Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Zebrafish larvalarında dopaminergik nörodejenerasyonun in vivo fenotiplenmesi, davranışsal analiz ve yüksek içerikli görüntüleme kullanılarak

345 görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/71516

⸱

16 Haziran 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Clinical Pharmacy Practice, UC Irvine School of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, 2Robert A. Mah Molecular Innovation Center, University of California Irvine

Bu makalede

Özet

Bu protokol, dopaminergik nöron kaybı ve lokomotor davranış bozukluklarını niceleyen in vivo zebrafish kullanarak standartlaştırılmış, yüksek verimli bileşik tarama yöntemi sunar ve böylece nöroprotektif bileşiklerin verimli taramasını sağlar.

Özet

Nörodejenerasyonda ilaç keşfi araştırmaları, geleneksel memeli modellerinin yüksek maliyeti ve düşük verimliliği nedeniyle sınırlandırılmıştır. Bu darboğaz özellikle Parkinson hastalığı araştırmalarında gözlemlenmektedir; burada titiz ve ölçeklenebilir dopaminergik (DA) nörodejenerasyon çalışmaları yavaş ve kaynak yoğun kalır. Bu boşluğu gidermek için, döllenme sonrası beş gün içinde DA nöron kaybını incelemek amacıyla, DA nöronlarında nitroredüktazı eksprese eden transjenik zebrafish modeli kullanarak standartlaştırılmış, yüksek verimli bir fenotipleme boru hattı sunuyoruz. Zebrafish, hızlı larval gelişimi, in vivo tüm beyin görüntülemesini sağlayan optik şeffaflık, Parkinson hastalığıyla ilgili genlerin ve yolların güçlü korunması ve hücre kültürü modellerinde erişilemeyen sağlam sinir devreleri gibi translasyonel sinirbilim için önemli avantajlar sunar. Protokolümüz, tarama için hızlı veri setleri oluşturmak amacıyla kemogenetik ablasyon ve yüksek içerikli görüntülemeyi entegre eder. DA nöronları, metronidazol (MTZ) kullanılarak seçici olarak ablasyon edilir ve spesifik ve ayarlanabilir nörodejenerasyon üretir. MTZ tedavisi, bradikinezi benzeri fenotiplerle uyumlu hareket hareketinde doza bağlı azalmalar sağlar ve DA hücre kaybına sağlam bir davranışsal korelasyon sağlar. Parkinson hastalığı temelde bir motor bozukluk olduğundan, anatomik ölçümleri fonksiyonel davranışsal okumalarla eşleştiriyoruz. Lokomotor aktivite doğrudan bir plakaya kaydedilir ve otomatik takip kullanılarak nicel edilir; toplam mesafe, yüzme sıklığı ve patlama başlatma gibi metrikler çıkarılır. Zebrafish, yüzlerce larvanın aynı anda minimum kullanımla analiz edilebileceği verimli ve ölçeklenebilir bir model sistemi sunar. Lisans araştırmalarında deneysel varyansı en aza indirmek için tasarlanmış yüksek verimlilikli, plaka tabanlı ilaç tarama protokolünü optimize ettik. Nörokoruma veya fonksiyonel kurtarma için aday bileşiklerin taraması için standartlaştırılmış, plaka tabanlı bu format, farklı araştırmacılar tarafından toplanan verilerin istatistiksel olarak karşılaştırılabilir ve nöroprotektif adayların belirlenmesinde etkili kalmasını sağlayarak tekrarlanabilirliği artırır. Bu metodoloji, nörodejenerasyon araştırmaları için sağlam ve ölçeklenebilir bir çerçeve sağlar.

Giriş

Nörodejenerasyonda ilaç keşif araştırmaları, geleneksel memeli modellerinin yüksek maliyeti ve düşük verimliliği nedeniyle önemli bir verimlilikdarboğazı ile karşı karşıyadır 1,2; bu da dikkatli deneysel planlama ve büyük bir iş gücü gerektirir. Bu yöntemin genel amacı, Tg(th:Gal4; UAS:NTR-mCherry) transjenik zebrafish modelinde nitroredüktaz-mKiraz özellikle dopaminergik (DA) nöronlar üzerinde eksprese edilir ve DA nöron kaybı ve hareket eksikliklerini incelemektedir. Bu tekniğin kullanımının gerekçesi, nörodejenerasyon araştırmaları için titiz, ölçeklenebilir ve ekonomik olarak uygulanabilir in vivo modellere olan ihtiyacdankaynaklanmaktadır 3,4,5. In vitro hücre kültürleri hızlı ilaç taramasına olanak tanırken, translasyonel önem için gerekli olan sağlam sinir devresi ve tüm organizma bağlamındanyoksundurlar 6. Buna karşılık, kemirgen modelleri mükemmel fizyolojik bağlam sağlar ancak nöroprotektif bileşiklerin ilk yüksek verimli taraması için pahalı ve zamanalıcıdır 7,8.

Zebrabalıklar hızlı larva gelişimine, in vivo tüm beyin görüntülemesini sağlayan optik şeffaflığa ve özellikle nörodejenerasyon 9,10,11 ile ilgili hastalıkla ilgili yolların güçlü genetik korunmasına sahiptir. Protokol özellikle standartlaştırılmış yetiştiriciliği, metronidazol (MTZ) ile kemogenetik ablasyonu ve yüksek içerikli görüntülemeyi fonksiyonel davranışsal takip ile birleştirir. Lokomotor aktivitenin ölçülmesi, dopamin nöron kaybı davranışsal anormalliklerle bağlantılı olduğundan, DA nöron kaybına doğrudan sağlam bir davranışsal korelasyon sağlar 12,13,14. Standartlaştırılmış, plaka tabanlı format, operatörler arasında deneysel varyansı en aza indirir ve zebrafish larva sisteminin yüksek verimliliği büyük örneklem boyutlarına olanak tanır; bu da nöroprotektif etkileri tespit etmek için yeterli istatistiksel güç sağlar. Bu da protokolü, araştırmacı deneyimlerinin değişken olabileceği ayarlar dahil olmak üzere ölçeklenebilir ve tekrarlanabilir tarama gerektiren uygulamalar için oldukça uygun hale getirir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Omurgalı deneklerin kullanımını içeren tüm yöntemler, Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi yönergelerine (IACUC onayı AUP-25-098) uygun olarak gerçekleştirilmiştir.

