Yöntem makalesi

Hasta Kaynaklı Tümör Organoidlerinin Tümöre İnfiltre Lenfosit Aracılı Apoptotik Öldürülmesini Nicelendirmek İçin Gerçek Zamanlı Görüntü Tabanlı Bir Ko-Kültür Analizi

128 görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/71688

⸱

3 Eylül 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Englander Institute for Precision Medicine, Weill Cornell Medicine, 2Department of Genetics and Genomic Sciences, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 3Institute for Computational Biomedicine, Weill Cornell Medicine, 4Department of Systems and Computational Biomedicine, Weill Cornell Medicine

Bu makalede

Özet

Bu protokol, hasta türevli tümör organoidlerine karşı tümör infiltre eden lenfosit (TIL) aracılı sitotoksisiteyi nicelleştirmek için görüntüleme tabanlı bir canlı hücre görüntüleme protokolü sunarak, fonksiyonel immün profilleme ve immünomodülatör tedavilerin değerlendirilmesi için apoptozun gerçek zamanlı kinetik analizine olanak tanır.

Özet

Tümörle ilişkili lenfositlerin (TIL'ler), otolog tümör hücrelerini tanıma ve yok etme yönündeki fonksiyonel kapasitesinin anlaşılması, kişiselleştirilmiş immünoterapinin geliştirilmesinde merkezi bir öneme sahiptir. Bu yöntemin amacı, hasta kaynaklı tümör organoidlerine (PDTO'lar) karşı TIL aracılı, caspase-3 bağımlı apoptotik öldürmeyi gerçek zamanlı olarak ölçen görüntüleme tabanlı bir canlı hücre görüntüleme protokolü sağlamaktır. Bu yöntem, PDTO'ların ve TIL'lerin izolasyonu ve genişletilmesine yönelik yerleşik prosedürleri, standartlaştırılmış bir üç boyutlu ko-kültür sistemi ve otomatik floresan tabanlı apoptoz tespiti ile entegre etmektedir.

Tümör organoidleri görüntülemeye uygun 96 kuyucuklu plakalara ekilir ve kırmızı bir tümör belirteci ile işaretlenir; genişletilmiş TIL'ler ise kaspaz-3 aktive olan yeşil floresan bir substrat varlığında, tanımlanmış efektör-hedef oranlarında eklenir. Ko-kültürler, faz-kontrast ve çift floresan kanallarını yakalamak için canlı hücre analiz sistemi kullanılarak her 4 saatte bir görüntülenir. Kantitatif görüntü analizi, kırmızı-pozitif tümör yapılarını tanımlar ve zaman içinde kırmızı/yeşil çift-pozitif apoptotik tümör objelerinin oranını hesaplar. Deneyin titizliğini sağlamak amacıyla uygun teknik ve biyolojik tekrarların yanı sıra bazal seviye, spontan apoptoz, negatif ve pozitif öldürme kontrolleri dahil edilir.

Bu protokol, PDTO'ların üç boyutlu mimarisi içindeki tümör heterojenliğini korurken boylamsal nicelleştirmeye olanak tanıyarak, hastaya özgü tümör-TIL etkileşimlerinin fonksiyonel profillemesi ve anti-tümör immüniteyi artıran immünomodülatör ajanların araştırılması için fizyolojik olarak ilgili bir sistem sağlar.

Giriş

Kanser immünoterapisi; birden fazla katı tümör tipinde endojen T hücresi aracılı antitümör yanıtlarını yeniden canlandıran, programlanmış hücre ölümü proteini 1/programlanmış ölüm ligandı 1 (PD-1/PD-L1) ve sitotoksik T-lenfositle ilişkili protein 4 (CTLA-4) yolaklarını hedefleyen immün kontrol noktası inhibitörlerinin (ICIs) geliştirilmesiyle dönüşüme uğramıştır1,2,3. Hastaların bir kısmında kalıcı yanıtlar görülmesine rağmen, çoğu anlamlı bir klinik fayda elde edememektedir ve yanıt verenleri prospektif olarak tanımlayacak valide edilmiş prediktif biyobelirteçler karşılanmamış bir ihtiyaç olmaya devam etmektedir. Bu nedenle, T hücresi aracılı tümör öldürmesini doğrudan ölçen fonksiyonel analizler, biyobelirteç keşfi ve sitotoksik immün yanıtları artırmak için tasarlanan terapötik kombinasyonların preklinik değerlendirmesi için kritik araçlardır.

Krom-51 salınımı, laktat dehydrogenaz (LDH) kantifikasyonu ve CellTiter-Glo gibi lüminesans tabanlı ATP canlılık analizleri dahil olmak üzere geleneksel sitotoksisite analizleri, immün aracılı öldürmeyi kantifiye etmek için yaygın olarak kullanılmıştır; ancak bunlar, mekansal ve zamansal çözünürlükten yoksun, tek zaman noktalı ve toplam ölçümler üretir4,5,6. Benzer şekilde, uç nokta akış sitometrisi tabanlı öldürme analizleri, hücre ölümünü sabit bir zaman noktasında kantifiye eder ve üç boyutlu kültür formatları için pek uygun değildir. Ayrıca, bu analizlerde yaygın olarak kullanılan iki boyutlu tümör hücre hatları, primer hasta tümörlerinin tümöre özgü heterojenliğini tam olarak yansıtmamaktadır.

Hastadan türetilen tümör organoidleri (PDTO'lar), orijinal tümörün genomik değişikliklerini, hücresel heterojenliğini ve ilaç yanıt fenotiplerini geleneksel hücre hattı modellerinden daha sadık bir şekilde koruyan, klinik olarak ilgili bir ex vivo platform olarak ortaya çıkmıştır7,8,9,10,11,12. Güncel çalışmalar, antitümör immün yanıtları ex vivo modellemek için PDTO'ların otolog immün hücrelerle birlikte kültüre edilebileceğini göstermiştir; ancak, yayınlanmış yaklaşımların çoğu, deneysel verimliliği sınırlayan ve öldürme yanıtının dinamik izlemesini engelleyen uç nokta canlılık ölçümlerine veya emek yoğun konfokal görüntüleme analizlerine dayanmaktadır13,14,15,16.

Burada, floresan işaretli PDTO'lara karşı T hücresi aracılı sitotoksisitenin kantitatif, görüntü tabanlı okuması için gerçek zamanlı, görüntü tabanlı bir ko-kültür testi tanımlıyoruz. Bu yöntem, 12–36 h'lik bir gözlem penceresinde tekil organoid çözünürlüğünde kinetik apoptoz eğrileri oluşturmak için kaspaz-3 ile aktive olan floresan bir substratla birleştirilmiş zaman serili floresan mikroskobiyi kullanır. Geleneksel sitotoksisite testleriyle karşılaştırıldığında, bu platform birçok teknik avantaj sunar: test boyunca üç boyutlu tümör mimarisini korur, apoptotik indüksiyonun zamansal dinamiklerini çözer, tanımlanmış efektör-hedef oranlarına imkan tanır ve tek başına veya kombinasyon halinde test edilen immün kontrol noktası inhibitörleri ve hedeflenmiş ajanlar dahil olmak üzere orta ölçekli ilaç tarama formatları için gelecekte uygulama potansiyeline sahiptir. Bu protokol, immüno-onkoloji, fonksiyonel hassas tıp ve T hücresi biyolojisi alanında çalışan araştırmacılar için hazırlanmıştır ve standart doku kültürü altyapısına ve canlı hücre floresan görüntüleme sistemine sahip laboratuvarlarda uygulanabilir.

İnsan tümör örneklerinden hasta kaynaklı tümör organoidlerinin (PDTO'lar) ve eşleşmiş tümör infiltrasyon lenfositlerinin (TIL'ler) izolasyonu ve kültürü, iyi tanımlanmış ve yaygın olarak yayınlanmış metodolojilerdir. Mekanik ve enzimatik tümör disosyasyonunu, bazal membran matrisinde 3D gömmeyi, uzun süreli organoid ekspansiyonunu ve TIL'lerin paralel izolasyonunu ve ex vivo ekspansiyonunu tanımlayan güçlü protokoller, birçok tümör tipi üzerinde kapsamlı bir şekilde valide edilmiştir. Bu yöntemler; tümör hücresi heterojenitesini, mimarisini ve immün spesifisitesini güvenilir bir şekilde korur ve tümör-immün etkileşimlerini değerlendirmek için ko-kültür sistemlerine uyarlanmıştır. Bu nedenle, bu çalışmada organoid ve TIL izolasyonu ile ekspansiyonu, aksi belirtilmedikçe herhangi bir esaslı modifikasyon yapılmadan, daha önce yayınlanmış ve valide edilmiş protokollere göre gerçekleştirilmiştir.

