Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Araştırma makalesi

Çok Aşamalı Genetik, Transkriptomik ve Tek Hücre Kanıtları, Glioblastomdaki Ferroptozla İlişkili Genler Arasında MAP1LC3A'yı Önceliklendirmektedir

94 görüntülenme

⸱

11 Eylül 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cerebrovascular Neurosurgery, The First People's Hospital of Zhaoqing, 2The National Key Clinical Specialty, Guangdong Provincial Key Laboratory on Brain Function Repair and Regeneration, Department of Neuro-oncological Surgery, Zhujiang Hospital, Southern Medical University

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Mendelyen randomizasyon, tümör transkriptomiği ve tek hücre analizlerini entegre eden genetik tabanlı, çok aşamalı bir çerçeve, MAP1LC3A'yı glioblastoma duyarlılığı ile ilişkili ferroptozla bağlantılı bir gen ve gelecekteki deneysel doğrulama için bir aday olarak önceliklendirmiştir.

Özet

Glioblastoma (GBM), oldukça agresif bir malignite olmaya devam etmektedir ve ferroptozla ilişkili genlerin hastalık yatkınlığına olan katkısı henüz tam olarak anlaşılamamıştır. GBM ile ilişkili ferroptozla ilişkili genleri önceliklendirmek için genetik tabanlı, çok aşamalı bir çerçeve uygulanmıştır. FerrDb V2'den seçilen 483 gen arasından 315'inin eQTLGen'de aday cis-ekspresyon kantitatif özellik lokusları (cis-eQTL'ler) bulunduğu, 250'sinin bağlantı dengesizliği kümelemesi (linkage disequilibrium clumping) sonrası en az üç bağımsız araç koruduğu ve 226'sının 6.183 vaka ve 18.169 kontrolden oluşan bir GBM genom çapında ilişkilendirme çalışması kullanarak geçerli ters-varyans ağırlıklı (IVW) Mendel randomizasyon tahminleri verdiği saptanmıştır. Otuz dört gen, P < 0.05 ve Benjamini–Hochberg yanlış keşif oranı (BH-FDR) < 0.20 keşif kriterlerini karşılamış ve yönsel olarak uyumlu Bayesian ağırlıklı Mendel randomizasyon (BWMR) tahminleri göstermiştir. GTEx V10 tüm kan cis-eQTL'leri kullanılarak yapılan replikasyon aşaması Mendel randomizasyonu dört geni desteklemiştir: ATG7, RPTOR, MAP1LC3A ve CHMP6. Üç bağımsız tümör-kontrol transkriptomik kohortundaki değerlendirmeler, MAP1LC3A'nın tümör dokusunda tutarlı bir şekilde aşağı regüle edildiğini ve anlamlı bir rastgele etkiler havuzlanmış tahmini (log₂ kat değişimi, −1.273; %95 güven aralığı, −1.625 ila −0.920; yanlış keşif oranı = 0.016) gösterdiğini, diğer üç genin ise benzer kohortlar arası istatistiksel destekten yoksun olduğunu ortaya koymuştur. Ardından, 20 yetişkin IDH-wild-type GBM tümöründen seçilen 4.916 uygun hücre içindeki 2.400 malign hücreden oluşan hasta dengeli bir alt kümede tek hücreli sanal nakavt analizi gerçekleştirilmiştir. Bağımsız olarak başlatılan beş çalışma boyunca ATG7, RPTOR, MAP1LC3A ve CHMP6 için sırasıyla 3, 15, 4 ve 7 sağlam aşağı akış geni belirlenmiştir. Ortaya çıkan konsensüs setleri 17 benzersiz genle oluşturulmuş ve RND3'ün dört hedefin tamamında ortak olduğu görülmüştür. Gen Ontolojisi analizi, hücre yapışması ve hücre yüzeyi süreçlerinin zenginleştiğini gösterirken, çoklu test düzeltmesi sonrası hiçbir KEGG veya Reactome yolak anlamlı kalmamıştır. Topluca bu bulgular, genetik ilişkilendirme, tümör ekspresyon uyumu ve hesaplamalı perturbasyonu kesin nedensellik veya mekanizma kanıtlarından ayırırken, gelecekteki deneysel araştırmalar için MAP1LC3A'yı önceliklendirmektedir.