1. Zebrafish Yetiştiriciliği

  1. Su sistemi koşullarını korumak
    1. Geri dolanan su sistemini 28,5°C (kabul edilebilir aralık: 26°C–30°C), pH 7,1–7,8 ve iletkenlik 600–700 μS/cm olarak tutun. Ev tanklarında yetişkin zebra balıklarını yaklaşık 5 balık/L stoklama yoğunluğunda tutun.
    2. Üreticinin talimatlarına göre amonyak, nitrit ve nitrat seviyelerini kolorimetrik akvaryum su kalitesi test seti ile günlük olarak izleyin. Amonyak ve nitriti 0 ppm, nitrat ise 10–20 ppm arasında tutun.
    3. Amonyak veya nitrit 0 ppm'yi aştığında, nitrat 20 ppm'yi aştığında, görünür bulanıklık veya kalıntı varsa veya pH/iletkenlik değerleri Adım 1.1.1'de tanımlanan hedef aralıkların dışında kaldığında su değişimi gerçekleştirin. Amonyak ve nitrit 0 ppm'ye, nitrat 10–20 ppm'ye dönene ve pH/iletkenlik değerleri hedef aralığa geri dönene kadar değişime devam edin.
    4. Sirkadiyen ritim ve üremeyi senkronize etmek için 14 saat ışık:10 saat karanlık döngü sürdürün.
  2. Zebra balıklarını farklı gelişim aşamalarında besle
    1. Yetişkin balıklara günde iki kez 0,5 mm yavaş batan peletler verin. Beslenmeyi tüketim süresine göre standartlaştırın ve sadece 3–5 dakika içinde tüketilen miktarı verin. Deneysel gruplar arasında aynı pellet boyutunu ve diyet türünü tutarlı şekilde kullanın.
    2. Larva balığı Gemma Micro 75 ZF veya yaklaşık 75 μm parçacık boyutuna sahip eşdeğer larva zebrafish diyeti ile günde üç kez besleyin. Genç balıkları (1 aylık) Gemma Micro 150 ZF veya yaklaşık 150 μm parçacık boyutuna sahip eşdeğer zebrafish diyetiyle günde üç kez besleyin.
    3. Eşdeğer diyetler, yalnızca zebrafish larvaları veya gençleri için formüle edilmiş, benzer parçacık boyutu sağladıkları ve gelişim aşamasına uygun yüksek proteinli, tam besin içeren besin sağladıkları durumlarda değiştirilin.
    4. Hafta içi öğlen günde bir kez yeni yumurtadan çıkan canlı tuzlu karides nauplii ile larva ve genç diyetleri takviye edin. Üreticinin talimatlarına göre tuzlu suda tuzlu su içinde tuzlu tuzlu kistleri 24–36 saat boyunca hatch edin.
    5. Aktif olarak yüzen nauplii'leri toplayın, sistem suyla durulayın ve sadece 5–10 dakika içinde tüketilen miktarı besleyin.
    6. Aşırı beslemeden kaçının, çünkü fazla yem amonyak seviyelerini yükseltir.
      NOT: Yememiş yiyecekleri ve görünür kalıntıları her gün nazikçe sifonlayarak temizleyin. Tanklarda ölü veya sağlıksız balıklar için kontrol edin ve kiraz biriktiği tespit edildiğinde tank yüzeylerini veya süzgeçleri temizleyin. Deneysel kohortlar arasında tank yoğunluğunu, beslenme, temizlik ve su kalitesi izlemesini tutarlı şekilde koruyun. Zebrafish yetiştiriciliği, gelişimsel aşamalama, tuzlu karides kültürü ve uzun vadeli tesis bakımı hakkında ek detaylar için Westerfield15 ve Avdesh ve ark.16'ya bakınız.

2. Embriyo Toplama, Reaktif Hazırlama ve Transgenik Tarama

  1. Üreme melezleri kurma
    1. Embriyo toplamadan önce akşam bir bölücüyle çapraz tankları birleştirin.
    2. Her geçiş tankına bir erkek ve iki dişi zebrafish yerleştirin; gece boyunca erkek ve dişi ayırıcı ile ayrılır.
    3. Ertesi sabah ışık döngüsünün başında bölücüyü kaldırın ve yumurtlamaya sabit bir 2 saat süre izin verin. Gelişim aşamasındaki değişkenliği en aza indirmek için embriyoları yumurtlama penceresinden hemen sonra toplayın.
  2. Embriyoları toplap kuluçka altına almak
    1. Embriyoları 400 μm mesh filtreden tank suyu doldurarak toplayın. Embriyoları sistem suyu veya mavi yumurta suyu (BEW) ile nazikçe durulayın, ardından tek kullanımlık transfer pipeti kullanarak embriyoları 100 mm Petri kaplarına aktarın. Tutuşmayı en aza indirin ve embriyoları uzun süre havaya maruz bırakmaktan kaçının.
    2. Embriyoları, 30 mL BEW içeren 100 mm Petri kablarına transfer edin; her tabak başına 50–60 embriyo yoğunluğunda. Sürekli gelişim ve oksijen bulunabilirliğini korumak için her tabak başına 60 embriyoyu aşmayın.
    3. Embriyoları 28,5°C'de, 14 saat ışık:10 saat karanlık döngü altında kuluçka yapın.
    4. Döllenmemiş yumurtaları ve hayatta kalmayan embriyoları günlük olarak çıkarın.
      NOT: BEW'yi 60 mg Instant Ocean deniz tuzu, 50 μL %1 metilen mavisi ve 1 L deiyonize suile hazırlayın 17.
  3. 1-fenil-2-tioüre (PTU) çözeltisi hazırlayın ve uygulayın
    1. 100 mM PTU stok çözeltisi dimetil sülfoksitte (DMSO) hazırlayın.
    2. PTU stok çözeltisini ışıktan korunan 4°C'de sakla.
    3. Döllenme sonrası 24–36 saat (hpf) süresinde, her kaba 30 mL BEW içeren her kaba 60 μL PTU stok çözeltisi eklenerek nihai konsantrasyon 200 μM'ye ulaşılır.
    4. PTU'yu Petri kabını dairesel hareketlerle 5–10 kez nazikçe karıştırın. Mekanik stresi en aza indirmek için doğrudan embriyolara pipet yapmaktan kaçının.
      DIKKAT: PTU solunum ve cilt tahrişine neden olabilir. Eldivenle tutun ve iyi havalandırılan bir alanda hazırlık yapın.
  4. Trikain anestezik hazırlayın
    1. 400 mg trikain metansülfonatı 97,9 mL Milli-Q suda çözün.
    2. Çözeltiye 2,1 mL 1 M Tris baz (pH 9) ekleyin.
    3. Çözeltiyi pH 7.0'a ayarlayın, 0.1 M sodyum hidroksit veya hidroklorik asit kullanarak.
    4. Çözeltiyi etiketli tüplere alıp 4°C'de sakla.
    5. Stok çözeltiyi 1:25 salıntı ile 160 μg/mL çalışma konsantrasyonu elde edin veya düşük doz uygulamalar için 40 μg/mL elde etmek için 1:100seyreltirin 18.
      DIKKAT: Trikain metansülfonat kimyasal anesteziktir. Uygun kişisel koruyucu ekipman kullanın.
  5. Çaprazlama gerçekleştirin
    1. Çapraz homozigot Tg(th:Gal4; UAS:NTR-mCherry) AB vahşi tipi zebrafish ile yetişkinler, bir homozigot transgenik yetişkin ve karşı cinsten bir AB vahşi tip yetişkin olarak, gece boyunca kesici olan bir geçiş tankına yerleştirilir. Işık döngüsünün başında bölücüyü çıkarın ve sabit 2 saatlik bir yumurtlama penceresinden sonra embriyoları toplayın.
  6. Ekran transgenik larvalar
    1. Döllenme sonrası 3 gün (dpf) sırasında, larvalar trikain ile 160 μg/mL nihai konsantrasyonda anestezi edilir.
    2. Larvaları mCherry filtre seti kullanarak floresans stereomikroskopu altında gözlemleyin (uyarılma ~587 nm, emisyon ~610 nm). Deneydeki tüm larvalar için aynı tarama ayarlarını kullanın; objektif büyütme, pozlama süresi, kazanç ve aydınlatma yoğunluğu dahil.
    3. Bilinen pozitif transgenik larva kullanılarak maruz kalma ve kazanç ayarlayın ki DA nöron floresansı doygunluk olmadan net görünür olsun, ardından deneydeki kalan tüm larvalar için bu ayarları koruyun.
    4. Gözler arasındaki ventral diensefalonda ve hafifçe ventral orta hatta DA nöronları kümelerinde lokalize mCherry-pozitif sinyalin varlığını doğrulayın (Şekil 1A).
    5. Pozitif larvaları, ventral diensefalonun beklenen DA nöron kümelerinde açıkça tespit edilebilir mKiraz floresansı gösterenler olarak tanımlayın. Sabit tarama ayarlarında arka planın üzerinde mCherry sinyali görünmüyorsa, larvaları negatif olarak sınıflandırın; arka plan kontrolü olarak transjenik olmayan veya bilinen negatif larvalar kullanılır.
      NOT: 3 dpf, ventral diensefalondaki DA nöronlarının nicelik için güvenilir bir floresan sinyal ürettiği en erken aşamadır.

