miR-486-3p, Akciğer Adenokarsinom Hücrelerinde Malign Fenotipleri Baskılar ve Azalmış WNT5B, DVL1 ve β-catenin Ekspresyonu ile İlişkilidir

Wanli Cheng; Weibo Qi; Niu Niu; Junjie Zhao

doi:10.3791/71545

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Araştırma makalesi

miR-486-3p, Akciğer Adenokarsinom Hücrelerinde Malign Fenotipleri Baskılar ve Azalmış WNT5B, DVL1 ve β-catenin Ekspresyonu ile İlişkilidir

44 görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/71545

⸱

21 Ağustos 2026

Wanli Cheng^*¹ , Weibo Qi^*¹ , Niu Niu¹ , Junjie Zhao¹

¹Department of Thoracic Surgery, The First Hospital of Jiaxing

^* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Zorlanmış miR-486-3p aşırı ekspresyonu; A549 ve H358 akciğer adenokarsinom hücrelerinde proliferasyonla ilişkili aktiviteyi, klonojenik büyümeyi, yara kapanmasını ve Matrigel geçişini baskılar. Bu etkiler; WNT5B, DVL1, β-catenin ve BCL-2 ekspresyonundaki azalma ile birlikte görülmekte olup, doğrudan hedefleme veya yolak nedenselliği kanıtlanmaksızın Wnt ile ilgili değişikliklerle in vitro bir ilişkiye işaret etmektedir.

Özet

Akciğer adenokarsinomu (LUAD), küçük hücreli dışı akciğer kanserinin baskın histolojik alt tipidir ve önemli morbidite ve mortalite ile ilişkisi devam etmektedir. Önceki çalışmalar, LUAD'da miR-486-3p'nin tümör baskılayıcı işlevlerini tanımlamıştır, ancak WNT5B, DVL1 ve β-katenin ile ilişkili ekspresyon değişiklikleri ile olan ilişkisi net olarak tanımlanmamıştır. Burada, bazal miR-486-3p bolluğu A549 ve H358 LUAD hücrelerinde incelenmiş ve kendi rutin koşulları altında tutulan Beas-2b bronşiyal epitel hücrelerindekilerle karşılaştırılmıştır. Lentiviral transdüksiyon ile stabil miR-486-3p aşırı ekspresyon modelleri oluşturulmuştur. Hücre büyümesiyle ilişkili aktivite, klonojenik büyüme, yara kapanması ve Matrigel kaplı membranların geçişi; Cell Counting Kit-8, koloni oluşumu, yara iyileşmesi ve Transwell analizleri kullanılarak değerlendirilmiştir. WNT5B, DVL1, β-katenin ve BCL-2 protein bolluğu Western blotting ile belirlenmiş ve ek olarak WNT5B, DVL1, CTNNB1 ve BCL2 mRNA seviyeleri RT-qPCR ile incelenmiştir. Kullanılan kültür koşulları altında, miR-486-3p bolluğu A549 ve H358 hücrelerinde Beas-2b hücrelerine göre daha düşük çıkmış ve lentiviral transdüksiyon her iki LUAD hücre hattında stabil aşırı ekspresyon sağlamıştır. Zorlanmış miR-486-3p aşırı ekspresyonu; CCK-8 sinyalini, koloni oluşumunu, yara kapanmasını ve Matrigel kaplı membran geçişini azaltmış ve düşük WNT5B, DVL1, toplam β-katenin ve BCL-2 protein bolluğu ile beraber seyretmiştir. RT-qPCR, miR-486-3p aşırı ekspresyonundan sonra her iki LUAD hücre hattında daha düşük WNT5B, DVL1, CTNNB1 ve BCL2 transkript bolluğu olduğunu göstermiştir. Bu bulgular, zorlanmış miR-486-3p ekspresyonu, çeşitli malign hücre çıktıların azalması ve değişmiş Wnt-ilişkili ekspresyon arasında in vitro bir ilişkiyi desteklemektedir; ancak bunlar doğrudan miRNA-hedef bağlanmasını, yolak aktivitesini veya nedensel lineer bir sinyalizasyon mekanizmasını kanıtlamamaktadır.