Giriş

Glioblastoma (GBM), tedavize dirençli malignitelerin prototipi olmayı sürdürmektedir. Giderek daha rafine hale gelen moleküler sınıflandırma ve multidisipliner bakıma rağmen, hasta sonuçlarındaki kalıcı iyileşmeler sınırlı kalmıştır1. Tıbbi açıdan uygun hastalarda mevcut yönetim; maksimal güvenli rezeksiyonun ardından eş zamanlı ve adjuvan temozolomid ile birlikte radyoterapi uygulanmasını içerir; bu rejim, dönüm noktası niteliğindeki randomize bir çalışmada belirlenmiş ve güncel klinik kılavuzlarda korunmuştur1,2. Buna rağmen, yaygın infiltrasyon ile geniş hücresel ve moleküler heterojenite kalıcı hastalık kontrolünü kısıtlamakta ve çoğu hasta nihayetinde, evrensel olarak etkili standart bir tedavisi bulunmayan progresyon veya nüks deneyimlemektedir1,3. Hastalık karakterizasyonundaki ilerlemeler ile klinik sonuçlar arasındaki bu süregelen boşluk, GBM için yeni terapötik stratejilere yön verebilecek biyolojik olarak ilgili moleküler bağımlılıkların tanımlanması gerekliliğini vurgulamaktadır.

Ferroptoz, kontrolsüz fosfolipid peroksidasyonu ve hücresel antioksidan savunmaların yetersizliği ile karakterize edilen, demire bağımlı bir düzenlenmiş hücre ölümü formudur ve bu yönüyle mekanistik olarak apoptoz ve diğer kanonik hücre ölümü programlarından ayrılır4,5. Bu süreç, genetik değişikliklerin ve metabolik plastisitenin demir homeostazını, redoks dengesini ve lipid metabolizmasını yeniden şekillendirdiği GBM için özellikle önemlidir. Entegre genomik ve lipidomik profilleme, CDKN2A delesyonunun oksitlenebilir çoklu doymamış yağ asitlerini yeniden dağıttığını ve böylece GBM modellerinde genotipe bağımlı ferroptoz duyarlılığı oluşturduğunu göstermiştir6. Benzer şekilde, primer ve rekürren tümörlerin eşleştirilmiş analizleri; GPX4, ACSL4 ve diğer ferroptoz düzenleyicilerinde relaps ile ilişkili değişiklikler tanımlamıştır7. Ferroptoz savunma yolaklarının deneysel modülasyonunun, GBM hücrelerinde ve xenograft modellerinde temozolomide yanıtını etkilediği de gösterilmiştir8. Topluca bu bulgular, ferroptozu GBM'de biyolojik olarak makul bir terapötik zayıflık olarak tanımlamaktadır. Bununla birlikte, bu bulgular öncelikle tümör durumu ilişkilerini veya bağlama bağımlı deneysel gözlemleri yansıtmakta olup, ferroptozla ilgili gen ekspresyonundaki konstitütif varyasyonun GBM'ye karşı kalıtsal yatkınlığa katkıda bulunup bulunmadığını belirlememektedir.

Gliomada ferroptozu inceleyen insan çalışmalarının çoğu; TCGA, CGGA ve GEO veri setlerini kullanarak yapılan diferansiyel ekspresyon, sağkalım modellemesi ve moleküler alt tiplendirme analizlerine dayanmıştır9,10. Bu çalışmalar, ferroptozla ilişkili transkripsiyonel programların prognostik önemini belirlemiş olsa da, gözlemsel tasarımları nedeniyle değişen gen ekspresyonunun GBM duyarlılığına mı katkıda bulunduğu, yoksa tümör gelişiminin bir sonucu mu olduğu belirlenememektedir. Transkriptom genelindeki Mendelyen randomizasyon çalışmaları, daha sonra gliom riskiyle ilişkili, genetik olarak düzenlenen ve doku bağımlı genleri tanımlamıştır; daha yakın tarihli ekspresyon kantitatif trait lokusu (eQTL) ve protein kantitatif trait lokusu (pQTL) tabanlı çalışmalar ise GBM için potansiyel terapötik hedefleri önceliklendirmeye başlamıştır11,12. Buna rağmen, önceki araştırmalar genellikle önceden belirlenmiş, kapsamlı bir ferroptoz ilişkili gen setini değerlendirmek yerine, transkriptom genelinde veya ilaç-hedef odaklı yaklaşımlar benimsemiştir. Ayrıca, çok az çalışma, büyük bir GBM genom genelinde ilişkilendirme çalışmasını (GWAS), bağımsız bir eQTL kaynağı kullanılarak gerçekleştirilen replikasyon aşaması Mendelyen randomizasyonu ile entegre etmiş ve ardından birden fazla tümör-kontrol transkriptomik kohortunda değerlendirme yapmıştır. Gen ekspresyonunun genetik düzenlemesi dokular arasında önemli ölçüde farklılık gösterdiğinden ve kandan türetilen eQTL ilişkilerinin beyin tümörlerindeki düzenleyici etkileri yansıttığı varsayılamayacağından bu ayrım önemlidir11,13. Bu nedenle, GBM'deki rolleri yakınsak kanıt hatlarıyla desteklenen ferroptozla ilişkili genleri tanımlamak için; genetik ilişkilendirmeyi, replikasyon aşaması Mendelyen randomizasyonunu, kohortlar arası tümör transkriptomiğini ve hastadan türetilmiş tek hücreli fonksiyonel tahmini birleştiren entegratif bir çerçeveye ihtiyaç duyulmaktadır.