figure-protocol-1
Şekil 1: Transjenik tarama, larva gömülümesi ve plaka tasarımı. (A) Dopaminergik (DA) nöronlarda nitroredüktaz (NTR) ifade eden transjenik zebrafish larvasının floresans görüntüsü (mCherry kanalı, 4× objektif), gözler arasındaki ventral diensefalonda DA nöron kümelerini gösteriyor. (B) Yaklaşık 1,5 mm açıklıklara kadar kesilen modifiye P200 pipet uçları, agaroz gömületme sırasında larvaların transferi için kullanılır. (C) Araç kontrolü, metronidazol (MTZ) ile arandırılmış kuyular ve tarama bileşik koşulları dahil olmak üzere yüksek verimli ilaç taraması için temsil eden 96 kuyu plaka düzeni. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

3. Kemogenetik Ablasyon ve Floresans Görüntüleme

  1. Agaroz göme ortamı hazırlayın
    1. 4 dpf'de gömme gününde, Milli-Q suya %1,2 düşük erime noktası agarozu (LMA) hazırlayın.
    2. Agaroz çözeltisini mikrodalgada 5–10 saniyelik kısa aralıklarla, aralıklar arasında nazikçe dönerek agaroz tamamen çözünene ve çözelti berrak olana kadar ısıtın. Buharlaşma yoluyla nihai agaroz konsantrasyonunu değiştirebilen aşırı kaynatma veya uzun süreli ısıtmadan kaçının.
    3. Agarozu 1,5 mL mikrosantrifüj tüplerine alarak birleştirin.
    4. Aliquotları 70°C'de eritin ve kullanmadan önce 42°C ısı bloğunda dengeleyin.
    5. Her agaroz aliquot'a 20 μL trikain stok çözeltisi (4 mg/mL) ekleyerek yaklaşık 40 μg/mL çalışma konsantrasyonu elde edilir.
    6. Erimiş agaroza trikaini karıştırın; P200 pipeti kullanarak 5–10 kez nazikçe yukarı aşağı pipetle yapın. Girdablar oluşturmaktan veya baloncuklar oluşturmaktan kaçının, çünkü baloncuklar larva konumlandırması ve görüntülemeye müdahale edebilir.
  2. Larvaları anestezi ve gömü
    1. 4 dpf larva içeren Petri kabına trikain stok çözeltisi ekleyerek nihai konsantrasyon 160 μg/mL elde edilir.
    2. Larvaları yaklaşık 5 dakika boyunca trikainde kuluçka yapın veya kendiliğinden yüzme kaybı gösterene ve probla nazik dokunuşa tepki vermeyince inkubka edin. Gömme işlemi ancak bu anestezi son noktasına ulaştıktan sonra devam edin.
    3. P200 pipet ucunun distal ucunu temiz makas veya steril bir bıçakla yaklaşık 1,5 mm açıklık oluşturmak için kesin. Kullanmadan önce açılış boyutunu bir cetvel veya kalibre edilmiş bir ölçek ile stereomikroskop altında doğrulayın. Uçları pürüzlü veya larvaların temassız geçemeyeceği kadar dar açıklıkları olan uçları atın (Şekil 1B).
    4. Modifiye pipet ucu kullanarak minimal sıvıda tek bir larvayı aspire edin.
    5. Pipet ucunu agarose alikotuna batırın.
    6. Bir larva içeren 40 μL agarozu düz tabanlı 96 kuyu plakasının bir kuyusuna dağıtın. Deneydeki tüm kuyular için aynı agaroz hacmini kullanın. Farklı bir plaka tipi kullanılırsa, deneye başlamadan önce agaroz hacmini optimize edin ve seçilen hacmi tüm kuyular boyunca korursunuz.
      NOT: Düzenli görüntüleme sağlamak için düz tabanlı plakalar kullanın. Plaka geometrisine göre agaroz hacmini optimize edin.
  3. Larvaları yönlendirme ve gömü
    1. Plakayı stereomikroskop (diseksiyon mikroskobu) altına yerleştirin.
    2. Larvayı ventral diencephalon hedefe bakacak şekilde yönlendirmek için ince uçlu forseps veya 0,25 mm prob kullanın.
    3. Larvaları ters mikroskoplar için dorsal tarafı aşağı, dik mikroskoplar için dorsal yüzü yukarı konumlandırın.
    4. Agaroz katılaşmadan önce 1–2 dakika içinde tam yönelim.
    5. Önceden tanımlanmış 96 kuyu plaka haritasına göre her kuyu başına bir larva gömül. Araç kontrolleri için A satırı, sadece MTZ kontrolleri için H satırı ve B–G satırlarını aday bileşik koşullara veya doz-yanıt gruplarına atayın. Pozisyonsal yanlılığı azaltmak için B–G satırlarında bileşik yerleşimini rastgele hale getirin. Aynı plaka haritasını temel ve tedavi sonrası görüntüleme için kullanın.
    6. Agaroz katılaşmasından sonra, her kuyuya trikainsiz BEW ekleyin ve nihai kuyu hacmi tam olarak 200 μL'ye ulaşır. Plaka içindeki tüm kuyular için aynı son hacmi kullanarak tutarlı difüzyon ve işlem maruziyeti sağlanır.
  4. MTZ tedavi çözümleri hazırlayın
    1. BEW'de %1 DMSO ve 200 μM PTU ile desteklenen MTZ çalışma çözümleri hazırla. Çözeltiye MTZ tozu ekleyin ve görünür parçacıklar kalmayana kadar girdabla devam edin. Oda sıcaklığında ışıktan korunan bir rocker veya tüplü döner üzerinde 15–30 dakika boyunca karıştırın. Kullanmadan önce çözeltinin şeffaf ve görünür çökelti içermediğinden emin olun.
    2. Doz-yanıt optimizasyonu için 3, 4.5 ve 9 mM konsantrasyonlar hazırlayın.
    3. 200 μM PTU ile BEW'de %1 DMSO içeren bir araç kontrolü hazırlayın.
    4. Optimizasyondan sonra rutin tarama için yalnızca doğrulanmış MTZ konsantrasyonunu hazırlayın.
      DIKKAT: MTZ ışığa hassastır. Her deney için taze çözelti hazırlayın, folga kullanarak ışığı korumanız ve kalan çözeltileri tekrar kullanmayın.
      NOT: Tüm tedavi ve kontrol gruplarında aynı nihai DMSO konsantrasyonlarını koruyun. Alternatif MTZ formülasyonlarını yerine koymayın.
  5. Tedavi öncesi floresan görüntüleri alın
    1. 4 dpf'de, gömme yaptıktan sonra, 20× hedefli bir floresans mikroskobu kullanılarak temel floresans görüntüleri alın (Şekil 2).
    2. Her kuyu mCherry kanalı ile görüntüleyin (uyarılma ~587 nm, emisyon ~610 nm).
    3. Bir deneydeki tüm kuyular için aynı görüntüleme ayarları kullanın. Araç kontrol larvası kullanarak pozlama süresi, aydınlatma yoğunluğu ve dedektör kazancı ayarlanarak en parlak DA nöron piksellerinin dedektör dinamik aralığının yaklaşık %70–%80'ine doygunluk olmadan ulaşmasını sağlar. Son pozlama süresini, aydınlatma yoğunluğunu, dedektör kazancı, objektif ve alım profilini kaydedin ve bu ayarları tüm temel ve tedavi sonrası görüntüler için korun.
    4. Mümkün olduğunda, lamba yoğunluğu veya dedektör hassasiyetindeki zaman noktaları arasında değişkenliği en aza indirmek için tüm görüntüleri tek bir oturumda alın. Otomatik aşama kontrolüne sahip sistemler için, görüntüleme seansları boyunca aynı koordinatları korumak için çoklu konum alımını kullanın.
    5. Alım profilini, tedavi sonrası görüntüleme sırasında (Adım 3.7) ve sonraki deneylerde tekrar kullanılmak üzere kaydedin.
      NOT: 20× bir hedef, diensefalik DA nöronunun kümesinin görüntülenmesi için görüş alanı ile çözünürlük arasında bir denge sağlar.
  6. Başlangıç görüntüleme sonrası MTZ tedavisini uygulayın
    1. 4 dpf'de başlangıç görüntülemesinden hemen sonra, her kuyuya doğrudan MTZ içeren çözelti veya araç çözeltisi eklenerek nihai kuyu hacmi 200 μL'ye ulaşır.
    2. Bileşik tarama deneylerinde, bu aşamada aday bileşikler MTZ ile birlikte eklenerek larvalar aynı 24 saatlik tedavi süresinde MTZ ± bileşiğe maruz kalır.
    3. Plakaları 28,5°C'de 14 saat ışık:10 saat karanlık döngü altında 24 saat boyunca 4 dpf'den 5 dpf'ye kadar kuluçka edin.
    4. Kuluçka sırasında plakaları rahatsız etmekten kaçının.
      NOT: Doz-yanıt deneyleri için, tedavi koşullarını optimize etmek için ek kuluçka sürelerini (örneğin 12 ve 48 saat) değerlendirin.
      DURAKLAMA NOKTASI: Levhalar, görüntülemeye geçmeden önce belirlenen tedavi süresi boyunca kuluçka koşullarında tutulabilir.
  7. Tedavi sonrası floresans görüntüleri alın
    1. 5 dpf'de, 4 dpf'de başlangıç görüntüleme için kullanılan aynı mikroskop ayarlarıyla tedavi sonrası görüntüler alın; pozlama süresi, aydınlatma yoğunluğu, dedektör kazancı, objektif ve alım profili dahil olmak üzere (Şekil 2).
    2. Kuyular arasında veya tedavi öncesi ve sonrası görüntüleme seansları arasında pozlama süresi, dedektör kazancı, aydınlatma yoğunluğu, odak, hedef veya alma ayarlarını ayarlamayın.
    3. Mikroskop seanslar arasında kapalıysa, kaydedilen alım profilini yeniden yükleyin ve görüntülemeden önce tüm ayarları kaydedilen parametrelerle karşılaştırın.
    4. Mümkün olduğunda başlangıç görüntüleme sırasında kullanılan aynı sırayla görüntü kuyuları ve tüm tedavi sonrası görüntüleri aynı görüntüleme oturumu içinde elde eder.
    5. Bu yöntem, başlangıç DA nöron floresansında bireyler arası değişkenlik için tedavi öncesi ve tedavi sonrası görüntüleme tasarım kontrollerini birleştirir ve sinyaldeki değişikliklerin alım farklılıklarından ziyade tedaviye bağlanmasını sağlar.

figure-protocol-2
Şekil 2: Metronidazol tedavisi sonrası DA nöron floresansında doza bağlı azalma. 24 saat tedavi sonrası farklı MTZ konsantrasyonlarıyla diensefal DA nöronlarını gösteren transjenik zebrafish larvalarının temsil floresan görüntüleri (mCherry kanalı, 20× objektif). Flüoresans yoğunluğu doza bağlı olarak azalır, bu da NTR eksprese eden nöronların başarılı kemogenetik ablasyonunu gösterir. Ölçek çubuğu = 50 μm. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

