Zorlanmış miR-486-3p aşırı ekspresyonu; A549 ve H358 akciğer adenokarsinom hücrelerinde proliferasyonla ilişkili aktiviteyi, klonojenik büyümeyi, yara kapanmasını ve Matrigel geçişini baskılar. Bu etkiler; WNT5B, DVL1, β-catenin ve BCL-2 ekspresyonundaki azalma ile birlikte görülmekte olup, doğrudan hedefleme veya yolak nedenselliği kanıtlanmaksızın Wnt ile ilgili değişikliklerle in vitro bir ilişkiye işaret etmektedir.
Araştırma makalesi
miR-486-3p, Akciğer Adenokarsinom Hücrelerinde Malign Fenotipleri Baskılar ve Azalmış WNT5B, DVL1 ve β-catenin Ekspresyonu ile İlişkilidir
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
Akciğer adenokarsinomu (LUAD), küçük hücreli dışı akciğer kanserinin baskın histolojik alt tipidir ve önemli morbidite ve mortalite ile ilişkisi devam etmektedir. Önceki çalışmalar, LUAD'da miR-486-3p'nin tümör baskılayıcı işlevlerini tanımlamıştır, ancak WNT5B, DVL1 ve β-katenin ile ilişkili ekspresyon değişiklikleri ile olan ilişkisi net olarak tanımlanmamıştır. Burada, bazal miR-486-3p bolluğu A549 ve H358 LUAD hücrelerinde incelenmiş ve kendi rutin koşulları altında tutulan Beas-2b bronşiyal epitel hücrelerindekilerle karşılaştırılmıştır. Lentiviral transdüksiyon ile stabil miR-486-3p aşırı ekspresyon modelleri oluşturulmuştur. Hücre büyümesiyle ilişkili aktivite, klonojenik büyüme, yara kapanması ve Matrigel kaplı membranların geçişi; Cell Counting Kit-8, koloni oluşumu, yara iyileşmesi ve Transwell analizleri kullanılarak değerlendirilmiştir. WNT5B, DVL1, β-katenin ve BCL-2 protein bolluğu Western blotting ile belirlenmiş ve ek olarak WNT5B, DVL1, CTNNB1 ve BCL2 mRNA seviyeleri RT-qPCR ile incelenmiştir. Kullanılan kültür koşulları altında, miR-486-3p bolluğu A549 ve H358 hücrelerinde Beas-2b hücrelerine göre daha düşük çıkmış ve lentiviral transdüksiyon her iki LUAD hücre hattında stabil aşırı ekspresyon sağlamıştır. Zorlanmış miR-486-3p aşırı ekspresyonu; CCK-8 sinyalini, koloni oluşumunu, yara kapanmasını ve Matrigel kaplı membran geçişini azaltmış ve düşük WNT5B, DVL1, toplam β-katenin ve BCL-2 protein bolluğu ile beraber seyretmiştir. RT-qPCR, miR-486-3p aşırı ekspresyonundan sonra her iki LUAD hücre hattında daha düşük WNT5B, DVL1, CTNNB1 ve BCL2 transkript bolluğu olduğunu göstermiştir. Bu bulgular, zorlanmış miR-486-3p ekspresyonu, çeşitli malign hücre çıktıların azalması ve değişmiş Wnt-ilişkili ekspresyon arasında in vitro bir ilişkiyi desteklemektedir; ancak bunlar doğrudan miRNA-hedef bağlanmasını, yolak aktivitesini veya nedensel lineer bir sinyalizasyon mekanizmasını kanıtlamamaktadır.
Giriş
Akciğer adenokarsinomu (LUAD), küçük hücreli dışı akciğer kanserinin (NSCLC) en yaygın histolojik alt tipidir ve dünya çapında akciğer kanserine bağlı morbidite ve mortaliteye önemli ölçüde katkıda bulunur1,2,3,4,5. Moleküler sınıflandırma ve hedefe yönelik tedaviler, seçili hasta grupları için sonuçları iyileştirmiştir ancak ileri evre LUAD'nin tedavisi halen zordur ve biyolojik olarak heterojendir1,2,3,4,5. Bu nedenle, malign hücre davranışına katkıda bulunan düzenleyici süreçlerin tanımlanması, test edilebilir terapötik hipotezlerin geliştirilmesi açısından önemini korumaktadır.
Wnt sinyali, proliferasyon, sağkalım, polarite ve motiliteyi düzenleyen β-catenin bağımlı ve β-catenin bağımsız kollardan oluşur6,7,8,9. Biyolojik etkileri reseptöre ve hücresel bağlama göre değişse de, WNT5B çoğunlukla non-kanonik sinyalleme ile ilişkilendirilir10,11. DVL1, birkaç Wnt kolu tarafından paylaşılan sitoplazmik bir sinyal iletim proteinidir ve akciğer kanserinde β-catenin ile ilişkili davranışlarla bağlantılı bulunmuştur12. Buna göre, WNT5B, DVL1 ve β-catenin'deki eş zamanlı değişiklikler, kendi başlarına tek bir doğrusal yolak için kanıt olarak yorumlanmamalıdır.
MikroRNA'lar (miRNA'lar), hedef transkriptlerle sekansa bağımlı etkileşimler yoluyla gen ekspresyonunu düzenleyen kısa kodlamayan RNA'lardır13,14,15. Tek bir miRNA birden fazla RNA'yı etkileyebildiğinden, değişen miRNA bolluğu çeşitli tümörle ilişkili fenotipleri etkileyebilir13,14,15,16,17,18. Çeşitli miRNA'ların akciğer kanseri büyümesi, motilitesi ve sinyal iletimi ile ilişkili olduğu saptanmış olup, miRNA'lar ile Wnt ile ilişkili ağlar arasındaki karşılıklı etkileşim birçok kanser bağlamında tanımlanmıştır16,17,18,19,20.
MIR486 lokusu, olgun miR-486-3p ve miR-486-5p zincirlerini oluşturur. miR-486-3p'nin oral kanser ve glioblastomada tümör baskılayıcı aktivite gösterdiği, buna karşın kutanöz skuamöz hücreli karsinomda tümör destekleyici bir etkisinin olduğu bildirilmiştir21,22,23,24,25. miR-486-3p, halka açık LUAD verilerindeki düşük bolluğu, LUAD'da daha önce raporlanmış tümör baskılayıcı aktivitesi ve onu WNT ile ilişkili aday transkriptlere bağlayan biyoinformatik öngörüler temelinde, hipotez odaklı bir strateji aracılığıyla mevcut çalışma için seçilmiştir. Tomioka ve ark., LUAD'da her iki miR-486 zincirinin de tümör baskılayıcı etkilerini göstermiş ve genom çapında hedef taraması yoluyla GINS4'ü tanımlamıştır26. Bu nedenle, mevcut çalışma bir antitümör fenotipin ilk gösterimi olduğunu iddia etmemektedir. Bunun yerine, zorlanmış miR-486-3p ekspresyonunun, WNT5B, DVL1 ve β-catenin bolluğundaki değişimler ve iki LUAD hücre hattında tekrarlanabilir fenotipik değişimlerle birlikte seyredip seyretmediğini değerlendirmektedir. Bu analizler ilişkileri değerlendirmekte olup; doğrudan hedeflemeyi, yolak aktivitesini veya doğrusal bir WNT5B/DVL1/β-catenin mekanizmasını kanıtlamamaktadır.
Protokol
Kullanılan reaktifler ve ekipmanlar Materyaller Tablosunda listelenmiştir.
