Bu protokol, halka açık transkriptomik veri setleri ve kolon epitel hücre doğrulamasını entegre ederek S100P'yi inflamatuar bağırsak hastalığı, kolorektal kanser ve pankreas adenokarsinomu ile ilişkili ortak bir biyobelirteç olarak tanımlar.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Araştırma makalesi
* These authors contributed equally
Bu protokol, halka açık transkriptomik veri setleri ve kolon epitel hücre doğrulamasını entegre ederek S100P'yi inflamatuar bağırsak hastalığı, kolorektal kanser ve pankreas adenokarsinomu ile ilişkili ortak bir biyobelirteç olarak tanımlar.
İltihaplı bağırsak hastalığı (IBD), kolorektal kanser (CRC) ve pankreas adenokarsinoması (PAAD) riskinin artmasıyla ilişkilidir, ancak bu hastalıklar arasında paylaşılan moleküler özellikler henüz tam olarak anlaşılmamıştır. Bu çalışma, entegre transkriptomik analiz ve deneysel doğrulama yoluyla IBD, CRC ve PAAD ile ilişkili ortak genleri ve biyolojik yolları belirlemeyi amaçladı. IBD, CRC ve PAAD için gen ifade veri setleri The Cancer Genome Atlas ve Gene Expression Omnibus veritabanlarından alınmıştır. Hastalıkla ilişkili ve paylaşılan genlerin belirlenmesi için ağırlıklı gen ortak ifade ağı analizi ve diferansiyel ifade analizi gerçekleştirildi. Gen Ontolojisi ve Kyoto Genler ve Genomlar Ansiklopedisi (analizler, zenginleştirilmiş biyolojik fonksiyonları ve yolları incelemek için kullanıldı. İmmün hücre infiltrasyonu, RNA Transkriptlerinin Göreceli Alt Kümelerini Tahmin Ederek Hücre Tipi Tanımlama yöntemiyle değerlendirildi. Yaygın genlerin tanısal performansını değerlendirmek için alıcı çalışma karakteristikleri analizi yapıldı. S100P'nin hücresel dağılımını incelemek için tek hücreli RNA dizileme analizi yapıldı. Ayrıca, S100P aşağı regulasyonunun etkileri lipopolisakkarit (LPS) ile uyarılan kolon epitel hücrelerinde değerlendirildi. Toplamda 162 hastalıkla ilişkili gen ve dört yaygın gen tespit edildi. Fonksiyonel zenginleştirme analizleri, interlökin-17 sinyal yolu da dahil olmak üzere bağışıklık ve iltihapla ilgili yolların önemli ölçüde zenginleştiğini gösterdi. İmmün infiltrasyon analizi, IBD, CRC ve PAAD genelinde çeşitli bağışıklık hücre popülasyonlarında benzer eğilimleri ortaya koydu. Tek hücreli analiz, üç hastalıktan epitel hücrelerinde S100P ekspresyonunun yükseldiğini gösterdi. S100P'nin aşağı regulasyonu, LPS ile uyarlanan kolon epitel hücrelerinin proliferatif kapasitesini geri kazandı ve inflamatuar sitokin ekspresyonunu azalttı. Entegre transkriptomik analiz, S100P'yi IBD, CRC ve PAAD ile ilişkili bir biyobelirteç olarak tanımladı ve bu hastalıklar arasında ortak bağışıklık ilişkili özellikleri ortaya koydu.
İltihap bağırsak hastalığı (IBD), gastrointestinal sistemi etkileyen ülseratif kolit ve Crohn hastalığı dahil olmak üzere bağışıklıkla ilgili bozuklukların bir spektrumunutemsil eder 1. IBD'nin etiyolojisi oldukça karmaşıktır ve mukoza bağışıklık anormallikleri, disbiyoz ve genetik duyarlılıkiçerir 2. IBD, artan insidans oranları ve önemli ekonomik yüklerle küresel bir sağlık sorunudur ve artan yaygınlığı önemli dikkatçekmiştir 1. Önemli olarak, IBD hastalarında kolorektal kanser (CRC)3 ve pankreas adenokarsinom (PAAD)4 gelişme riski önemli ölçüde artmıştır. Bu ilişki iyi belgelenmiş olsa da, IBD, CRC ve PAAD arasındaki genetik çapraz konuşma hâlâ tam olarak anlaşılmamaktadır.