Protokol

İnsan tümör dokusu ve tümör infiltre lenfositleri (TIL'ler) ile ilgili tüm prosedürleri, Kurumsal Gözden Geçirme Kurulu (IRB#1305013903) onayı ve kurumsal biyogüvenlik düzenlemeleri uyarınca gerçekleştirdik ve doku alımı öncesinde yazılı bilgilendirilmiş onam aldık. Onay makamı, protokol #1305013903 kapsamında Weill Cornell Medicine Kurumsal Gözden Geçirme Kurulu'dur (Kurumsal Gözden Geçirme Kurulu (IRB), Weill Cornell Medicine, New York, NY olarak listelenmiştir). Bu protokol kapsamındaki örnekler arasında; rutin patolojik değerlendirme sonrası standart bakım cerrahilerinden veya araştırma prosedürlerinden elde edilen artık tümör dokusu; Weill Cornell Tıp Fakültesi'nden veya diğer kurumlardan gelen mevcut arşiv dondurulmuş veya formaline sabitlenmiş parafine gömülü (FFPE) doku; periferik kan mononükleer hücrelerinin (PBMC'ler), serum ve plazmanın izole edilip saklandığı kan; bazı durumlarda kontrol olarak kullanılan bukkal sürüntüler, tükürük, idrar veya benign doku ve Hızlı Otopsi Programı'na kayıtlı katılımcılar için ölümden sonra 6 saat (en fazla 24 saat) içinde gerçekleştirilen otopsilerde toplanan dokular yer almaktadır. Bu çalışmada kullanılan TIL'ler, yukarıda açıklanan tümör dokusu örneklerinden genişletilmiştir. Tüm biyolojik örneklerden kişisel tanımlayıcılar kaldırılmış olup, bu örnekler HIPAA ve kurumsal standartlar uyarınca yalnızca benzersiz bir hasta kimlik numarası aracılığıyla katılımcı kimliğiyle ilişkilendirilmiştir; veriler yalnızca rapor oluşturma aşamasında yeniden kimliklendirilmiştir. Tüm deneyler, sertifikalı bir Sınıf II biyolojik güvenlik kabininde, Biyogüvenlik Düzeyi 2 (BSL-2) koşulları altında yürütülmüştür. Biyotehlikeli materyaller kurumsal politikaya uygun olarak imha edilmiştir. Bu çalışmada kullanılan materyaller ile tamponların ve besiyerlerinin hazırlanışı için Materyal Tablosuna ve Ek Dosya 1'e bakınız.

1. Hasta kaynaklı tümör organoidlerinin (PDTO'lar) floresan işaretlenmesi ve yeniden yapılandırılması (Şekil 1)

  1. Eski Matrigel'i uzaklaştırın ve hücre dissosiyasyonunu başlatın.
    1. Kültür plağını BSC'ye yerleştirin. Matrigel damlacıklarını bozmadan kuyucuklardaki medyumu dikkatlice aspire edin.
    2. Kuyucuk başına oda sıcaklığında 1–2 mL hücre dissosiyasyon enzimi ekleyin. Matrigel damlacıklarını tamamen parçalamak için P1000 ve steril bir hücre kazıyıcı ile tekrarlayan şekilde pipetleme yapın.
    3. Hücre karışımını etiketlenmiş 15 mL konik tüpe aktarın. Kalan hücreleri yıkamak için her kuyucuğa ek olarak 1 mL hücre dissosiyasyon enzimi ekleyin ve aynı tüpe aktarın. Kuyucuk başına en az 5 mL enzim toplandığından emin olmak için hacmi ayarlayın. Tüpün kapağını kapatın ve iyice karışması için manuel olarak çalkalayın.
  2. Enzimatik dissosiyasyon
    1. Tüpü 37 °C'lik bir su banyosuna yerleştirin. 10 dk inkübe edin ve dissosiyasyonu kolaylaştırmak için tüpü her 2–3 dk'da bir manuel olarak çalkalayın. Tam disagregasyonu görsel olarak izleyin.
    2. Dissosiyasyon tamamlandığında, 4 °C'de 3 dk boyunca 300 × g hızda santrifüjleyin. Santrifüj sonrası tüpü kontrol edin.
    3. Pellet oluşmamışsa ve Matrigel bulutu kalmışsa, ek hücre dissosiyasyon enzimi ekleyin. Çalkalayın ve 3–5 dk boyunca su banyosuna geri koyun. Pellet hala oluşmamışsa, matriksin çökmesine izin vermek için tüpü 3 dk boyunca buz üzerinde bekletin.
  3. Hücre sayımı ve canlılık değerlendirmesi
    1. Pelleti bozmadan süpernatanı aspire edin. 10 mL +++ yıkama medyumu ekleyin.
    2. 4 °C'de 3 dk boyunca 300 × g hızda santrifüjleyin. Pelleti 1 mL PBS içinde resüspande edin. Tek hücre süspansiyonu elde etmek için nazikçe tritüre edin.
    3. 15 µL hücre süspansiyonunu 15 µL %0,4 Trypan Blue ile karıştırın. Sayım lamının her bir odasına 10 µL yükleyin. Otomatik bir sayıcı veya hemositometre kullanarak canlı hücreleri sayın.
    4. Sayım sırasında hücreleri buz üzerinde tutun. Daha sonraki ekim için ısıtılmak üzere 37 °C'de 6 kuyucuklu, doku dışı, işlem görmüş bir plağı hazır bulundurun.
  4. Tümör hücrelerinin floresan işaretlenmesi
    1. Hücre konsantrasyonunu PBS içinde 1 × 106 canlı hücre/mL olacak şekilde ayarlayın.
    2. 1 mM stok çözelti hazırlamak için CellTrace Far Red boyasını 20 µL DMSO ile yeniden çözün. Vorteksleyin ve kısa süreli santrifüjleyin.
    3. 1 mL hücre süspansiyonu (1 × 106 hücre/mL) başına 1 µL 1 mM stok çözelti ekleyerek nihai boyama konsantrasyonunu 1 µM'ye getirin. Karıştırmak için nazikçe ters çevirin. Işıktan koruyarak 37 °C'de 30 min inkübe edin.
    4. Boyayı yıkamak için 5 hacim PBS ekleyin. 300 × g hızda 5 dk santrifüjleyin. PBS ile iki kez yıkayın.
    5. İşaretleme verimliliğini değerlendirin. Görünür şekilde renklenmiş bir hücre pellet'i, kalitatif kabul kriteri olarak hizmet eder.
    6. Boyama sonrası canlılığı Trypan Blue eksklüzyonu ile belirleyin ve gözlemlenen canlılığı (%80) kaydedin.
      ​NOT: Hücreleri gömme aşamasına yalnızca hücre pellet'i tekdüze renklenme gösteriyorsa ve boyama sonrası canlılık ≥%80 ise ilerletin.
  5. 3B hücresel matriks süspansiyonunun oluşturulması
    1. Pelleti, pellet boyutuna bağlı olarak uygun hacimdeki kültüre özgü medyumda resüspande edin (örneğin, 900.000 hücre için 500 µL medyum; 1,8 milyon hücre için 1.000 µL medyum ekleyin).
    2. Nihai konsantrasyon %67 Matrigel olacak şekilde 1:2 oranında (medyum:matriks) soğutulmuş Matrigel ekleyin. Kabarcık oluşumunu önlemek için iyice ama nazikçe karıştırın (tipik hedef: 6 kuyucuklu plağın kuyucuğu başına 300.000 hücre).
  6. 3B matriks damlacıklarının plağa ekilmesi
    1. 200 µL'lik bir pipet kullanarak 100 µL'lik damlacıklar ekleyin: 6 kuyucuklu plakalarda kuyucuk başına 5 damlacık. Plakaları 5 dk boyunca 37 °C'lik inkübatöre yerleştirin.
    2. Plakaları ters çevirin ve tam polimerizasyon için ek 40 dk daha inkübe edin. Gömülü hücrelerin varlığını mikroskopi ile doğrulayın.
    3. Kuyucuk başına 4 mL medyum (6 kuyucuklu plak) ekleyin ve plakaları inkübatöre geri koyun. 100–300 µm organoid oluşumu için 72 sa boyunca kültüre edin.

2. Öldürme analizi için organoidlerin hazırlanması

  1. 3D organoid yapısını koruyarak bazal membran matrisini çözün.
    1. Organoid plakalarını inkübatörden çıkarın ve bir biyogüvenlik kabinine aktarın. Matrigel kubbelerini rahatsız etmeden her kuyucuktaki kültür ortamını dikkatlice aspire edin.
      NOT: Tam disosiasyon ve tümör hücresi sayımı için bir kuyucuğu ayırın ve dokunmadan bırakın (bkz. Bölüm 2.2).
    2. Bazal membran matrisini çözmek için her kuyucuğa doğrudan 1 mL buz gibi soğuk Cell Recovery Solution ekleyin. Matris plaka yüzeyinden tamamen ayrılana kadar P1000 pipet ve steril hücre kazıyıcı kullanarak kubbeleri mekanik olarak parçalayın.
    3. Üç kuyucuğa kadar olan süspansiyonu, buz üzerinde tutulan önceden etiketlenmiş 15 mL'lik konik bir tüpe aktarın. Tüpe ek olarak 8 mL buz gibi soğuk Cell Recovery Solution ekleyin. Matrisin tamamen çözünmesini sağlamak için tüpü 4 °C'de bir sarsıcının üzerine yatay olarak 30 dk yerleştirin.
      NOT: Floresan işaretleme yapılmışsa numuneleri ışıktan koruyun.
    4. İnkübasyondan sonra, 4 °C'de 3 dk boyunca 300 × g hızında santrifüjleyin. Organoid peletini rahatsız etmeden süpernatantı dikkatlice ve tamamen aspire edin.
    5. 3D organoid mimarisini bozulmadan korumak için peleti, yavaş ve geniş ağızlı pipetleme yöntemiyle komple PDTO ortamında nazikçe yeniden süspanse edin.
      KRİTİK: 3D yapıyı bozan aşırı pipetleme veya vortekslemeden kaçının.
      Santrifüjden sonra kalıntı matris görünürse, soğuk Cell Recovery Solution içindeki inkübasyonu ek 10–15 dk tekrarlayın. Yeniden santrifüjleyin ve durumu tekrar değerlendirin.
  2. Canlı tümör hücresi sayısını belirleyin ve organoid süspansiyon konsantrasyonunu ayarlayın.
    1. Ayırılan kuyucuğu, Bölüm 1'de açıklandığı gibi hücre disosiasyon enzimi kullanarak tamamen disosiye edin. Aralıklı tritürasyon ile 37 °C'de 5–7 dk inkübe edin.
    2. Komple PDTO ortamı ile nötralize edin. 300 × g hızında 5 dk santrifüjleyin. 1 mL ortamda yeniden süspanse edin.
    3. 15 µL hücre süspansiyonunu 15 µL %0,4 Trypan Blue ile karıştırın. Hemositometre veya otomatik bir sayıcı kullanarak canlı hücreleri sayın.
    4. Canlı hücre sayısına göre, komple PDTO ortamında 200.000 canlı hücre/mL elde etmek için gereken dilüsyonu hesaplayın.
      NOT: Örnek hesaplama: Kuyucuk başına 100 µL'de 20.000 tümör hücresi hedefi için 200.000 hücre/mL çalışma konsantrasyonu gereklidir. Tam bir 96 kuyucuklu görüntüleme plakası (içteki 60 kuyucuk) ekilecekse, gereken toplam analiz hacmi 6 mL'dir (100 µL × 60 kuyucuk), ancak %20 ölü hacimle birlikte 7,2 mL hazırlayın. Bu nedenle, gereken hücre sayısı 6 mL × 200.000 hücre/mL = 1,2 × 106 hücre ve 7,2 mL × 200.000 hücre/mL = 1,44 × 106 hücredir.
  3. Öldürme analizi için organoidleri plakaya ekini yapın.
    ​NOT: Siyah duvarlı, şeffaf tabanlı 96 kuyucuklu görüntüleme plakaları kullanın. Her koşulu en az üç teknik tekrarda plakaya ekin.
    1. Çok kanallı bir pipet kullanarak, kuyucuk başına 20.000 canlı tümör hücresi elde etmek için her kuyucuğa 100 µL organoid süspansiyonu dağıtın.
    2. Buharlaşmayı ve kenar etkilerini en aza indirmek için plakanın en dıştaki kuyucuklarını 200 µL steril PBS ile doldurun.
    3. Mikroskop altında homojen dağılımı görsel olarak doğrulayın.
    4. T hücresi eklemeden önce organoidlerin 37 °C'de 10–30 dk boyunca çökelmesini bekleyin.
  4. Sürekli organoid ekspansiyonunu sürdürün.
    1. Sayım sırasında oluşturulan tek hücre süspansiyonunu alın. Hücreleri kültüre özgü ortamda yeniden süspanse edin. Soğutulmuş Matrigel'i %67 nihai konsantrasyona ulaşana kadar ekleyin.
    2. Önceden ısıtılmış 6 kuyucuklu süspansiyon plakalarına kuyucuk başına 100.000 hücre olacak şekilde ekin. Bölüm 1'de açıklandığı gibi polimerize edin ve üzerine ortam ekleyin. Ekspansiyonun devamı için inkübatöre geri koyun.