Hücre kültürü
İnsan akciğer adenokarsinom (LUAD) hücre hatları A549 ve H358 ile ölümsüzleştirilmiş bronşiyal epitel hücre hattı Beas-2b kullanılmıştır. Farklı KRAS-mutant geçmişlerine sahip, yaygın olarak kullanılan LUAD modelleri olarak A549 (KRAS G12S) ve H358 (KRAS G12C; STK11-eksik) seçilmiş; Beas-2b ise malign olmayan bronşiyal epitel karşılaştırıcısı olarak dahil edilmiştir. A549 ve H358 hücreleri RPMI-1640 ortamında, Beas-2b hücreleri ise DMEM ortamında kültüre edilmiştir; her iki ortam da %10 fetal bovin serum ve %1 penisilin-streptomisin içermektedir. Hücreler, %5 CO₂ içeren nemlendirilmiş bir atmosferde 37 °C'de kültüre edilmiştir. Tümör ve epitel karşılaştırıcı hücre hatları farklı rutin ortamlarda tutulduğu için, hücre hatları arası bazal ekspresyon karşılaştırmaları ihtiyatla yorumlanmıştır.
Lentiviral transduksiyon ve stabil hücre seçimi
hsa-miR-486-3p öncülünü taşıyan lentiviral vektörler (LV-miR-486-3p) veya karma bir negatif kontrol dizisi (LV-NC), stabil fonksiyon kazanım tasarımı kapsamında kullanılmıştır. A549 ve H358 hücreleri, 6 kuyucuklu plakalara kuyucuk başına 5 × 104 hücre olacak şekilde ekilmiş ve gece boyunca kültüre edilmiştir. Ertesi gün hücreler, 8 µg/mL polybrene varlığında 10 enfeksiyon çokluğu (MOI) ile lentivirüse maruz bırakılmıştır. 24 saat sonra, viral inokülum taze komple ortam ile değiştirilmiştir. Transdükte edilmiş hücreler, 2 µg/mL puromisin ile 7 gün boyunca seçilmiştir. Seçim işleminden sonra, hayatta kalan hücrelerin toparlanmasına izin verilmiş ve sonraki moleküler ve fonksiyonel analizler için hücreler çoğaltılmıştır. Mevcut çalışma özellikle stabil zorunlu aşırı ekspresyonun etkilerini değerlendirmek üzere tasarlandığı için herhangi bir miR-486-3p inhibitör kolu dahil edilmemiştir.
NOT: Hücre canlılığındaki tedaviyle ilgili farklılıkları en aza indirmek için MOI, polybrene maruziyet süresi ve puromisin seleksiyon koşulları LV-NC ve LV-miR-486-3p grupları arasında aynı tutulmalıdır.
RT-qPCR
miR-486-3p ekspresyon seviyelerini belirlemek ve A549 ile H358 hücrelerindeki lentiviral aşırı ekspresyonun etkinliğini doğrulamak için RT-qPCR gerçekleştirilmiştir. Toplam RNA, üretici talimatlarına uygun olarak TRIzol reajeni kullanılarak izole edilmiştir. RNA konsantrasyonu ve saflığı spektrofotometrik olarak değerlendirilmiş ve 1,8–2,1 arasındaki A260/A280 oranı kabul edilebilir olarak değerlendirilmiştir. mRNA analizi için, 1 µg toplam RNA, üretici protokolüne göre ticari bir cDNA sentez kiti kullanılarak cDNA'ya ters transkribe edilmiştir. mikroRNA analizi için ise cDNA sentezi, miRNA'ya özgü stem-loop ters transkripsiyon primeri kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Kantitatif PCR; 10 µL 2× SYBR Green Master Mix, her bir primerden 0,4 µM ve 2 µL cDNA kalıbı içeren toplam 20 µL reaksiyon hacminde yürütülmüştür. Amplifikasyon protokolü, 95 °C'de 5 dakika başlangıç denatürasyon adımını, ardından 95 °C'de 10 saniye denatürasyon ve 60 °C'de 30 saniye bağlanma/uzama şeklinde 40 döngüden oluşmuştur. Amplifikasyon spesifikliğini doğrulamak için ardından bir erime eğrisi analizi gerçekleştirilmiştir. miRNA kantifikasyonu için iç kontrol olarak U6 küçük nükleer RNA, mRNA normalizasyonu için ise referans gen olarak GAPDH kullanılmıştır. Göreceli ekspresyon seviyeleri 2−ΔΔCq yöntemi kullanılarak belirlenmiştir.
miRNA primer dizileri şu şekildedir: stem-loop ters transkripsiyon primeri, 5′-GTCGTATCGACTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCAGTCGATACGAC
ATCCTG-3′; miR-486-3p ileri primer, 5′-CGCGGGGCAGCTCAGTA-3′; üniversal geri primer, 5′-ACTGCAGGGTCCGAGGTATT-3′; U6 ileri primer, 5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′ ve U6 geri primer, 5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′. WNT5B, DVL1, CTNNB1, BCL2 ve GAPDH için primer dizileri, amplikon uzunlukları ve amplifikasyon verimlilikleri ile birlikte Tablo 1'de verilmiştir. mRNA ekspresyonu GAPDH'ye göre normalize edilirken, miR-486-3p ekspresyonu U6'ya göre normalize edilmiştir. Her deney, biyolojik replika başına üç teknik replika olacak şekilde üç bağımsız biyolojik replika içermiştir.
Western blotting
7 günlük puromisin seçimi ve bir toparlanma süresinin tamamlanmasının ardından hücreler, proteaz inhibitörleri içeren RIPA tamponu ile lizlendi. Protein konsantrasyonları BCA protein analizi kullanılarak belirlendi. Eşit miktardaki proteinler (hat başına 20 µg), %10'luk SDS-PAGE jellerinde ayrıştırıldı ve 300 mA'de 120 dk boyunca ıslak transfer yöntemiyle PVDF membranlara aktarıldı. Membranlar, %0,1 Tween-20 içeren Tris-tamponlu salin (TBST) ile hazırlanan %5'lik yağsız süt ile oda sıcaklığında 1 saat boyunca bloke edildi. Membranlar; WNT5B (1:1.000), DVL1 (1:1.000), β-catenin (1:1.000), BCL-2 (0,5 µg/mL) veya β-actin (1:5.000) karşıtı primer antikorlarla 4 °C'de gece boyunca inkübe edildi. Tüm antikorların üreticileri ve katalog numaraları Materyaller Tablosunda verilmiştir. TBST ile yapılan üç adet 10 dakikalık yıkamanın ardından membranlar, 1:5.000 oranında seyreltilmiş HRP-konjuge keçi anti-tavşan IgG sekonder antikoru ile oda sıcaklığında 1 saat boyunca inkübe edildi. Membranlar daha sonra üç kez TBST ile yıkandı ve protein bantları kemilüminesans bir substrat kullanılarak görselleştirildi ve bir jel dokümantasyon ve görüntüleme sistemi ile görüntülendi. Bant yoğunlukları ImageJ kullanılarak nicelleştirildi. Her bir hedef proteinin bolluğu, aynı biyolojik örnekten elde edilen ilgili β-actin sinyaline normalize edildi. Densitometrik analiz için yalnızca lineer, doygun olmayan deteksiyon aralığındaki pozlamalar kullanıldı. Üç bağımsız biyolojik deney gerçekleştirildi.
Hücre Sayım Kiti-8 analizi
LV-NC veya LV-miR-486-3p ile stabil olarak transduce edilmiş A549 ve H358 hücreleri, 96 kuyucuklu plakalara 100 µL tam besiyeri içinde her kuyucuğa 1.5 × 104 hücre olacak şekilde ekildi. Gece boyu yapışmanın ardından besiyeri değiştirildi ve Cell Counting Kit-8 reaktifi eklendikten hemen sonra 0. saat absorbansı ölçüldü. 0 sa, 24 sa, 48 sa, 72 sa ve 96. saatlerde, her kuyucuğa 10 µL reaktif eklendi ve 450 nm'de absorbans okunmadan önce 37 °C'de 1 sa inkübe edildi. Revize edilmiş zaman seyri analizi için, grafik çizilmeden önce her grup kendi 0. saat değerine göre normalize edildi. Üç bağımsız biyolojik deney gerçekleştirildi ve istatistiksel analizden önce her deneydeki teknik kuyucukların ortalaması alındı.