Önceki çalışmalar, IBD, CRC ve PAAD'ın ortak patojenik süreçleri paylaştığını güçlü bir şekilde öne sürmektedir; Ancak, spesifik ve hassas tanısal biyobelirteçler hâlâ eksik olmakta ve ortak patojenik mekanizmalar tam olarak açıklanmamıştır. Neyse ki, yüksek verimli dizileme teknolojilerinin hızlı ilerlemesi ve yaygın erişimi sayesinde, IBD, CRC ve PAAD hastalarından alınan çok sayıda transkriptomik veri seti kamuya açık hale gelmiş ve bu hastalıklar arasındaki moleküler bağlantıların sistematik olarakincelenmesini mümkün kılmıştır 2,5,6.
Bu çalışma, IBD, CRC ve PAAD hastalarından yüksek verimli dizileme verilerini kullanarak ağırlıklı gen ortak ekspresyon ağı analizi (WGCNA) ve diferansiyel ifade analizi kullanarak hastalıkla ilişkili ve paylaşılan genleri tespit etti. Bu genler, IBD, CRC ve PAAD arasında potansiyel ortak sinyal yolları belirlemek için daha fazla araştırıldı. Ayrıca, bu yaygın genlerin tanısal değerini de değerlendirdik. Tek hücreli RNA dizileme (scRNA-seq) analizi, anahtar gen S100P'nin ağırlıklı olarak epitel hücrelerinde ekspresyona geçtiğini gösterdi. Son olarak, S100P'nin IBD'deki biyolojik rolünü araştırdık.
Sonuç olarak, bu çalışma IBD, CRC ve PAAD ile ilişkili yaygın tanısal biyobelirteçleri ve biyolojik yolları belirlemeyi, böylece bu hastalıkların ortak önlenmesi ve tedavisi hakkında değerli klinik bilgiler sağlamayı amaçladı.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Bu çalışma, Kanser Genomu Atlası (TCGA) ve Gen İfadesi Omnibus'u (GEO) gibi kamuya açık ve kimliği yok edilmiş veri setlerini ve yerleşik ticari hücre hatlarını kullandı. Yeni işe alınan insan katılımcılar, tanımlanabilir hasta bilgileri veya hasta kaynaklı örnekler dahil edilmedi. Tüm analizler, ilgili kurumsal yönergeler ve kamu veritabanlarının kullanım şartlarına uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Bu nedenle, bu çalışma için ek kurumsal etik onay ve bilgilendirilmiş onay gerekmemiştir.
Veri Kaynağı
IBD kohortları (GSE179285; platform: GPL6480 ve GSE24287; platform: GPL6480), CRC kohortları (TCGA-CRC; platform: Illumina HiSeq 2000 ve GSE87211; platform: GPL13497) ve PAAD kohortları (GSE128735; platform: GPL20301 ve GSE62452; platform: GPL6244) için RNA-seq verileri TCGA ve GEO'dan indirildi. Tüm veri setlerine 5 Aralık 2025'te erişildi.
Her veri seti için örnekler kesin olarak iki alt gruba ayrıldı; hastalık lezyon/tümör dokuları vaka grubu, ilgili lezyon olmayan normal dokular ise kontrol grubu olarak hizmet verdi. Özellikle, IBD kohortu IBD hastalarından 297 bağırsak mukozal örneği ve sağlıklı bireylerden 56 normal bağırsak mukoza örneği içeriyordu; CRC kohortu 841 primer kolorektal tümör dokusunu ve 211 uyumlu bitişik normal kolorektal epitel dokusunu içeriyordu; PAAD kohortu ise 114 PAAD tümör dokusu ve 106 normal pankreas parenkimal dokusundan oluşuyordu.
Aynı hastalık kategorisindeki tüm veri setleri eşit şekilde entegre edildi. Limma paketinin normalizeBetweenArrays fonksiyonu, çapraz örneklem quantil normalizasyonu gerçekleştirmek için uygulandı; böylece platformlar arası parti etkileri etkili bir şekilde ortadan kaldırıldı ve farklı veri setlerinde gen ifade değerlerini standartlaştırarak sonraki diferansiyel ifade analizi yapıldı.
IBD-, CRC- ve PAAD ile İlgili Genlerin ve Yaygın Genlerin Taraması
İlk olarak, IBD, CRC ve PAAD kohortlarından limma paketi kullanılarak farklı olarak eksprese edilen genler (DEG) tarandı ve orijinal P değerleri Benjamini-Hochberg yanlış keşf oranı (FDR) yöntemiyle düzeltildi. IBD, CRC ve PAAD kohortlarında tarama kriterleri |logFC| > 0.4 ve P < 0.05. Ayrıca, WGCNA tüm genlerde yapıldı ve minimum modül gen eşiği 100 oldu (yumuşak eşik güç = 0.90; ağ tipi = işaretli). Sonuç olarak, üç kohort arasında ortak DEG'ler ve modül genleri tespit edildi. Her iki yöntemle de tutarlı şekilde tanımlanan genler ortak genler olarak tanımlanırken, kalan genler ilişkili genler olarak kategorize edildi.