4. Yüksek Verimli Plaka Tabanlı Uyuşturucu Taraması

  1. Transjenik larvalar üretin ve tarayın
    1. Yeni bir homozigot transgenik larva kohortu oluştur.
    2. Embriyoları topla ve onları BEW'de büyüt.
    3. Embriyoları, döllenme sonrası 24–36 saat içinde 200 μM PTU ile tedavi edin (hpf) Adım 2.3'te açıklandığı gibi.
    4. 3 dpf'de, deneydeki tüm larvalar için sabit mikroskop ayarlarıyla mCherry kanalı ile larvaları ekrana geçirin. Bilinen pozitif bir larva kullanarak pozitif bir larva kullanarak DA nöron floresansını doygunluk olmadan net bir şekilde tespit etmek için pozlama süresini, dedektör kazancını ve aydınlatma yoğunluğunu ayarlayın, ardından tarama sırasında bu ayarları değiştirmeden kalın.
    5. Sabit tarama ayarlarında ventral diensefalonun beklenen DA nöron kümelerinde şeffaf mKiraz floresansı görünürse larvaları pozitif olarak sınıflandırın. Bu bölgede arka plan üzerinde sinyal olmayan veya zayıf, dağınık veya ektopik floresanslı larvaları atın.
  2. Larvaları gömüp temel görüntüler elde edin
    1. 4 dpf'de, Adımlar 3.2–3.3'te açıklandığı gibi larvaları 96 kuyruklu bir plakaya gömülün, her kuyu başına bir larva kullanılır.
    2. Adım 3.5'te tanımlandığı şekilde tedavi öncesi başlangıç floresan görüntüleri alın.
  3. MTZ ve aday bileşikleri uygulayın
    1. 4 dpf'de başlangıç floresans görüntüleri alındıktan sonra, levha haritasına göre doğrudan kuyulara tedavi çözümleri ekleyin (Şekil 1C).
    2. Araç kontrol kuyuları için, bileşik aranmış kuyularda kullanılan aynı son DMSO konsantrasyonuna sahip BEW ekleyin.
    3. Sadece MTZ kontrol kuyuları için, aday bileşik içermeyen MTZ çözeltisi ekleyin.
    4. Bileşik tarama kuyuları için, MTZ ve aday bileşik eklenir ki larvalar aynı 24 saatlik tedavi süresinde her ikisine de maruz kalsın.
    5. İlk taramada, bileşiğe özgü çözünürlüğü, toksisite veya önceki doz-yanıt verileri farklı bir konsantrasyon kullanılmasını belirtmiyorsa, örneğin 10 μM gibi tek bir bileşik konsantrasyonu kullanın.
    6. Her kuyuyu, nihai hacmi 200 μL'ye ayarlayın. Tüm kuyular içinde, araç kontrolü, sadece MTZ kontrolü ve MTZ plus bileşik kuyular dahil olmak üzere aynı nihai DMSO konsantrasyonlarını koruyun.
    7. Plakaları 28,5°C'de 14 saat ışık:10 saat karanlık döngü altında 24 saat boyunca 4 dpf'den 5 dpf'ye kadar kuluçka edin.
      NOT: Bu protokol, bileşik maruziyetten önce MTZ'nin çıkarılması veya yıkamasını içermez. Aday bileşikler, başlangıç görüntülemesinden hemen sonra MTZ ile eşzamanlı olarak uygulanır.
  4. Tedavi sonrası görüntüler alın ve floresans tutulmasını hesaplayın
    1. 5 dpf'de, 4 dpf'de başlangıç görüntüleme için kullanılan aynı alım ayarlarıyla tedavi sonrası floresan görüntüleri alın.
    2. Mümkün olduğunda temel görüntüleme sırasında kullanılan aynı sırayla görüntü yuvaları.
    3. Her larva için floresan tutumunu şu şekilde hesaplayın:
      figure-protocol-3
    4. Aynı plakadan ortalama araç kontrol değerine floresans tutma değerlerini normalize edin.
    5. Aday koruyucu bileşikleri, sadece MTZ kontrolünden belirgin şekilde floresan tutma değerlerine sahip olanlar olarak belirleyin.
  5. Isabet bileşiklerini tespit et
    1. Vurulan bileşikler, floresan tutma oranlarının negatif kontrolden (sadece MTZ) önemli ölçüde daha yüksek olduğunu belirtin.
    2. Welch'in t-testini kullanarak istatistiksel analiz yaparak sadece MTZ'ye yönelik kontrolleri MTZ ve bileşik tedavi gruplarıyla karşılaştırın.
    3. Bağımsız biyolojik kopyalar ve doz-yanıt testleriyle vuruş bileşiklerini doğrulayın. Sadece MTZ kontrolüne göre floresans tutulmasını tekrarlayan şekilde artıran bileşikler olarak vuruşları, p < 0.05 ve görünür larva toksisitesi veya anormal morfoloji olmadan doğrulamak.
    4. Doğrulanmış sonuçları, lokomotor davranışsal analiz, doz-yanıt doğrulama veya bağımsız biyolojik kopyalama testi gibi ikincil testlere ilerlet.
      NOT: Bileşik kütüphane ekranları için, her plaka için pozitif ve negatif kontroller kullanılarak Z-faktörünü hesaplayın. Z-faktörü > 0.5, isabet tanımlamaya uygun sağlam bir testi gösterir.