Bu çalışma, ferroptozla ilişkili genlerin genetik olarak düzenlenen ekspresyonunun GBM'ye karşı yatkınlıkla ilişkili olup olmadığını incelemiştir. Keşif aşaması ve replikasyon aşaması Mendel randomizasyonu, üç bağımsız tümör-kontrol transkriptomik kohortundaki gen ekspresyon analizleriyle birleştirilmiştir. Her iki Mendel randomizasyon aşaması tarafından desteklenen genler, ardından malign hücrelerdeki öngörülen transkripsiyonel yanıtları karakterize etmek amacıyla sanal pertürbasyon kullanılarak hasta kaynaklı tek hücreli transkriptomik verilerde değerlendirilmiştir. Genleri yalnızca tümör ekspresyon imzalarına dayanarak önceliklendirmek yerine, bu çok aşamalı çerçeve öncelikle kalıtsal genetik varyasyonlardan yararlanmış ve ardından hücre çözünürlüklü hesaplamalı pertürbasyon profilleri ile birlikte hastalıkla ilgili ekspresyon modellerini değerlendirmiştir. Elde edilen yakınsak kanıtlar, GBM'deki gelecekteki deneysel araştırmalar için ferroptozla ilişkili genleri önceliklendirmek amacıyla kullanılmıştır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Bu çalışma, Zhaoqing Birinci Halk Hastanesi Tıbbi Etik Kurulu tarafından etik incelemeden muaf tutulmuştur (Referans No. B2026-08-03). Çalışmada; EGAD00010001657'den alınan Veri Erişim Komitesi onaylı kontrollü erişim verileri ile GEO, eQTLGen ve GTEx'ten ilgili erişim ve kullanım koşulları uyarınca elde edilen veri setleri dahil olmak üzere, geriye dönük olarak toplanmış, kimliksizleştirilmiş özet düzeyde genetik ve transkriptomik veriler kullanılmıştır. Yeni katılımcı alınmamış, biyolojik örnek toplanmamış ve tanımlanabilir katılımcı düzeyinde verilere erişilmemiştir. Orijinal çalışmalar için etik onay ve bilgilendirilmiş onam, ilgili veri üreticileri tarafından alınmış olup, kontrollü erişim verileri geçerli Veri Erişim Sözleşmesi uyarınca kullanılmıştır.

Çalışma tasarımı

Bu çalışma, glioblastoma (GBM) duyarlılığı ile ilişkili ferroptozla ilgili genleri önceliklendirmek ve bunların hastalıkla ilgili transkripsiyonel etkilerini değerlendirmek için çok aşamalı bir çerçeve kullanmıştır (Şekil 1). İlk olarak, FerrDb V2'den derlenen ferroptozla ilgili genler, cis-ekspresyon kantitatif trait lokusu (cis-eQTL) verileri ve geniş kapsamlı bir GBM genom çapında ilişkilendirme çalışması (GWAS) kullanılarak iki örneklemli Mendel randomizasyonu (MR) ile değerlendirilmiştir. Ters varyans ağırlıklı (IVW) MR temel tarama yöntemi olarak kullanılmış, Bayesian ağırlıklı Mendel randomizasyonu (BWMR) sağlamlığın tamamlayıcı bir değerlendirmesini sağlamış ve bağımsız bir eQTL veri seti replikasyon aşaması MR'ı için kullanılmıştır. İkinci olarak, genetik analizlerle desteklenen genler üç bağımsız tümör-kontrol transkriptomik kohortunda değerlendirilmiş ve ardından kohortlar arası meta-analiz yapılmıştır. Üçüncü olarak, malign hücrelerde sanal gen pertürbasyonu gerçekleştirmek ve tekrarlanabilir downstream transkripsiyonel yanıtları belirlemek için hasta kaynaklı tek hücreli transkriptomik veriler kullanılmıştır. Bu yanıtlar daha sonra fonksiyonel zenginleştirme ve ortak ağ analizleri aracılığıyla karakterize edilmiştir. Genel olarak, genetik analizler GBM duyarlılığı ile ilişkili genleri belirlemek için tasarlanırken, transkriptomik ve tek hücreli analizler biyolojik uyumu değerlendirmiş ve sonraki deneysel doğrulamalar için hipotezler oluşturmuştur.

