Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Araştırma makalesi

HepG2 Hücrelerinde ve NOD/SCID Fare Xenograft Modelinde Kombine Sorafenib ve Gemcitabine Tedavisinin Değerlendirilmesi: Bir Pilot Çalışma

73 görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/71790

⸱

28 Ağustos 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pharmacy, the Fourth Affiliated Hospital of School of Medicine, and International School of Medicine, International Institutes of Medicine, Zhejiang University

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Sorafenib ile gemcitabine kombinasyonu, HepG2 hücre proliferasyonunun additif inhibisyonuna dair ön kanıtlar sunmakta, p-ERK ve VEGF ekspresyonunda korelatif değişiklikler göstermekte ve NOD/SCID farelerde karaciğer tümörü büyümesini baskılamaktadır.

Özet

Karaciğer kanseri, ilaç direnci ve sınırlı tedavi seçenekleri nedeniyle kansere bağlı ölümlerin önde gelen nedenlerinden biri olmaya devam etmektedir. Sonuçları iyileştirmek için terapötik stratejilerin araştırılmasına acil bir ihtiyaç vardır. Bu pilot çalışma, karaciğer kanserinde sorafenib ve gemcitabine kombinasyonunun potansiyel etkilerini ve temel mekanizmalarını değerlendirmek için bir protokol sunmaktadır. HepG2 karaciğer kanseri hücre hattı kullanılmış ve obez olmayan diyabetik/şiddetli kombine immün yetmezliği (NOD/SCID) fare ksenograft modeli oluşturulmuştur. Şu temel prosedür adımları gösterilmektedir: (1) HepG2 hücre kültürü ve ilaç uygulaması; (2) MTT analizi kurulumu, inkübasyon ve absorbans okuması; (3) protein ekstraksiyonu, SDS-PAGE, transfer ve ERK ile p-ERK için immunoblotting; (4) NOD/SCID farelerde deri altı ksenograft oluşturulması; (5) tümör ölçümü ve hacim hesaplaması; ve (6) tümör kesitlerinde VEGF immünohistokimyası. Kritik adımlar, sorun giderme ipuçları ve ekipman spesifikasyonları sağlanmıştır. Sorafenib (3 µmol/L) ve gemcitabine (10 µmol/L) kombinasyonu, 72 h süresinde % 71,23 ± % 6,76'lık bir inhibisyon oranı ve 1,35'lik bir q-değeri elde etmiştir; bu da test edilen koşullar altında bu spesifik doz çiftinde  sinerjik bir etkiye işaret etmektedir. Kontrol grubuyla karşılaştırıldığında, kombinasyon tedavisi azalmış p-ERK ekspresyonu, azalmış tümör hacmi ve kalitatif olarak daha düşük VEGF immün boyaması ile ilişkilendirilmiştir. Bu veriler, nedensellik kurmadan, azalmış p-ERK ekspresyonu ile gözlemlenen antiproliferatif etki arasında korelatif bir ilişki olduğunu göstermektedir. HepG2 hücrelerinde ve bir NOD/SCID fare ksenograft modelinde, sorafenib ve gemcitabine kombinasyonu antiproliferatif potansiyele dair ön kanıtlar sunmakta ve azalmış VEGF ekspresyonu ile ilişkilendirilmektedir; ancak mikrodamar yoğunluğu veya fonksiyonel vasküler analizler gerçekleştirilmediği için bu bulgu anti-anjiyojenik aktivitenin doğrudan kanıtını oluşturmamaktadır. Bu tekrarlanabilir protokol, HCC modellerinde ilaç kombinasyonlarını değerlendirmek için kullanışlı bir çerçeve sunmakta ve diğer hedefe yönelik tedavi-kemoterapi rejimlerine uyarlanabilmektedir, ancak herhangi bir klinik çıkarım yapılmadan önce daha fazla mekanistik ve doz doğrulama çalışmaları gereklidir.