Koloni oluşum deneyi
Stabil olarak seçilmiş A549 ve H358 hücreleri, 5 × 102 hücre/mL konsantrasyonunda tek hücre süspansiyonları şeklinde hazırlandı. 6 kuyucuklu bir plakadaki her bir kuyucuğa bir mililitre hücre süspansiyonu eklendi ve ardından 3 mL komple besiyeri ilave edildi. Hücreler, her 5 günde bir besiyeri değişimi yapılarak 14 gün boyunca kültüre edildi. Koloniler PBS ile yıkandı, %4 paraformaldehit ile 20 dk fikse edildi, 20 dk kristal viyole ile boyandı, yıkandı ve havada kurutuldu. En az 50 hücre içeren koloniler ImageJ'de sayıldı. Üç bağımsız biyolojik deney gerçekleştirildi.
NOT: Hücrelerin yapay olarak kümelenmesini önlemek için, homojen bir tek hücre süspansiyonu ve koloni oluşumu sırasında plakanın minimum düzeyde sarsılması gereklidir.
Hücre göçü deneyi
Stabil olarak transduce edilmiş A549 ve H358 hücreleri 6 kuyucuklu plakalara ekilmiş ve konfluent bir monolayer oluşana kadar kültüre edilmişlerdir. Steril bir 10 µL pipet ucuyla düz bir çizik oluşturulmuş, ayrılan hücreler uzaklaştırılmış ve aynı işaretli alanlar 0 h, 24 h, 48 h ve 72 h sürelerinde görüntülenmiştir. Yara alanı ImageJ'de ölçülmüş ve yara kapanması (0 h'deki alan − belirtilen zaman noktasındaki alan) / 0 h'deki alan × 100% olarak hesaplanmıştır. Üç bağımsız biyolojik deney gerçekleştirilmiştir. Herhangi bir farmakolojik proliferasyon blokörü kullanılmamıştır; bu nedenle, bu analiz migrasyona özgü bir sonuçtan ziyade yara kapanmasının bir ölçümü olarak yorumlanmıştır.
NOT: Çizikler tutarlı genişlik ve basınçla oluşturulmalı ve zaman seyri boyunca aynı alanlar takip edilmelidir.
Hücre invazyon testi
Transwell invazyon analizleri, 8 µm gözenek boyutuna sahip 24 kuyucuklu polikarbonat membran insertler kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Her insertin üst yüzeyi, serumsuz DMEM ile 1:8 oranında seyreltilerek yaklaşık 1 mg/mL nihai protein konsantrasyonuna getirilen 100 µL Matrigel bazal membran matrisi ile kaplanmış ve 37 °C'de 4 s boyunca inkübe edilmiştir. A549 ve H358 hücreleri, sırasıyla 8 × 105 hücre/mL ve 4 × 105 hücre/mL yoğunluklarda serumsuz RPMI-1640 ortamında yeniden süspande edilmiştir. Üst bölmeye, insert başına 1,6 × 105 A549 hücresine veya 8 × 104 H358 hücresine karşılık gelen 200 µL hücre süspansiyonu eklenmiştir. Alt bölme, kemoatraktan olarak %20 fetal bovin serum içeren 500 µL RPMI-1640 ortamı ile doldurulmuştur. %5 CO₂ içeren nemlendirilmiş bir atmosferde 37 °C'de 48 s boyunca inkübasyonun ardından, membranın üst yüzeyinde kalan invaze olmamış hücreler bir pamuklu çubukla nazikçe uzaklaştırılmıştır. Membrandan geçerek invaze olan hücreler, %4 paraformaldehit ile 20 dk boyunca fikse edilmiş ve oda sıcaklığında %0,1 kristal viyole ile 20 dk boyunca boyanmıştır. Her insert için rastgele seçilen beş mikroskobik alan görüntülenmiş ve invaze olan hücre sayısı ImageJ kullanılarak nicelendirilmiştir. Beş alandan elde edilen ortalama hücre sayısı her bir insert için tek bir değer olarak kabul edilmiş ve bireysel bir mikroskobik alan yerine insert, deneysel birim olarak değerlendirilmiştir. Üç bağımsız biyolojik deney gerçekleştirilmiştir.
NOT: Membrana zarar vermemek veya alt yüzeye göç etmiş hücreleri yerinden oynatmamak için, istila etmeyen hücreleri nazikçe ve tutarlı bir şekilde uzaklaştırın.
İstatistiksel analiz
Aksi belirtilmedikçe veriler ortalama ± SD olarak sunulmuştur ve n bağımsız biyolojik deneyleri ifade eder. Teknik tekrarlar veya aynı deney biriminden alınan birden fazla mikroskobik alan, çıkarımsal testler öncesinde ortalamaları alınarak birleştirilmiştir. Üç hücre hattı karşılaştırması için tek yönlü varyans analizi ve ardından Tukey düzeltmeli ikili karşılaştırmalar kullanılmıştır. CCK-8 ve yara kapanma zaman seyirleri için tedavi, zaman ve tedavi-zaman etkileşimi etkilerini değerlendirmek amacıyla iki yönlü tekrarlanan ölçümler varyans analizi kullanılmış ve ardından münferit zaman noktalarında Šídák düzeltmeli karşılaştırmalar yapılmıştır. İki grup karşılaştırmaları, iki yönlü eşleşmemiş Student t-testleri kullanılarak analiz edilmiştir. İstatistiksel analizler ve veri görselleştirme işlemleri, istatistiksel analiz ve grafik yazılımları kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Kesin p-değerleri şekil panellerinde veya kaynak veri tablolarında raporlanmıştır. İstatistiksel anlamlılık p < 0.05 olarak tanımlanmıştır; *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001 ve ****p < 0.0001.
Sonuçlar
TCGA/starBase analizi LUAD'da miR-486-3p bolluğunun azaldığını göstermekte ve TargetScan aday bağlanma bölgelerini belirlemektedir
starBase v3.0 aracılığıyla erişilen TCGA kaynaklı ekspresyon verileri, ... olduğunu göstermiştir miR-486-3p bolluk, 512 akciğer adenokarsinomu (LUAD) örneğinde 20 tümör dışı akciğer örneğine göre anlamlı derecede daha düşüktü (Wilcoxon sıra toplamı testi, p = 3.2 × 10⁻5; Şekil 1). TargetScanHuman, için zayıf korunan bir aday 7mer-m8 bölgesi tanımlamıştır miR-486-3p ...nin 468–474. pozisyonlarında DVL1 −0,23'lik bir context++ skoru ve %80'lik bir context++ skor yüzdelik dilimine sahip 3′ çevrilmeyen bölge (3′ UTR). Kötü korunmuş bir aday 8mer bölgesi, 913–920. pozisyonlarda tespit edilmiştir. WNT5B context++ skoru −0,46 ve context++ skor yüzdeliki 97 olan 3′ UTR (Şekil 2). Hesaplamalı olarak öngörülen bu bölgeler, deneysel hipotezi oluşturmak için kullanılmış olup doğrudan miRNA-hedef bağlanma kanıtı olarak değerlendirilmemiştir. Kaynak URL'leri şurada verilmiştir: Tablo 2.
miR-486-3p bolluğu LUAD hücre hatlarında azalmıştır ve lentiviral transdüksiyon sonrası belirgin şekilde artmıştır
Kendi rutin kültür koşulları altında, RT-qPCR analizi, miR-486-3p miktarının A549 ve H358 hücrelerinde Beas-2b bronşiyal epitel hücrelerine göre daha düşük olduğunu göstermiştir. Tek yönlü varyans analizini takiben yapılan Tukey düzeltmeli karşılaştırmalar, A549 ve Beas-2b hücreleri arasında (p < 0.01) ve H358 ve Beas-2b hücreleri arasında (p < 0.001; Şekil 3A) anlamlı farklılıklar olduğunu ortaya koymuştur.