Giriş

Akciğer adenokarsinomu (LUAD), küçük hücreli dışı akciğer kanserinin (NSCLC) en yaygın histolojik alt tipidir ve dünya çapında akciğer kanserine bağlı morbidite ve mortaliteye önemli ölçüde katkıda bulunur¹^,²^,³^,⁴^,⁵. Moleküler sınıflandırma ve hedefe yönelik tedaviler, seçili hasta grupları için sonuçları iyileştirmiştir ancak ileri evre LUAD'nin tedavisi halen zordur ve biyolojik olarak heterojendir¹^,²^,³^,⁴^,⁵. Bu nedenle, malign hücre davranışına katkıda bulunan düzenleyici süreçlerin tanımlanması, test edilebilir terapötik hipotezlerin geliştirilmesi açısından önemini korumaktadır.

Wnt sinyali, proliferasyon, sağkalım, polarite ve motiliteyi düzenleyen β-catenin bağımlı ve β-catenin bağımsız kollardan oluşur⁶^,⁷^,⁸^,⁹. Biyolojik etkileri reseptöre ve hücresel bağlama göre değişse de, WNT5B çoğunlukla non-kanonik sinyalleme ile ilişkilendirilir¹⁰^,¹¹. DVL1, birkaç Wnt kolu tarafından paylaşılan sitoplazmik bir sinyal iletim proteinidir ve akciğer kanserinde β-catenin ile ilişkili davranışlarla bağlantılı bulunmuştur¹². Buna göre, WNT5B, DVL1 ve β-catenin'deki eş zamanlı değişiklikler, kendi başlarına tek bir doğrusal yolak için kanıt olarak yorumlanmamalıdır.

MikroRNA'lar (miRNA'lar), hedef transkriptlerle sekansa bağımlı etkileşimler yoluyla gen ekspresyonunu düzenleyen kısa kodlamayan RNA'lardır¹³^,¹⁴^,¹⁵. Tek bir miRNA birden fazla RNA'yı etkileyebildiğinden, değişen miRNA bolluğu çeşitli tümörle ilişkili fenotipleri etkileyebilir¹³^,¹⁴^,¹⁵^,¹⁶^,¹⁷^,¹⁸. Çeşitli miRNA'ların akciğer kanseri büyümesi, motilitesi ve sinyal iletimi ile ilişkili olduğu saptanmış olup, miRNA'lar ile Wnt ile ilişkili ağlar arasındaki karşılıklı etkileşim birçok kanser bağlamında tanımlanmıştır¹⁶^,¹⁷^,¹⁸^,¹⁹^,²⁰.

MIR486 lokusu, olgun miR-486-3p ve miR-486-5p zincirlerini oluşturur. miR-486-3p'nin oral kanser ve glioblastomada tümör baskılayıcı aktivite gösterdiği, buna karşın kutanöz skuamöz hücreli karsinomda tümör destekleyici bir etkisinin olduğu bildirilmiştir²¹^,²²^,²³^,²⁴^,²⁵. miR-486-3p, halka açık LUAD verilerindeki düşük bolluğu, LUAD'da daha önce raporlanmış tümör baskılayıcı aktivitesi ve onu WNT ile ilişkili aday transkriptlere bağlayan biyoinformatik öngörüler temelinde, hipotez odaklı bir strateji aracılığıyla mevcut çalışma için seçilmiştir. Tomioka ve ark., LUAD'da her iki miR-486 zincirinin de tümör baskılayıcı etkilerini göstermiş ve genom çapında hedef taraması yoluyla GINS4'ü tanımlamıştır²⁶. Bu nedenle, mevcut çalışma bir antitümör fenotipin ilk gösterimi olduğunu iddia etmemektedir. Bunun yerine, zorlanmış miR-486-3p ekspresyonunun, WNT5B, DVL1 ve β-catenin bolluğundaki değişimler ve iki LUAD hücre hattında tekrarlanabilir fenotipik değişimlerle birlikte seyredip seyretmediğini değerlendirmektedir. Bu analizler ilişkileri değerlendirmekte olup; doğrudan hedeflemeyi, yolak aktivitesini veya doğrusal bir WNT5B/DVL1/β-catenin mekanizmasını kanıtlamamaktadır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Kullanılan reaktifler ve ekipmanlar Materyaller Tablosunda listelenmiştir.