3. Tümör-reaktif T hücrelerinin hazırlanması

  1. Tümör infiltrasyon lenfositlerinin (TIL'ler) genişletilmesi ve toplanması
    1. Daha önce oluşturulmuş protokolleri13,14 kullanarak tümör örneklerinden TIL'leri izole edin ve genişletin.
    2. Her bir TIL preparasyonu için aşağıdaki özellikleri kaydedin: genişletme sonrası canlılık: ≥80% (Trypan Blue dışlama); CD3⁺ saflığı: ≥85%; CD4⁺/CD8⁺ dağılımı: CD4:CD8 oranı belgelenmiş şekilde, ≥30% CD8⁺ T hücreleri; genişletme süresi ve kültür koşulları: besleyici hücre içermeyen (feeder-free) koşullarda, %10 insan AB serumu ve rekombinant insan IL-2 (600 IU/mL) ile desteklenmiş tam RPMI-1640 içerisinde 10–14 gün; aktivasyon/tükenme fenotipi: analiz anında CD3⁺ hücrelerin PD-1 ≤ 50%, TIM-3 ≤ 30% ve LAG-3 ≤ 20% kısmı; stimülasyon sonrası tespit edilebilir aktivasyon marker'ları (örn. CD69 veya CD25); tümör reaktivitesi kanıtı: en az bir fonksiyonel analiz ile ölçülebilir antijen-spesifik aktivite (örn. artmış IFN-γ üretimi, CD137/4-1BB regülasyonu, CD107a degranülasyonu veya otolog tümör hücrelerine karşı sitotoksisite).
    3. Her bir PDTO'nun yalnızca kendi otolog TIL preparasyonu ile ko-kültür edildiğini doğrulayın.
      NOT: CD8+ sitotoksik popülasyonlarını korumak için besleyici hücre içermeyen genişletme stratejilerini tercih edin. Işınlanmış besleyici PBMC'lerin kullanıldığı protokoller, genişletmeyi CD4+ T hücrelerine doğru kaydırabilir. Besleyici hücre içermeyen sistemler, CD8+ T hücrelerini daha iyi korur.
      Tükenme fenotiplerini ve sitotoksik fonksiyon kaybını önlemek için TIL genişletmesini maksimum 14 gün ile sınırlandırın.
    4. Analiz gününde, T hücrelerini kültür flasklarından toplayın. Hücreleri 15 mL konik tüplere aktarın. Oda sıcaklığında 3 dk boyunca 300 × g hızında santrifüj edin. Süpernatantı tamamen aspire edin.
  2. T hücrelerini fonksiyonel analiz için hazırlayın.
    1. Adım 3.1.4'teki peleti 1 mL temel T-hücre besiyerinde (RPMI 1640 + %10 FBS + %1 Pen/Strep) yeniden süspande edin.
      NOT: Besiyerinin IL-2, IL-15, sitokinler, anti-CD3/CD28 boncukları veya besleyici hücreler içermediğinden emin olun.
      ​KRİTİK: Kalıntı sitokinler veya aktivasyon boncukları, sitotoksisiteyi yapay olarak artıracak ve analiz yorumunu yanıltacaktır.
    2. Trypan Blue kullanarak hücre konsantrasyonunu ve canlılığını belirleyin. Yalnızca canlılık ≥ 80% ise işleme devam edin.
  3. Efektör-hedef (E:T) oranlarını hazırlayın.
    1. E:T oranını T hücreleri:tümör hücreleri olarak tanımlayın.
      NOT: E:T oranını hesaplamak için kullanılan tümör hücresi sayısı, paralel olarak işlenen tamamen disosiye edilmiş bir referans kuyucuktan (Bölüm 2.2) tahmin edilir. Organoidler bozulmamış üç boyutlu yapılar olarak ekildiği için, tümör hücresi sayıları analizi bozmadan bireysel ko-kültür kuyucukları içinde doğrudan belirlenemez. Referans kuyucuktan elde edilen tahmini tümör hücresi konsantrasyonu, aynı havuzlanmış organoid süspansiyonundan hazırlanan tüm kuyucuklara tek tip olarak uygulanır.
      1. Kuyucuk başına 20.000 tümör hücresi ile 2:1 E:T oranı için, kuyucuk başına 40.000 T hücresi ekleyin. Kuyucuk başına 100 µL vermek için T hücrelerini 400.000 hücre/mL konsantrasyonda hazırlayın; böylece, 400.000 hücre/mL × 0,1 mL = 40.000 hücre.
      2. Tam bir 96 kuyucuklu görüntüleme plakası (içteki 60 kuyucuk) ekilecekse, gerekli T-hücre hacmi 6 mL'dir ve %20 ölü hacim ile birlikte T-hücre hacmi 7,2 mL olur.
        Gerekli T hücreleri: 6 mL × 400.000 hücre/mL = 2,4 × 106 hücre
        7,2 mL × 400.000 hücre/mL = 2,88 × 106 hücre
        NOT: Tahmini E:T oranı; organoid boyutundaki varyasyonlar (tipik olarak 100–300 µm çapında), Matrigel çözünmesi ve yıkama sırasında meydana gelen hücre kaybı (Bölüm 2.1) ve plaka hazırlama sırasında meydana gelen küçük pipetleme ve hücre çökme varyasyonları dahil olmak üzere, üç boyutlu organoid kültürü ile ilişkili doğal değişkenliğe tabidir.
        ​Değişkenliği minimize etmek için, her koşul başına en az üç teknik replika ekleyin, organoid bütünlüğünü korumak için geniş ağızlı pipet uçları ve nazik yeniden süspansiyon kullanın ve T hücrelerini eklemeden önce kuyucuklar arasında homojen organoid dağılımını görsel olarak doğrulayın (Bölüm 2.3).
  4. Kaspaz-3 tespit reaktifini hazırlayın.
    1. T-hücre süspansiyonunda 2 µM nihai konsantrasyon elde etmek için, substratı doğrudan T-hücre süspansiyonuna ekleyerek bir çalışma çözeltisi hazırlamak amacıyla Kaspaz-3 substratı kullanın; stok konsantrasyon: 200 µM. Nazikçe karıştırın.
      NOT: Her zaman ışıktan koruyun.
  5. Opsiyonel: İlaç tarama veya immün modülasyon çalışmaları
    ​NOT: Bu analiz; küçük molekül inhibitörlerini (örn. kinaz inhibitörleri, metabolik modülatörler), immün kontrol noktası inhibitörlerini (örn. anti-PD-1, anti-PD-L1) ve kombinasyon tedavilerini değerlendirmek için uyarlanabilir.
    1. İlaçları, matriks disosiyasyonu ve T hücresi eklemesinden önce 24–72 saat boyunca organoidlerle ön-inkübe edin veya T hücreleriyle eş zamanlı olarak ekleyin.
    2. Her koşul için yalnızca araç (vehicle) içeren kontroller ekleyin.
    3. İmmün kontrol noktası inhibitörlerini test ediyorsanız, analizden önce organoidlerde hedef (örn. PD-L1) ve T hücrelerinde PD-1 ekspresyonunu doğrulayın.