PPI ve Fonksiyonel Zenginleştirme Analizi
Bu analizler hastalıkla ilişkili genler üzerinde yapıldı. Protein-protein etkileşimi (PPI) analizi STRING veritabanı kullanılarak yapıldı (etkileşim puanı > 0.40). Fonksiyonel zenginleştirme analizi, clusterProfiler, enrichplot ve org kullanılarak gerçekleştirilen Gen Ontolojisi (GO) ve Kyoto Genom Ansiklopedisi (KEGG) analizlerini içeriyordu. Hs.eg.db paketleri (P < 0.05 ve FDR ile ayarlanmış q değeri [Benjamini–Hochberg yöntemi] < 0.05).
İmmün Mikroçevre Profilleme
CIBERSORT, varsayılan LM22 imzamatrisi 7 kullanılarak gen ifadesi verilerinden bağışıklık hücresi sızma seviyelerini tahmin etmek için güvenilir bir algoritmadır. Bu çalışmada, IBD, CRC ve PAAD kohortlarından alınan örneklerde bağışıklık hücresi infiltrasyonunun kapsamını tahmin etmek için CIBERSORT algoritması kullanıldı ve üç hastalık arasında bağışıklık mikroçevresinin ortak özelliklerini inceledi. Analiz, her örnek için P değerleri hesaplanmak amacıyla 1.000 permütasyon ile yapıldı ve karışım ifade dosyasına quantil normalizasyon (QN = TRUE) uygulandı. Yalnızca CIBERSORT P değeri 0.05 < örnekler sonraki analizler için tutuldu ve dekonvolüsyon sonuçlarının güvenilirliği sağlandı.
Yaygın Genlerin Tanısal Değerinin Değerlendirilmesi
IBD, CRC ve PAAD kohortlarındaki yaygın genlerin tanısal değeri, R'deki pROC paketiyle alıcı çalışma karakteristikli (ROC) analizi kullanılarak değerlendirildi. Duyarlılık ve özgüllük arasındaki optimal denge, ROC eğrileri kullanılarak görselleştirildi.
qRT-PCR, Hücre Transfeksiyonu ve Koloni Oluşumu Testi
qRT-PCR ve hücre transfeksiyonu önceki 8,9,10 çalışmalarına göre gerçekleştirilmiştir. Geçici transfeksiyon, üreticinin talimatlarına göre jetPRIME transfeksiyon reaktifi (Polyplus, Çin) kullanılarak gerçekleştirildi. Hücreler, transfeksiyon karışımıyla 6 saat kuluçka edilmiş, ardından ortam tam DMEM ile değiştirilmiştir. Sonraki deneyler transfeksiyondan 48 saat sonra gerçekleştirildi.
Kısaca, toplam hücresel RNA TRIzol reaktifi kullanılarak ekstraksiyon yapıldı. RNA, PrimeScript RT Master Mix kullanılarak cDNA'ya ters transkribe edildi. Kantitatif PCR, TB Green qPCR kullanılarak gerçekleştirildi. β-aktin, ifade normalizasyonu için iç referans gen olarak kullanıldı. Biyolojik deneyler üçlü olarak gerçekleştirildi. Primer dizileri ve siS100P dizisi önceki bir çalışma 11'de bulunabilir.
NCM460, FHC, HCT116, SW116, PANC1 ve BXPC2 hücreleri, Malzeme Tablosu'nda listelendiği gibi elde edilmiştir. Tüm hücre hatları hücre tanımlaması ve mikoplazma testlerinden geçti.
Deneyler sırasında tüm hücreler 3–5 nesil boyunca geçiş yapıldı. Tüm hücreler, %10 fetal sığır serumu ve %1 penisillin–streptomisin içeren tam DMEM'de kültürlendi.