Hücre kültürü

İnsan akciğer adenokarsinom (LUAD) hücre hatları A549 ve H358 ile ölümsüzleştirilmiş bronşiyal epitel hücre hattı Beas-2b kullanılmıştır. Farklı KRAS-mutant geçmişlerine sahip, yaygın olarak kullanılan LUAD modelleri olarak A549 (KRAS G12S) ve H358 (KRAS G12C; STK11-eksik) seçilmiş; Beas-2b ise malign olmayan bronşiyal epitel karşılaştırıcısı olarak dahil edilmiştir. A549 ve H358 hücreleri RPMI-1640 ortamında, Beas-2b hücreleri ise DMEM ortamında kültüre edilmiştir; her iki ortam da %10 fetal bovin serum ve %1 penisilin-streptomisin içermektedir. Hücreler, %5 CO₂ içeren nemlendirilmiş bir atmosferde 37 °C'de kültüre edilmiştir. Tümör ve epitel karşılaştırıcı hücre hatları farklı rutin ortamlarda tutulduğu için, hücre hatları arası bazal ekspresyon karşılaştırmaları ihtiyatla yorumlanmıştır.

Lentiviral transduksiyon ve stabil hücre seçimi

hsa-miR-486-3p öncülünü taşıyan lentiviral vektörler (LV-miR-486-3p) veya karma bir negatif kontrol dizisi (LV-NC), stabil fonksiyon kazanım tasarımı kapsamında kullanılmıştır. A549 ve H358 hücreleri, 6 kuyucuklu plakalara kuyucuk başına 5 × 10⁴ hücre olacak şekilde ekilmiş ve gece boyunca kültüre edilmiştir. Ertesi gün hücreler, 8 µg/mL polybrene varlığında 10 enfeksiyon çokluğu (MOI) ile lentivirüse maruz bırakılmıştır. 24 saat sonra, viral inokülum taze komple ortam ile değiştirilmiştir. Transdükte edilmiş hücreler, 2 µg/mL puromisin ile 7 gün boyunca seçilmiştir. Seçim işleminden sonra, hayatta kalan hücrelerin toparlanmasına izin verilmiş ve sonraki moleküler ve fonksiyonel analizler için hücreler çoğaltılmıştır. Mevcut çalışma özellikle stabil zorunlu aşırı ekspresyonun etkilerini değerlendirmek üzere tasarlandığı için herhangi bir miR-486-3p inhibitör kolu dahil edilmemiştir.

NOT: Hücre canlılığındaki tedaviyle ilgili farklılıkları en aza indirmek için MOI, polybrene maruziyet süresi ve puromisin seleksiyon koşulları LV-NC ve LV-miR-486-3p grupları arasında aynı tutulmalıdır.

RT-qPCR

miR-486-3p ekspresyon seviyelerini belirlemek ve A549 ile H358 hücrelerindeki lentiviral aşırı ekspresyonun etkinliğini doğrulamak için RT-qPCR gerçekleştirilmiştir. Toplam RNA, üretici talimatlarına uygun olarak TRIzol reajeni kullanılarak izole edilmiştir. RNA konsantrasyonu ve saflığı spektrofotometrik olarak değerlendirilmiş ve 1,8–2,1 arasındaki A260/A280 oranı kabul edilebilir olarak değerlendirilmiştir. mRNA analizi için, 1 µg toplam RNA, üretici protokolüne göre ticari bir cDNA sentez kiti kullanılarak cDNA'ya ters transkribe edilmiştir. mikroRNA analizi için ise cDNA sentezi, miRNA'ya özgü stem-loop ters transkripsiyon primeri kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Kantitatif PCR; 10 µL 2× SYBR Green Master Mix, her bir primerden 0,4 µM ve 2 µL cDNA kalıbı içeren toplam 20 µL reaksiyon hacminde yürütülmüştür. Amplifikasyon protokolü, 95 °C'de 5 dakika başlangıç denatürasyon adımını, ardından 95 °C'de 10 saniye denatürasyon ve 60 °C'de 30 saniye bağlanma/uzama şeklinde 40 döngüden oluşmuştur. Amplifikasyon spesifikliğini doğrulamak için ardından bir erime eğrisi analizi gerçekleştirilmiştir. miRNA kantifikasyonu için iç kontrol olarak U6 küçük nükleer RNA, mRNA normalizasyonu için ise referans gen olarak GAPDH kullanılmıştır. Göreceli ekspresyon seviyeleri 2^−ΔΔCq yöntemi kullanılarak belirlenmiştir.

miRNA primer dizileri şu şekildedir: stem-loop ters transkripsiyon primeri, 5′-GTCGTATCGACTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCAGTCGATACGAC
ATCCTG-3′; miR-486-3p ileri primer, 5′-CGCGGGGCAGCTCAGTA-3′; üniversal geri primer, 5′-ACTGCAGGGTCCGAGGTATT-3′; U6 ileri primer, 5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′ ve U6 geri primer, 5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′. WNT5B, DVL1, CTNNB1, BCL2 ve GAPDH için primer dizileri, amplikon uzunlukları ve amplifikasyon verimlilikleri ile birlikte Tablo 1'de verilmiştir. mRNA ekspresyonu GAPDH'ye göre normalize edilirken, miR-486-3p ekspresyonu U6'ya göre normalize edilmiştir. Her deney, biyolojik replika başına üç teknik replika olacak şekilde üç bağımsız biyolojik replika içermiştir.