4. Ko-kültürü ve deneysel kontrolleri oluşturun.

  1. Ko-kültür kurulumu
    1. Organoidlerin ekildiği 96 kuyucuklu görüntüleme plakasını inkübatörden çıkarın ve biyogüvenlik kabinine aktarın. Homojen dağılım sağlamak için, ekimden hemen önce hazırlanmış olan T hücresi süspansiyonunu (Bölüm 3) nazikçe resüspande edin (Şekil 2A).
    2. Çok kanallı bir pipet kullanarak, ekleyin 100 µL T-hücresi süspansiyonunun ( caspase substratı içeren 2 µM) içeren her bir kuyucuğa 100 µL organoidlerin. Ekledikten sonra, hücrelerin eşit dağılımını sağlamak için plakaya 2-3 kez hafifçe vurun.
      NOT: Organoidlerin bozulmasını önlemek için kuyucuğun tabanına dokunmaktan kaçının. Kuyucukların içinde pipetleme (yukarı-aşağı çekme) yapmayın. Aşırı ajitasyon, organoid bütünlüğünü bozar ve T-hücresi infiltrasyon kinetiğini değiştirir.
    3. Sıcaklık dalgalanmalarını en aza indirmek için plakayı derhal bir canlı hücre görüntüleme sistemine aktarın.
      ​NOT: 1:1 oranında karıştırma sonrası nihai kuyucuk içi konsantrasyonlar: birleştirme 100 µL (Tam Organoid besiyerindeki) organoid süspansiyonundan 100 µL T hücresi süspansiyonunun (temel T hücresi ortamında) eklenmesi, her bir bileşenin konsantrasyonunu yarıya indirir. Nihai konsantrasyonlar şöyledir: B27 Takviyesi 0,5X; Nikotinamid 5 mM; glutamin ikamesi 0,5X; Penisilin/Streptomisin 50 U/mL / 50 µg/mL; HEPES 5 mM; N-Asetilsistein 0.625 mM; Primocin 50 µg/mL; FGF-Basic (FGF-2) 0,5 ng/mL; FGF-10 10 ng/mL; PGE2 0.5 µM; SB202190 5 µM; EGF 25 ng/mL; Y-27632 5 µM; A-83-01 250 nM; NRG1 5 ng/mL; Noggin ve R-Spondin her biri %5 v/v; FBS (T-hücresi ortamından) %5; kaspaz-3 substratı 1 µM nihai kuyuk içi.
      1. Canlı hücre görüntüleme yazılımında, şunları seçerek kinetik veri toplama ayarlarını yapılandırın: Zamanlanmış Tarama tüm analiz süresi boyunca tekrarlanan görüntüleme yapılabilmesi için (Şekil 3B), seçin Standart faz ve floresans uyumluluğu için tarama tipi (Şekil 3C), ve Faz, Yeşil ve Kırmızı kanallarını 10 seviyesinde belirleyin× optimize edilmiş kanal başına kazanım süreleri ile (Şekil 3D).
      2. Hem Yeşil hem de Kırmızı kanallar için kanal başına floresan kazanım (pozlama) süresini yaklaşık 300–400 ms olarak ayarlayın ve 10'u doğrulayın× objektif seçilir (görüntü kalibrasyonu 1.24 µm/px 10'da×).
        NOT: Temsili veri seti, referans verilen canlı hücre analiz sisteminde elde edilmiştir (bkz. Materyal Tablosu). Görüntü analizi, kaydedilmiş bir Analiz Tanımı (red-green-overlap-Bladder olarak adlandırılan) ile Basic Analyzer kullanılarak gerçekleştirilmiştir.
      3. 96 kuyucuklu plakanın her bir iç kuyucuğundan dört görüntü alınacak şekilde ayarlama yapın ve taramaları 36 saate kadar her 2 saatte bir tekrarlayın (Şekil 3A,E).
      4. Bir ... oluşturarak görüntü analizini başlatın yeni Analiz Tanımı ve olanak sağlayan Faz, Yeşilve Kırmızı kanallar (Şekil 4A,B).
      5. Şunlar dahil olmak üzere kırmızı kanal segmentasyon parametrelerini optimize edin: alan eşikleri ve kenar dışlama filtreleritümör objelerini debris ve dubletlerden izole etmek için (Şekil 4C).
      6. Kırmızı (tümör, CellTrace Far Red) kanalı için şu ayarları yapın: Segmentasyon Türü e 2,0 RCU Eşik Değerli Yüzey Uyumu; etkinleştir Kenar Hassasiyeti = 0 ile Kenar Ayırma; set Delik Doldurma = 0 µm2 ve Boyutu Ayarla = 0 piksel; ve bir ... uygulayın minimum nesne alanı filtresi -in / -ın / -un / -ün 50 µm2 (maksimum alan, eksantrisite veya yoğunluk filtreleri uygulanmamıştır).
      7. Yeşil (NucView 488 caspase-3/7) kanalı için, şu şekilde yeşil segmentasyonu oluşturun: Segmentasyon Tipi ayarla Yüzey Uyumu ve bir Eşik değer -in / -un / -ın / -un 2.0 GCUetkinleştir Kenar Duyarlılığı = 0 ile Kenar Ayırma; set Boşluk Doldurma = 0 µm2 ve Boyutu Ayarla = 0 pikselve alan veya yoğunluk filtreleri uygulamayın.
      8. Apoptotik tümör okumasını, Yeşil + Kırmızı çift pozitif nesneler olarak tanımlayın. Çakışmaya ek bir alan veya yoğunluk filtresi uygulamayın. Çakışma kriterlerini, spontan apoptoz ve pozitif öldürme kontrol kuyucuklarına karşı doğrulayın, ardından analiz tanımını tüm kuyucuklara tek biçimde uygulayın.
      9. Kırmızı/yeşil çift pozitif apoptotik nesnelerin oranını belirlemek için her iki kanal için analiz metriklerini yapılandırın; tümör nesnelerinin doğru tanımlandığını doğrulamak için segmentasyon bindirmelerini gözden geçirin (Şekil 4D).
      10. Tüm deneysel zaman noktalarını kapsayacak şekilde tarama sürelerini ve kuyucukları seçin (Şekil 4E), ve tamamlanan analizlerin gözden geçirme ile tablo veya grafik şeklinde veri dışa aktarımı için erişilebilir olduğunu onaylayın (Şekil 4F,G).
      11. Aşağı akış kantifikasyonu için nesne düzeyindeki ve kuyu başına analiz verilerini (zaman noktası başına) dışa aktarın.

Sonuçlar

Burada gösterilen sonuçlar için kullanılan tümör organoid kültürleri oluşturulmuş, pasaj 5'in ötesine genişletilmiş ve her bir kriyotüpte 1 × 106 hücre olacak şekilde 6'dan fazla kriyotüpte depolanmıştır; her bir analiz için kültürler çözme işleminden sonra yeniden genişletilmiştir. Malign epitelyal kimlik ve normal epitelyal veya stromal aşırı büyümeden arındırılmış olma durumu, ebeveyn tümörde mevcut olan somatik mutasyonların korunduğunu kanıtlayan hedefli sekanslama ile ve organoid morfolojisinin orijinal tümörün patolojisiyle uyumlu olduğunu gösteren histolojik gömme işlemi ile doğrulanmıştır; tüm hatların kullanım öncesinde mikoplazma-negatif olduğu onaylanmıştır. Normal epitelyal morfoloji sergileyen veya ebeveyn tümörün moleküler özelliklerini koruyamayan kültürler belirlenmiş ve hariç tutulmuş, böylece analizdeki tümör dışı kontaminasyon minimize edilmiştir.

Gösterilen tüm sonuçlar (Şekil 1, Şekil 2, Şekil 3, Şekil 4 ve Şekil 5), akciğer adenokarsinomu olan tek bir hastadan türetilen eşleşmiş tek bir organoid-TIL çiftinden elde edilmiştir. Tümör örneği, ön neoadjuvan tedavi uygulanmadan gerçekleştirilen cerrahi bir rezeksiyondan alınmış ve organoidler pasaj 21'de kullanılmıştır. Organoidler, ilk izolasyondan gösterilen analize kadar (pasaj 21) yaklaşık 12 hafta boyunca kültürde tutulmuştur. Tümör rezeksiyon tarihi korunan sağlık bilgisi olarak kabul edildiğinden raporlanmamıştır.

Yeniden genişletmenin ardından, PDTO'lar geri kazanılır, sayılır ve 96 kuyucuklu görüntüleme plaklarına ekilir. TIL'ler, eş zamanlı olarak 2:1 efektör-hedef oranında hazırlanır ve ko-kültür kurulumundan hemen önce NucView 488 kaspaz-3 substratı eklenir (Şekil 2A). Ara bir zaman noktasındaki tek bir kuyucuktan alınan temsili görüntüler, beklenen dört kanallı çıktıyı göstermektedir: faz kontrastı, organoid ve immün hücre varlığını doğrular (Şekil 2B); yeşil floresans, kaspaz-3 ile aktive edilmiş apoptotik sinyali tanımlar (Şekil 2C); kırmızı floresans, seçici olarak CellTrace Far Red ile işaretlenmiş tümör organoidlerini işaretler (Şekil 2D); ve birleştirilmiş bindirme (merged overlay), birincil analiz okuması olan kırmızı/yeşil çift pozitif apoptotik tümör objelerini ortaya çıkarır (Şekil 2E). TIL aracılı öldürmenin yokluğunda, kırmızı pozitif yapılar içinde minimal spontan yeşil sinyal beklenir. Nicelleştirme için, kırmızı/yeşil çift pozitif (apoptotik) organoidler, apoptotik PDTO yüzdesi olarak ifade edilir ve zaman içinde ortalama ± SEM olarak grafiğe dökülür; segmentasyon bindirmeleri ise tümör yapısının doğru tanımlandığını doğrular (Şekil 4D).