LV-miR-486-3p ile yapılan stabil transdüksiyon, karşılık gelen LV-NC gruplarına kıyasla miR-486-3p bolluğunu belirgin şekilde artırmıştır. Ekspresyon, A549 hücrelerinde yaklaşık 1.470 kat ve H358 hücrelerinde 220 kat artmış olup, her iki karşılaştırma da istatistiksel anlamlılığa ulaşmıştır (p < 0,001; Şekil 3B,C). Bu sonuçlar, stabil miR-486-3p aşırı eksprese eden hücre modellerinin başarıyla oluşturulduğunu doğrulamıştır.
Zorlanmış miR-486-3p ekspresyonu, azalmış WNT5B, DVL1, β-catenin ve BCL-2 ekspresyonu ile ilişkilidir
Western blotting, LV-miR-486-3p transdüksiyonu yapılan hücrelerde WNT5B, DVL1, toplam β-catenin ve BCL-2 protein bolluğunun ilgili LV-NC kontrollere göre daha düşük olduğunu göstermiştir (Şekil 4A–E). A549 hücrelerinde, zorlanmış miR-486-3p ekspresyonu; β-catenin (p = 0.022), WNT5B (p = 0.0008), DVL1 (p = 0.019) ve BCL-2 (p = 0.0017) protein bolluğunda azalma ile ilişkilendirilmiştir. Benzer azalmalar H358 hücrelerinde de β-catenin (p = 0.001), WNT5B (p = 0.0002), DVL1 (p = 0.0003) ve BCL-2 (p = 0.0018) için gözlemlenmiştir.
Transkript düzeyindeki değişikliklerin protein bulgularına eşlik edip etmediğini belirlemek için ardından RT-qPCR gerçekleştirilmiştir (Şekil 4F–I). A549 hücrelerinde, zorlanmış miR-486-3p ekspresyonu CTNNB1 mRNA'sını LV-NC grubuna kıyasla 0,226 kata (p = 0,004), WNT5B mRNA'sını 0,180 kata (p = 0,004), DVL1 mRNA'sını 0,278 kata (p = 0,006) ve BCL2 mRNA'sını 0,259 kata (p = 0,003) indirmiştir.
Benzer transkript düzeyindeki değişiklikler H358 hücrelerinde tespit edildi. LV-NC grubuna kıyasla CTNNB1 mRNA'sı 0,288 kata (p = 0,028), WNT5B mRNA'sı 0,250 kata (p = 0,019), DVL1 mRNA'sı 0,271 kata (p = 0,020) ve BCL2 mRNA'sı 0,534 kata (p = 0,003) düştü. Böylece, transkript düzeyindeki değişikliklerin yönü, her iki hücre hattındaki ilgili protein düzeyi bulgularıyla tutarlılık gösterdi. Bu sonuçlar koordineli ekspresyon değişikliklerini ortaya koymaktadır ancak doğrudan hedefleme veya doğrusal bir WNT5B/DVL1/β-catenin sinyal mekanizmasının aktivitesini kanıtlamamaktadır.
Zorlanmış miR-486-3p ekspresyonu, büyüme ile ilişkili CCK-8 sinyalini azaltır
CCK-8 ölçümleri, her bir deney grubu için karşılık gelen 0-saat değerine göre normalize edildi. Normalize edilmiş CCK-8 sinyali, hem LV-NC hem de LV-miR-486-3p ile transduksiyon yapılmış hücrelerde zamanla arttı, ancak zorlanmış miR-486-3p ekspresyonunu takiben genel olarak daha düşük değerler gözlemlendi (Şekil 5).
A549 hücrelerinde, iki yönlü tekrarlanan ölçümler varyans analizi sonrası yapılan Šídák düzeltmeli karşılaştırmalar, LV-miR-486-3p grubunda 24, 48 ve 96. saatlerde CCK-8 sinyallerinin LV-NC grubuna göre anlamlı derecede daha düşük olduğunu göstermiştir (p < 0.05); buna karşın 72. saatteki fark istatistiksel olarak anlamlı bulunmamıştır (Şekil 5A). H358 hücrelerinde ise CCK-8 sinyali 24, 48, 72 ve 96. saatlerde LV-miR-486-3p grubunda anlamlı derecede daha düşüktü (p < 0.05; Şekil 5B). Bu bulgular, zorlanmış miR-486-3p ekspresyonunun büyüme ile ilişkili metabolik aktiviteyi azalttığını ve bu etkinin H358 zaman seyri boyunca daha tutarlı olduğunu göstermektedir.
Zorlanmış miR-486-3p ekspresyonu klonojenik büyümeyi azaltır
Uzun süreli klonojenik büyümeyi değerlendirmek için koloni oluşum analizleri gerçekleştirilmiştir. LV-miR-486-3p ile transdukt edilen A549 hücreleri, karşılık gelen LV-NC hücrelerine kıyasla anlamlı derecede daha az koloni oluşturmuştur (p = 0.013; Şekil 6A). H358 hücrelerinde de koloni sayısında anlamlı bir azalma gözlemlenmiştir (p = 0.006; Şekil 6B). Azalma, H358 hücrelerinde A549 hücrelerine göre daha belirgindi; bu durum, klonojenik etkinin büyüklüğünün iki LUAD modeli arasında farklılık gösterdiğini belirtmektedir.
Zorlanmış miR-486-3p ekspresyonu yara kapanmasını azaltır
Yara kapanması, çizme işleminin 24, 48 ve 72. saatlerinde nicelendirildi (Şekil 7). A549 kültürlerinde, LV-miR-486-3p grubu; 24, 48 ve 72. saatlerde LV-NC grubuna göre anlamlı derecede daha düşük yara kapanması göstermiştir (her bir karşılaştırma için p < 0.05; Şekil 7A,C).
Benzer şekilde, LV-miR-486-3p transdüksiyonu yapılan H358 kültürlerinde yara kapanması 24. ve 48. saatlerde (p < 0.05) ve 72. saatte (p < 0.01; Şekil 7B,D) azalmıştır. Deney farmakolojik bir proliferasyon inhibitörü olmadan yürütüldüğü için, bu sonuçlar yalnızca migrasyona özgü bir etkinin kanıtı olarak değil, azalmış yara kapanması olarak yorumlanmıştır.
Zorlanmış miR-486-3p ekspresyonu, Matrigel kaplı membranların geçişini azaltır
Hücrelerin Matrigel kaplı Transwell membranlarını geçme yeteneği 48 sa sonra değerlendirildi. A549 LV-miR-486-3p grubunda, alt membran yüzeyinde A549 LV-NC grubuna kıyasla anlamlı derecede daha az kristal viyole ile boyanmış hücre tespit edildi (p = 0.0001; Şekil 8A). Benzer bir azalma H358 hücrelerinde de gözlendi (p = 0.0007; Şekil 8B).
Her bir insert için beş mikroskobik alanın ortalaması alınmış ve insert deneysel birim olarak kabul edilmiştir. Bu bulgular, bu analizde kullanılan koşullar altında zorlanmış miR-486-3p ekspresyonu sonrası Matrigel kaplı membranlardan geçişin azaldığını göstermektedir.
VERİ ERİŞİLEBİLİRLİĞİ:
Şekillerin temelini oluşturan tüm kaynak veriler; veritabanı kaynak dosyaları, RT-qPCR verileri, kırpılmamış Western blotlar, densitometri değerleri, mikroskopi görüntüleri, sayım kayıtları, CCK-8 ölçümleri ve istatistiksel analiz dosyaları dahil olmak üzere Ek Dosya 1'de yer almaktadır.