Giriş

Karaciğer kanseri, en yaygın ve en ölümcül kanserlerden biri olmasının yanı sıra, en hızlı büyüyen malign tümörlerden biridir1,2. Karaciğer kanseri insidansı azalmakla birlikte, karaciğer kanserinin genel yükü artmaya devam etmiştir. 2022 yılına ait küresel epidemiyolojik veriler, Global Cancer Observatory (GLOBOCAN) 2022 çevrimiçi veri tabanında karaciğer kanserinin yaşa göre standardize edilmiş insidans oranının 100.000 kişi başına 15,0; yaşa göre standardize edilmiş mortalite oranının ise 100.000 kişi başına 26,7 olduğunu ve bunun karaciğer kanserini kanser kaynaklı ölümlerde ikinci ana neden haline getirdiğini ortaya koymuştur3. Günümüzde, karaciğer kanserinin etkili bir tedavisinin olmaması ve sinsi başlangıcı nedeniyle çoğu hasta teşhisten sonra bir yıl içinde hayatını kaybetmektedir. Sorafenib, epidermal büyüme faktörü reseptörü (EGFR), trombosit kaynaklı büyüme faktörü reseptörü (PDGFR) ve serin/treonin kinazlar gibi reseptör tirozin kinazları hedefleyen, klinik kullanım için onaylanmış ilk çok hedefli kinaz inhibitörüdür4,5. Oral bir multikinaz inhibitörü olan sorafenib, çoklu büyüme faktörü yollarını hedefleyerek karaciğer kanserinde antiproliferatif ve anti-anjiyojenik etkiler gösterir. Tarihsel olarak sorafenib, ileri evre veya rezeke edilemeyen karaciğer kanseri olan hastalar için FDA onaylı ilk birinci basamak sistemik tedaviydi6. Ancak, ileri evre hepatosellüler karsinom (HCC) için mevcut birinci basamak tedavi yelpazesi önemli ölçüde genişlemiştir. Önerilen seçenekler arasında artık immün kontrol noktası inhibitörü kombinasyonu olan atezolizumab artı bevacizumab, lenvatinib ve dual immünoterapi kombinasyonu olan durvalumab artı tremelimumab gibi tedaviler yer almaktadır. Bu ilerlemelere rağmen sorafenib, özellikle immünoterapi kombinasyonlarının kolayca erişilebilir olmadığı veya kontrendike olduğu bölgelerde önemli bir birinci basamak seçeneği olmaya devam etmektedir. Karaciğer kanserinde yaygın kullanımı nedeniyle, ilaca bağlı advers olaylar bir endişe kaynağı olmuştur7. 2006'dan 2023'e kadar olan FDA Advers Olay Raporlama Sistemi (FAERS) veri tabanı analizinde, sorafenib'in advers olaylarının temel olarak sindirim sistemi, cilt ve deri altı dokularının yanı sıra enfeksiyon ve yaralanma gibi spesifik olmayan fiziksel rahatsızlıkları kapsadığı görülmüştür7. İleri evre karaciğer kanseri olan bazı hastalar sorafenib tedavisinden fayda görebilse de, çoğu hasta sonunda direnç geliştirir veya tedavi başarısızlığı yaşar, bu da kötü bir prognoza yol açar8,9,10. Kullanımına rağmen sorafenib, HCC hastalarının yalnızca yaklaşık %30'una fayda sağlamaktadır; dahası, yanıt veren hastalar genellikle 6 ay içinde direnç geliştirmektedir11. Sorafenib direnci ile ilişkili moleküler yolaklar arasında hücre dışı sinyal düzenleyici kinaz (ERK)/fosforile ERK (p-ERK), protein kinaz B (Akt), fosfoinositid 3-kinaz (PI3K)/AKT/memeli rapamisin hedefi (mTOR), hipoksiyle indüklenebilir faktör 1α (HIF-1α)/HIF-2α ve otofaji ile ilgili yolaklar yer almakta olup, bu araştırmada özellikle ERK/p-ERK vurgulanmış ve seçilmiştir11. Gemcitabine, vücuda girerek DNA sentezi üzerinde farklı inhibitör etkileri olan diflorositidin difosfat ve diflorositidin trifosfat üreten bir sitidin analoğudur12. Hepatobiliyer malignitelerde gemcitabine, kombinasyon kemoterapisinin bir bileşeni olarak değerlendirilmiştir. Ancak, gemcitabine'in klinik olarak daha yüksek ilaç direnci gösterdiği rapor edilmiş olup bu durum gemcitabine'in etkinliğini sınırlamaktadır12,13. Bu nedenle, optimal ilaç rejimini etkili ve verimli bir şekilde belirlemek son derece zordur. Son çalışmalar, yeni bir tümör kök hücre benzerliği biyobelirteç öngörüsüne dayanarak, gemcitabine ile sorafenib kombinasyonunun artırılmış terapötik etkiye sahip olabileceğini göstermiştir14. Ancak, bildiğimiz kadarıyla, hiçbir çalışma bu kombinasyonu karaciğer kanserinde özellikle HepG2 hücreleri ve bir hepatosellüler karsinom non-obez diyabetik/şiddetli kombine immün yetmezlik (NOD/SCID) fare ksenogreft modeli kullanarak incelememiştir. Dolayısıyla, sorafenib ve gemcitabine'in karaciğer kanserindeki additive etkilerini doğrudan doğrulayan deneysel kanıtlar halen eksiktir.