Altı küçük molekülün 1 µM konsantrasyonda test edildiği temsili bir deneyde, İlaç 4 ve İlaç 5, yaklaşık 24 saatten itibaren taşıyıcıya kıyasla artmış apoptoz göstermektedir (Şekil 5A; ** p < 0.01, *** p < 0.001, **** p < 0.0001); karşılaştırma tek bir temsili deney içindedir. 36 saatlik bitiş noktasındaki keman grafikleri, tekrarlar arasındaki yanıt dağılımına tamamlayıcı bir bakış sunmakta ve bu temsili deneyde İlaç 4 ile İlaç 5'in apoptotik PDTO'larda en büyük artışları sağladığını, İlaç 3'ün ise olası immünsüpresif aktivite ile uyumlu olarak nominal düzeyde azalmış bir öldürme yanıtı gösterdiğini ortaya koymaktadır (Şekil 5B).

Ölçülen apoptozun, doğrudan ilaç sitotoksisitesinden veya efektör hücre kaynaklı sinyalden ziyade tümör infiltrasyonlu lenfosit (TIL) bağımlı öldürmeyi yansıttığını doğrulamak için, temsili bir bileşik (Drug 5); ko-kültür (TIL + organoid), sadece organoid (TIL-siz) ve sadece T hücresi olmak üzere üç paralel kolda, 36 saatlik bir zaman seyri boyunca değerlendirilmiştir (Şekil 5C).

Ko-kültür kolu, 36. saate kadar %19,2 ± 1,0'ye ulaşan (ortalama ± SEM, n = 6 kuyu), ilerleyici ve zamana bağlı bir apoptotik PDTO birikimi göstermişken; sadece organoid içeren (TIL içermeyen) kol boyunca düşük kalmış ve 36. saatte yalnızca %4,0 ± 0,3'e (n = 3 kuyu) yükselerek 4,8 kat daha düşük bir sinyal vermiştir. Sadece T hücresi içeren kontrol grubu, tüm zaman seyri boyunca bazal düzeyde kalmış ( %0,0; n = 3 kuyu), bu durum yalnızca tümör organoidlerinin floresanla işaretlenmiş olmasıyla uyumlu olup okumanın efektör hücrelerden kaynaklanmadığını doğrulamıştır. Birlikte bu kollar, tümör-yalnız bazal düzeyinin üzerindeki net, TIL'ye bağımlı apoptotik öldürmeyi izole eder. Sadece organoid içeren kol ilaç varlığında elde edildiği için, aynı zamanda ilaç-artı-tümör (TIL içermeyen) kontrolü olarak da hizmet eder: İlaç mevcutken ancak TIL yokken apoptoz düşük kalmış (%4,0 ± 0,3 36. saatte), bu da eşleşmiş ko-kültür kolundaki artmış öldürmenin bu bileşik için doğrudan organoid sitotoksisitesi ile açıklanamayacağını göstermiştir. Eşleşmiş bir ilaç-yalnız kolu sadece İlaç 5 için oluşturulmuştur; geri kalan bileşikler için artmış apoptoz, henüz spesifik olarak immün güçlendirmeye atfedilemeyen kombine bir etki olarak tanımlanmış ve bileşik başına ilaç-yalnız kontrolü gerekli bir doğrulama adımı olarak belirlenmiştir.

Bu çalışmanın bulgularını destekleyen tüm veriler herhangi bir kısıtlama olmaksızın mevcuttur. Ham zaman atlamalı görüntü serileri, nesne düzeyindeki dışa aktarma dosyaları, Incucyte Analiz Tanım dosyaları, segmentasyon parametre ayarları, üst veriler ve Şekil 5'in temelini oluşturan istatistiksel kaynak veriler, halka açık bir depoya kaydedilmiş olup açık bir lisans altında doi: 10.5281/zenodo.21676769 adresinden ücretsiz olarak erişilebilir durumdadır. Şekil 5'i oluşturmak için kullanılan nesne düzeyindeki kaynak veriler, plaka haritaları, segmentasyon ayarları ve analiz tanım dosyası Ek Dosya 2'de sunulmuştur.

Organoid yeniden oluşum süreci: diyagram tek hücre süspansiyonunu, boyamayı ve Matrigel kubbelerine ekimi göstermektedir.
Şekil 1: Hasta kaynaklı tümör organoidlerinin floresan işaretlemesi ve üç boyutlu yeniden yapılandırılması. (A) PDTO hazırlama iş akışının şematik genel görünümü: organoidler Matrigel'den ayrıştırılır, tek hücre süspansiyonuna getirilir, CellTrace Far Red boyası ile işaretlenir, bir Matrigel matrisi içinde yeniden süspanse edilir ve ko-kültür deneyi öncesinde 72 saati süren yeniden genişleme için 3B damlacıklar şeklinde ekilir. (B) 15 mL tüplerdeki işaretli hücre peletlerinin, başarılı CellTrace Far Red boyamasını gösteren görünür renklenmeyi ortaya koyan temsilci fotoğrafı. (C) 72 saatlik kültür sonrası yeniden genişlemiş tümör organoidleri içeren bir Matrigel damlacığını gösteren faz kontrast görüntüsü. (D) Kırmızı işaretli tümör organoidlerini (CellTrace Far Red) gösteren floresan üst üste bindirme görüntüsü; ko-kültür deneyi kurulumu öncesinde bozulmamış 3B organoid morfolojisini ve tekdüze floresan işaretlemeyi doğrulamaktadır. Görüntüler 10× büyütmede elde edilmiştir. Ölçek çubukları = 800 µm (C) ve 400 µm (D). Kısaltma: PDTO = hasta kaynaklı tümör organoidi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Organoid-TIL analiz iş akışı şeması; NucView 488 boyası; apoptoz ölçümü; Incucyte sistemi.
Şekil 2. Ko-kültür analiz iş akışı ve TIL aracılı tümör organoid öldürmesinin temsili floresan görüntülemesi. (A) İki paralel hazırlık akışını betimleyen tam ko-kültür analiz iş akışının şeması: (üst yol) organoidlerin Matrigel'den geri kazanımı, sayımı ve 96 kuyucuklu görüntüleme plaklarına ekimi; (alt yol) TIL ekspansiyonu, resüspansiyonu ve kaspaz-3 substratı ile eklenmesi. Her iki akış, kinetik veri toplama ve otomatik analiz için canlı hücre görüntüleme sistemine yerleştirilen 96 kuyucuklu bir plaktaki ko-kültür düzeneğinde birleşir. Tek bir zaman noktasındaki ko-kültür kuyusundan alınan temsili görüntüler: (B) faz kontrast, (C) apoptotik hücrelerde kaspaz-3 ile aktive olmuş NucView 488 sinyalini gösteren yeşil floresan kanalı, (D) CellTrace Far Red ile işaretlenmiş tümör organoidlerini gösteren kırmızı floresan kanalı ve (E) kırmızı/yeşil çift pozitif apoptotik tümör objelerini gösteren birleştirilmiş floresan bindirme görüntüsü. Görüntüler 10× büyütmede elde edilmiştir. Ölçek çubuğu = 400 µm. Kısaltma: TIL = tümör infiltre lenfosit. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Otomatik tarama konfigürasyonu; ayarlar arayüzü; veri toplama; görüntüleme analizi; yazılım kılavuzu.
Şekil 3. Canlı hücre görüntüleme için cihaz tarama kurulumu ve veri toplama parametre konfigürasyonu. (A) Kap türü, görüntü kanalları, objektif, tarama süresi ve veri toplama takvimi dahil olmak üzere plaka haritası ve tarama özellikleriyle birlikte aktif bir taramayı gösteren cihaz planlama paneli. (B) Tüm analiz süresi boyunca boylamsal kinetik görüntülemeyi etkinleştirmek için Scan on Schedule (Takvime Göre Tara) seçeneğinin işaretli olduğu Scan Repeatedly or Once? (Tekrarlı mı yoksa Bir Kez mi Taransın?) iletişim kutusu. (C) Faz kontrastı ve floresan tabanlı analiz uygulamalarını destekleyen Standard (Standart) modun seçildiği tarama tipi seçim paneli. (D) Görüntü kanallarını (Faz, Yeşil, Kırmızı), kanal başına veri toplama sürelerini ve 10× objektif seçimini belirten Scan settings (Tarama ayarları) paneli. (E) Tahmini tarama süresi ile kuyuk başına dört görüntü şeklinde yapılandırılmış, bir 96 kuyucuklu plakanın iç kuyucukları için kuyucuk seçimini gösteren tarama deseni paneli. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayınız.

