlu moleküler kenetlenme konformasyonu. Quercetin'in MAPK1'in ATP bağlama cebini işgal ettiği tahmin edildi; bu da potansiyel kinaz ilişkili etkileşimleri önermektedir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 13. IL10 ile quercetinin moleküler kenetleme modeli (PDB ID: 1ILK). IL10'a bağlı quercetinin üç boyutlu moleküler kenetlenme konformasyonu. Quercetin'in IL10'un dimer arayüz bölgesine yakın bir yerde etkileşime girdiği ve protein kompleksinin stabilizasyonuna katkıda bulunabileceği öngörülmüştür. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Veri Erişilebilirliği:
Bu çalışmanın bulgularını destekleyen tüm veriler, el yazması, tablolar, şekiller ve ek materyaller içinde yer almaktadır. Ek Tablo 1 , TongBi Formülü (TBF)'nin elenmiş aktif bileşiklerini içerir, Ek Tablo 2 ilgili tahmin edilen hedef bilgilerini sağlar ve Ek Tablo 3 , ağ inşası ve topolojik analiz için kullanılan ağ kodlama ve etkileşim verilerini içerir.

Gen	Protein Adı	Derece	Yakınlık Merkeziliği	Aralık Merkezilik
JUN	Transkripsiyon faktörü AP-1	18	0.58	0.22
RELA	Transkripsiyon faktörü p65	15	0.56	0.15
IL6	İnterlökin 6	14	0.59	0.33
MAPK1	Mitogen-aktive edilmiş protein kinaz 1	13	0.54	0.16
IL10	İnterlökin 10	10	0.47	0.12
ESR1	Östrojen reseptörü	10	0.44	0.03
IL2	Interleukin 2	9	0.53	0.05
AKT1	RAC-alfa serin/treonin-protein kinaz	9	0.44	0.04
MMP1	Matriks metallopeptidaz 1	8	0.44	0.03
MMP2	Matriks metallopeptidaz 2	8	0.44	0.03

Tablo 1: PPI ağındaki çekirdek hedeflerin topolojik parametreleri. PPI ağ analizinde belirlenen ana hedeflerin topolojik parametreleri. Derece, yakınlık merkezi ve aralık merkezilik, düğüm önemini değerlendirmek ve TBF ile OA'ya ilişkili temel terapötik hedefleri belirlemek için hesaplandı. Daha yüksek dereceye ve merkezilik değerlerine sahip hedefler, etkileşim ağı içinde daha önemli görüldü.

Hedef	PDB Kimliği	Aktif Saha Koordinatları (X, Y, Z)	Ligand	Bağlama Yakınlığı (kcal/mol)
JUN	1JNM	X = 10.201; Y = 0.493; Z = 19.492	Quercetin	−8.4
RELA	7LEU	X = 1.717; Y = 23.889; Z = −0.778		−7.6
IL6	1ALU	X = 2.599; Y = −20.016; Z = 8.749		−6.9
MAPK1	6D5Y	X = 7.052; Y = 12.800; Z = 20.749		−6.7
IL10	1ILK	X = 17.836; Y = 46.443; Z = 38.685		−6.7

Tablo 2: Quercetin ile çekirdek hedef proteinler arasındaki moleküler kenetlenme parametreleri ve bağlanma eğilimleri. Quercetin ile seçilen çekirdek hedef proteinler JUN, RELA, IL6, MAPK1 ve IL10 arasında moleküler kenetlenme sonuçları. Tablo, Protein Veri Bankası (PDB) tanımlayıcılarını, kenetlenme hesaplamaları için kullanılan aktif site ızgara merkezi koordinatlarını ve moleküler kenetlenme analizinden elde edilen tahmini bağlanma akıllılığı değerlerini sunmaktadır. Daha düşük bağlanma enerjisi değerleri, ligand–reseptör bağlanma afinitesinin daha güçlü olduğunu gösterir.