5. Lokomotor Davranışsal Değerlendirme

  1. Larvaları tedavi gruplarına atama
    1. 4 dpf ile her genotipten larvaları en az 10 larva içeren üç tedavi grubuna ayırın: sadece BEW, DMSO araç kontrolü ve MTZ tedavisi.
    2. Grupları şu şekilde atandırın: (1) sadece BEW (işlenmemiş başlangıç), (2) %1 DMSO araç kontrolü ve (3) optimize edilmiş MTZ konsantrasyonu (%1 DMSO/BEW'de 4,5 mM, 200 μM PTU ile).
    3. Aynı koşullarda araç veya MTZ ile işlenmiş AB vahşi tip larvaları dahil edin. MTZ, Tg(th:Gal4; UAS:NTR-mCherry) larvalar ama AB vahşi tip larvalarda değil.
  2. Tedavi ve larvaları plaka ile gerçekleştirin
    1. Larvaları 24 saat boyunca 28,5°C'de tedavi edin; Adım 5.1.2'de tanımlanan koşullar kullanılarak: sadece BEW, %1 DMSO araç kontrolü veya %1 DMSO/BEW'de 4,5 mM MTZ ile 200 μM PTU ile tedavi edin.
    2. Beş larvayı, geniş delikli bir transfer pipeti ile 2,5 mL taze BEW içeren 6 kuyu plakasının her kuyusuna aktarın. Taşıyıcı hacmi en aza indirin ve larvaları stres veya yaralanmayı önlemek için nazikçe ele alın.
      NOT: Her kuyu başına beş larva kullanmak, veri verimini dengeler ve aşırı kalabalıklığı en aza indirir. Daha yüksek yoğunluklar, yol geçişlerini artırır ve davranışsal analizde takip hatalarına yol açar.
  3. Aydınlatma koşullarını kur
    1. 6 kuyruklu plakayı, 25°C–28°C arasında sabit bir dağıtılmış aydınlatma ile beyaz LED ışık pedine yerleştirin. Deneydeki tüm kayıtlar için aynı ışık paneli, parlaklık ayarı ve plaka konumu kullanın (Şekil 3A).
    2. Plakayı hem aşağıdan hem de yukarıdan, gölgeleri, parlamaları ve yansımaları en aza indirmek için dağıtılmış ışık kaynaklarıyla aydınlatın.
  4. Video kayıt kurulumunu yapılandırın
    1. Yüksek çözünürlüklü bir kamerayı, sabit bir üst aşağı konumda, sabit bir destek (örneğin, tripod veya kol montajı) kullanarak plakanın üzerinde monte edin (Şekil 3B).
    2. Mekânsal kalibrasyon için görüş alanına plakanın yanına bir cetvel yerleştirin.
    3. Paralaks bozulmasını en aza indirmek için kameranın plaka yüzeyine dik olduğundan emin olun.
  5. Kayıt lokomotor aktivite
    1. Kayıtlar, 14 saat ışık:10 saat karanlık döngüsünün ışık fazında yapılarak sirkadiyen değişkenliği en aza indirin.
    2. Larvaların kayıttan önce 1 saat alışmasına izin verin.
    3. 60 dakika boyunca lokomotor aktivite kaydedin.
    4. Kayıt sırasında kurulumu rahatsız etmeyin.
      NOT: Sirkadiyen değişkenliği en aza indirmek için deneyler arasında günün aynı saatinde kayıtlar yapın.
  6. Davranışsal takip yazılımını yapılandırmak
    1. Kaydedilen videoyu EthoVision XT (davranış takip yazılımı) içine aktarın (Şekil 3C).
    2. Aşağıdaki ayarları yapılandırın: 6 arena, her arenada 5 denek, merkez noktası algılama, milimetre cinsinden mesafe ve saniye cinsinden zaman.
    3. Video çerçevesindeki cetvel kullanarak mekânsal ölçeği kalibre edin.
    4. Her kuyu için arena sınırlarını belirleyin, böylece her arenanın kuyu iç kısmını tamamen kapsayacağı ve kuyu kenarlarının ötesine geçmeden kapsayacağı sağlanır.
  7. Algılama ayarlarını optimize et
    1. Yazılım arayüzü (Algılama Ayarları → Referans Görüntü → Öğrenmeye Başla) kullanarak bir referans görüntü oluşturun.
    2. Tüm larvaların yanlış tespit olmadan doğru şekilde takip edilmesini sağlamak için tespit eşiğini ayarlayın.
    3. Kısa bir test kaydı (~2 dakika) çalıştırın.
    4. Tam analize geçmeden önce izlenen yolları görsel olarak inceleyin. Tüm larvaların tespit edildiğini ve kabarcıkların, kalıntıların, yansımaların veya kuyu kenarlarının yanlış şekilde larva olarak tanımlanmadığını doğrulayın.
      NOT: Yaygın artefaktlar arasında büyük arenalardan kaynaklanan kenar takibi, baloncuklardan veya enkaz kaynaklı yanlış tespitler ve uzun süreli hareketsizlik sırasında takip kaybı bulunur.
    5. Kuyular kalıcı takip hatası, aşırı yol çaprazlığı, görünür kalıntılar veya baloncuklar, ölü larvalar, anormal morfoloji veya kuyu kenarında sıkışmış larvalar güvenilir nicelik belirlemeyi engelliyorsa analizden dışlanın.
    6. Aynı dışlama kriterlerini istatistiksel analizden önce tüm tedavi gruplarına uygulayın.
  8. Tam analiz ve veri dışa aktarma
    1. Tam satın alma işlemini çalıştırın.
    2. Takip görselleştirmeleri ve ısı haritaları oluşturun (Analiz → Sonuçlar → İzler ve Isı Haritaları).
    3. Toplam kat edilen mesafe (mm), ortalama hız (mm/s) ve hareket anları sayısı dahil olmak üzere denek başına metrikleri içeren ham veri tablosunu dışa aktarın.
    4. 60 dakikadan fazla toplam mesafeyi birincil lokomotor uç noktası olarak kullanın (Şekil 3D).

figure-protocol-4