Bu makalede açıklanan prosedürler yaygın olarak kullanılmaktadır ancak kariyerinin başındaki araştırmacıların tekrarlayabileceği şekilde ayrıntılı, görsel ve adım adım bir formatta nadiren sunulmaktadır. Sorafenib ve gemcitabine kombinasyonunun karaciğer kanseri hücre proliferasyonunu ve tümör büyümesini eklemeli olarak inhibe edeceğini ve bu etkinin ERK/p-ERK yolunun aşağı regülasyonu ve vasküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF) aracılı anjiyogenezin azalmasıyla ilişkili olacağını hipotez ettik. Bu çalışma, sorafenib ile kombine edilen gemcitabine'in HepG2 karaciğer kanseri hücre hattının proliferasyonu üzerindeki inhibisyon etkisini in vitro ve in vivo olarak ve mekanizmasını öncül olarak araştırmayı amaçlamaktadır (Ek Şekil 1). Bu çalışmanın özgünlüğü üç noktada yatmaktadır: (1) sorafenib-gemcitabine kombinasyonunu, yaygın olarak kullanılan HepG2 hücre hattı ve buna karşılık gelen NOD/SCID fare modeli kullanarak özellikle karaciğer kanserinde test eden ilk çalışmadır; (2) potansiyel bir mekanizma olarak yeterince çalışılmamış olan ERK/p-ERK yolunu incelemektedir; ve (3) bu kombinasyonun karaciğer kanserindeki eklemeli etkisi için hesaplamalı öngörüler yerine doğrudan deneysel kanıtlar sunmaktadır. Bu özellikler, bu çalışmayı diğer tümör tiplerinde veya farklı deneysel modeller kullanılarak yürütülen, özellikle sorafenib bazlı rejimler bağlamındaki önceki kombinasyon tedavisi raporlarından ayırmaktadır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Etik onay, Zhejiang University-Laboratory Animal Welfare and Ethics Review tarafından sağlanmıştır (Onay No. ZJU20250049).

Hayvanlar ve gruplandırma

Lisanslı bir ticari tedarikçiden (Lisans No. SCXK (Shanghai) 2013-0006) satın alınan, 4–5 haftalık, 18–20 g ağırlığındaki toplam 40 dişi NOD/SCID fare, spesifik patojenle arındırılmış (SPF) sınıfı hayvan odalarında barındırılmıştır. Tüm hayvan protokolleri standart kılavuzlara uygun olarak yürütülmüştür. Deney boyunca hayvanların serbestçe beslenip içmelerine izin verilmiş, iyi kontrol edilen bir SPF odasında gruplar halinde (kafes başına 5 fare), oda sıcaklığı 22 ± 2 °C, nem %50%–60% ve 12/12 saatlik bir ışık/karanlık döngüsü ile barındurulmuşlardır. Hayvanlara ad libitum yem ve su sağlanmış ve vücut ağırlıkları her 2 haftada bir izlenmiştir. Farelerin sürekli ağrı, kaşeksi, tümör ülserleri göstermesi, tümör boyutunun maksimum 2 cm'ye ulaşması veya diğer geri dönüşü olmayan sağlık sorunlarının oluşması durumunda, Hayvan Etik Kurulu tarafından onaylanan insani sonlandırma kriterlerine uygun olarak, vücut ağırlığına göre ≥150 mg/kg dozunda %0,45 pentobarbital sodyumun intraperitonal enjeksiyonu ile ötanazi uygulanmış; ardından solunum ve kalp atışının durması, kornea refleksinin kaybı teyit edilmiş veya gerekirse ikincil bir fiziksel yöntem uygulanmıştır. Örneklem büyüklüğü (grup başına n = 10), 1,2'lik bir etki büyüklüğü (pilot deneylerden türetilen), α = 0,05 ve β = 0,20 (%80 güç) varsayılarak yapılan bir güç analizine ve %20'lik bir yıpranma payına göre belirlenmiştir. Tümör implantasyon prosedürleri, tedaviye önceden atanmadan önce gerçekleştirilmiştir (ksenogreft oluşturma için aşağıya bakınız).