Western blotting

7 günlük puromisin seçimi ve bir toparlanma süresinin tamamlanmasının ardından hücreler, proteaz inhibitörleri içeren RIPA tamponu ile lizlendi. Protein konsantrasyonları BCA protein analizi kullanılarak belirlendi. Eşit miktardaki proteinler (hat başına 20 µg), %10'luk SDS-PAGE jellerinde ayrıştırıldı ve 300 mA'de 120 dk boyunca ıslak transfer yöntemiyle PVDF membranlara aktarıldı. Membranlar, %0,1 Tween-20 içeren Tris-tamponlu salin (TBST) ile hazırlanan %5'lik yağsız süt ile oda sıcaklığında 1 saat boyunca bloke edildi. Membranlar; WNT5B (1:1.000), DVL1 (1:1.000), β-catenin (1:1.000), BCL-2 (0,5 µg/mL) veya β-actin (1:5.000) karşıtı primer antikorlarla 4 °C'de gece boyunca inkübe edildi. Tüm antikorların üreticileri ve katalog numaraları Materyaller Tablosunda verilmiştir. TBST ile yapılan üç adet 10 dakikalık yıkamanın ardından membranlar, 1:5.000 oranında seyreltilmiş HRP-konjuge keçi anti-tavşan IgG sekonder antikoru ile oda sıcaklığında 1 saat boyunca inkübe edildi. Membranlar daha sonra üç kez TBST ile yıkandı ve protein bantları kemilüminesans bir substrat kullanılarak görselleştirildi ve bir jel dokümantasyon ve görüntüleme sistemi ile görüntülendi. Bant yoğunlukları ImageJ kullanılarak nicelleştirildi. Her bir hedef proteinin bolluğu, aynı biyolojik örnekten elde edilen ilgili β-actin sinyaline normalize edildi. Densitometrik analiz için yalnızca lineer, doygun olmayan deteksiyon aralığındaki pozlamalar kullanıldı. Üç bağımsız biyolojik deney gerçekleştirildi.

Hücre Sayım Kiti-8 analizi

LV-NC veya LV-miR-486-3p ile stabil olarak transduce edilmiş A549 ve H358 hücreleri, 96 kuyucuklu plakalara 100 µL tam besiyeri içinde her kuyucuğa 1.5 × 10⁴ hücre olacak şekilde ekildi. Gece boyu yapışmanın ardından besiyeri değiştirildi ve Cell Counting Kit-8 reaktifi eklendikten hemen sonra 0. saat absorbansı ölçüldü. 0 sa, 24 sa, 48 sa, 72 sa ve 96. saatlerde, her kuyucuğa 10 µL reaktif eklendi ve 450 nm'de absorbans okunmadan önce 37 °C'de 1 sa inkübe edildi. Revize edilmiş zaman seyri analizi için, grafik çizilmeden önce her grup kendi 0. saat değerine göre normalize edildi. Üç bağımsız biyolojik deney gerçekleştirildi ve istatistiksel analizden önce her deneydeki teknik kuyucukların ortalaması alındı.

Koloni oluşum deneyi

Stabil olarak seçilmiş A549 ve H358 hücreleri, 5 × 10² hücre/mL konsantrasyonunda tek hücre süspansiyonları şeklinde hazırlandı. 6 kuyucuklu bir plakadaki her bir kuyucuğa bir mililitre hücre süspansiyonu eklendi ve ardından 3 mL komple besiyeri ilave edildi. Hücreler, her 5 günde bir besiyeri değişimi yapılarak 14 gün boyunca kültüre edildi. Koloniler PBS ile yıkandı, %4 paraformaldehit ile 20 dk fikse edildi, 20 dk kristal viyole ile boyandı, yıkandı ve havada kurutuldu. En az 50 hücre içeren koloniler ImageJ'de sayıldı. Üç bağımsız biyolojik deney gerçekleştirildi.