Şekil 3: Lokomotor davranış kaydı kurulumu ve analiz iş akışı. (A) Deneysel kurulum, uzamsal kalibrasyon için bir cetvel ve deneysel koşulları korumak için sıcaklık kontrollü ısı kaynağı bulunan bir ışık pedine yerleştirilmiş zebrafish larvalarının bulunduğu 6 kuyu plakasını göstermektedir. (B) Larval hareketini kaydetmek için kullanılan yukarıdan aşağı kamera ile video alım kurulumu, temsilci takip üst katmanı ile birlikte. (C) EthoVision XT (davranışsal takip yazılımı) kullanılarak yapılan davranışsal takibi, larva hareketinin otomatik algılanması ve takibi gösteriliyor. (D) Video ediniminden lokomotor davranışın nicel analizine kadar olan adımları özetleyen iş akışı özeti. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

6. Veri Analizi

  1. Görüntüleri analiz için hazırlayın
    1. Fiji'de açık ön tedavi ve tedavi sonrası görüntü çiftleri (ImageJ, görüntü analiz yazılımı).
    2. Görüntüler Z-yığınları olarak alınırsa, maksimum yoğunluk projeksiyonları oluşturulur (Image → Stacks → Z Project → Max Intensity).
    3. Bir veri setindeki tüm görüntüler için aynı sabit ekran ayarlarıyla Parlaklık/Kontrastı ayarlayın. Nicel ölçümler için otomatik ölçeklendirme kullanmayın ve orijinal ayarlanmamış görüntülerde floresans nicelendirmesi yapın.
  2. İlgi alanlarını (ROI) tanımlayın
    1. Tedavi öncesi görüntüdeki diensefalik DA nöron kümesi etrafında bir yatırım getirisi oluşturmak için çokgen seçim aracı ile bir yatırım getirisi oluşturun. Floresan görüntüsünde görülebilen anatomik işaretler, gözlerin medial kenarları ve diensefalonun ventral orta hattı dahil olmak üzere, ROI sınırını tanımlayın (Şekil 2). ROI'nin tüm DA nöron kümesini kapsaydığından emin olun ve bitişik floresan yapılara uzanmasın. Operatörler arasında tutarlılık için, temsilci bir ROI şablonu kaydedin ve bunu tüm ekip üyelerine mekânsal referans olarak dağıtın.
    2. ROI Yöneticisi'ne ROI eklemek için "t" tuşuna basın.
    3. Tedavi öncesi ve tedavi sonrası görüntüleri, gözler ve ventral diencephalon dahil olmak üzere anatomik işaretlerle hizalayın, yatırım hattını uygulamadan önce. Aynı yatırım getirisini sadece hizalama doğrulandıktan sonra eşleşen tedavi sonrası görüntüye uygulayın.
    4. Her plaka için tüm ROI'ları kaydederek tekrarlanabilirlik ve yeniden analiz yapılmasını mümkün kılar.
  3. Flüoresans yoğunluğunu niceleştirin
    1. Ölçüm ayarlarını yapıya alın (Ölçümleri Analiz → Ayarlayın) ve "Alan" ile "Ortalama gri değeri" seçin.
    2. Her görüntüyü ölç (Analiz → Ölç).
    3. Aynı görüntüdeki bitişik bir nöronal olmayan bölgeden arka plan floresansını ölçmek ve DA nöron ROI ölçümünden çıkarmak. Arka plan düzeltmeli entegre yoğunluğu şu şekilde hesaplayın: düzeltilmiş IntDen = IntDenROI − (areaROI × ortalama arka plan).
    4. Her larva için floresans tutma oranını IntDen (tedavi sonrası) / IntDen (tedavi öncesi) olarak hesaplayın.
    5. Aynı plakadan ortalama araç kontrol değerine floresans tutma oranlarını normalleştirin. Her plaka için araç kontrol ortalamasını ayrı hesaplayın, ardından tedavi gruplarınıkarşılaştırın 19.
      NOT: Daha yüksek verimlilikli analiz için, aynı nicelendirmeyi CellProfiler (görüntü analiz yazılımı) ile otomatik ROIalgılama 20 ile gerçekleştirin.
  4. İkili istatistiksel analiz yapın
    1. Bir tedavi grubu ile bir kontrol grubu arasındaki karşılaştırmalar için, gruplar arasında eşit varyans varsaymayan çiftsiz iki kuyruklu Welch t-testi uygulanır.
    2. Bu testi gruplar arasında farklılık olduğunda kullanın.
  5. Çok gruplu istatistiksel analiz yapmak
    1. Birden fazla tedavi grubunu içeren deneyler için tek yönlü ANOVA gerçekleştirin.
    2. Dunnett'in sonradan yaptığı test, her tedavi grubunu kontrol grubuyla karşılaştırmak için GraphPad Prism veya eşdeğer istatistiksel yazılım kullanılarak uygulanır.
  6. İstatistiksel sonuçları raporlayın
    1. Anlamlılık eşiğini α = 0.05 olarak ayarlayın.
    2. Kesin p-değerlerini raporlayın, kategorik eşikler yerine rapor edin.
    3. Verileri ortalama ±standart hata (SEM) olarak sunmak, bireysel veri noktaları GraphPad Prism veya eşdeğer grafik yazılımı kullanılarak dağılma grafikleri olarak üst üste bindirilsin.
    4. Örneklem büyüklüğü (n), istatistiksel test, test istatistikleri, özgürlük dereceleri ve şekil efsanelerindeki kesin p-değerini raporlayın. Büyük veri setleri için, tam istatistiksel çıktıları ek bir tabloya dahil edin.
      NOT: Tarama testleri için, her plaka için Z-faktörünü Z = 1 − [3(σp + σn)/|μp − μn|] olarak hesaplayın; burada σp veμ p araç kontrol grubunun standart sapması ve ortalaması, σn veμ n ise sadece MTZ'ye özgü kontrol grubunun standart sapması ve ortalamasıdır. Z-faktörü > 0.5 tarama için kabul edilebilir kabul edilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