Tümör implantasyonu ve tümör tutunmasının onaylanmasının ardından fareler, NOD/SCID fare transplant tümör modelini oluşturmak amacıyla rastgele sayı tablosu yöntemi kullanılarak kontrol grubu, sorafenib grubu, gemcitabine grubu ve sorafenib ile gemcitabine kombinasyon grubu olmak üzere 4 gruba rastgele ayrılmıştır ve her grupta 10 fare (kafes başına 5 fare) yer almıştır. Modelleme sürecindeki tümör dokularının NOD/SCID farelerde genel durumun kötüleşmesine ve hatta ölüme neden olabileceği ve istatistiksel analizlerin genellikle etkili bir örneklem büyüklüğü gerektirdiği göz önünde bulundurularak, her gruba en az 10 fare dahil edilmiştir. Rastgele gruplandırma bağımsız teknisyenler tarafından gerçekleştirilmiş ve kafesler etiketlenmiştir; ilaç uygulaması veya tümör ölçümü sırasında körleme uygulanmamıştır, bu durum önemli bir kısıtlamadır. Geri kalan doku örneklemesi, biyokimyasal ve patolojik değerlendirmelerin tamamı körleme yöntemiyle laboratuvar personeli tarafından yürütülmüştür. Veriler ayrıca, istatistikler tamamlanana ve veriler körlemeden çıkarılana kadar yalnızca kodlanmış dosyalara erişimi olan istatistikçiler tarafından körleme şeklinde analiz edilmiştir. Tüm hayvanlar final analizine dahil edilmiştir. Sistemik emilimi ve tutarlı biyoyararlanımı sağlamak için her iki ilaç için de intraperitoneal yol seçilmiştir; günde bir kez dozlama, bu rejimle sürdürülen plazma konsantrasyonlarını gösteren önceki farmakokinetik çalışmalara dayandırılmıştır. Araç kontrol grubuna intraperitoneal olarak 0.2 mL steril normal salin enjekte edilmiştir. Sorafenib grubuna intraperitoneal olarak 0.2 mL 40 mg/kg sorafenib enjekte edilmiştir. Gemcitabine grubuna intraperitoneal olarak 0.2 mL 100 mg/kg gemcitabine enjekte edilmiştir. Kombinasyon tedavi grubu: 40 mg/kg sorafenib ve 100 mg/kg gemcitabine'den 0.2 mL'şer intraperitoneal olarak uygulanmıştır. Her gruba 20 gün boyunca günde bir kez uygulama yapılmıştır. Tüm hayvanlar final analizine dahil edilmiş ve çalışmadan herhangi bir fare çıkarılmamıştır. 20 günlük tedavi süresi boyunca hiçbir grupta mortalite gözlemlenmemiştir. Takvim ve dozlar, hepatobilyer kanser modellerindeki yayınlanmış çalışmalara göre seçilmiştir. Gemcitabine'in günlük intraperitoneal uygulamasının toksisiteye neden olabileceği unutulmamalıdır. Transplant tümörlerin uzunluğu ve genişliği günlük olarak ölçülmüş ve transplant tümörlerin hacmi hesaplanmıştır. 20 gün sonra hayvanlar derin anestezi altında servikal dislokasyonla ötanize edilmiş ve transplant tümör dokuları formalinde fikse edilmiştir. Vücut ağırlığı çalışma boyunca her 2 günde bir ölçülmüştür. Fareler; piloereksiyon, kambur duruş, azalmış mobilite, diyare ve letarji dahil olmak üzere klinik toksisite belirtileri açısından günlük olarak izlenmiştir. Bununla birlikte, serum biyokimyası (örneğin, alanin aminotransferaz, aspartat aminotransferaz ve kreatinin) ve ana organların histopatolojik incelemesi yapılmamıştır. Bu nedenle, subklinik toksisite dışlanamaz.

İlaçlar ve reaktifler

Sorafenib, %10 dimetil sülfoksit (DMSO) içinde çözülmüş ve -20 °C'de saklanmıştır. Kullanımdan önce solüsyon çözdürülmüş ve hücre büyümesi üzerinde herhangi bir etkisi olmayan %0,5'ten düşük nihai DMSO konsantrasyonuna seyrelştirilmiştir. Gemcitabine ticari bir kaynaktan temin edilmiştir. Radyoimmünopresipitasyon analizi (RIPA) liz tamponu, tiazolil mavisi, gliseraldehit-3-fosfat dehidrogenaz (GAPDH), ERK, p-ERK ve VEGF'e karşı primer antikorlar, sekonder antikorlar, Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) yüksek glikozlu besiyeri, fetal sığır serumu ve HepG2 hücre hattı ticari kaynaklardan temin edilmiştir.

Sorafenib ve gemcitabine sitotoksik ajanlardır. Tüm ilaç hazırlama ve uygulama prosedürleri, uygun kişisel koruyucu ekipman (laboratuvar önlüğü, nitril eldivenler ve koruyucu gözlükler) giyilmiş halde, belirlenmiş bir biyogüvenlik kabininde gerçekleştirilmelidir. Bu protokolde kullanılan DMSO, metanol, ksilen ve diğer organik çözücüler tehlikelidir ve solunmayı veya ciltle teması önlemek için bir çeker ocak içerisinde kullanılmalıdır. Tüm reaktifler için malzeme güvenlik veri sayfaları (MSDS) kullanım öncesinde incelenmelidir.

Hücre Kültürü

HepG2 hücre hattı canlandırılmış ve 10 mL DMEM yüksek glukoz besiyeri (10% fetal bovine serum, 100 U/mL penisilin-streptomisin ve 4 mmol/L glutamin ile desteklenmiş) içeren hücre kültürü şişelerine ekilmiştir. Hücreler, %5 CO₂ içeren nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 °C'de inkübe edilmiştir. Kültür besiyeri her 2 günde bir değiştirilmiş ve logaritmik büyümeyi sürdürmek için hücreler her 4 günde bir pasajlanmıştır. HepG2 hücre hattı ticari bir kaynaktan temin edilmiştir; ancak, bu çalışmada bağımsız hücre hattı doğrulaması (örneğin, kısa tandem tekrar profilleme) ve mikoplazma testi yapılmamıştır.