Koloni oluşumu testi, önceki bir çalışmadatanımlandığı gibi yapılmıştır 12. Kısa bir süreliğine, 6 kuyuluğa ait bir plakanın her kuyusuna 1.000 hücre ekildi ve deney sona ermeden önce 10 gün boyunca kültürlendi. Hücreler %4 paraformaldehit ile sabitlendi, %0,1 kristal violet ile boyandı ve koloniler ImageJ kullanılarak sayıldı.
scRNA-seq verilerine dayalı yaygın genlerin analizi
IBD veri setinden (GSE214695), CRC veri setinden (GSE166555) ve PAAD veri setinden (GSE154778) scRNA-seq verileri önceki çalışmalardatanımlandığı gibi önceden işlenmiş 8,13. Ham sayı matrisleri, limma::avereps kullanılarak kopyalanmış gen sembolleri için ortalama ifade ile daraltıldı. İlk filtreleme, en az üç hücrede ve en az 50 benzersiz transkript içeren hücrelerde tespit edilen genleri tuttu. Mitokondriyal transkript fraksiyonu %>5 veya 50'den az tespit edilen genlere sahip hücreler çıkarıldı. Log normalizasyonu 10.000 ölçek faktörü ile gerçekleştirildi, ardından varyans stabilize edici dönüşüm yapıldı ve ana bileşen analizinden (PCA) önce Z-puanı standartlaştırılmış en çok değişken 1.500 gen belirlendi. Küme tanımlayan belirteç genleri, hedef kümelerde ≥0.25 (katlama değişimi) log2 (katlama değişimi) ve ayarlanmış P değeri ><0.05 kullanılarak filtrelendi.
Kısaca, veri ön işlemesi Seurat paketi kullanılarak yapıldı ve hücre tipi açıklaması SingleR paketi (sürüm 2.6.0) kullanılarak gerçekleştirildi. Hücre kümelenmesi, Seurat'ta k-en yakın komşu grafiği yapısı ve PCA boyutları 1–20 temelinde t-SNE gömülmesi kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Daha sonra farklı hücre tipleri arasında yaygın genlerin dağılımı ve ifade seviyeleri incelendi.
IBD Modelinin İnşası
Öncekiçalışmalara göre, normal insan kolon epitel hücrelerinde (FHC ve NCM460) iltihaplanma indüklemek için lipopolisakkarit (LPS) kullanıldı ve böylece iltihapı taklit eden bir IBD modeli oluşturuldu. Biyolojik deneyler üçlü olarak gerçekleştirildi. Hücreler, %5CO2 ile 37°C'de nemlendirilmiş bir kuluçka makinesinde rutin olarak kültürlendi. Hücre birleşimi yaklaşık %50–%70'e ulaştığında, kültür ortamı taze tam ortamla değiştirildi ve hücreler 12 saat boyunca 10 ng/mL LPS ile işlendi. Araç kontrolü olarak eşit miktarda steril fosfat-tamponlu tuzlu (PBS) kullanıldı. Kültür hacmi, 6 delikli plakalarda kuyu başına 2 mL idi. Tedaviden sonra ortam çıkarıldı, hücreler önceden soğutulmuş steril PBS ile iki kez yıkandı ve hücreler sonraki analizler için toplandı.
İstatistiksel Analiz
Tüm biyoinformatik analizler R yazılımı (sürüm 4.1.2) kullanılarak gerçekleştirilmiştir. İki grup arasındaki karşılaştırmalar Student's t-testi kullanılarak yapılırken, birden fazla grup arasındaki karşılaştırmalar tek yönlü varyans analizi (ANOVA) kullanılarak yapıldı. Korelasyon analizi Spearman yöntemiyle gerçekleştirildi. Tüm hücresel deneyler en az üç kez tekrarlanmış ve veriler ortalama ± standart sapma (SD) olarak sunulmuştur. P değeri veya FDR < 0.05 istatistiksel olarak anlamlı olarak kabul edildi. NS, önemli değil; P < 0.05 (*), P < 0.01 (**), P < 0.001 (***).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
IBD, CRC ve PAAD'da DEG'ler
İlk olarak, IBD kohortları (GSE179285 ve GSE24287), CRC kohortları (TCGA-CRC ve GSE87211) ve PAAD kohortları (GSE128735 ve GSE62452) entegre edildi ve entegrasyon PCA ile gen ifade yoğunluğu grafikleri kullanılarak değerlendirildi. Sonuçlar, farklı veri setleri arasındaki toplu etkilerin entegrasyondan sonra etkili bir şekilde ortadan kaldırıldığını gösterdi (Şekil 1A–F).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Önceki çalışmalar, bağışıklık kaynaklı gastrointestinal bozukluk olan IBD'nin, nörodejeneratifhastalıklar 17, multipl skleroz18, amiyotrofik lateral skleroz19,endometriozis 20, romatoidartrit 2, Hodgkin lenfoması21, CRC22 ve PAAD23 gibi çeşitli hastalıklarla ilişkisini vurgulamıştır. IBD'nin genelli...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Çıkar Çatışması:
Yazarlar rekabet eden çıkarlar belirtmemektedir.