Veri kaynakları

Ferroptozis ile ilişkili genler FerrDb V2'den elde edilmiş olup, gen sembolü uyumlaştırması ve mükerrer girişlerin çıkarılması sonucunda 483 benzersiz insan protein kodlayan gen belirlenmiştir14. Keşif aşaması Mendel randomize çalışması (MR) için maruziyet veri seti olarak eQTLGen Konsorsiyumu'ndan alınan tam kan cis-ekspresyon kantitatif özellik lokusu (cis-eQTL) özet istatistikleri kullanılırken, replikasyon aşaması MR için bağımsız bir maruziyet veri seti olarak GTEx sürüm V10 tam kan cis-eQTL verileri kullanılmıştır11,15. GBM sonuç ilişkileri, Avrupa soyundan gelen 6.183 vaka ve 18.169 kontrolden oluşan ve European Genome-phenome Archive üzerinden erişilebilen kontrollü erişimli genom çapında ilişkilendirme çalışması (GWAS) özet istatistiklerinden elde edilmiştir16. Genetik olarak önceliklendirilen genlerin doku düzeyindeki ekspresyonu, üç bağımsız Gene Expression Omnibus (GEO) kohortu üzerinden değerlendirilmiştir: depolanan meta verilerde GBM olarak tanımlanan 61 derece 4 gliom örneği ve dokuz non-neoplastik beyin örneğinden oluşan GSE196533; GBM ve epilepsi kaynaklı non-tümör beyin örneklerinden oluşan GSE4290; ve eşleştirilmiş tümör çekirdeği ile peritümöral örneklerin yanı sıra non-neoplastik kontrolleri içeren GSE11652017,18,19. Malign hücre sanal pertürbasiyon analizi için GSE131928'den alınan hastadan türetilmiş Smart-seq2 verileri kullanılmıştır20. Veri seti özellikleri ve bunlara karşılık gelen analitik rolleri Tablo 1'de özetlenmiştir. Tüm analizler, orijinal çalışmalarda etik onay ve bilgilendirilmiş onam alınmış, daha önceden toplanmış ve kimliksizleştirilmiş veri setleri kullanılarak gerçekleştirilmiştir.

Genetik cihaz seçimi ve veri harmonizasyonu

Aday araçlar, genom genelinde anlamlılık düzeyinde (P < 5 × 10⁻8) gen ekspresyonu ile ilişkili olan cis-ekspresyon kantitatif özellik lokusları (cis-eQTL'ler) ile sınırlandırıldı. Varyantlar, 10.000-kb'lık bir pencere içinde r2 < 0.001 bağlantı dengesi (LD) eşiği kullanılarak 1000 Genomes Projesi'nin Avrupa referans paneli ile kümelendi. Kümeleme sonrası üçten az bağımsız araca sahip olan genler, birincil Mendelyen randomizasyon (MR) analizinden çıkarıldı. Keşifsel tarama amacı göz önüne alındığında, seyrek ancak güçlü cis-eQTL desteği olan genleri korumak ve çok araçlı IVW tahminine olanak sağlamak için minimum üç araç önceden belirlendi. Bu eşik, sıkı LD kümelemesi ve F-statistiği filtrelemesi ile birlikte uygulandı; yalnızca üç veya dört araca dayalı tahminler ihtiyatla yorumlandı ve duyarlılık analizleri yalnızca metodolojik olarak uygun olduğunda gerçekleştirildi. Her bir varyant için araç gücü, β ve SE'nin sırasıyla cis-eQTL etki tahminini ve standart hatasını temsil ettiği F istatistiği (F = β2/SE2) kullanılarak değerlendirildi. Zayıf araç yanlılığını en aza indirmek için F < 10 olan varyantlar hariç tutuldu21,22. Maruziyet ve sonuç veri setleri, etki allelleri ve etki yönleri hizalanarak harmonize edildi. Yinelenen varyantlar, GBM GWAS veri setinde bulunmayan varyantlar ve uyumsuz allel kodlamasına sahip varyantlar çıkarıldı. GBM GWAS için etki-allel frekansları mevcut olmadığından, belirsiz zincir yönelimine sahip palindromik varyantlar çıkarıldı, tahmin edilmedi. Aynı nedenle, resmi bir Steiger yönlülük testi uygulanmadı.