Proliferasyon inhibisyon oranının belirlenmesi için MTT yöntemi

Sorafenibin ve gemcitabinin HepG2 hücre hattı üzerindeki proliferasyon inhibisyon oranı, 3-(4,5-dimetiltiyazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolyum bromür (MTT) yöntemi kullanılarak belirlenmiştir. Logaritmik büyüme evresindeki hücreler %0,25'lik tripsin ile 2 dakika boyunca sindirilmiş ve sindirim işlemi, eşit hacimde komple besiyeri eklenerek sonlandırılmıştır. 1000'de santrifüj işleminden sonra × g hücreler 10 dakika boyunca komple medyumda süspanse edildi. Hücre yoğunluğu 1'e ayarlandı × 105 hücre/mL ve 200 µL hücre süspansiyonu, 96 kuyucuklu bir plakanın her bir kuyucuğuna ekilmiştir. Bu ekim yoğunluğu, 5 arası hücre yoğunluklarının denendiği ön optimizasyon deneylerine dayanarak seçilmiştir × 103 5'e × 104 kuyu başına 2 hücre test edildi. 2'nin yoğunluğu × 104 kuyu başına hücre sayısı, 96 saat boyunca lineer absorbans artışı sağladı ve evriltme mikroskobu altındaki görsel inceleme ile doğrulandığı üzere, bitiş noktasında konfluens %80'in altında tutuldu. MTT ölçümlerinin lineer aralıkta kaldığından emin olmak için, her bir zaman noktasında araç ile işlem görmüş kontrol kuyucuklarıyla pilot deneyler gerçekleştirildi. Besin tükenmesini ve metabolik yan ürünlerin birikimini önlemek için besiyeri her 48 saatte bir yenilendi. Konfluens, bir evriltme mikroskobu kullanılarak günlük olarak izlendi. 96. saatte, kontrol kuyucukları yaklaşık %75-80 konfluense ulaştı ve herhangi bir belirgin besin tükenmesi belirtisi gözlemlenmedi. Hücre tutunmasının ardından besiyeri atıldı ve ilaç içeren besiyeri eklendi. İşlem görmemiş kontrol grubuna (araç kontrolü için) ilaç içermeyen besiyeri eklendi. in vivo deneyler). Deney; işlem görmemiş kontrol grubu, sorafenib grubu, gemcitabine grubu ve kombinasyon tedavi grubu olmak üzere bölünmüştür. Sorafenib dozları 1.5 µmol/L, 3 µmol/L, 4.5 µmol/Lve 6 µmol/Lve gemcitabine dozları şunlardı 5 µmol/L, 10 µmol/L, 15 µmol/Lve 20 µmol/LSorafenib'in gemcitabine ile kombine edilen dozları şöyledir: 1.5 µmol/L + 5 µmol/L, 3 µmol/L + 10 µmol/L, 4.5 µmol/L + 15 µmol/Lve 6 µmol/L + 20 µmol/LHer gruptaki hücreler 24 sa, 48 sa, 72 sa ve 96 sa boyunca kültüre edilmiştir. Kültürleme işleminin ardından, 20 µL her bir kuyucuğa 5 mg/mL MTT eklendi ve hücreler bir hücre inkübatöründe 4 saat boyunca inkübe edildi. Süpernatan dikkatlice uzaklaştırıldı ve ardından 150 µL Her bir kuyucuğa DMSO eklendi ve formazanın tamamen çözünmesi için plaka 10 dakika boyunca çalkalandı; ardından her kuyucuğun optik yoğunluk (OD) değeri, çok fonksiyonlu bir mikroplaka okuyucu kullanılarak 490 nm'de ölçüldü. Deney üç kez tekrarlandı ve her grupta beş tekrarlı kuyucuk yer aldı. Veriler ortalama olarak sunuldu ± Üç biyolojik replikanın standart sapması (SD). Hücre büyüme inhibisyon oranı (%) = (1 - OD deney grubu /OD işlem görmemiş grup）× %100. İki ilaç arasındaki etkileşim, şunlara göre değerlendirilmiştir: qşu formülle hesaplanan p-değeri: Soru (veya Sorgu) = EAB / (EA + EB - EA × EB). Burada EA ve EB, A ve B ilaçlarının tek başına kullanıldığındaki inhibisyon oranları, EAB ise iki ilacın birlikte kullanıldığı durumdaki inhibisyon oranıdır. Şöyle olduğunda q 1,15'ten büyükse, iki ilaç arasında sinerjistik bir etki olduğunu gösterir; 0,85–1,15 arası additif bir etkiyi gösterir ve q 0,85'ten küçük olması antagonistik bir etkiyi gösterir. Lütfen çevirmemi istediğiniz kaynak metni paylaşın.-değeri yöntemi basit bir tarama aracıdır ve daha titiz sinerji analizlerinin yerini tutmaz. Yalnızca birkaç sabit oranlı doz çifti test edilmiş olup bu durum sinerji iddiasının güvenilirliğini sınırlamaktadır. Bu nedenle, terimi "sinerji" bu çalışmada ... anlamına gelmektedir q > belirli doz çiftlerinde ve zaman noktalarında 1,15 değerine, tüm doz-yanıt matrisi boyunca doğrulanmış bir additif etkileşime değil.