NOT: Hücrelerin yapay olarak kümelenmesini önlemek için, homojen bir tek hücre süspansiyonu ve koloni oluşumu sırasında plakanın minimum düzeyde sarsılması gereklidir.

Hücre göçü deneyi

Stabil olarak transduce edilmiş A549 ve H358 hücreleri 6 kuyucuklu plakalara ekilmiş ve konfluent bir monolayer oluşana kadar kültüre edilmişlerdir. Steril bir 10 µL pipet ucuyla düz bir çizik oluşturulmuş, ayrılan hücreler uzaklaştırılmış ve aynı işaretli alanlar 0 h, 24 h, 48 h ve 72 h sürelerinde görüntülenmiştir. Yara alanı ImageJ'de ölçülmüş ve yara kapanması (0 h'deki alan − belirtilen zaman noktasındaki alan) / 0 h'deki alan × 100% olarak hesaplanmıştır. Üç bağımsız biyolojik deney gerçekleştirilmiştir. Herhangi bir farmakolojik proliferasyon blokörü kullanılmamıştır; bu nedenle, bu analiz migrasyona özgü bir sonuçtan ziyade yara kapanmasının bir ölçümü olarak yorumlanmıştır.

NOT: Çizikler tutarlı genişlik ve basınçla oluşturulmalı ve zaman seyri boyunca aynı alanlar takip edilmelidir.

Hücre invazyon testi

Transwell invazyon analizleri, 8 µm gözenek boyutuna sahip 24 kuyucuklu polikarbonat membran insertler kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Her insertin üst yüzeyi, serumsuz DMEM ile 1:8 oranında seyreltilerek yaklaşık 1 mg/mL nihai protein konsantrasyonuna getirilen 100 µL Matrigel bazal membran matrisi ile kaplanmış ve 37 °C'de 4 s boyunca inkübe edilmiştir. A549 ve H358 hücreleri, sırasıyla 8 × 10⁵ hücre/mL ve 4 × 10⁵ hücre/mL yoğunluklarda serumsuz RPMI-1640 ortamında yeniden süspande edilmiştir. Üst bölmeye, insert başına 1,6 × 10⁵ A549 hücresine veya 8 × 10⁴ H358 hücresine karşılık gelen 200 µL hücre süspansiyonu eklenmiştir. Alt bölme, kemoatraktan olarak %20 fetal bovin serum içeren 500 µL RPMI-1640 ortamı ile doldurulmuştur. %5 CO₂ içeren nemlendirilmiş bir atmosferde 37 °C'de 48 s boyunca inkübasyonun ardından, membranın üst yüzeyinde kalan invaze olmamış hücreler bir pamuklu çubukla nazikçe uzaklaştırılmıştır. Membrandan geçerek invaze olan hücreler, %4 paraformaldehit ile 20 dk boyunca fikse edilmiş ve oda sıcaklığında %0,1 kristal viyole ile 20 dk boyunca boyanmıştır. Her insert için rastgele seçilen beş mikroskobik alan görüntülenmiş ve invaze olan hücre sayısı ImageJ kullanılarak nicelendirilmiştir. Beş alandan elde edilen ortalama hücre sayısı her bir insert için tek bir değer olarak kabul edilmiş ve bireysel bir mikroskobik alan yerine insert, deneysel birim olarak değerlendirilmiştir. Üç bağımsız biyolojik deney gerçekleştirilmiştir.

NOT: Membrana zarar vermemek veya alt yüzeye göç etmiş hücreleri yerinden oynatmamak için, istila etmeyen hücreleri nazikçe ve tutarlı bir şekilde uzaklaştırın.

İstatistiksel analiz

Aksi belirtilmedikçe veriler ortalama ± SD olarak sunulmuştur ve n bağımsız biyolojik deneyleri ifade eder. Teknik tekrarlar veya aynı deney biriminden alınan birden fazla mikroskobik alan, çıkarımsal testler öncesinde ortalamaları alınarak birleştirilmiştir. Üç hücre hattı karşılaştırması için tek yönlü varyans analizi ve ardından Tukey düzeltmeli ikili karşılaştırmalar kullanılmıştır. CCK-8 ve yara kapanma zaman seyirleri için tedavi, zaman ve tedavi-zaman etkileşimi etkilerini değerlendirmek amacıyla iki yönlü tekrarlanan ölçümler varyans analizi kullanılmış ve ardından münferit zaman noktalarında Šídák düzeltmeli karşılaştırmalar yapılmıştır. İki grup karşılaştırmaları, iki yönlü eşleşmemiş Student t-testleri kullanılarak analiz edilmiştir. İstatistiksel analizler ve veri görselleştirme işlemleri, istatistiksel analiz ve grafik yazılımları kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Kesin p-değerleri şekil panellerinde veya kaynak veri tablolarında raporlanmıştır. İstatistiksel anlamlılık p < 0.05 olarak tanımlanmıştır; *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001 ve ****p < 0.0001.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