Ek Tablo 1: TBF'den tanımlanan aktif bileşikler. TBF'den taranan aktif bileşikler hakkında bileşik isimleri, moleküler tanımlayıcılar, OB değerleri, DL değerleri ve ilgili bitkisel kaynaklar dahil olmak üzere ayrıntılı bilgiler. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Tablo 2: TBF'nin aktif bileşiklerine karşılık gelen tahmin edilen hedefler. TBF'nin taranmış aktif bileşiklerine karşılık gelen tahmin edilen protein hedeflerinin kapsamlı listesi, hedefin normalizasyonu ve dedlikalisiyondan sonra elde edilen standart insan gen sembolleri dahil. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Tablo 3: TBF–Bileşen–Hedef ağı için ağ kodlama bilgisi. TBF bileşen-hedef etkileşim ağının inşasında kullanılan ayrıntılı kodlama bilgileri; moleküler tanımlayıcılar, hedef bilgileri, ağ ilişkileri ve ağ topoloji analizi için kullanılan düğüm sınıflandırma verileri dahil. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Bu çalışma, TBF'nin OA'ya karşı potansiyel mekanizmalarını incelemek için ağ farmakolojisi ve moleküler kenetlenme yaklaşımlarını kullandı. Analiz edilen temel bitkisel ilaçlar arasında Danggui, Danshen, Jixueteng, Haifengteng, Tougucao, Duhuo, Weilingxian ve Xiangfu bulunuyordu. Önceki çalışmalar, Danggui'nin (Angelica sinensis Radix) OA ile ilgili patolojik değişiklikleri hafifletebileceğini, kıkırdak dejenerasyonu, subkondral kemik sklerozu, anormal yürüyüş ve medial menisküs modellerinin dengesizleşmesinde diz şişmesini^{hafifletebileceğini göstermiştir 20}. IL-1β ile indüklenen OA hücre modellerinde, Danggui reaktif oksijen türlerinin birikimini azalttı ve süperoksit dismutaz ile glutation²¹ dahil antioksidan enzimlerin aktivitesini artırdı. Salvia miltiorrhiza'nın aktif bir bileşeni olan Danshenindione IIA'nın, OA fare modellerinde kıkırdak dejenerasyonunu hafiflettiği, subkondral kemik remodelasyon homeostazını geri kazandığı ve anormal anjiyogenezi bastırdığı^{bildirilmiştir 22}. Ayrıca, S. miltiorrhiza'dan türetilen bileşenler oksidatif stresi ve kemik metabolizmasını^{düzenleyebilir 23,24}. Spatholobus suberectus Dunn'un, kıkırdak metabolizması ve OA ilerlemesiyle ilişkili olan PI3K/Akt/mTOR ve Ras/Raf/MAPK sinyal^{yolları 25'i} düzenlediği bildirilmiştir. S. suberectus Dunn ekstraktları ayrıca pro-inflamatuar kemokin^{üretimini de engeller 26}. Ayrıca, Impatiens balsamina için bildirilen anti-inflamatuar ve antioksidan aktiviteler, kronik iltihap ve oksidatif stresin kıkırdak dejenerasyonuna katkıda bulunması nedeniyle OA patogeneziyle ilgili^{olabilir 27}. Radix Angelicae Biseratae ayrıca kan dolaşımının iyileşmesi ve artritle ilişkili semptomların hafifletilmesi^{ile ilişkilendirilmiştir 28,29}. Sınırlı çalışmalar, OA'da Jixueteng (Spatholobus suberectus Dunn), Haifengteng (Caulis Piperis Kadsurae) ve Xiangfu (Cyperi Rhizoma)'nin potansiyel terapötik etkilerini araştırmıştır.

PPI ağına dayalı hesaplamalı tahminler, TBF'nin OA'ya karşı inflamatuar yanıtların düzenlenmesi ve eklem kıkırdaklarının korunması yoluyla terapötik etkiler gösterebileceğini öne sürmüştür; ancak bu tahminler daha fazla deneysel doğrulama gerektirir. PPI ağında nispeten yüksek dereceye sahip temel hedefler arasında JUN, RELA, IL6, MAPK1 ve IL10 yer alıyordu. Önceki çalışmalar, JUN'un kondrositlerin yaşlanması ve OA ilerlemesiyle ilişkili olduğunu göstermiştir. JunB/Jun çift mutant fareler, eklem dokularında infiltrasyon gösterir, kemik yıkımı ve periostit³⁰ ile birlikte olur. Osteoartritik kıkırdak ve sinovyumun transkriptomik analizleri de JUN^{ekspresyonunun 31'in} azaldığını göstermiştir. Ayrıca, ön çapraz bağ transeksiyonu ile indüklenen OA sıçan modellerinde ve yaşlanan kondrositlerde JUN protein ekspresyonunun azalması^{gözlemlenmiştir 32}. Önceki çalışmalar, JUN ile ilgili sinyallerin OA kondrositlerinde kıkırdak dejenerasyonu, apoptoz, otofaji ve ekstraselüler matriks metabolizmasını^{düzenleyebileceğini de göstermiştir 33}. Önceki çalışmalar ayrıca, transfer RNA kaynaklı parçaların, eklem kondrositlerinin çoğalmasını ve hayatta kalmasını RELA ile ilişkili sinyal yolları^{aracılığıyla düzenlediğini göstermiştir 34}. Ayrıca, Sox9 geninin yukarı regulasyonu ve mezenkimal stromal hücrelerde RELA ekspresyonunun inhibisyonu birleşince, deneysel modellerde kondrojenik ve immünomodülatör kapasiteleri artırmış ve OA ilerlemesini^{yavaşlatmıştır 35}. Bu bulgular, mevcut hesaplamalı analizde tanımlanan JUN ve RELA ile ilgili sinyal yollarının potansiyel önemini desteklemektedir.