ERK ve p-ERK protein ekspresyonunun Western blot analizi

Hücre kültürü ve deneysel gruplandırma yukarıda açıklandığı şekilde gerçekleştirilmiştir. Western Blot yöntemiyle ERK ve p-ERK tespiti için sorafenib dozu 3 µmol/L; gemcitabine dozu 10 µmol/L ve kombinasyon dozu 3 µmol/L + 10 µmol/L olarak uygulanmıştır. 72 saatlik tedavinin ardından hücreler RIPA liziz tamponu ile lizize edilmiş ve her deneysel gruptan toplam protein ekstraksiyonu yapılmıştır. Protein konsantrasyonu bikarboninik asit (BCA) yöntemi ile belirlenmiştir. Eşit miktarda protein (hat başına 30 µg), %10 sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) ile 120 V'da 90 dakika boyunca yüklenmiş ve ayrıştırılmıştır. Proteinler, 4 °C'de 300 mA ile 90 dakika boyunca poliviniliden diflorür (PVDF) membranlara (0,45 µm gözenek boyutu) aktarılmıştır. %0,1 Tween-20 içeren Tris tamponlu salin (TBST) içindeki %5 yağsız süt ile oda sıcaklığında 1 saat boyunca bloklama yapıldıktan sonra, membranlar primer antikorlarla 4 °C'de hafif çalkalama ile gece boyunca inkübe edilmiştir. TBST ile üç kez yıkamanın ardından (her biri 10 dk), membranlar oda sıcaklığında 1 saat boyunca sekonder antikorlarla inkübe edilmiştir. Protein bantları, geliştirilmiş kemilüminesans (ECL) substratı kullanılarak görselleştirilmiş ve dijital jel görüntüleme sistemi ile görüntülenmiştir. Doygunluğu önlemek için her antikor için pozlama süreleri optimize edilmiştir. Densitometrik kantifikasyon, jel analiz aracı kullanılarak ImageJ yazılımı ile gerçekleştirilmiştir. Tüm hedef protein bant yoğunlukları, yükleme kontrolü olarak GAPDH'ye normalize edilmiş ve p-ERK ekspresyonu ayrıca toplam ERK ekspresyonuna normalize edilmiştir. %5 yağsız süt dışında ek bloklama adımı uygulanmamıştır. Kantifikasyon sonuçları, 1,0 olarak belirlenen kontrol grubuna göre kat değişimi (fold change) olarak sunulmuştur. Her deney bağımsız olarak üç kez tekrarlanmıştır. Temsili immünoblotlar gösterilmiştir.

NOD/SCID farelerde HepG2 ksenogreft tümörlerde VEGF ekspresyonunun immünohistokimyasal tespiti

Xenograft oluşturulması için: Logaritmik büyüme fazındaki HepG2 hücreleri tripsinizasyon yoluyla toplandı, steril fosfat tamponlu salin (PBS) ile iki kez yıkandı ve serumsuz DMEM içinde yeniden süspanse edildi. NOD/SCID farelerde bir HepG2 deri altı xenograft modeli oluşturmak için, 0,2 mL serumsuz DMEM (Matrigel olmadan) içindeki toplam 2 × 106 hücre, her bir NOD/SCID faresinin sağ aksiller bölgesine (zengin kan akışına sahip bir alan) 1 mL'lik bir şırınga kullanılarak deri altına enjekte edildi. Tümör tutulumu her 2 günde bir izlendi. Tümör boyutu her iki günde bir ölçüldü ve tümör çapı 0,3–0,5 cm'ye ulaştığında (enjeksiyondan yaklaşık 7–10 gün sonrası, tedavi başlangıç noktası olarak tanımlanmıştır), fareler deney için rastgele 4 gruba ayrıldı. Deri altı xenograftın uzunluğu (L) ve genişliği (W) dijital kumpaslar kullanılarak her gün ölçüldü ve tümör hacmi (V), V = (L × W2) / 2 formülüne göre hesaplandı. Tüm ölçümler, grup tahsislemesine kör olan bir araştırmacı tarafından gerçekleştirildi. 20 gün sonra hayvanlar derin anestezi altında servikal dislokasyonla ötaniyaziye tabi tutuldu ve xenograft dokusu, oda sıcaklığında 24 saat boyunca %10 nötr tamponlu formalin içinde fikse edildi, ardından parafinle gömüldü. Doku kesitleri (5 µm kalınlığında) döner mikrotom kullanılarak kesildi ve poli-L-lizin kaplı cam lamlara monte edildi. İmmünohistokimya için kesitler ksilenle (üç değişim, her biri 5 dk) deparafine edildi ve dereceli bir etanol serisi ( %100, %95, %70, %50; her biri 3 dk) ile yeniden hidrate edildi. Antijen geri kazanımı, kesitlerin bir mikrodalgada 10 mM sodyum sitrat tamponu içinde 15 dk ısıtılması ve ardından oda sıcaklığında 20 dk soğutulmasıyla gerçekleştirildi. Endojen peroksidaz aktivitesi, oda sıcaklığında 10 dk boyunca metanoldeki %3 hidrojen peroksit ile bloke edildi. Non-spesifik bağlanma, oda sıcaklığında 1 saat boyunca PBS içindeki %5 normal keçi serumu ile bloke edildi. Ardından kesitler, nemlendirilmiş bir hazne içinde 4 °C'de gece boyu primer anti-VEGF antikoru (dilüsyon 1 : 200) ile inkübe edildi. PBS ile yıkamanın ardından (üç kez, her biri 5 dk), kesitler oda sıcaklığında 1 saat boyunca horseradish peroxidase (HRP)-konjuge keçi anti-tavşan sekonder antikoru (1 : 500) ile inkübe edildi. Sinyal, 3,3′-diaminobenzidin (DAB) substratı kullanılarak tespit edildi. Kesitler 30 saniye boyunca hematoksilin ile karşı boyandı, dehidrate edildi, şeffaflaştırıldı ve kalıcı montaj medyumu kullanılarak lamellerle kapatıldı. Görüntüleme, parlak alan ayarlarında ×100 büyütmede floresan evirtmiş mikroskop kullanılarak gerçekleştirildi. Temsili görüntüler kalitatif gösterim için sunulmuştur.