MTZ tedavisi, doza bağlı dopaminergik nöron kaybı ve lokomotor bozulma üretir

MTZ aracılı DA nöronları ablasyonu için optimal parametreleri belirlemek için, DA nöronunun sağ kalımı için bir vekil olarak kullanılan floresans yoğunluğu ve lokomotor mesafe, 24 saatlik tedaviden sonra MTZ konsantrasyonlarında 3, 4.5 ve 9 mM olarak değerlendirildi. Her tedavi grubu n = 10 bireysel Tg(th:Gal4; UAS:NTR-mCherry) larvalarda eşleştirilmiş araç kontrol g...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu protokol, transjenik zebrabalıklarda NTR–MTZ kemogenetik sistemi kullanarak DA nöronal kaybının nicelendirilmesi ve nöroprotektif bileşiklerin taraması için ölçeklenebilir, in vivo bir boru hattı sunar. Standartlaştırılmış, plaka tabanlı iş akışı, operatör devirinin yüksek olduğu ve araştırmacı deneyiminin akademik dönemler arasında değiştiği lisans araştırma ekipleri için özel olarak geliştirilmiştir. İş akışının her adımı, tekrarlanabilirlik ve eğitim kolaylığı önceliklendirecek şek...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar herhangi bir mali çıkar çatışması belirtmemektedir.

Teşekkürler

Transgenik zebrafishi sağladıkları için Dr. Su Guo'ya (Kaliforniya Üniversitesi, San Francisco) ve vahşi tip embriyolar sağladıkları ve zebrafish yetiştiriciliği ile balık tesislerinin bakımı konusunda rehberlik sağlayan Dr. Daeseok Eom, Dr. Michael Parsons ve Eddie Hallo'ya (University of California, Irvine) teşekkür ediyoruz. Ayrıca Robert A. Mah Moleküler İnovasyon Merkezi ve Falling Leaves Innovation Building (Kaliforniya Üniversitesi, Irvine) personeline su sporları tesisi için altyapı sağladıkları için teşekkür ederiz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Yetişkin zebra balığı diyeti, 0,5 mm peletlerZeiglerAH271Rutin bakım sırasında yetişkin zebra balıklarını beslemek için kullanılır
Agaroz, düşük erime noktası (LMA)Sigma-AldrichA9414-10GGörüntüleme sırasında stabil konumlandırma için larvaları kuyulara yerleştirmek için kullanılır
Alüminyum folyoULINES-20197Hazırlık ve inkübasyon sırasında MTZ gibi ışığa duyarlı reaktiflerin korunması için kullanılır
CellProfilerBroad InstituteRRID: SCR_007358Opsiyonel otomatik floresan görüntü analizi için kullanılır
Konik tüpler, 15 mLCorning352097Reaktif hazırlama ve numune işleme için kullanılır
Konik tüpler, 50 mLCorning352070Reaktif hazırlama ve çözelti depolama için kullanılır
Geçiş tankları (1.0 L)AquaneeringZHCT100Kontrollü zebra balığı üretimi ve embriyo toplanması için kullanılır
Danio rerio (AB vahşi tip)——Nitroredüktaz bağımlı etkilerinin özgüllüğünü doğrulamak için kullanılan non-transgenik kontrol hattı
Danio rerio (Tg(th:Gal4; UAS:NTR-mCherry))——Hedeflenmiş kemojenetik ablasyon için dopaminerjik nöronlarda nitroredüktaz-mCherry eksprese eden transgenik zebra balığı hattı
Dimetil sülfoksit (DMSO), susuz (≥99.9%)Sigma-Aldrich472301-500MLPTU, MTZ ve tarama bileşikleri için çözücü
EthoVision XTNoldusRRID: SCR_000441Larv a lokomosyonunu kantitatif olarak ölçmek için kullanılan davranış izleme yazılımı
Fiji (ImageJ)NIHRRID: SCR_003070Floresan kantitatif analizi için kullanılan görüntü analiz yazılımı
İnce uçlu forseps veya 0,25 mm probWorld Precision InstrumentsWPI0118Agaroz gömme sırasında larvaları yönlendirmek için kullanılır
Floresan mikroskopuZeiss11845460Dopaminerjik nöronları mCherry floresansı ile görüntülemek için kullanılır
Gemma Micro 150 ZF (juvenil diyet, 100–200 μm)Skretting10818945Juvenil zebra balıklarını beslemek için kullanılır
Gemma Micro 75 ZF (larval diyet, 50–100 μm)Skretting10818935Larval zebra balıklarını beslemek için kullanılır
GraphPad PrismGraphPadRRID: SCR_002798Veri analizi ve çizim için kullanılan istatistiksel analiz yazılımı
Isı bloğu (42°C ve 70°C yeteneği)Thermo Fisher88870001Agarozu kontrollü sıcaklıklarda eritip tutmak için kullanılır
Yüksek çözünürlüklü kamera (üstten montaj uyumlu)Basler88-327Larval lokomotor aktivitesini kaydetmek için kullanılır
Hidrochloric asit (HCl), 0.1 MFisher ScientificSA48-500Tricaine hazırlama sırasında pH'ı ayarlamak için kullanılır
İnkübatör (28,5°C, 14 saat ışık:10 saat karanlık fotoperiod)MilliporeZ763314Zebra balığı gelişimi için kontrollü çevresel koşulları sürdürür
Instant Ocean deniz tuzuInstant OceanSS15-10Mavi yumurta suyu (BEW) hazırlamak için kullanılır
Işık dağılımcı levha (veya eşdeğeri)Edmund Optics27-103Davranışsal kayıt sırasında tek tip aydınlatma sağlamak ve parlama en aza indirmek için kullanılır
Işık pediLightcraftLC2004LEDLokomotör takip sırasında alttan aydınlatma sağlar
Metronidazol (MTZ)Sigma-AldrichM3761-100GDopaminerjik nöronların kemojenetik ablasyonu için kullanılır
Metilen mavisi, %1 sulu çözeltiSigma-AldrichM9140Embriyolardaki mikrobiyal büyümeyi önlemek için BEW'ye eklenir
Mikrosantrifüj tüpleri, 1,5 mLEppendorf22363204Reaktif alikotlama ve depolama için kullanılır
Mikropipet, P200GilsonFP10005SLarvaları elleçlemek ve çözeltileri hazırlamak için kullanılır
Petri kapları, 100 mmCorningCLS430167Embriyo toplama ve inkübasyon için kullanılır
Pipet uçları, 200 μLRAININ30389188Sıvı işleme ve larval transferi için mikropipetlerle kullanılır
Sodyum klorür (NaCl), ≥99.0%Sigma-AldrichS9888-500GTampon ve sulu çözeltileri hazırlamak için kullanılır
Sodyum hidroksit (NaOH), 0.1 MFisher ScientificSS256-500Tricaine hazırlama sırasında pH'ı ayarlamak için kullanılır
StereomikroskopNikonSMZ-745Gömme sırasında larval manipülasyon ve yönlendirme için kullanılır
Sıcaklık kontrollü ısı matı (25°C–28°C)VivosunV-SHM