Şekil 1: TCGA/starBase'den alınan LUAD ve normal akciğer örneklerinde miR-486-3p bolluğu. TCGA kaynaklı ekspresyon verileri, Mayıs 2026'da starBase v3.0 aracılığıyla elde edilmiş olup 512 akciğer adenokarsinomu (LUAD) örneğini ve 20 normal akciğer örneğini içermektedir. Gruplar Wilcoxon sıra toplamı testi ile karşılaştırılmıştır (p = 3.2 × 10⁻5). LUAD, akciğer adenokarsinomu. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: DVL1 ve WNT5B 3′ UTR'lerinde TargetScan tarafından öngörülen aday miR-486-3p bağlanma bölgeleri. TargetScanHuman, DVL1 3′ çevrilmeyen bölgesinin (3′ UTR) 468–474. pozisyonlarında aday bir 7mer-m8 bölgesi ve WNT5B 3′ UTR'sinin 913–920. pozisyonlarında aday bir 8mer bölgesi tanımlamıştır. Kaynak URL'leri Tablo 2'de verilmiştir. Bu hesaplamalı öngörüler hipotez oluşturmak için kullanılmış olup doğrudan bağlanmaya dair deneysel kanıt teşkil etmemektedir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3: Bazal miR-486-3p bolluğu ve lentiviral aşırı ekspresyonun doğrulanması. (A) Kendi rutin kültür ortamlarında tutulan A549, H358 ve Beas-2b hücrelerindeki miR-486-3p bolluğunun RT-qPCR analizi. (B,C) LV-NC veya LV-miR-486-3p ile transduce edilmiş A549 (B) ve H358 (C) hücrelerinde miR-486-3p aşırı ekspresyonunun RT-qPCR doğrulaması. Ekspresyon U6'ya göre normalize edilmiştir. Veriler, üç bağımsız biyolojik deneyden elde edilen ortalama ± SD olarak sunulmuştur. (A) tek yönlü ANOVA ve ardından Tukey-düzeltmeli çoklu karşılaştırmalar ile analiz edilmiştir. (B,C) iki yönlü eşleşmemiş Student t-testleri kullanılarak analiz edilmiştir. *p < 0.01; **p < 0.001. LV-NC, negatif kontrol lentivirüs; RT-qPCR, ters transkripsiyon kantitatif PCR; SD, standart sapma. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Zorlanmış miR-486-3p ekspresyonu, azalan aday gen ekspresyonu ile ilişkilidir. (A) LV-NC veya LV-miR-486-3p ile transduce edilmiş A549 ve H358 hücrelerinde β-catenin, WNT5B, DVL1, BCL-2 ve β-actin bolluğunu gösteren temsilci Western blotlar. Moleküler kütleler kilodalton cinsinden belirtilmiştir. (B–E) β-actin'e normalize edilmiş β-catenin (B), WNT5B (C), DVL1 (D) ve BCL-2 (E)'nin densitometrik kantifikasyonu. (F–I) GAPDH'ye normalize edilmiş CTNNB1 (F), WNT5B (G), DVL1 (H) ve BCL2 (I) transkript bolluğunun RT-qPCR analizi. Veriler, üç bağımsız biyolojik deneyden elde edilen ortalama ± SD olarak sunulmuştur; bireysel noktalar bağımsız biyolojik tekrarları temsil eder. Gruplar, iki yönlü eşleşmemiş Student t-testleri kullanılarak karşılaştırılmıştır. Kesin p-değerleri ve kat değişimleri ilgili panellerde verilmiştir. kDa, kilodalton; LV-NC, negatif kontrol lentivirüs; RT-qPCR, ters transkripsiyon kantitatif PCR; SD, standart sapma. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Zorlanmış miR-486-3p ekspresyonu, büyüme ile ilişkili CCK-8 sinyallerini zamanla azaltır. LV-NC veya LV-miR-486-3p ile transduksiyon yapılan A549 (A) ve H358 (B) hücreleri 0 sa, 24 sa, 48 sa, 72 sa ve 96 sa'da analiz edilmiştir. OD450 değerleri, her grup içindeki ilgili 0 sa değerine göre normalize edilmiştir. Veriler, üç bağımsız biyolojik deneyden elde edilen ortalama ± SD olarak sunulmuştur. Tedavi, zaman ve tedavi-zaman etkileşiminin etkileri, iki yönlü tekrarlanan ölçümler ANOVA ve ardından her zaman noktasındaki gruplar arası Šídák-düzeltmeli karşılaştırmalar kullanılarak analiz edilmiştir. *p < 0.05. CCK-8, Cell Counting Kit-8; LV-NC, negatif kontrol lentivirüs; OD450, 450 nm'deki optik yoğunluk; SD, standart sapma. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Zorlanmış miR-486-3p ekspresyonu klonojenik büyümeyi azaltır. LV-NC veya LV-miR-486-3p ile transduksiyonu yapılmış A549 (A) ve H358 (B) hücreleri için temsili tüm kuyucuk görüntüleri ve kantitatif koloni sayıları gösterilmiştir. Koloniler, tüm gruplar için aynı analiz ayarları kullanılarak ImageJ ile quantify edilmiştir. Veriler, üç bağımsız biyolojik deneyden elde edilen ortalama ± SD olarak sunulmuş ve iki yönlü eşleşmemiş Student t-testleri kullanılarak analiz edilmiştir. Kesin p-değerleri ilgili panellerde verilmiştir. LV-NC, negatif kontrol lentivirüs; SD, standart sapma. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 7: Zorlanmış miR-486-3p ekspresyonu yara kapanmasını azaltır. Çizme işleminden sonraki 0 h, 24 h, 48 h ve 72 h zaman noktalarında A549 (A,C) ve H358 (B,D) hücreleri için temsili görüntüler ve kantitatif yara kapanma ölçümleri gösterilmiştir. Yara kapanması şu şekilde hesaplanmıştır: (0 h'deki yara alanı − belirtilen zaman noktasındaki yara alanı) / 0 h'deki yara alanı × 100%. Veriler, üç bağımsız biyolojik deneyden elde edilen ortalama ± SD olarak sunulmuştur. Tedavinin, zamanın ve tedavi-zaman etkileşiminin etkileri, iki yönlü tekrarlanan ölçümler ANOVA ve ardından her zaman noktasındaki gruplar arasında Šídák-düzeltmeli karşılaştırmalar kullanılarak analiz edilmiştir. Ölçek çubukları, 200 µm. *p < 0.05; **p < 0.01. LV-NC, negatif kontrol lentivirüs; SD, standart sapma. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 8: Zorlanmış miR-486-3p ekspresyonu, Matrigel kaplı Transwell membranlarının geçişini azaltır. LV-NC veya LV-miR-486-3p ile transduce edilmiş A549 (A) ve H358 (B) hücreleri için temsili kristal viyole boyalı mikroskobik alanlar ve kantitatif insert seviyesi hücre sayımları gösterilmiştir. 8-µm gözenek boyutuna sahip Transwell insertleri kullanılmıştır. Her insert için beş mikroskobik alanın ortalaması alınmış ve her insert bir deneysel birim olarak kabul edilmiştir. Veriler üç bağımsız biyolojik deneyden elde edilen ortalama ± SD olarak sunulmuş ve iki yönlü eşleştirilmemiş Student t-testleri kullanılarak analiz edilmiştir. Ölçek çubukları, 200 µm. Kesin p-değerleri ilgili panellerde verilmiştir. LV-NC, negatif kontrol lentivirüs; SD, standart sapma. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Gen | Primer dizileri | Amplikon uzunlukları | Amplifikasyon verimlilikleri | |
| WNT5B | İleri: 5'-AAATGCCACGGCGTCTCG-3', | 118 bp | 101% | |
| Ters: 5'-GGGTGAAGCGGCTGTTGA-3' | ||||
| DVL1 | İleri: 5'-GAGGGTGCTCACTCGGATG-3', | 158 bp | 95.60% | |
| Ters: 5'-GTGCCTGTCTCGTTGTCCA-3' | ||||
| CTNNB1 | İleri: 5'- GCGCCATTTTAAGCCTCTCG -3', | 140 bp | 96.30% | |
| Ters: 5'-AAATACCCTCAGGGGAACAGG-3' | ||||
| BCL2 | İleri: 5'- GTCATGTGTGTGGAGAGCGT-3', | 139 bp | 97.20% | |
| Ters: 5'-ATAGTTCCACAAAGGCATCC-3' | ||||
| GAPDH | İleri: 5'-GACTTCAACAGCAACTCCCACTC-3', | 107 bp | 98.30% | |
| Ters: 5'-TAGCCGTATTCATTGTCATACCAG-3' | ||||
Tablo 1: RT-qPCR için kullanılan primer dizileri.