Mendelyen randomizasyon analizleri

Genetik olarak öngörülen gen ekspresyonu ile GBM duyarlılığı arasındaki ilişki, iki örneklemli Mendelian randomizasyon (MR) kullanılarak değerlendirildi. Keşif aşamasında, yalnızca en az üç bağımsız cis-ekspresyon kantitatif özellik lokusu (cis-eQTL) instrument'ine sahip genler dahil edildi ve temel analitik yaklaşım olarak ters varyans ağırlıklı (IVW) yöntem kullanıldı. Etki tahminleri, genetik olarak öngörülen gen ekspresyonundaki birim artış başına %95 güven aralıkları (CI) ile birlikte odds oranları (OR) olarak raporlandı. Değerlendirilen genler genelinde çoklu testleri hesaba katmak için IVW P değerleri Benjamini-Hochberg prosedürü kullanılarak düzeltildi23. P < 0.05 ve Benjamini-Hochberg yanlış keşif oranı (BH-FDR) < 0.20 olan genler, keşif amaçlı adaylar olarak tutuldu. Bu nispeten esnek FDR eşiği, keşif aşamasında potansiyel olarak ilgili genlerin erken dışlanmasını azaltmak için seçilmiştir; bu nedenle, aday durumu doğrulayıcı bir kanıt olarak değil, sonraki analizlerle birlikte yorumlanmıştır. Ardından, aynı harmonize edilmiş instrument'ler kullanılarak keşif aşaması adaylarına Bayes ağırlıklı Mendelian randomizasyon (BWMR) uygulandı24. IVW ve BWMR sonuçları arasındaki uyum, hem istatistiksel anlamlılık hem de etkinin yönü temel alınarak değerlendirildi. Mevcut instrument sayısının izin verdiği durumlarda; heterojenliği, yatay pleiotropiyi, etkili aykırı varyantları ve bireysel tek nükleotid polimorfizmlerinin (SNP'ler) etkisini değerlendirmek için Cochran's Q testi, MR-Egger kesişim testi, MR-PRESSO ve birini çıkarma (leave-one-out) analizleri gerçekleştirildi22.

Replikasyon aşaması MR, GTEx V10 tüm kan cis-eQTL verileri kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Sadece tek bir instrument mevcut olduğunda Wald oranı yöntemi uygulanmış, iki veya daha fazla instrument'a sahip genler için ise IVW yöntemi kullanılmıştır. Replikasyon; P < 0.05, BH-FDR < 0.20 ve keşif aşamasındaki ilgili tahminle tutarlı bir etki yönü olarak tanımlanmıştır. Bazı GTEx replikasyon tahminleri yalnızca bir veya iki instrument'a dayandığından, bunlar nedenselliğin bağımsız kanıtlarından ziyade replikasyon için destekleyici kanıtlar olarak yorumlanmıştır.

Kohortlar arası transkriptomik değerlendirme

Keşif ve replikasyon aşaması Mendelyen randomizasyon (MR) analizleri ile önceliklendirilen dört gen, üç bağımsız transkriptomik kohort üzerinden değerlendirildi. GSE196533 için ham RNA-sekanslama sayım verileri DESeq225 kullanılarak analiz edildi. İki örnek hariç tüm örneklerde sayımı 10'un altında olan genler hariç tutulurken, dört hedef gen ekspresyon filtrelemesine bakılmaksızın korundu. Diferansiyel ekspresyon, depolanmış meta verilerde GBM olarak tanımlanmış 61 derece 4 gliom örneği ile dokuz non-neoplastik beyin örneği arasında değerlendirildi.

GSE4290 için, açık bir histopatolojik tanısı olmayan dört örnek hariç tutulmuş, geriye 77 GBM ve 23 tümör dışı beyin örneği kalmıştır. İşlenmiş mikroarray yoğunlukları log2-dönüştürülmüş, kuantil normalizasyonuna tabi tutulmuş ve limma26 içerisinde uygulanan robust ampirik Bayes doğrusal modelleri kullanılarak analiz edilmiştir. Birden fazla probun aynı gene eşlendiği durumlarda, diferansiyel ekspresyon anlamlılığından bağımsız olarak, dahil edilen tüm örnekler genelinde ortalama ekspresyonu en yüksek olan prob seçilmiştir.

GSE116520, 17 hastadan alınan eşleştirilmiş tümör merkezi ve peritümoral örneklerin yanı sıra sekiz non-neoplastik kontrolü içermekteydi. Depozite edilen log-dönüştürülmüş, kantil-normalleştirilmiş ekspresyon verileri limma kullanılarak analiz edildi. Tümör merkezi ve peritümoral örnekler arasındaki hasta içi korelasyonlar, hasta düzeyinde bloklama ve duplicateCorrelation fonksiyonu kullanılarak hesaba katıldı. Kohortlar arası meta-analiz için önceden belirlenmiş karşılaştırma tümör merkezi ile kontrol arasındayken; peritümoral karşılaştırmalar ve sıralı kontrol–peritümoral–tümör merkezi trendi ayrı olarak değerlendirildi.