Kontamine olmuş tüm uçlar, tüpler ve hücre kültürü atıkları biyo-tehlikeli atık olarak toplandı ve bertaraf edilmeden önce otoklavlandı. İlaç içeren çözeltiler, DMSO, ksilen ve metanol dahil olmak üzere kimyasal atıklar, ayrıştırılmış ve etiketlenmiş atık konteynerlerinde toplandı ve tehlikeli kimyasal atıklara yönelik yerel kurumsal düzenlemeler uyarınca bertaraf edildi.

İstatistiksel analiz

İstatistiksel analizler için SPSS 19.0 yazılımı kullanılmıştır. Deneysel veriler, in vitro deneyler için üç bağımsız biyolojik tekrardan elde edilen ortalama ± SD olarak ve in vivo deneyler için grup başına n = 10 fareden elde edilen ortalama ± standart sapma (SD) olarak ifade edilmiştir. İki grup arasındaki karşılaştırmalar için iki kuyruklu bağımsız t-testleri kullanılmıştır. Birden fazla grup arasındaki karşılaştırmalar için tek yönlü varyans analizi (ANOVA) ve ardından Tukey post hoc testi kullanılmıştır. p < 0.05, p < 0.01 ve p < 0.001 değerleri rapor edilmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Sorafenib ve gemcitabine'in HepG2 hücre proliferasyonu üzerindeki inhibitör etkisi

Tablo 1'de gösterildiği üzere, Sorafenib ve gemcitabine HepG2 hücre proliferasyonunu doz bağımlı olarak inhibe etmiştir. Kombinasyon tedavisi, tüm zaman noktalarında monoterapiden anlamlı derecede daha yüksek inhibisyon oranları göstermiştir. MTT, hücre sayısı ile korelasyon gösteren ancak proliferasyonu veya sitotoksisiteyi doğrudan ölçmeyen metabolik aktiviteyi ölçer. Bu neden...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Karaciğer kanseri; sinsi başlangıcı, hızlı ilerlemesi ve etkili tedavi seçeneklerinin azlığı nedeniyle yüksek bir mortalite oranına sahiptir3,15. İleri evre karaciğer kanseri genellikle kemoterapi ve radyasyon direncine sahiptir ve cerrahi rezeksiyon ile karaciğer naklini içeren mevcut seçenekler yetersiz kalmaktadır15,16. Farklı etki mekanizmalarına sahip iki veya daha fazla kemoterapi ilacının kombinasy...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların beyan edilecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Yazarların herhangi bir teşekkürü yoktur.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Dijital jel görüntüleme sistemiBio-Rad Laboratories, Inc., ABD1708280
yüksek glukozlu DMEM medyumuHyClone, ABDSH30243.01
ERK tavşan monoklonal antikoruSanta Cruz, ABDsc-94
Fetal sığır serumuZhejiang Tianhang Biotechnology Co., Ltd., Çin11011-8611/11011-8615
Floresan ters mikroskopOlympus, JaponyaIX73
GAPDH tavşan poliklonal antikoruSanta Cruz, ABDsc-25778
GemcitabinEli Lilly and Company95058-81-4
Keçi anti-tavşan ikincil antikoruShanghai Shenggong Biological Engineering Co., Ltd., ÇinD111018
ImageJ yazılımı National Institutes of Health, Bethesda, MD, ABD Sürüm 1.8.0_112
Mikroplaka okuyucuThermo Fisher Scientific Inc., ABDMK3
p-ERK tavşan monoklonal antikoruSanta Cruz, ABD9106
Soğutmalı santrifüjChangsha Xiangyi Centrifuge Co., Ltd.DL-5M
RIPA liziz tamponuBiyuntian Biological Technology Research Institute, ÇinP0013B
Rotary mikrotomLeica, AlmanyaCM3050
SorafenibBayer Şirketi, Almanya284461-73-0
Tiyazolil Mavi (MTT)Sigma, ABDM5655
Üç gazlı inkübatörThermo Fisher Scientific Inc., ABD51026402
VEGF tavşan monoklonal antikoruBioLegend, USAB199116