| Hedef | Tahmin bilgileri | Lütfen çevirilecek kaynak metni sağlayın. | ||
| DVL1 | 7mer-m8, 468–474. pozisyonlar | TargetScan URL (https://www.targetscan.org/cgi-bin/targetscan/vert_80/view_gene.cgi? rs=ENST00000397196.2&taxid=9606&üyeler=miR-486-3p&cnc'yi göster=1& gösterilenc=1&shownc_nc=1&showncf1=1&showncf2=1&subset=1) | ||
| WNT5B | 8mer, 913–920. pozisyonlar | TargetScan URL (https://www.targetscan.org/cgi-bin/targetscan/vert_80/view_gene.cgi? rs=ENST00000378891.5&taxid=9606&üyeler=miR-486-3p&showcnc=1& gösterilen_c=1&shownc_nc=1&showncf1=1&showncf2=1&subset=1) | ||
Tablo 2: TargetScan veritabanı ve ilgili URL.
Ek Dosya 1: Bu çalışmanın bulgularını destekleyen veriler.Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Tartışma
Bu fonksiyon kazanım çalışması, A549 ve H358 akciğer adenokarsinom (LUAD) hücrelerinde stabil, zorlanmış miR-486-3p ekspresyonunun etkilerini değerlendirmiştir. Her iki modelde de, miR-486-3p aşırı ekspresyonu; büyüme ile ilişkili CCK-8 sinyallerinde azalma, azalmış klonojenik büyüme, daha düşük yara kapanma oranı ve Matrigel kaplı Transwell membranlarından geçen daha az hücre ile ilişkilendirilmiştir. Bu fenotipik değişikliklere, WNT5B, DVL1, CTNNB1 ve BCL2 transkript seviyelerindeki düşüşle birlikte WNT5B, DVL1, toplam β-catenin ve BCL-2 protein bolluğundaki azalma eşlik etmiştir. Topluca, bu bulgular zorlanmış miR-486-3p ekspresyonu, çeşitli malign hücre fenotiplerinin azalması ve seçili Wnt-ilişkili moleküllerdeki koordineli değişiklikler arasındaki bir ilişkiyi desteklemektedir. Ancak, bu bulgular doğrudan miRNA-hedef bağlanmasını, yolak aktivitesini veya nedensel bir sinyalizasyon dizisini kanıtlamamaktadır.
Bu çalışmada gözlemlenen genel tümör baskılayıcı fenotip, önceki raporlarla tutarlıdır ve temel yeni bulgu olarak yorumlanmamalıdır. Tomioka ve ark., daha önce hem miR-486-3p hem de miR-486-5p'nin LUAD hücrelerinde malign fenotipleri baskıladığını göstermiş ve tarafsız bir hedef tarama stratejisi aracılığıyla GINS4'ü tanımlamışlardır26. Mevcut çalışmanın katkısı daha spesifiktir: zorlanmış miR-486-3p ekspresyonuna, iki LUAD hücre modelinde WNT5B, DVL1 ve β-catenin bolluğundaki azalmalar eşlik etmiştir. Ayrıca çalışma; stabil lentiviral transdüksiyon, RT-qPCR, Western blotting, CCK-8 analizi, koloni oluşumu, yara kapanması ve Matrigel kaplı Transwell analizlerini birleştiren entegre bir deneysel iş akışı sunmaktadır. Bu ayrım önemlidir, çünkü mevcut çalışma, miR-486-3p'nin LUAD'daki antitümör aktivitesinin ilk gösterimi olduğunu iddia etmeksizin, miR-486-3p aşırı ekspresyonu ile ilişkili moleküler gözlemleri genişletmektedir.
Wnt ile ilgili bulguların dikkatli bir şekilde yorumlanması gerekmektedir. WNT5B genellikle nonkanonik bir Wnt ligandı olarak tanımlanır ve reseptöre ve bağlama bağlı bir şekilde düzlemsel hücre polaritesi (planar-cell-polarity) veya Wnt/Ca2⁺ sinyal yolunu aktive edebilir. Bazı hücresel ortamlarda, nonkanonik Wnt sinyallemesi aynı zamanda β-katenin bağımlı sinyallemeyi antagonize edebilir10,11. DVL1, hem kanonik hem de nonkanonik Wnt sinyallemesine katılabilen ortak bir hücre içi aracıdır ve küçük hücreli dışı akciğer kanserinde β-katenin ile ilişkili fenotiplerle ilişkilendirilmiştir12. Bu nedenle, WNT5B, DVL1 ve toplam β-kateninin eş zamanlı azalması, lineer bir WNT5B→DVL1→β-katenin yolak durumunu kanıtlamamaktadır. Mevcut veriler bunun yerine, zorlanmış miR-486-3p ekspresyonu sonrası WNT5B ekspresyonunda ve DVL1 ile β-katenin miktarında eş zamanlı azalmalar olduğunu göstermektedir.
Transkript düzeyindeki sonuçlar, Western blot bulgularıyla yönsel olarak tutarlılık göstermiştir. Zorunlu miR-486-3p ekspresyonu, hem A549 hem de H358 hücrelerinde WNT5B, DVL1 ve CTNNB1 transkript bolluğunu azaltmıştır. Bu uyum, gözlemlenen protein değişimlerinin yalnızca protein stabilitesindeki değişikliklerden kaynaklanmak yerine, değişen transkript bolluğu ile birlikte gerçekleşmiş olabileceğini düşündürmektedir. Bununla birlikte, azalan transkript ve protein seviyeleri, miR-486-3p'nin öngörülen 3′ çevrilmeyen bölgelere doğrudan bağlandığını kanıtlamaz. WNT5B veya DVL1'in miR-486-3p tarafından doğrudan düzenlenip düzenlenmediğini belirlemek için, yabanıl tip ve mutant bağlanma bölgelerinin kullanıldığı çift lüsiferaz raporlayıcı analizleri ile kurtarma deneylerinin yapılması gerekecektir. Benzer şekilde, BCL-2 bolluğundaki azalma, sağkalım ile ilişkili bir proteinde değişim olduğunu göstermekte ancak doğrulanmış hücre ölümü analizleri olmadan, artmış apoptozun kanıtı olarak yorumlanamaz.
Fonksiyonel analizlerin de analize özgü kısıtlamaları vardır. CCK-8, hücre sayısını doğrudan belirlemek yerine hücresel metabolik aktiviteyi ölçer ve absorbans değerlerindeki değişiklikler proliferasyon, metabolizma veya canlılıktaki değişimleri yansıtabilir. Koloni oluşumu, klonojenik kapasiteye dair daha uzun vadeli bir ölçüm sağlar, ancak etkinin büyüklüğü iki hücre hattı arasında farklılık göstermiş; A549 hücrelerinde hafif bir azalma, H358 hücrelerinde ise daha büyük bir azalma görülmüştür. Bu fark, zorlanmış miR-486-3p ekspresyonuna verilen yanıtın moleküler ve hücresel bağlama bağlı olabileceğini göstermektedir.