TCGA/starBase analizi LUAD'da miR-486-3p bolluğunun azaldığını göstermekte ve TargetScan aday bağlanma bölgelerini belirlemektedir

starBase v3.0 aracılığıyla erişilen TCGA kaynaklı ekspresyon verileri, ... olduğunu göstermiştir miR-486-3p bolluk, 512 akciğer adenokarsinomu (LUAD) örneğinde 20 tümör dışı akciğer örneğine göre anlamlı derecede daha düşüktü (Wilcoxon sıra toplamı testi, p = 3.2 × 10⁻⁵; Şekil 1). TargetSca...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu fonksiyon kazanım çalışması, A549 ve H358 akciğer adenokarsinom (LUAD) hücrelerinde stabil, zorlanmış miR-486-3p ekspresyonunun etkilerini değerlendirmiştir. Her iki modelde de, miR-486-3p aşırı ekspresyonu; büyüme ile ilişkili CCK-8 sinyallerinde azalma, azalmış klonojenik büyüme, daha düşük yara kapanma oranı ve Matrigel kaplı Transwell membranlarından geçen daha az hücre ile ilişkilendirilmiştir. Bu fenotipik değişikliklere, WNT5B, DVL1, CTNNB1 ve BCL2 transkript seviyelerindeki ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların beyan edilecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışma, Zhejiang Eyaleti Tıbbi ve Sağlık Bilimi ve Teknolojisi Planı (2025KY349) ve Jiaxing Şehri Kilit Destekleyici Disiplin (2023-zc-014) tarafından finansal olarak desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
1 M Tris-HCl (pH 6.8)	Solarbio	T1020	SDS-PAGE istifleme jelinin hazırlanması
1,5 M Tris-HCl (pH 8,8)	Solarbio	T1010	SDS-PAGE ayırıcı jelinin hazırlanması
20× TBS tamponu	Solarbio	71080	Western blot yıkama ve antikor seyreltme için stok tamponu
%30 akrilamid/bis-akrilamid çözeltisi (29:1)	Solarbio	A1010	SDS-PAGE jellerinin hazırlanması
%4 paraformaldehit fiksatif	Servicebio	G1101	Koloni oluşumu ve Transwell analizleri için fiksasyon
5× protein yükleme tamponu	Beyotime	P0015	SDS-PAGE için protein örneği hazırlama
Amonyum persülfat	Solarbio	427A038	SDS-PAGE jeli polimerizasyon başlatıcısı
BCA Protein Analiz Kiti	Beyotime	P0009-1	Protein konsantrasyonu tayini
BCL-2 antikoru	Boster Biological Technology	A00040-2	Tavşan poliklonal antikor; western blotting 1:5.000
Hücre Sayım Kiti-8 (CCK-8)	TargetMol	C0005	Hücre büyümesiyle ilişkili metabolik aktivite analizi; 100 μL kültür ortamı başına 10 μL
Kemilüminesans görüntüleme sistemi	Bio-Rad	ChemiDoc MP	Western blot görüntüleme
Kloroform	Servicebio	G3005	TRIzol bazlı RNA ekstraksiyonu sırasında faz ayrımı
Kristal viyole boyama çözeltisi	Servicebio	G1014	Koloni ve Transwell membran boyama
DMEM	Servicebio	G4511	Beas-2b hücreleri için rutin kültür ortamı
DVL1 antikoru	Signalway Antibody	53180	Tavşan primer antikor; western blotting 1:5.000
Fetal bovine serum (FBS)	Biosharp	BL203B	Rutin hücre kültürü için %10 (v/v) takviye; Transwell alt bölmesinde %20 (v/v)
GraphPad Prism 8	GraphPad Software	Version 8	Grafik hazırlama ve istatistiksel analiz
Hieff qPCR SYBR Green Master Mix (No Rox)	Yeasen Biotechnology	11201ES08	SYBR Green bazlı kantitatif PCR