Çalışmaya özgü log2 kat değişimler ve standart hatalar, metafor paketinde uygulandığı üzere, Hartung–Knapp çıkarımı içeren kısıtlı maksimum olabilirlik rastgele etkiler modeli kullanılarak birleştirilmiştir. Çalışmalar arası heterojenlik, Cochran's Q istatistiği ve I2 kullanılarak değerlendirilmiştir. Dört hedef gen için birleştirilmiş P değerleri, Benjamini–Hochberg prosedürü ile düzeltilmiştir. Güçlü transkriptomik destek; meta-analiz yanlış keşif oranı (FDR) < 0.05, en az iki veri setinde kohort düzeyinde FDR anlamlılığı ve üç kohortun tamamında tutarlı etki yönleri olarak tanımlanmıştır.

Tek hücreli sanal nakavt analizi

Malign hücrelerdeki dört MR-replike genini değerlendirmek için GSE131928'den alınan hastadan türetilmiş Smart-seq2 verileri kullanıldı. Erişkin malign hücreler, orijinal çalışmada sağlanan açıklamalara göre tanımlandı ve hasta temsilindeki dengesizliği en aza indirmek için uygun olan her hastadan rastgele eşit sayıda hücre örneklendi. Sanal nakavt işlemi scTenifoldKnk kullanılarak gerçekleştirildi ve beş bağımsız çalışma boyunca tekrarlandı. Tek bir çalışmada Benjamini–Hochberg düzeltmeli P < 0.05 olan genler anlamlı kabul edildi. Beş çalışmanın en az üçünde tekrarlanan downstream genleri birincil konsensüs seti olarak tanımlanırken, duyarlılık analizi için daha sıkı bir dört-beş kriteri kullanıldı. Bu sonuçlar, doğrudan moleküler düzenleme kanıtı olarak değil, transkripsiyonel pertürbasyonun hesaplamalı öngörüleri olarak yorumlandı.

Fonksiyonel zenginleştirme ve ortak ağ analizi

Fonksiyonel zenginleştirme analizi, beş sanal nakavt çalışmasının en az üçünde tekrarlanabilir şekilde tanımlanan hedef-spesifik alt akış genleri kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Gen Ontolojisi (GO), Kyoto Gen ve Genom Ansiklopedisi (KEGG) ve Reactome yolak zenginleştirmeleri, ağ çıkarımına dahil edilen 1.004 genin arka plan gen setini oluşturduğu tek yönlü hipergeometrik testler kullanılarak değerlendirilmiştir. P değerleri, her bir anotasyon veritabanı için Benjamini–Hochberg prosedürü kullanılarak ayrı ayrı düzeltilmiş ve düzeltilmiş P < 0,05 değeri istatistiksel olarak anlamlı kabul edilmiştir.

Dört nakavt hedefi ve bunların ortak aşağı akış genleri arasındaki ilişkileri temsil etmek için iki parçalı bir ağ oluşturulmuştur. Birden fazla hedefle ilişkili olan genler, ortak derecelerine göre belirlenmiş ve hedefe özgü gen setleri arasındaki örtüşme, kesişim sayıları ve Jaccard indeksleri kullanılarak nicelendirilmiştir. Ağ kenarları, tekrarlanabilir hesaplamalı pertürbasyonlar arasındaki ilişkileri temsil eder ve doğrudan moleküler etkileşimlerin kanıtı olarak yorumlanmamalıdır.

İstatistiksel analiz ve tekrarlanabilirlik

Aksi belirtilmedikçe, istatistiksel testler çift yönlü yapılmış ve çoklu karşılaştırmalar Benjamini–Hochberg prosedürü kullanılarak kontrol edilmiştir. Analize özgü anlamlılık kriterleri, ilgili alt bölümlerde açıklanmıştır. Tüm analizler R veya Python kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Randomize prosedürlerde önceden belirlenmiş tohumlar kullanılmış; tekrarlanabilirliği desteklemek amacıyla analitik kodlar, yazılım sürümleri ve ayrıntılı parametre ayarları arşivlenmiştir. Tüm veri setleri daha önceden toplanmış ve kimliksizleştirilmiştir; etik onay ve bilgilendirilmiş onam orijinal çalışmalarda alınmıştır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Ferroptozla ilişkili genlerin ve genetik araçların seçimi

FerrDb V2'den toplam 483 ferroptozla ilişkili gen elde edilmiştir (Şekil 1). Bunların arasından 315 gen eQTLGen veri setiyle eşleşmiş ve en az bir aday cis-ekspresyon kantitatif özellik lokusuna (cis-eQTL) sahip olduğu görülmüştür. Bağlantı dengesi kümelemesi (linkage disequilibrium clumping) sonrası, 250 gen en az üç bağımsız aday araçla korunmuştur. Sonuç varyant araştırması, alel armoniz...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu çalışma, glioblastoma (GBM) yatkınlığı ile ilişkili ferroptozla ilgili genleri önceliklendirmek için genetik ilişkilendirme, replikasyon aşaması Mendel randomizasyonunu (MR), tümör transkriptomiğini ve hasta türevli tek hücreli modellemeyi entegre etmiştir. 6.183 vaka ve 18.169 kontrolden oluşan bir GBM genom çapında ilişkilendirme çalışmasına (GWAS) karşı 483 kürate edilmiş genin taranması sonucunda 34 keşif aşaması adayı belirlenmiş; bunlardan dördü —ATG7, RPTOR, MAP1LC3A ve CHMP6— bağımsız bir ekspresyon kantitatif...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir.