Görüntü analiz yazılımı iş akışı; mikroskopi görüntü kurulumu; veri tarama/entegrasyonu; eğitim diyagramı.
Şekil 4. Canlı hücre görüntüleme cihazı kurulumu ve entegre yazılım kullanılarak gerçekleştirilen görüntü analiz iş akışı. (A) Yeni bir analiz boru hattı başlatmak için Yeni Analiz Tanımı Oluştur seçeneğinin belirlendiği Analizi Başlat arayüzü. (B) Çift floresan kazanımı için Faz, Yeşil ve Kırmızı kanalların etkinleştirildiği Görüntü kanalı seçimi paneli. (C) Tümör nesnelerini tanımlamak için kullanılan minimum ve maksimum alan eşikleri, kenar hariç tutma ve kalıntı filtreleri dahil olmak üzere kırmızı kanal segmentasyon parametrelerini görüntüleyen Analiz Tanımı arayüzü. (D) Kırmızı/yeşil çift pozitif apoptotik tümör yapılarının doğru tanımlandığını onaylayan temsili bir segmentasyon bindirmesi ile hem yeşil hem de kırmızı kanallar için yapılandırılmış analiz metriklerini gösteren Analiz Tanımı arayüzü. (E) 96 kuyucuklu görüntüleme plakasının iç kuyucuklarında tekrarlanan görüntü kazanımını planlamak için kullanılan Tarama süresi ve kuyucuk seçimi arayüzü. (F) Görüntü dosyası altında tamamlanmış analiz tanımını seçin. (G) Kap bilgileri, analiz türü, mevcut metrikler ve mikroplaka grafiği, grafik ve tablo dışa aktarma dahil olmak üzere veri dışa aktarma seçeneklerini görüntüleyen tamamlanmış analiz özet görünümü. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Apoptotik ilaç yanıt grafiği: zaman seyri, keman grafiği analizi, organoid ilaç testi, tedavi etkinliği.
Şekil 5. Küçük moleküllü ilaçların TIL aracılı tümör organoid öldürme etkilerinin temsili analizi. (A) Birden fazla küçük moleküllü tedavi durumu ve araç kontrolü ile karşılaştırılan, zamanla apoptotik PDTO yüzdelerini gösteren kinetik öldürme eğrileri; ortalama ± SEM olarak sunulmuştur. (B) Tedavi durumları genelindeki apoptotik yanıtların dağılımını görselleştirmek için alternatif bir grafik yaklaşım olarak 36. saatteki bitiş noktası analizini gösteren keman grafikleri; bu temsili deney dahilinde ilaçla tedavi edilen ve araç kontrolü uygulanan ko-kültürler arasında betimleyici karşılaştırma sağlar. (C) Temsili bir bileşik (İlaç 5) için TIL-bağımlılık kontrolleri: ko-kültür (TIL + organoid), yalnızca organoid (TIL yok) ve yalnızca T-hücresi kolları için 36 saatlik zaman seyri boyunca apoptotik PDTO yüzdeleri; apoptotik sinyalin TIL-bağımlı olduğunu ve efektör hücrelerden kaynaklanmadığını doğrular (ko-kültür n = 6 kuyu; yalnızca organoid ve yalnızca T-hücresi n = 3 kuyu; ortalama ± SEM). Kısaltmalar: PDTO = hastadan türetilmiş tümör organoidi; TIL = tümörle ilişkili lenfosit; SEM = ortalamanın standart hatası. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 1: Besiyeri ve tamponların hazırlanması. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 2. Şekil 5 için kaynak veriler ve analiz dosyaları.Bu ZIP klasörü, Şekil 5 bileşik taraması ve İlaç 5 kontrol analizlerini oluşturmak için kullanılan nesne düzeyindeki kaynak verileri, plaka haritalarını, segmentasyon ayarlarını ve analiz tanımlama dosyasını içermektedir. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Bu protokol, hastadan türetilmiş tümör organoidleri (PDTO'lar) ile eşleştirilmiş tümörle ilişkili lenfositler (TIL'ler) arasındaki sitotoksik etkileşimleri değerlendirmek için görüntüleme tabanlı bir canlı hücre görüntüleme protokolünü açıklamaktadır. Üç boyutlu tümör mimarisini, otolog immün efektörleri ve gerçek zamanlı kaspaz-3 aktivasyon ölçümlerini entegre eden bu sistem, fizyolojik olarak ilgili koşullar altında tümör hücresi apoptozunun dinamik değerlendirmesine olanak tanır. İş akışı, yerleşik organoid ve TIL genişletme yöntemlerini kontrollü ko-kültür koşulları ve otomatik görüntü tabanlı nicelik belirleme ile birleştirerek, immün fonksiyonel çalışmalar için görüntüleme tabanlı bir yaklaşım sunar. Yukarı akıştaki PDTO ve TIL izolasyon ve genişletme adımları burada tam olarak açıklanmak yerine önceden yayınlanmış protokollere göre gerçekleştirildiğinden, bu iş akışının tamamen yeniden üretilmesi için bu protokole ek olarak ilgili kaynak referanslara başvurulması gerekmektedir.

Bu yaklaşımın temel bir gücü, organoidler içindeki tümöre özgü heterojenliğin korunmasıdır. İki boyutlu monokatman sistemlerin aksine, organoidler üç boyutlu yapıyı ve tümör hücreleri arasındaki etkileşimleri sürdürür. Eşleşmiş TIL'ler ile birlikte kültüre edildiğinde bu durum; T hücresi infiltrasyonunun, kontağa bağlı öldürmenin ve zaman içindeki kinetik yanıtların değerlendirilmesine olanak tanır. Kaspaz-3 ile aktive olan floresan bir substratın kullanımı, konfluans kaybı veya ATP tabanlı son nokta canlılık analizleri gibi dolaylı belirteçlere güvenmek yerine, apoptozun doğrudan ölçülmesini sağlar.

Deneysel başarıyı belirleyen birkaç kritik parametre bulunmaktadır. Ekim sırasında organoid bütünlüğü esastır; başlangıçtaki tümör disosiyasyonu sırasında aşırı sindirim veya ko-kültür kurulumu sırasındaki aşırı mekanik bozulma, organoidleri fragmente ederek kırmızı nesne sayımlarını yapay olarak artırabilir ve apoptoz hesaplamalarını değiştirebilir. Tutarlı organoid boyut dağılımı, segmentasyon doğruluğunu artırır ve kuyucuklar arası değişkenliği azaltır. Benzer şekilde, hatalı T hücresi sayımı veya kümeleşme öldürme kinetiğinde değişkenliğe yol açtığından, replikalar arasında doğru efektör-hedef (E:T) oranları korunmalıdır. Ekimden hemen önce yapılacak nazik bir resüspansiyon bu sorunu en aza indirir. Laboratuvar protokolümüzde belirlenen standart çalışma parametresiyle uyumlu olarak, gösterilen temsili veri setinde yalnızca tek bir E:T oranı (2:1) değerlendirilmiştir. Yerleşik T hücresi sitotoksisite literatürüne dayanarak, daha yüksek E:T oranlarının genellikle tümör öldürmeyi artırması beklenmektedir ve bu parametrenin resmi titrasyonu, bu platformun gelecekteki doğrulama çalışmaları için bir yön olarak kalmaktadır. Segmentasyon parametrelerinin seçimi ve doğrulanması başka bir kritik adımı temsil eder. Minimum ve maksimum nesne boyutu eşikleri, sağlam tümör yapılarını yakalarken debrisleri hariç tutmalıdır; aşırı izin verici eşikler tümör sayımlarını şişirirken, aşırı kısıtlayıcı eşikler tümör yükünü olduğundan az gösterir. Kırmızı ve yeşil sinyaller için örtüşme kriterleri, hem spontan apoptoz kontrolleri hem de pozitif öldürme kontrolleri kullanılarak doğrulanmalı ve yüzde apoptoz hesaplamalarında yanlılığı önlemek için tüm kuyucuklara tutarlı bir şekilde uygulanmalıdır.

Uygun kontrollerin eklenmesi yorumlanabilirliği güçlendirir. Yalnızca tümör içeren kuyucuklar bazal kırmızı floresan stabilitesini belirlerken, tümör artı substrat kontrolleri immün aktiviteden bağımsız spontan apoptozu niceliklendirir. Yalnızca T hücresi içeren kontroller, ölen lenfositlerden kaynaklanan arka plan kaspaz sinyalini belirler. Pozitif apoptoz kontrolleri substrat işlevselliğini doğrular ve segmentasyon eşiklerini valide eder. Bazal apoptik oranlar organoid hatları arasında farklılık gösterebileceğinden, bu kontroller bağımsız tümör-TIL çiftlerini karşılaştırırken özellikle önemlidir.

Bu görüntüleme tabanlı platform, krom salınımı veya uç nokta ATP tabanlı canlılık ölçümleri gibi geleneksel sitotoksisite analizlerine kıyasla çeşitli avantajlar sunar. Gerçek zamanlı görüntüleme, tümör-immün etkileşimlerinin sürekli ve tahribatsız bir şekilde izlenmesine olanak tanıyarak, immün aracılı öldürmenin hassas kinetik çözünürlüğünü sağlar. Yalnızca tek bir kümülatif ölçüm sağlayan ve geçici veya ardışık sitotoksik olayları gizleyebilen uç nokta analizlerinin aksine, boylamsal görüntüleme, hızlı erken sitotoksik yanıtları gecikmiş veya ilerleyici apoptozdan ayırır. Bu zamansal çözünürlük; T hücresi aktivasyonu veya infiltrasyonu ile ilişkili gecikme fazlarının, pik öldürme aralıklarının ve T hücresi tükenmişliğini veya hedef hücre direncini yansıtabilecek plato fazlarının tanımlanmasına izin verir. Aynı kuyucuktan alınan tekrarlı ölçümler, örnekler arası değişkenliği azaltır ve birden fazla zaman noktasında paralel plakalar kullanma gereksinimini ortadan kaldırır. Tümör yükü ve apoptotik dönüşüm her aralıkta eş zamanlı olarak quantifiye edildiğinden, dinamik normalizasyon mümkündür; bu da immün öldürmeyi spontan hücre ölümünden ayıramayan toplu lizis analizlerine kıyasla doğruluğu artırır. Topluca bu yaklaşım, sitotoksik fonksiyonun geleneksel tek zaman noktalı analizlerden daha fizyolojik olarak bilgilendirici ve mekanistik olarak yorumlanabilir bir değerlendirmesini sağlar.