Her iki hücre hattında da azalmış yara kapanması gözlemlenmiştir, ancak analiz sırasında herhangi bir proliferasyon inhibitörü kullanılmamıştır. Zorlanmış miR-486-3p ekspresyonu büyüme ile ilişkili ölçümleri de etkilediği için, azalmış proliferasyon yara kapanması fenotipine katkıda bulunmuş olabilir. Bu nedenle bulgular, migrasyona özgü bir etkiden ziyade azalmış yara kapanması olarak yorumlanmalıdır. Benzer şekilde, 48 saatlik Matrigel kaplı Transwell analizi; membran geçişi, proliferasyon, sağkalım veya adezyon farklarından etkilenmiş olabilir. Sonuç olarak, alt membran yüzeyindeki hücrelerde gözlenen azalma, test edilen koşullar altında bozulmuş geçişi desteklemekte ancak spesifik bir invazyon mekanizmasını tek başına belirlememektedir.
Ek bir değerlendirme konusu, miR-486-3p aşırı ekspresyonunun büyüklüğüdür. Lentiviral transdüksiyon, miR-486-3p bolluğunu A549 hücrelerinde yaklaşık 1.470 kat, H358 hücrelerinde ise karşılık gelen kontrol gruplarına kıyasla 220 kat artırmıştır. Bu tür suprafizyolojik ekspresyon, tohum dizisine bağlı hedef dışı baskılanmayı artırabilir, RNA-indüklenmiş susturma kompleksinin bileşenlerinin mevcudiyetini etkileyebilir veya spesifik olmayan hücresel stresle tetiklenebilir. Herhangi bir doz-yanıt serisi gerçekleştirilmediği için, miR-486-3p bolluğu ile gözlemlenen fenotipler arasındaki ilişki tanımlanamamıştır. Ayrıca, inhibitör tabanlı bir fonksiyon kaybı deneyinin eksikliği, LUAD hücrelerinde miR-486-3p'nin endojen fizyolojik rolüne ilişkin sonuçlar çıkarılmasını engellemektedir. Bu nedenle, mevcut sonuçlar spesifik olarak stabil zorlanmış aşırı ekspresyonun sonuçları olarak yorumlanmalıdır.
Bazı kısıtlamalar göz önünde bulundurulmalıdır. Sadece iki KRAS-mutant LUAD hücre hattı incelenmiş olup, farklı rutin besiyerlerinin kullanımı, Beas-2b hücreleri ile yapılan karşılaştırmaların yorumlanmasını sınırlamaktadır. Çalışma sırasında hücre hattı doğrulaması ve mikoplazma testi yapılmamış ve miR-486-3p kantifikasyonu için tek referans olarak U6 kullanılmıştır. Ayrıca çalışma; fonksiyon kaybı, doz-yanıt, raporlayıcı, kurtarma ve fonksiyonel Wnt yolu analizlarından yoksundur. Dahası, yara kapanma ve Transwell sonuçları proliferasyon, viabilite veya adezyondaki farklılıklardan etkilenmiş olabilir. Son olarak, herhangi bir hayvan modeli, hasta örneği veya klinik doğrulama kohortu dahil edilmemiştir. Bu nedenle, bulgular bu zorunlu ekspresyonlu in vitro sistemle sınırlıdır ve doğrudan hedefleme, yol nedenselliği veya klinik fayda oluşturmamaktadır.
Sonuç olarak, stabil zorlanmış miR-486-3p ekspresyonu, A549 ve H358 LUAD hücrelerinde büyüme ve hareketlilikle ilişkili çeşitli ölçümleri azaltmış ve buna daha düşük WNT5B, DVL1, toplam β-catenin ve BCL-2 ekspresyonu eşlik etmiştir. Bu bulgular daha ileri mekanistik araştırmalar için bir temel oluşturmaktadır, ancak WNT5B veya DVL1'in doğrudan hedefler olduğunu, doğrusal bir WNT5B/DVL1/β-catenin yolağını veya miR-486-3p'nin klinik değerini kanıtlamamaktadır.
Açıklamalar
Yazarların beyan edilecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.
Teşekkürler
Bu çalışma, Zhejiang Eyaleti Tıbbi ve Sağlık Bilimi ve Teknolojisi Planı (2025KY349) ve Jiaxing Şehri Kilit Destekleyici Disiplin (2023-zc-014) tarafından finansal olarak desteklenmiştir.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 1 M Tris-HCl (pH 6.8) | Solarbio | T1020 | SDS-PAGE istifleme jelinin hazırlanması |
| 1,5 M Tris-HCl (pH 8,8) | Solarbio | T1010 | SDS-PAGE ayırıcı jelinin hazırlanması |
| 20× TBS tamponu | Solarbio | 71080 | Western blot yıkama ve antikor seyreltme için stok tamponu |
| %30 akrilamid/bis-akrilamid çözeltisi (29:1) | Solarbio | A1010 | SDS-PAGE jellerinin hazırlanması |
| %4 paraformaldehit fiksatif | Servicebio | G1101 | Koloni oluşumu ve Transwell analizleri için fiksasyon |
| 5× protein yükleme tamponu | Beyotime | P0015 | SDS-PAGE için protein örneği hazırlama |
| Amonyum persülfat | Solarbio | 427A038 | SDS-PAGE jeli polimerizasyon başlatıcısı |
| BCA Protein Analiz Kiti | Beyotime | P0009-1 | Protein konsantrasyonu tayini |
| BCL-2 antikoru | Boster Biological Technology | A00040-2 | Tavşan poliklonal antikor; western blotting 1:5.000 |
| Hücre Sayım Kiti-8 (CCK-8) | TargetMol | C0005 | Hücre büyümesiyle ilişkili metabolik aktivite analizi; 100 μL kültür ortamı başına 10 μL |
| Kemilüminesans görüntüleme sistemi | Bio-Rad | ChemiDoc MP | Western blot görüntüleme |
| Kloroform | Servicebio | G3005 | TRIzol bazlı RNA ekstraksiyonu sırasında faz ayrımı |
| Kristal viyole boyama çözeltisi | Servicebio | G1014 | Koloni ve Transwell membran boyama |
| DMEM | Servicebio | G4511 | Beas-2b hücreleri için rutin kültür ortamı |
| DVL1 antikoru | Signalway Antibody | 53180 | Tavşan primer antikor; western blotting 1:5.000 |
| Fetal bovine serum (FBS) | Biosharp | BL203B | Rutin hücre kültürü için %10 (v/v) takviye; Transwell alt bölmesinde %20 (v/v) |
| GraphPad Prism 8 | GraphPad Software | Version 8 | Grafik hazırlama ve istatistiksel analiz |
| Hieff qPCR SYBR Green Master Mix (No Rox) | Yeasen Biotechnology | 11201ES08 | SYBR Green bazlı kantitatif PCR |
| Hifair III 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR (gDNA digester plus) | Yeasen Biotechnology | 11141ES60 | mRNA RT-qPCR için ters transkripsiyon |
| IBM SPSS Statistics | IBM | Version 22.0 | İstatistiksel analiz |
| ImageJ | National Institutes of Health | Version 1.53 | Western blot densitometrisi, yara alanı ölçümü, koloni sayımı ve Transwell hücre sayımı |
| İnverted mikroskop | Olympus | CKX53 | Yara iyileşmesi ve Transwell analizlerinin görüntülenmesi |
| İzopropanol | Servicebio | G3006 | TRIzol bazlı ekstraksiyon sırasında RNA presipitasyonu |
| LV-miR-486-3p ve LV-NC lentiviral preparatları | GenePharma | Özel sentez | Stabil miR-486-3p aşırı ekspresyon vektörü ve scramble negatif kontrol vektörü |
| Matrigel bazal membran matriksi | Corning | 354234 | Serumsuz DMEM içinde 1:8 oranında seyreltilmiş; yaklaşık 1 mg/mL final protein konsantrasyonu |
| Metanol | Xilong Scientific | GB/T 683-2006 | PVDF membran aktivasyonu |