Teşekkürler

Yazarlar, Avrupa Genom-Fenom Arşivi (veri seti EGAD00010001657) aracılığıyla glioma GWAS özet istatistiklerine erişim sağladıkları için The Institute of Cancer Research'deki Kanser Genomiği ekibine teşekkür ederler. Bu verilerin orijinal üretimi, Bobby Moore Fonu dahil olmak üzere Cancer Research UK, Wellcome Trust ve DJ Fielding Medical Research Trust (C1298/A8362) tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
BWMRR paketiBWMRBayesyen ağırlıklı Mendelian randomizasyon
DESeq2BioconductorSürüm 1.46.0RNA dizileme diferansiyel ekspresyon analizi
FerrDb V2FerrDbSürüm 2Kürate edilmiş 483 ferroptozla ilişkili genin kaynağı
Glioblastoma toplu mikro-dizi (bulk microarray)NCBI Gen İfadesi Omnibus'uGSE4290Transkriptomik değerlendirme kohortu
Glioblastoma GWAS özet istatistikleriAvrupa Genom-fenom ArşiviEGAD00010001657Kontrollü erişimli sonuç verileri; 6.183 vaka ve 18.169 kontrol
Glioblastoma Smart-seq2 tek hücre RNA dizilemeNCBI Gene Expression OmnibusGSE131928Malign hücre sanal nakavt analizi
Evre 4 gliom bulk RNA dizilemeNCBI Gene Expression OmnibusGSE196533Transkriptomik değerlendirme kohortu
GTEx tam kan cis-eQTL özet istatistikleriGenotip-Doku İfadesi projesiGTEx V10Replikasyon aşaması maruziyet verileri
limmaBioconductorSürüm 3.62.2Mikrodizilim diferansiyel ekspresyon analizi
metaforR paketiSürüm 4.8-0Rastgele etkiler meta-analizi
RR Foundation for Statistical ComputingSürüm 4.4.2İstatistiksel hesaplama ortamı
scTenifoldKnkR paketiSürüm 1.0.3Tek hücreli sanal nakavt analizi
Tümör çekirdeği ve peritümöral kütle mikroarray analiziNCBI Gen İfade Omnibus'uGSE116520Transkriptomik değerlendirme kohortu
TwoSampleMRR paketiSürüm 0.6.29İki örneklemli Mendelian randomizasyonu
Tam kan cis-eQTL özet istatistiklerieQTLGen KonsorsiyumueQTLGenKeşif aşaması maruziyet verileri