Ancak, bazı sınırlamalar göz önünde bulundurulmalıdır. Hasta kaynaklı tümör organoidleri, geleneksel iki boyutlu kültürlere göre doğal tümör mimarisini daha yakından taklit etse de, tümör mikroçevresinin stromal, vasküler veya myeloid bileşenlerini tam olarak modellemezler. Ek olarak, 10× büyütmedeki görüntüleme, boylamsal analiz için yeterli verim sağlar ancak yoğun şekilde paketlenmiş organoidler içindeki tek hücreli etkileşimleri çözümleyemeyebilir. Daha yüksek büyütmeli görüntüleme uzaysal çözünürlüğü artırabilir ancak görüş alanını ve analiz verimini azaltır. Bu analiz, özellikle tümör hücrelerinin caspase-3-bağımlı apoptotik ölümünü nicelleştirir. Nekroz veya nekroptoz dahil olmak üzere caspase-bağımsız mekanizmalar aracılığıyla meydana gelen T-hücresi aracılı sitotoksisite bu okuma ile tespit edilemez ve bu nedenle analizin kapsamı dahilinde yorumlanmalıdır. Ayrıca, tek hücreli ayrıştırma, etiketleme ve 72 h yeniden genişletme, prensipte alt popülasyonları seçebilir; buna rağmen bu süre zarfında yeniden oluşan 100–300 µm yapıları, ebeveyn organoidlerin çok hücreli üç boyutlu mimarisini korur ve ebeveyn kültürlere kıyasla belirgin bir morfolojik değişiklik gözlemlenmemiştir, ancak yeniden genişletme öncesi ve sonrası klonal kompozisyonun resmi bir karşılaştırması yapılmamıştır. Mevcut çalışma, analizin dinamik aralığını resmi olarak kalibre etmek için, beklenen öldürme artışına sahip bir PD-L1⁺/PD-1⁺ organoid-TIL çiftinde bir immün kontrol noktası inhibitörü (örneğin, anti-PD-1) gibi farmakolojik bir pozitif kontrol referansı içermemektedir; böyle bir referans immün güçlendirici ajanın dahil edilmesi önemli bir sonraki doğrulama adımıdır ve burada rapor edilen karşılaştırmalı bileşik sonuçları buna göre yorumlanmalıdır. Bu örneklerde eşleşmiş tek başına ilaç (TIL içermeyen) kontrolü yalnızca İlaç 5 için gerçekleştirilmiştir; hücre ölümündeki göreceli artış, bileşik başına tek başına ilaç kontrolü bulunmayan diğer bileşiklere atfedilemez. Bu görüntü tabanlı okumanın, akış sitometrik Annexin V boyaması veya konfokal tek hücreli onaylama gibi bağımsız bir altın standart hücre ölümü ölçümüne karşı ortogonal, aynı örnek üzerinden doğrulaması burada yapılmamış olup, kırmızı/yeşil çift pozitif okumanın spesifikliğini daha fazla belirlemek için temel bir sonraki adım olarak tanımlanmıştır17.

Ek bir husus, CellTrace Far Red floresansının her tümör hücresi bölünme döngüsüyle kademeli olarak seyrelmesidir. Sonuç olarak, 72 h'lik organoid toparlanma süresi ve ardından gelen görüntüleme penceresi sırasındaki proliferasyon, sonraki zaman noktalarında floresans yoğunluğunu azaltabilir; bu durum, tespit edilebilir CellTrace-pozitif tümör objelerinin sayısını potansiyel olarak düşürebilir ve paydanın azalması yoluyla hesaplanan apoptoz yüzdesini hafifçe artırabilir. Bu potansiyel karıştırıcı faktörü izlemek için, CellTrace Far Red-pozitif objelerin sayısı görüntüleme süresi boyunca boylamsal olarak takip edilmiş ve kuyucuklar, apoptozla ilişkili caspase-3/7 aktivasyonundan bağımsız olarak kırmızı-pozitif sinyalde meydana gelen belirgin düşüşler açısından değerlendirilmiştir. Görüntüleme penceresi boyunca CellTrace-pozitif objelerde açıklanamayan önemli bir kayıp gözlemlenmemiş olup, bu durum boya seyrelmesinin, apoptoz ölçümlerindeki gözlemlenen değişikliklere ana katkıda bulunan bir faktör olma ihtimalinin düşük olduğunu göstermektedir. Bununla birlikte, bu durum floresans seyrelmesi tabanlı tümör hücresi takibinin doğal bir sınırlaması olmaya devam etmektedir ve geç zaman noktası ölçümleri yorumlanırken dikkate alınmalıdır.

Hasta kaynaklı örnekler arasındaki biyolojik değişkenlik, bu analiz platformunun hem güçlü yönünü hem de zorluğunu temsil eder. Bu değişkenlik klinik olarak anlamlı tümör heterojenitesini yansıtsa da, uygun deneysel tasarım, çalışma büyüklüğü ve replikasyon gereksinimleri belirlenirken biyolojik varyasyonu dikkate almalıdır. Her benzersiz tümör–TIL çifti bağımsız bir biyolojik replika olarak kabul edilmeli, teknik replikalar ise örnek içi analiz değişkenliğini değerlendirmek için kullanılmalıdır. Şekil 5'te gösterilen temsili veri seti, teknik triplika olarak analiz edilmiş tek bir organoid–TIL çiftini yansıtmaktadır; bu nedenle, sunulan iki yönlü tekrarlı ölçümler ANOVA'sı, söz konusu bireysel örnek içindeki analiz değişkenliğini tanımlar ve hastalar arası biyolojik değişkenliğin bir değerlendirmesi olarak yorumlanmamalıdır. Her çalışma için gereken bağımsız organoid–TIL çifti sayısı; beklenen etki büyüklüğü, biyolojik değişkenlik ve deneysel hedeflere dayalı prospektif güç hesaplamaları kullanılarak belirlenmelidir. Analiz hassasiyetini nicelleştirmek için teknik replikalar dahil edilmeli, ancak bunlar bağımsız biyolojik replikaların yerini tutan unsurlar olarak görülmemelidir

Bu protokolün gelecekteki modifikasyonları, T hücresi aracılı sitotoksisiteyi düzenleyen mekanizmaları çözümlemek için immün kontrol noktası blokajı, sitokin modülasyonu, küçük molekül inhibitörleri veya genetik perturbasyonları içerebilir. Tek hücre transkriptomiği veya uzaysal görüntüleme ile entegrasyon, mekanistik içgörüyü daha da artırabilir. Ek olarak, yüksek kapasiteli 384 kuyucuklu formatlara adaptasyon, ilaç tarama uygulamalarına olanak sağlayabilir. Bu platform, poliklonal TIL'ler yerine kimerik antijen reseptörü T hücresi (CAR-T) tedavilerini değerlendirmek için de kolayca uyarlanabilir; bunun için yalnızca ko-kültür öncesinde PDTO'larda hedef antijen ekspresyonunun doğrulanması ve hedef üzerindeki özgünlüğü onaylamak için antijen-negatif organoid kontrollerinin uygun şekilde dahil edilmesi gerekir18,19,20.

Özetle bu protokol, otolog tümör organoidlerine karşı TIL aracılı sitotoksisiteyi gerçek zamanlı olarak ölçmek için görüntü tabanlı, kantitatif bir yöntem sunmaktadır. Organoid bütünlüğüne gösterilen özen, tutarlı efektör oranları, doğrulanmış segmentasyon eşikleri ve uygun kontroller güvenilir kantifikasyon sağlar. Bu sistem; tümör immünolojisi, immün kontrol noktası modülasyonu, adaptif hücre tedavisi optimizasyonu ve kişiselleştirilmiş fonksiyonel immün profilleme çalışmalarında geniş çapta uygulanabilir.

Açıklamalar

B.D.H., Faeth Therapeutics'in kurucu ortağı ve danışmanıdır. O.E., Volastra Therapeutics ve Owkin şirketlerinde hisse sahibidir ancak bunun bu projeyle bir ilgisi yoktur. Ne Faeth Therapeutics, ne Volastra Therapeutics ne de Owkin; bu çalışma için finansman, malzeme, ekipman, yazılım, fikri mülkiyet veya çalışma tasarımı girdisi sağlamamıştır. Geri kalan yazarlar herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

YAPAY ZEKA KULLANIMI BEYANI:
Bu çalışmanın hazırlanması sırasında, yazar(lar) dil düzenlemesi için Claude kullanmıştır. Bu araç/servis kullanıldıktan sonra, yazar(lar) içeriği gerektiği şekilde gözden geçirmiş ve düzenlemiş olup, yayınlanan makalenin içeriği için tüm sorumluluğu üstlenmektedir.