| Mikroplaka okuyucu | BioTek | ELx800 | 450 nm'de absorbans ölçümü |
| Mikrovolümlü UV-Vis spektrofotometre | Allsheng | Nano-600 | RNA konsantrasyonu ve A260/A280 saflık değerlendirmesi |
| Penisilin-streptomisin | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 15240062 | Rutin hücre kültürü için %1 (v/v) takviye |
| Fosfat tamponlu salin (PBS) | Servicebio | G0002 | Hücre ve membran yıkama |
| Proteaz İnhibitör Kokteyli | APExBIO | K1007 | RIPA liz tamponuna eklendi |
| Protein merdiveni | Biosharp | BL712A | Western blotting için moleküler ağırlık referansı |
| PVDF membran | Millipore | K2MA8350E | Western blotting için protein transfer membranı |
| QuantStudio 5 Real-Time PCR Sistemi | Thermo Fisher Scientific | QuantStudio 5 | RT-qPCR veri toplama |
| RIPA liz tamponu | Beyotime | P0013B | Toplam hücresel protein ekstraksiyonu |
| RNA ekstraksiyon reajeni (TRIzol tipi) | Servicebio | G3013 | Toplam RNA ekstraksiyonu |
| RPMI 1640 ortamı | Servicebio | G4510 | A549 ve H358 hücreleri için rutin kültür ortamı ve serumsuz Transwell hücre süspansiyonu |
| SDS | Solarbio | S8010 | SDS-PAGE reajeni |
| Yağsız süt tozu | BD | 2271470 | Western blotting için %5 bloklama çözeltisi |
| StarBase v3.0 | Sun Yat-sen University | https://rnasysu.com/encori/ | TCGA kaynaklı miR-486-3p ekspresyon analizi |
| TargetScanHuman | Whitehead Institute for Biomedical Research | https://www.targetscan.org/vert_80/ | Aday miR-486-3p bağlanma bölgelerinin tahmini |
| TEMED | Sigma-Aldrich | T8090 | SDS-PAGE jeli polimerizasyon katalizörü |
| Transwell insertleri, 24 kuyucuklu, 8 μm gözenek boyutu | Corning | 3428 | Matrigel kaplı membran geçiş analizi |
| Tripsin | Servicebio | G4000 | Hücre ayırma |
| Tween-20 | Solarbio | 815A043 | Western blot yıkama tamponunun hazırlanması |
| Dikey elektroforez sistemi | Liuyi Biotechnology | DYCZ-24DN | SDS-PAGE protein ayırımı |
| Western HRP substrat luminol reajeni | Affinity Biosciences | KF001 | Kemilüminesan western blot deteksiyonu |
| Islak transfer sistemi | Bio-Rad | 1703930 | Proteinin PVDF membranına transferi |
| WNT5B antikoru | Signalway Antibody | 56808 | Tavşan primer antikor; western blotting 1:5.000 |
| β-actin antikoru | Abcam | ab8227 | Yükleme kontrolü; western blotting 1:5.000 |
| β-catenin antikoru | Signalway Antibody | 21725 | Tavşan primer antikor; western blotting 1:5.000 |
Kaynaklar
- Herbst RS, Heymach JV, Lippman SM. Lung cancer. N Engl J Med. 2008;359(13):1367-1380.
- Siegel RL, Miller KD, Jemal A. Cancer statistics, 2019. CA Cancer J Clin. 2019;69(1):7-34.
- Han B, et al. Cancer incidence and mortality in China, 2022. J Natl Cancer Cent. 2024;4(1):47-53.
- Lin JJ, et al. Five-year survival in EGFR-mutant metastatic lung adenocarcinoma treated with EGFR-TKIs. J Thorac Oncol. 2016;11(4):556-565.
- She J, Yang P, Hong Q, Bai C. Lung cancer in China: challenges and interventions. Chest. 2013;143(4):1117-1126.
- Barker N, Clevers H. Mining the Wnt pathway for cancer therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 2006;5(12):997-1014.
- Komiya Y, Habas R. Wnt signal transduction pathways. Organogenesis. 2008;4(2):68-75.
- Stewart DJ. Wnt signaling pathway in non-small cell lung cancer. J Natl Cancer Inst. 2014;106(1):djt356.
- Zhang Z, et al. Wnt/β-catenin signaling in the development and therapeutic resistance of non-small cell lung cancer. J Transl Med. 2024;22(1):565.
- Zhang Q, et al. WNT5B exerts oncogenic effects and is negatively regulated by miR-5587-3p in lung adenocarcinoma progression. Oncogene. 2020;39(7):1484-1497.
- Suthon S, et al. WNT5B in physiology and disease. Front Cell Dev Biol. 2021;9:667581.
- Ji H, et al. SPATA2 suppresses epithelial-mesenchymal transition to inhibit metastasis and radiotherapy sensitivity in non-small cell lung cancer via. impairing DVL1/β-catenin signaling. Thorac Cancer. 2023;14(11):969-982.
- Wang Y, Wang L, Chen C, Chu X. New insights into the regulatory role of microRNA in tumor angiogenesis and clinical implications. Mol Cancer. 2018;17(1):22.
- Iqbal MA, Arora S, Prakasam G, Calin GA, Syed MA. MicroRNA in lung cancer: role, mechanisms, pathways and therapeutic relevance. Mol Aspects Med. 2019;70:3-20.
- Lee YS, Dutta A. MicroRNAs in cancer. Annu Rev Pathol. 2009;4:199-227.
- Lin G, et al. MiR-26a enhances invasive capacity by suppressing GSK3β in human lung cancer cells. Exp Cell Res. 2017;352(2):364-374.
- Jiang W, et al. MicroRNA-1258 suppresses tumor progression via. GRB2/Ras/Erk pathway in non-small-cell lung cancer. Cell Prolif. 2018;51(6):e12502.
- Xie Y, Xue C, Guo S, Yang L. MicroRNA-520a suppresses pathogenesis and progression of non-small-cell lung cancer through targeting the RRM2/Wnt axis. Anal Cell Pathol (Amst). 2021;2021:9652420.
- Peng Y, Zhang X, Feng X, Fan X, Jin Z. The crosstalk between microRNAs and the Wnt/β-catenin signaling pathway in cancer. Oncotarget. 2017;8(8):14089-14106.
- Wang X, et al. MiR-214 inhibits cell growth in hepatocellular carcinoma through suppression of β-catenin. Biochem Biophys Res Commun. 2012;428(4):525-531.
- Lulli V, et al. MicroRNA-486-3p regulates γ-globin expression in human erythroid cells by directly modulating BCL11A. PLoS One. 2013;8(4):e60436.
- Chou ST, et al. MicroRNA-486-3p functions as a tumor suppressor in oral cancer by targeting DDR1. J Exp Clin Cancer Res. 2019;38(1):281.
- Wu H, et al. Overexpression of miR-486-3p promoted by allicin enhances temozolomide sensitivity in glioblastoma via. targeting MGMT. Neuromolecular Med. 2020;22(3):359-369.
- Garajei A, et al. Evaluation of the expression of miR-486-3p, miR-548-3p, miR-561-5p and miR-509-5p in tumor biopsies of patients with oral squamous cell carcinoma. Pathogens. 2022;11(2):211.
- Li X, et al. MicroRNA-486-3p promotes the proliferation and metastasis of cutaneous squamous cell carcinoma by suppressing flotillin-2. J Dermatol Sci. 2022;105(1):18-26.
- Tomioka Y, et al. The molecular pathogenesis of tumor-suppressive miR-486-5p and miR-486-3p target genes: GINS4 facilitates aggressiveness in lung adenocarcinoma. Cancers (Basel). 2023;15(13):3408.