Kaynaklar

  1. Fujii T, Kuzuya T, Kondo N, Funasaka K, Ohno E, Hirooka Y, et al. Altered intestinal Streptococcus anginosus and 5α-reductase gene levels in patients with hepatocellular carcinoma and elevated Bacteroides stercoris in atezolizumab/bevacizumab non-responders. J Med Microbiol. 2024;73(9):001878.
  2. Gay MD, Drda JC, Chen W, Huang Y, Yassin AA, Duka T, et al. Implicating the cholecystokinin B receptor in liver stem cell oncogenesis. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2024;326(3):G291-g309.
  3. Diao X, Guo C, Jin Y, Li B, Gao X, Du X, et al. Cancer situation in China: an analysis based on the global epidemiological data released in 2024. Cancer Commun (Lond). 2025;45(2):178-97.
  4. Yokota S, Yonezawa T, Momoi Y, Maeda S. Sorafenib inhibits tumor cell growth and angiogenesis in canine transitional cell carcinoma. J Vet Med Sci. 2022;84(5):666-74.
  5. Nassar-Reis JP, Umeta PF, Stefano JT, Longatto-Filho A, Carrilho FJ, Alves VAF, et al. P53 and VEGF are promising biomarkers for sorafenib efficacy in an experimental model of NASH-related HCC. J Mol Histol. 2023;54(5):473-88.
  6. Taha AM, Aboulwafa MM, Zedan H, Helmy OM. Ramucirumab combination with sorafenib enhances the inhibitory effect of sorafenib on HepG2 cancer cells. Sci Rep. 2022;12(1):17889.
  7. Ning L, Tian Y, Chen D, Han J, Xie G, Sun J. Sorafenib safety evaluation: Real-world analysis of adverse events from the FAERS database. Heliyon. 2024;10(18):e37348.
  8. Vij P, Hussain MS, Satapathy SK, Cobos E, Tripathi MK. The emerging role of long noncoding RNAs in sorafenib resistance within hepatocellular carcinoma. Cancers (Basel). 2024;16(23):3904.
  9. Lu X, Chen Z, Mi W, Zheng J, Liu Y. MARK1 suppress malignant progression of hepatocellular carcinoma and improves sorafenib resistance through negatively regulating POTEE. Open Med (Wars). 2024;19(1):20241060.
  10. Lee HJ, Lee JS, So H, Yoon JK, Choi JY, Lee HW, et al. Comparison between nivolumab and regorafenib as second-line systemic therapies after sorafenib failure in patients with hepatocellular carcinoma. Yonsei Med J. 2024;65(7):371-9.
  11. Tang W, Chen Z, Zhang W, Cheng Y, Zhang B, Wu F, et al. The mechanisms of sorafenib resistance in hepatocellular carcinoma: theoretical basis and therapeutic aspects. Signal Transduct Target Ther. 2020;5(1):87.
  12. Lin Q, Guan S, Peng M, Yu H. A mesoporous silica-based nano-drug co-delivery system with gemcitabine for targeted therapy of pancreatic cancer. J Coll Physicians Surg Pak. 2024;34(12):1456-63.
  13. Tang J, Liu Z, Xie G, Wang C, Jiang Y. POU4F1 enhances lung cancer gemcitabine resistance by regulating METTL3-dependent TWF1 mRNA N6 adenosine methylation. 3 Biotech. 2025;15(1):7.
  14. Cheng J, Zhu T, Liu S, Zhou J, Wang X, Liu G. Prediction of synergistic gemcitabine-based combination treatment through a novel tumor stemness biomarker NANOG in pancreatic cancer. RSC Med Chem. 2024;15(11):3853-61.
  15. Man S, Luo C, Yan M, Zhao G, Ma L, Gao W. Treatment for liver cancer: From sorafenib to natural products. Eur J Med Chem. 2021;224:113690.
  16. Llovet JM, Pinyol R, Kelley RK, El-Khoueiry A, Reeves HL, Wang XW, et al. Molecular pathogenesis and systemic therapies for hepatocellular carcinoma. Nat Cancer. 2022;3(4):386-401.
  17. Bronte F, Bronte G, Cusenza S, Fiorentino E, Rolfo C, Cicero G, et al. Targeted therapies in hepatocellular carcinoma. Curr Med Chem. 2014;21(8):966-74.
  18. Li H, Zhang Z, Zhou Z, Ding X, Zhou G. Optimal combination of gemcitabine, sorafenib, and S-1 shows increased efficacy in treating cholangiocarcinoma in vitro and in vivo. Anticancer Drugs. 2016;27(7):600-8.
  19. Awasthi N, Zhang C, Hinz S, Schwarz MA, Schwarz RE. Enhancing sorafenib-mediated sensitization to gemcitabine in experimental pancreatic cancer through EMAP II. J Exp Clin Cancer Res. 2013;32(1):12.
  20. Jiang S, Wang R, Zhang X, Wu F, Li S, Yuan Y. Combination treatment of gemcitabine and sorafenib exerts a synergistic inhibitory effect on non-small cell lung cancer in vitro and in vivo via the epithelial-to-mesenchymal transition process. Oncol Lett. 2020;20(1):346-56.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

Karaciğer KanseriSorafenib GemsitabinNOD SCID FarelerMTT AnaliziProtein EkstraksiyonuSDS PAGEERK EkspresyonuVEGF İmmünohistokimyası
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.