Kaynaklar

  1. Haynes, E. M., Ulland, T. K., Eliceiri, K. W. A model of discovery: the role of imaging established and emerging non-mammalian models in neuroscience. Front Mol Neurosci. 15, 867010 (2022).
  2. Yang, W., Chen, X., Li, S., Li, X. J. Genetically modified large animal models for investigating neurodegenerative diseases. Cell Biosci. 11 (1), 218 (2021).
  3. Dodiya, R., et al. Zebrafish-based Parkinson’s disease models: unveiling genetic mechanisms and therapeutic pathways. CNS Neurol Disord Drug Targets. 24 (12), 900-920 (2025).
  4. Wasel, O., Freeman, J. L. Chemical and genetic zebrafish models to define mechanisms of and treatments for dopaminergic neurodegeneration. Int J Mol Sci. 21 (17), (2020).
  5. Kozol, R. A., et al. Function over form: modeling groups of inherited neurological conditions in zebrafish. Front Mol Neurosci. 9, 55 (2016).
  6. Jang, H., Kim, S. H., Koh, Y., Yoon, K. J. Engineering brain organoids: toward mature neural circuitry with an intact cytoarchitecture. Int J Stem Cells. 15 (1), 41-59 (2022).
  7. Vandamme, T. F. Use of rodents as models of human diseases. J Pharm Bioallied Sci. 6 (1), 2-9 (2014).
  8. Malik, N., et al. Compounds with species and cell type specific toxicity identified in a 2000 compound drug screen of neural stem cells and rat mixed cortical neurons. Neurotoxicology. 45, 192-200 (2014).
  9. Hasani, H., et al. Whole-brain imaging of freely-moving zebrafish. Front Neurosci. 17, 1127574 (2023).
  10. Mattern, K., von Trotha, J. W., Erfle, P., Köster, R. W., Dietzel, A. NeuroExaminer: an all-glass microfluidic device for whole-brain in vivo imaging in zebrafish. Commun Biol. 3 (1), 311 (2020).
  11. Panier, T., et al. Fast functional imaging of multiple brain regions in intact zebrafish larvae using selective plane illumination microscopy. Front Neural Circuits. 7, 65 (2013).
  12. Noda, S., et al. Aging-related motor function and dopaminergic neuronal loss in C57BL/6 mice. Mol Brain. 13 (1), 46 (2020).
  13. Godoy, R., et al. Chemogenetic ablation of dopaminergic neurons leads to transient locomotor impairments in zebrafish larvae. J Neurochem. 135 (2), 249-260 (2015).
  14. Schallert, T., Tillerson, J. L. Intervention strategies for degeneration of dopamine neurons in parkinsonism: optimizing behavioral assessment of outcome. Cent Nerv Syst Dis. , 131-151 (2000).
  15. Westerfield, M. . The zebrafish book: a guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2007).
  16. Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction. J Vis Exp. (69), e4196 (2012).
  17. Nipu, N., et al. Methylene blue at recommended concentrations alters metabolism in early zebrafish development. Commun Biol. 8 (1), 120 (2025).
  18. Ohnesorge, N., et al. Assessment of the effect of tricaine (MS-222)-induced anesthesia on brain-wide neuronal activity of zebrafish larvae. Front Neurosci. 18, 1456322 (2024).
  19. Schroeder, A. B., et al. The ImageJ ecosystem: open-source software for image visualization, processing, and analysis. Protein Sci. 30 (1), 234-249 (2021).
  20. Stirling, D. R., et al. CellProfiler 4: improvements in speed, utility and usability. BMC Bioinformatics. 22 (1), 433 (2021).
  21. Kim, G. H. J., et al. A zebrafish screen reveals renin-angiotensin system inhibitors as neuroprotective via mitochondrial restoration in dopamine neurons. eLife. 10, (2021).
  22. Kim, G. H. J., et al. In vivo dopamine neuron imaging-based small molecule screen identifies novel neuroprotective compounds and targets. Front Pharmacol. 13, 837756 (2022).
  23. Aponte, P. M., Gutierrez-Reinoso, M. A., Garcia-Herreros, M. Bridging the gap: animal models in next-generation reproductive technologies for male fertility preservation. Life (Basel). 14 (1), (2023).
  24. Fen, W., et al. A review for cell-based screening methods in drug discovery. Biophys Rep. 7 (6), 504-516 (2021).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

Kemogenetik AblasyonMetronidazol TedavisiParkinson Hastalığı ModeliLokomotor Aktiviteİlaç TaramaNöroprotektif Bileşikler
Zebrafish larvalarında dopaminergik nörodejenerasyonun in vivo fenotiplenmesi, davranışsal analiz ve yüksek içerikli görüntüleme kullanılarak
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.