Hifair III 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR (gDNA digester plus)	Yeasen Biotechnology	11141ES60	mRNA RT-qPCR için ters transkripsiyon
IBM SPSS Statistics	IBM	Version 22.0	İstatistiksel analiz
ImageJ	National Institutes of Health	Version 1.53	Western blot densitometrisi, yara alanı ölçümü, koloni sayımı ve Transwell hücre sayımı
İnverted mikroskop	Olympus	CKX53	Yara iyileşmesi ve Transwell analizlerinin görüntülenmesi
İzopropanol	Servicebio	G3006	TRIzol bazlı ekstraksiyon sırasında RNA presipitasyonu
LV-miR-486-3p ve LV-NC lentiviral preparatları	GenePharma	Özel sentez	Stabil miR-486-3p aşırı ekspresyon vektörü ve scramble negatif kontrol vektörü
Matrigel bazal membran matriksi	Corning	354234	Serumsuz DMEM içinde 1:8 oranında seyreltilmiş; yaklaşık 1 mg/mL final protein konsantrasyonu
Metanol	Xilong Scientific	GB/T 683-2006	PVDF membran aktivasyonu
Mikroplaka okuyucu	BioTek	ELx800	450 nm'de absorbans ölçümü
Mikrovolümlü UV-Vis spektrofotometre	Allsheng	Nano-600	RNA konsantrasyonu ve A260/A280 saflık değerlendirmesi
Penisilin-streptomisin	Gibco, Thermo Fisher Scientific	15240062	Rutin hücre kültürü için %1 (v/v) takviye
Fosfat tamponlu salin (PBS)	Servicebio	G0002	Hücre ve membran yıkama
Proteaz İnhibitör Kokteyli	APExBIO	K1007	RIPA liz tamponuna eklendi
Protein merdiveni	Biosharp	BL712A	Western blotting için moleküler ağırlık referansı
PVDF membran	Millipore	K2MA8350E	Western blotting için protein transfer membranı
QuantStudio 5 Real-Time PCR Sistemi	Thermo Fisher Scientific	QuantStudio 5	RT-qPCR veri toplama
RIPA liz tamponu	Beyotime	P0013B	Toplam hücresel protein ekstraksiyonu
RNA ekstraksiyon reajeni (TRIzol tipi)	Servicebio	G3013	Toplam RNA ekstraksiyonu
RPMI 1640 ortamı	Servicebio	G4510	A549 ve H358 hücreleri için rutin kültür ortamı ve serumsuz Transwell hücre süspansiyonu
SDS	Solarbio	S8010	SDS-PAGE reajeni
Yağsız süt tozu	BD	2271470	Western blotting için %5 bloklama çözeltisi
StarBase v3.0	Sun Yat-sen University	https://rnasysu.com/encori/	TCGA kaynaklı miR-486-3p ekspresyon analizi
TargetScanHuman	Whitehead Institute for Biomedical Research	https://www.targetscan.org/vert_80/	Aday miR-486-3p bağlanma bölgelerinin tahmini
TEMED	Sigma-Aldrich	T8090	SDS-PAGE jeli polimerizasyon katalizörü
Transwell insertleri, 24 kuyucuklu, 8 μm gözenek boyutu	Corning	3428	Matrigel kaplı membran geçiş analizi
Tripsin	Servicebio	G4000	Hücre ayırma
Tween-20	Solarbio	815A043	Western blot yıkama tamponunun hazırlanması
Dikey elektroforez sistemi	Liuyi Biotechnology	DYCZ-24DN	SDS-PAGE protein ayırımı
Western HRP substrat luminol reajeni	Affinity Biosciences	KF001	Kemilüminesan western blot deteksiyonu
Islak transfer sistemi	Bio-Rad	1703930	Proteinin PVDF membranına transferi
WNT5B antikoru	Signalway Antibody	56808	Tavşan primer antikor; western blotting 1:5.000
β-actin antikoru	Abcam	ab8227	Yükleme kontrolü; western blotting 1:5.000
β-catenin antikoru	Signalway Antibody	21725	Tavşan primer antikor; western blotting 1:5.000