Yazarlar, Çin Ulusal Ana Ar-Ge Planı'ndan (Hibe No. 2023YFB3210400) maddi destek aldığını takdir etmektedir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| BXPC2 cell line | Cell Bank of the Chinese Academy of Sciences | N/A | Human pancreatic adenocarcinoma cell line |
| CIBERSORT | N/A | N/A | Immune cell infiltration analysis |
| clusterProfiler package | Bioconductor | v4.8.0 | Gene Ontology (GO) and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) enrichment analyses |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | Cell culture medium |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | A5256701 | Cell culture supplement |
| FHC cell line | Cell Bank of the Chinese Academy of Sciences | N/A | Human normal colonic epithelial cell line |
| GEO dataset (GSE128735) | Gene Expression Omnibus (GEO) | N/A | Public gene expression dataset for pancreatic adenocarcinoma |
| GEO dataset (GSE154778) | Gene Expression Omnibus (GEO) | N/A | Public single-cell RNA sequencing dataset for pancreatic adenocarcinoma |
| GEO dataset (GSE166555) | Gene Expression Omnibus (GEO) | N/A | Public single-cell RNA sequencing dataset for colorectal cancer |
| GEO dataset (GSE179285) | Gene Expression Omnibus (GEO) | N/A | Public gene expression dataset for inflammatory bowel disease |
| GEO dataset (GSE214695) | Gene Expression Omnibus (GEO) | N/A | Public single-cell RNA sequencing dataset for inflammatory bowel disease |
| GEO dataset (GSE24287) | Gene Expression Omnibus (GEO) | N/A | Public gene expression dataset for inflammatory bowel disease |
| GEO dataset (GSE62452) | Gene Expression Omnibus (GEO) | N/A | Public gene expression dataset for pancreatic adenocarcinoma |
| GEO dataset (GSE87211) | Gene Expression Omnibus (GEO) | N/A | Public gene expression dataset for colorectal cancer |
| ggplot2 package | CRAN | v3.4.2 | Data visualization |
| HCT116 cell line | Cell Bank of the Chinese Academy of Sciences | N/A | Human colorectal cancer cell line |
| ImageJ | National Institutes of Health (NIH) | v1.8.0 | Colony counting |
| jetPRIME Transfection Reagent | Polyplus | 101000046 | Cell transfection |
| Lipopolysaccharide (LPS) | Beyotime Co., Ltd | S1735 | Induction of an inflammation-mimicking IBD cell model |
| limma package | Bioconductor | v3.54.0 | Differential expression analysis |
| NCM460 cell line | Cell Bank of the Chinese Academy of Sciences | N/A | Human normal colonic epithelial cell line |
| org.Hs.eg.db package | Bioconductor | v3.23.1 | Gene annotation for enrichment analysis |
| PANC1 cell line | Cell Bank of the Chinese Academy of Sciences | N/A | Human pancreatic adenocarcinoma cell line |
| Penicillin–streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | Antibiotic supplement for cell culture |
| pheatmap package | CRAN | v1.0.12 | Heatmap visualization |
| pROC package | CRAN | v1.19.0.1 | Receiver operating characteristic (ROC) analysis |
| PrimeScript RT Master Mix | Takara Bio | RR036A | Reverse transcription of RNA into cDNA |
| Primer sets for qRT-PCR | Tsingke Biotech Co., Ltd | N/A | Primer sequences reported in Reference 11 |
| R software | R Foundation for Statistical Computing | v4.1.2 | Statistical and bioinformatics analyses |
| Seurat package | CRAN | v4.0 | Single-cell RNA sequencing data preprocessing and analysis |
| siS100P | Tsingke Biotech Co., Ltd | N/A | Small interfering RNA targeting S100P |
| SingleR package | Bioconductor | v2.6.0 | Cell type annotation for single-cell RNA sequencing |
| STRING database | STRING Consortium | N/A | Protein-protein interaction analysis |
| SW1116 cell line | Cell Bank of the Chinese Academy of Sciences | N/A | Human colorectal cancer cell line |
| TB Green qPCR Mix | Takara Bio | RR430B | Quantitative real-time PCR |
| TCGA-CRC dataset | The Cancer Genome Atlas (TCGA) | N/A | Public colorectal cancer transcriptomic dataset |
| TRIzol reagent | Invitrogen | 15596-026 | Total RNA extraction |
| WGCNA package | CRAN | v1.73 | Weighted gene co-expression network analysis |
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.