Teşekkürler

Kurumsal kaynaklara erişim ve cömert destekleri için Weill Cornell Medicine bünyesindeki Englander Institute for Precision Medicine'a şükranlarımızı sunarız. Bu çalışma ayrıca, Olivier Elemento ve Benjamin D. Hopkins'e verilen MERIT Program Gift / The Medical Excellence Foundation, Inc. (ödül# 61500857) tarafından da desteklenmiştir. Fon sağlayıcının çalışma tasarımı, veri toplama, analiz veya taslak hazırlama süreçlerinde herhangi bir rolü olmamıştır. Noggin ve R-Spondin salgılayan HEK293T üretici hatları, Yu Chen laboratuvarı (Memorial Sloan Kettering Cancer Center) tarafından nezaketle hediye edilmiş olup daha önce açıklandığı şekilde oluşturulmuştur21.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
15 mL Konik TüplerCorning430791Hücre toplama ve santrifüjleme
6 Kuyucuklu Doku Kültürü İşlemi Görmemiş PlakalarGreiner Bio-One6571853D organoid ekimi ve ekspansiyonu
A-83-01 (TGF-beta inhibitörü)Tocris Bioscience2939Komple Organoid Besiyeri
Advanced DMEM/F12Thermo Fisher Scientific12634010Besiyeri Bileşeni
B27 Supplement (50X), serumsuzThermo Fisher Scientific17504044Komple Organoid Besiyeri
Siyah Duvarlı, 96 Kuyucuklu Optik Tabanlı Mikroplaka, siyah, TC yüzeyliNunc165305Öldürme deneyi için canlı hücre görüntüleme plakası
Cell Recovery SolutionCorning3542533D organoid yapısını koruyarak Matrigel'in soğuk çözünmesi
CellTrace Far Red Hücre Proliferasyon KitiThermo Fisher ScientificC34564Tümör hücrelerinin floresan işaretlenmesi (kırmızı kanal)
Sınıf II Biyogüvenlik KabiniThermo Fisher Scientific1375 (1300 Serisi A2, 4 ft)BSL-2 altında aseptik çalışma
CO2 İnkübatörü (37 °C, 5% CO2, nemlendirilmiş)Thermo Fisher Scientific51030400 (Heracell VIOS 160i)Organoid ekspansiyonu ve ko-kültür inkübasyonu
Countess 3 Otomatik Hücre SayacıThermo Fisher Scientific (Invitrogen)AMQAX2000Otomatik hücre sayımı/viyalite (Countess lamları ile kullanılır, C10312)
Countess Sayım Lamları (veya hemositometre)Thermo Fisher ScientificC10312Otomatik hücre sayımı
Dimetil Sülfoksit (DMSO), sterilSigma-AldrichD2650CellTrace Far Red boyasının yeniden çözülmesi
Dulbecco Fosfat Tamponlu Salin (PBS), 1X, Ca2+/Mg2+ içermeyenCorning21-040-CVRSayım ve boya işaretlemesi için hücre resüspansiyonu
Fetal Bovin Serum (FBS), ısı ile inaktive edilmişThermo Fisher Scientific16140071Besiyeri Bileşeni
GlutaMAX-I Supplement (100X)Thermo Fisher Scientific35050061Besiyeri Bileşeni
GraphPad Prism (v10.6.1)GraphPad Software / DotmaticsVersion 10.6.1İstatistiki analiz (iki yönlü RM ANOVA) ve grafik çizimi
HEK293T Üretici Hücre Hatları (Noggin ve R-Spondin salgılayan)Yu Chen Lab, Memorial Sloan Kettering Cancer Center (MSKCC)Hediye (bkz. Gao et al., Cell 2014)Kondisyonlu besiyeri üretimi (Bölüm 0.2); Yu Chen Lab'dan (MSKCC) nazik bir hediye; Gao et al., Cell 2014, DOI: 10.1016/j.cell.2014.08.016'daki gibi üretilmiştir
HEPES (1 M çözelti)Thermo Fisher Scientific15630080Besiyeri Bileşeni
İnsan Rekombinant FGF-10Thermo Fisher ScientificPHG0204Komple Organoid Besiyeri
İnsan Rekombinant FGF-Basic (FGF-2)Thermo Fisher ScientificPHG0261Komple Organoid Besiyeri
Incucyte Temel Yazılımı (v2024B)SartoriusIntegrated software v2024BGörüntü alım çizelgelemesi ve otomatik segmentasyon/analiz
Incucyte S3 Canlı Hücre Analiz SistemiSartorius4647Canlı hücre görüntüleme cihazı (37 °C, 5% CO2); faz + çift floresans alımı
Ters Faz-Kontrast / Floresans MikroskobuNikonEclipse Ts2-FLOrganoid kalite kontrolü ve görsel segmentasyon onayı
Laboratuvar Dondurucusu (−20 °C / −80 °C)Thermo Fisher ScientificTSX40086A (TSX Serisi −86 °C)Büyüme faktörü ve kondisyonlu besiyeri alikotlarının saklanması
Laboratuvar Sallayıcı / Rocker Platform (4 °C uyumlu)Benchmark ScientificB3D2300 (BenchRocker 3D)Soğuk Cell Recovery Solution içinde matris çözünmesi (Bölüm 2.1)
Matrigel Bazal Membran Matrisi, Büyüme Faktörü AzaltılmışCorning356231Organoid gömme ve ekspansiyonu için 3D matris
Fare Rekombinant EGFPeproTech315-09Komple Organoid Besiyeri
N-AsetilsisteinSigma-AldrichA9165Komple Organoid Besiyeri
NikotinamidSigma-AldrichN0636Komple Organoid Besiyeri
Noggin (kondisyonlu besiyeri veya rekombinant)Lab-hazırlanmış alikot—Komple Organoid Besiyeri
NRG1 (Neuregulin-1 / Heregulin)R&D Systems396-HBKomple Organoid Besiyeri
NucView 488 Caspase-3 Substratı (200 µM stok)Biotium30029Kaspaz-3 aktivasyonunun gerçek zamanlı tespiti (apoptoz okuması, yeşil kanal)
Penisilin-Streptomisin Çözeltisi (100X)Thermo Fisher Scientific15140122Besiyeri Bileşeni
PGE2 (Prostaglandin E2)Sigma-AldrichP0409Komple Organoid Besiyeri
PrimocinInvivoGenant-pm-1Komple Organoid Besiyeri
Soğutmalı Santrifüj (salıncak kovalı, 300 × g, 4 °C)Eppendorf022628187 (Centrifuge 5810 R, A-4-62 rotor)Disosiyasyon ve yıkama santrifüj adımları
RPMI 1640 BesiyeriThermo Fisher Scientific11875093T-hücresi resüspansiyonu için temel besiyeri
R-Spondin (kondisyonlu besiyeri veya rekombinant)Lab-hazırlanmış alikot—Komple Organoid Besiyeri
SB202190 (p38 MAPK inhibitörü)Sigma-AldrichS7076Komple Organoid Besiyeri
StaurosporinSigma-AldrichS4400Pozitif öldürme kontrolü; kaspaz substrat fonksiyonelliğini onaylamak için pro-apoptotik ajan
Stericup Steril Vakum Filtrasyon Sistemi (0.22 µm)MilliporeSigma (Merck)S2GPU05RENoggin ve R-Spondin kondisyonlu besiyerlerinin filtrasyonu/üretimi (Bölüm 0.2)
Steril Hücre KazıyıcıCorning3008Matrigel kubbelerinin mekanik parçalanması
Trypan Blue Çözeltisi, %0,4Thermo Fisher Scientific15250061Boya dışlama yoluyla viyalite değerlendirmesi
TrypLE Express Enzimi (1X)Thermo Fisher Scientific12604021Matrigel ve organoidlerin enzimatik disosiyasyonu
Su Banyosu (37 °C)Thermo Fisher ScientificTSGP05 (Precision GP 05)Enzimatik disosiyasyon ve besiyeri ısıtma
Y-27632 (ROCK İnhibitörü)Sigma-AldrichY0503Komple Organoid Besiyeri

Kaynaklar

  1. Reck M, et al. Pembrolizumab versus chemotherapy for PD-L1-positive non-small-cell lung cancer. N Engl J Med. 2016;375(19):1823-33.
  2. Larkin J, et al. Overall survival in patients with advanced melanoma who received nivolumab versus investigator’s choice chemotherapy in CheckMate 037: a randomized, controlled, open-label phase III trial. J Clin Oncol. 2018;36(4):383-90.
  3. Weber J, et al. Adjuvant nivolumab versus ipilimumab in resected stage III or IV melanoma. N Engl J Med. 2017;377(19):1824-35.
  4. Karimi MA, et al. Measuring cytotoxicity by bioluminescence imaging outperforms the standard chromium-51 release assay. PLoS One. 2014;9(2):e89357.
  5. Kaja S, Payne AJ, Naumchuk Y, Koulen P. Quantification of lactate dehydrogenase for cell viability testing using cell lines and primary cultured astrocytes. Curr Protoc Toxicol. 2017;72:2.26.1-2.26.10.
  6. Crouch SPM, Kozlowski R, Slater KJ, Fletcher J. The use of ATP bioluminescence as a measure of cell proliferation and cytotoxicity. J Immunol Methods. 1993;160(1):81-8.
  7. Pauli C, et al. Personalized in vitro and in vivo cancer models to guide precision medicine. Cancer Discov. 2017;7(5):462-77.
  8. Lee SH, et al. Tumor evolution and drug response in patient-derived organoid models of bladder cancer. Cell. 2018;173(2):515-28.e17.
  9. Dijkstra KK, et al. Challenges in establishing pure lung cancer organoids limit their utility for personalized medicine. Cell Rep. 2020;31(5):107588.
  10. Veninga V, Voest EE. Tumor organoids: opportunities and challenges to guide precision medicine. Cancer Cell. 2021;39(9):1190-201.
  11. Wang HM, et al. Using patient-derived organoids to predict locally advanced or metastatic lung cancer tumor response: a real-world study. Cell Rep Med. 2023;4(2):100911.
  12. Betge J, et al. The drug-induced phenotypic landscape of colorectal cancer organoids. Nat Commun. 2022;13(1):3135.
  13. Dijkstra KK, et al. Generation of tumor-reactive T cells by co-culture of peripheral blood lymphocytes and tumor organoids. Cell. 2018;174(6):1586-98.e12.
  14. Cattaneo CM, et al. Tumor organoid-T-cell coculture systems. Nat Protoc. 2020;15(1):15-39.
  15. Votanopoulos KI, et al. Model of patient-specific immune-enhanced organoids for immunotherapy screening: feasibility study. Ann Surg Oncol. 2020;27(6):1956-67.
  16. Harter MF, et al. Analysis of off-tumour toxicities of T-cell-engaging bispecific antibodies via donor-matched intestinal organoids and tumouroids. Nat Biomed Eng. 2024;8(4):345-60.
  17. Gelles JD, Chipuk JE. Robust high-throughput kinetic analysis of apoptosis with real-time high-content live-cell imaging. Cell Death Dis. 2016;7(12):e2493.
  18. Schnalzger TE, et al. 3D model for CAR-mediated cytotoxicity using patient-derived colorectal cancer organoids. EMBO J. 2019;38(12):e100928.
  19. Ehlen L, et al. Lung tumouroids as a testing platform for precision CAR T cell therapy. Nat Biomed Eng. 2026;10:815-31.
  20. Logun M, et al. Patient-derived glioblastoma organoids as real-time avatars for assessing responses to clinical CAR-T cell therapy. Cell Stem Cell. 2025;32(2):181-90.e4.
  21. Gao D, et al. Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer. Cell. 2014;159(1):176-87.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

T m r nfiltre LenfositlerCanl H cre G r nt lemeKaspaz 3 AktivasyonuFloresan TespitG r nt AnaliziHasta T revli Organoidlermm noterapi Analizi

Bu makale yayımlandı

Video yakında

Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.