Kaynaklar

  1. Weller M, et al. EANO guidelines on the diagnosis and treatment of diffuse gliomas of adulthood. Nat Rev Clin Oncol. 2021;18:170-186.
  2. Stupp R, et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. N Engl J Med. 2005;352:987-996.
  3. McBain C, et al. Treatment options for progression or recurrence of glioblastoma: a network meta-analysis. Cochrane Database Syst Rev. 2021;5:CD013579.
  4. Dixon SJ, et al. Ferroptosis: an iron-dependent form of nonapoptotic cell death. Cell. 2012;149:1060-1072.
  5. Stockwell BR, et al. Ferroptosis: A regulated cell death nexus linking metabolism, redox biology, and disease. Cell. 2017;171:273-285.
  6. Minami JK, et al. CDKN2A deletion remodels lipid metabolism, priming glioblastoma for ferroptosis. Cancer Cell. 2023;41:1048-1060.e1049.
  7. Kram H, et al. Glioblastoma relapses show increased markers of vulnerability to ferroptosis. Front Oncol. 2022;12:841418.
  8. Miao Z, et al. A targetable PRR11-DHODH axis drives ferroptosis- and temozolomide-resistance in glioblastoma. Redox Biol. 2024;73:103220.
  9. Liu HJ, et al. Ferroptosis-related gene signature predicts glioma cell death and glioma patient progression. Front Cell Dev Biol. 2020;8:538.
  10. Dong J, et al. Ferroptosis-related gene contributes to immunity, stemness, and predicts prognosis in glioblastoma multiforme. Front Neurol. 2022;13:829926.
  11. Robinson JW, et al. Transcriptome-wide Mendelian randomization study prioritizing novel tissue-dependent genes for glioma susceptibility. Sci Rep. 2021;11:2329.
  12. Zhang H, Wang Z, Qiao X, Wu J, Cheng C. Investigating potential drug targets for the treatment of glioblastoma: a Mendelian randomization study. BMC Cancer. 2025;25:654.
  13. GTEx Consortium. The GTEx Consortium atlas of genetic regulatory effects across human tissues. Science. 2020;369:1318-1330.
  14. Zhou N, et al. FerrDb V2: update of the manually curated database of ferroptosis regulators and ferroptosis-disease associations. Nucleic Acids Res. 2023;51:D571-D582.
  15. Võsa U, et al. Large-scale cis- and trans-eQTL analyses identify thousands of genetic loci and polygenic scores that regulate blood gene expression. Nat Genet. 2021;53:1300-1310.
  16. Melin BS, et al. Genome-wide association study of glioma subtypes identifies specific differences in genetic susceptibility to glioblastoma and non-glioblastoma tumors. Nat Genet. 2017;49:789-794.
  17. Zeng C, et al. Dissection of transcriptomic and epigenetic heterogeneity of grade 4 gliomas: implications for prognosis. Acta Neuropathol Commun. 2023;11:133.
  18. Sun L, et al. Neuronal and glioma-derived stem cell factor induces angiogenesis within the brain. Cancer Cell. 2006;9:287-300.
  19. Kruthika BS, et al. Transcriptome profiling reveals PDZ binding kinase as a novel biomarker in peritumoral brain zone of glioblastoma. J Neurooncol. 2019;141:315-325.
  20. Neftel C, et al. An integrative model of cellular states, plasticity, and genetics for glioblastoma. Cell. 2019;178:835-849.e821.
  21. Burgess S, Thompson SG. Avoiding bias from weak instruments in Mendelian randomization studies. Int J Epidemiol. 2011;40:755-764.
  22. Papadimitriou N, et al. Physical activity and risks of breast and colorectal cancer: a Mendelian randomisation analysis. Nat Commun. 2020;11:597.
  23. Song W, et al. Causal relationship between gut microbiota and lung squamous cell carcinoma: a bidirectional two-sample Mendelian randomization study. Postgrad Med J. 2025;101:526-534.
  24. Zhao J, et al. Bayesian weighted Mendelian randomization for causal inference based on summary statistics. Bioinformatics. 2020;36:1501-1508.
  25. Love MI, Huber W, Anders S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biol. 2014;15:550.
  26. Ritchie ME, et al. limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies. Nucleic Acids Res. 2015;43:e47.
  27. Yun D, et al. A novel prognostic signature based on glioma essential ferroptosis-related genes predicts clinical outcomes and indicates treatment in glioma. Front Oncol. 2022;12:897702.
  28. Li R, et al. Identification of candidate genes associated with prognosis in glioblastoma. Front Mol Neurosci. 2022;15:913328.
  29. Bai H, Inoue J, Kawano T, Inazawa J. A transcriptional variant of the LC3A gene is involved in autophagy and frequently inactivated in human cancers. Oncogene. 2012;31:4397-4408.
  30. Hayashima K, Kimura I, Katoh H. Role of ferritinophagy in cystine deprivation-induced cell death in glioblastoma cells. Biochem Biophys Res Commun. 2021;539:56-63.
  31. Wu Y, et al. ALDH1-mediated autophagy sensitizes glioblastoma cells to ferroptosis. Cells. 2022;11:4015.
  32. Carriere A, et al. ERK1/2 phosphorylate Raptor to promote Ras-dependent activation of mTOR complex 1 (mTORC1). J Biol Chem. 2011;286:567-577.
  33. Dai E, Meng L, Kang R, Wang X, Tang D. ESCRT-III-dependent membrane repair blocks ferroptosis. Biochem Biophys Res Commun. 2020;522:415-421.
  34. Comincini S, et al. microRNA-17 regulates the expression of ATG7 and modulates the autophagy process, improving the sensitivity to temozolomide and low-dose ionizing radiation treatments in human glioblastoma cells. Cancer Biol Ther. 2013;14:574-586.
  35. Wang L, et al. Autophagy mediates glucose starvation-induced glioblastoma cell quiescence and chemoresistance through coordinating cell metabolism, cell cycle, and survival. Cell Death Dis. 2018;9:213.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

Ferroptoz GenleriGlioblastoma DuyarlılığıMendel RandomizasyonuTek Hücre AnaliziTranskriptomik KohortlareQTL AnaliziGen OntolojisiTümör DownregülasyonuGenetik İlişki
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.