Kaynaklar

Herbst RS, Heymach JV, Lippman SM. Lung cancer. N Engl J Med. 2008;359(13):1367-1380.
Siegel RL, Miller KD, Jemal A. Cancer statistics, 2019. CA Cancer J Clin. 2019;69(1):7-34.
Han B, et al. Cancer incidence and mortality in China, 2022. J Natl Cancer Cent. 2024;4(1):47-53.
Lin JJ, et al. Five-year survival in EGFR-mutant metastatic lung adenocarcinoma treated with EGFR-TKIs. J Thorac Oncol. 2016;11(4):556-565.
She J, Yang P, Hong Q, Bai C. Lung cancer in China: challenges and interventions. Chest. 2013;143(4):1117-1126.
Barker N, Clevers H. Mining the Wnt pathway for cancer therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 2006;5(12):997-1014.
Komiya Y, Habas R. Wnt signal transduction pathways. Organogenesis. 2008;4(2):68-75.
Stewart DJ. Wnt signaling pathway in non-small cell lung cancer. J Natl Cancer Inst. 2014;106(1):djt356.
Zhang Z, et al. Wnt/β-catenin signaling in the development and therapeutic resistance of non-small cell lung cancer. J Transl Med. 2024;22(1):565.
Zhang Q, et al. WNT5B exerts oncogenic effects and is negatively regulated by miR-5587-3p in lung adenocarcinoma progression. Oncogene. 2020;39(7):1484-1497.
Suthon S, et al. WNT5B in physiology and disease. Front Cell Dev Biol. 2021;9:667581.
Ji H, et al. SPATA2 suppresses epithelial-mesenchymal transition to inhibit metastasis and radiotherapy sensitivity in non-small cell lung cancer via. impairing DVL1/β-catenin signaling. Thorac Cancer. 2023;14(11):969-982.
Wang Y, Wang L, Chen C, Chu X. New insights into the regulatory role of microRNA in tumor angiogenesis and clinical implications. Mol Cancer. 2018;17(1):22.
Iqbal MA, Arora S, Prakasam G, Calin GA, Syed MA. MicroRNA in lung cancer: role, mechanisms, pathways and therapeutic relevance. Mol Aspects Med. 2019;70:3-20.
Lee YS, Dutta A. MicroRNAs in cancer. Annu Rev Pathol. 2009;4:199-227.
Lin G, et al. MiR-26a enhances invasive capacity by suppressing GSK3β in human lung cancer cells. Exp Cell Res. 2017;352(2):364-374.
Jiang W, et al. MicroRNA-1258 suppresses tumor progression via. GRB2/Ras/Erk pathway in non-small-cell lung cancer. Cell Prolif. 2018;51(6):e12502.
Xie Y, Xue C, Guo S, Yang L. MicroRNA-520a suppresses pathogenesis and progression of non-small-cell lung cancer through targeting the RRM2/Wnt axis. Anal Cell Pathol (Amst). 2021;2021:9652420.
Peng Y, Zhang X, Feng X, Fan X, Jin Z. The crosstalk between microRNAs and the Wnt/β-catenin signaling pathway in cancer. Oncotarget. 2017;8(8):14089-14106.
Wang X, et al. MiR-214 inhibits cell growth in hepatocellular carcinoma through suppression of β-catenin. Biochem Biophys Res Commun. 2012;428(4):525-531.
Lulli V, et al. MicroRNA-486-3p regulates γ-globin expression in human erythroid cells by directly modulating BCL11A. PLoS One. 2013;8(4):e60436.
Chou ST, et al. MicroRNA-486-3p functions as a tumor suppressor in oral cancer by targeting DDR1. J Exp Clin Cancer Res. 2019;38(1):281.
Wu H, et al. Overexpression of miR-486-3p promoted by allicin enhances temozolomide sensitivity in glioblastoma via. targeting MGMT. Neuromolecular Med. 2020;22(3):359-369.
Garajei A, et al. Evaluation of the expression of miR-486-3p, miR-548-3p, miR-561-5p and miR-509-5p in tumor biopsies of patients with oral squamous cell carcinoma. Pathogens. 2022;11(2):211.
Li X, et al. MicroRNA-486-3p promotes the proliferation and metastasis of cutaneous squamous cell carcinoma by suppressing flotillin-2. J Dermatol Sci. 2022;105(1):18-26.
Tomioka Y, et al. The molecular pathogenesis of tumor-suppressive miR-486-5p and miR-486-3p target genes: GINS4 facilitates aggressiveness in lung adenocarcinoma. Cancers (Basel). 2023;15(13):3408.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

WNT5B Ekspresyonu DVL1 Ekspresyonu Beta-Katenin Lentiviral Transdüksiyon Koloni Oluşumu Yara İyileşme Analizi Western Blot RT-qPCR