IL6, OA'da önemli bir inflamatuar aracıdır ve hem bozulma hem de onarım süreçlerini etkileyerek kıkırdak metabolizmasında önemli bir rol oynar. Kronik düşük dereceli iltihap koşullarında, yüksek IL6 seviyeleri kondrositlerin yaşlanmasına, kıkırdak matriks sentezinin azalmasına ve kıkırdak^{homeostazının 36} bozulmasına katkıda bulunur. Önceki çalışmalar, IL6 reseptörü/JAK2 sinyalinin yaşlanan hücre apoptozunun düzenlenmesinde rol aldığını ve yaşlı hücrelerin hedefli olarak çıkarılmasının OA^{ilerlemesini 37} azaltabileceğini göstermiştir. Ayrıca, Li Q ve meslektaşları, miR-186-5p'nin yukarı regülasyonunun, IL-1β ile uyarlanan kondrositlerde inflamatuar yanıtları düzenlediğini, miR-186-5p'nin inhibisyonunun ise MAPK1^{ekspresyonu 38'in} artırılmasıyla OA ilerlemesini hafiflettiğini bildirdi. Bu bulgular, mevcut hesaplamalı analizde tanımlanan IL6 ve MAPK1 ile ilgili sinyal yollarının potansiyel katılımını desteklemektedir.

IL10, kıkırdak homeostazında koruyucu bir rol oynar ve kıkırdak mikro ortamının korunmasına katkıda bulunabilir. Önceki çalışmalar, IL10'un mitokondriyal apoptotik yolların düzenlenmesi, kaspaz aktivitesinin azalması ve Bax/Bcl-2^{oranının 39} modülasyonu yoluyla kondrosit apoptozunu inhibe ettiğini göstermiştir. Ayrıca, IL10, sıkıştırılmış eklem kıvrım modellerinde MMP3, MMP13, ADAMTS4 ve indüklenebilir nitrik oksit sentazlar dahil olmak üzere matris bozunmasına bağlı faktörlerin azalması ve matris bozulmasıyla ilgili faktörlerin azalması ile^{ilişkilendirilmiştir 40}. Mevcut çalışmadaki KEGG yolu zenginleştirme analizi, IL-17, TNF ve hipoksi indüklenebilir faktör-1 (HIF-1) sinyal yollarının TBF'nin OA'ya karşı öngörülen terapötik etkileriyle ilişkili olabileceğini göstermiştir; ancak bu hesaplamalı tahminler deneysel doğrulama gerektirmektedir. Önceki çalışmalar, IL-17'nin inflamatuar yanıtların ve sinovial hücre aktivitesinin düzenlenmesi yoluyla OA ilerlemesine^{katkıda bulunduğunu göstermiştir 41,42}. Artan IL-17 ifadesi de diz OA^43'te hastalık şiddetiyle pozitif korelasyon göstermiştir. TNF-α, OA ile ilişkili iltihaplanma, ağrı ve kıkırdak dejenerasyonu ile ilişkili bir diğer önemli inflamatuar aracıdır ve TNF-α sinyalizasyonunun inhibisyonu hastalık ilerlemesini^{hafifletebilir 44}. Ayrıca, HIF-1α, OA^45'te kondrosit hipoksik metabolizmada, hücre dışı matriks regülasyonunda, sinovial iltihabda ve subkondral kemik remodelasyonunda önemli bir rol oynar. Önceki çalışmalar ayrıca, HIF-1α ile ilişkili sinyal inhibisyonunun kondrosit fonksiyonunu koruyabileceğini ve kıkırdak dejenerasyonunu^{azaltabileceğini öne sürmüştür.} Bu bulgular, mevcut hesaplamalı zenginleştirme analiziyle belirlenen sinyal yolları ile tutarlıdır.

Bu in silico çalışmanın birkaç önemli sınırlaması vardır. İlk olarak, analiz, bitkisel bileşikler ve hedef notasyonları hakkında eksik veya önyargılı bilgiler içerebilir ve kamuya açık veri tabanlarına dayanıyordu. Ayrıca, hesaplamalı hedef tahmin yöntemleri doğuştan gelen belirsizlik içerir ve bu çalışmada tespit edilen öngörülen etkileşimler deneysel doğrulama gerektirir. Moleküler kenetlenme analizi, doğrudan fizyolojik veya farmakolojik aktivite yerine teorik bağlanma potansiyelini yansıtır. Ayrıca, hesaplamalı tahminleri doğrulamak için in vitro veya in vivo deneyler yapılmamıştır. Bitkisel doz, farmakokinetik ve kombine formülün genel biyoyararlanımı gibi faktörler de değerlendirilmedi. Bu nedenle, bu çalışmadan elde edilen tüm sonuçlar öngörücü olarak kabul edilmeli ve daha fazla deneysel doğrulama gerektirmelidir.

Mevcut çalışma, ağ farmakolojisi ve moleküler kenetlenme analizlerine dayanarak, TBF'nin OA'ya karşı potansiyel mekanizmalarını incelemek için öngörücü bir çerçeve sunmaktadır. Sonuçlar, TBF'nin, sekiz bileşen bitkisinden türetilen aktif bileşikler arasındaki etkileşimler yoluyla birden fazla OA ile ilgili hedefi düzenleyebileceğini gösterdi. Belirlenen hedefler, IL-17, TNF ve HIF-1 yollarını içeren inflamatuar düzenleme, lipid metabolizması ve hipoksi ile ilişkili sinyal yoluyla biyolojik süreçler ve sinyal yolları açısından zenginleştirildi. Moleküler kenetlenme analizi, quercetin ile çekirdek hedefler JUN, RELA, IL6, MAPK1 ve IL10 arasında olumlu tahmin edilen bağlanma afinitelerini gösterdi. Bu bulgular topluca, TBF'nin OA'ya karşı çok bileşenli ve çok hedefli düzenleyici etkiler yaratabileceğini öne sürmektedir. Bu çalışma ayrıca OA araştırmalarında gelecekteki mekanik çalışmalar ve TCM formüllerinin deneysel doğrulaması için teorik bir strateji ve metodolojik çerçeve sunmaktadır.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
AutoDockTools	Yazılım	Sürüm 1.5.7; The Scripps Research Institute	https://autodock.scripps.edu/
AutoDock Vina	Yazılım	Sürüm 1.5.7; The Scripps Research Institute	https://autodock.scripps.edu/
barplot fonksiyonu	R görselleştirme fonksiyonu	clusterProfiler paketi	https://bioconductor.org/packages/clusterProfiler/
clusterProfiler	R paketi	Zenginleştirme analizi için Bioconductor paketi	https://bioconductor.org/packages/clusterProfiler/
CytoHubba	Eklentici	Cytoscape 3.10.2 ile uyumlu	https://apps.cytoscape.org/apps/cytohubba
Cytoscape	Yazılım	Sürüm 3.10.2; Cytoscape Consortium	https://cytoscape.org/
DAVID	Veritabanı	Eklenme, Görselleştirme ve Entegre Keşif için Veritabanı	https://david.ncifcrf.gov/
dotplot fonksiyonu	R görselleştirme fonksiyonu	clusterProfiler paketi	https://bioconductor.org/packages/clusterProfiler/
DrugBank	Veritabanı	Alberta Üniversitesi	https://go.drugbank.com/
GeneCards	Veritabanı	GeneCards Suite	https://www.genecards.org/
MicrobiomeAnalyst / MicrobiomeNet	Çevrimiçi Platform	Çevrimiçi zenginleştirme görselleştirme platformu	https://microbiomenet.com/
OMIM	Veritabanı	Online Mendelian Kalıtımı insanlarda	https://www.omim.org/
PDB	Veritabanı	RCSB Protein Veri Tabanı	https://www.rcsb.org/
PubChem	Veritabanı	Ulusal Biyoteknoloji Bilgi Merkezi	https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/
PyMOL	Yazılım	Sürüm 2.5.4	https://pymol.org/
R	Yazılım	Sürüm 4.3.1; R Foundation for Statistical Computing	https://www.r-project.org/
STRING	Veritabanı	Etkileşimli Genler/Proteinlerin Alınması için Arama Aracı	https://cn.string-db.org/
TCMSP	Veritabanı	Geleneksel Çin Tıbbı Sistemler Farmakolojisi Veritabanı ve Analiz Platformu	http://tcmspw.com/tcmsp.php
TTD	Veritabanı	Terapi Hedef Veritabanı	https://db.idrblab.net/ttd/
UniProt	Veritabanı	Universal Protein Kaynağı	https://www.uniprot.org/
Venny	Yazılım	Sürüm 2.1.0	https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html