Sorafenib ile gemcitabine kombinasyonu, HepG2 hücre proliferasyonunun additif inhibisyonuna dair ön kanıtlar sunmakta, p-ERK ve VEGF ekspresyonunda korelatif değişiklikler göstermekte ve NOD/SCID farelerde karaciğer tümörü büyümesini baskılamaktadır.
Araştırma makalesi
HepG2 Hücrelerinde ve NOD/SCID Fare Xenograft Modelinde Kombine Sorafenib ve Gemcitabine Tedavisinin Değerlendirilmesi: Bir Pilot Çalışma
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
Karaciğer kanseri, ilaç direnci ve sınırlı tedavi seçenekleri nedeniyle kansere bağlı ölümlerin önde gelen nedenlerinden biri olmaya devam etmektedir. Sonuçları iyileştirmek için terapötik stratejilerin araştırılmasına acil bir ihtiyaç vardır. Bu pilot çalışma, karaciğer kanserinde sorafenib ve gemcitabine kombinasyonunun potansiyel etkilerini ve temel mekanizmalarını değerlendirmek için bir protokol sunmaktadır. HepG2 karaciğer kanseri hücre hattı kullanılmış ve obez olmayan diyabetik/şiddetli kombine immün yetmezliği (NOD/SCID) fare ksenograft modeli oluşturulmuştur. Şu temel prosedür adımları gösterilmektedir: (1) HepG2 hücre kültürü ve ilaç uygulaması; (2) MTT analizi kurulumu, inkübasyon ve absorbans okuması; (3) protein ekstraksiyonu, SDS-PAGE, transfer ve ERK ile p-ERK için immunoblotting; (4) NOD/SCID farelerde deri altı ksenograft oluşturulması; (5) tümör ölçümü ve hacim hesaplaması; ve (6) tümör kesitlerinde VEGF immünohistokimyası. Kritik adımlar, sorun giderme ipuçları ve ekipman spesifikasyonları sağlanmıştır. Sorafenib (3 µmol/L) ve gemcitabine (10 µmol/L) kombinasyonu, 72 h süresinde % 71,23 ± % 6,76'lık bir inhibisyon oranı ve 1,35'lik bir q-değeri elde etmiştir; bu da test edilen koşullar altında bu spesifik doz çiftinde sinerjik bir etkiye işaret etmektedir. Kontrol grubuyla karşılaştırıldığında, kombinasyon tedavisi azalmış p-ERK ekspresyonu, azalmış tümör hacmi ve kalitatif olarak daha düşük VEGF immün boyaması ile ilişkilendirilmiştir. Bu veriler, nedensellik kurmadan, azalmış p-ERK ekspresyonu ile gözlemlenen antiproliferatif etki arasında korelatif bir ilişki olduğunu göstermektedir. HepG2 hücrelerinde ve bir NOD/SCID fare ksenograft modelinde, sorafenib ve gemcitabine kombinasyonu antiproliferatif potansiyele dair ön kanıtlar sunmakta ve azalmış VEGF ekspresyonu ile ilişkilendirilmektedir; ancak mikrodamar yoğunluğu veya fonksiyonel vasküler analizler gerçekleştirilmediği için bu bulgu anti-anjiyojenik aktivitenin doğrudan kanıtını oluşturmamaktadır. Bu tekrarlanabilir protokol, HCC modellerinde ilaç kombinasyonlarını değerlendirmek için kullanışlı bir çerçeve sunmakta ve diğer hedefe yönelik tedavi-kemoterapi rejimlerine uyarlanabilmektedir, ancak herhangi bir klinik çıkarım yapılmadan önce daha fazla mekanistik ve doz doğrulama çalışmaları gereklidir.
Giriş
Karaciğer kanseri, en yaygın ve en ölümcül kanserlerden biri olmasının yanı sıra, en hızlı büyüyen malign tümörlerden biridir1,2. Karaciğer kanseri insidansı azalmakla birlikte, karaciğer kanserinin genel yükü artmaya devam etmiştir. 2022 yılına ait küresel epidemiyolojik veriler, Global Cancer Observatory (GLOBOCAN) 2022 çevrimiçi veri tabanında karaciğer kanserinin yaşa göre standardize edilmiş insidans oranının 100.000 kişi başına 15,0; yaşa göre standardize edilmiş mortalite oranının ise 100.000 kişi başına 26,7 olduğunu ve bunun karaciğer kanserini kanser kaynaklı ölümlerde ikinci ana neden haline getirdiğini ortaya koymuştur3. Günümüzde, karaciğer kanserinin etkili bir tedavisinin olmaması ve sinsi başlangıcı nedeniyle çoğu hasta teşhisten sonra bir yıl içinde hayatını kaybetmektedir. Sorafenib, epidermal büyüme faktörü reseptörü (EGFR), trombosit kaynaklı büyüme faktörü reseptörü (PDGFR) ve serin/treonin kinazlar gibi reseptör tirozin kinazları hedefleyen, klinik kullanım için onaylanmış ilk çok hedefli kinaz inhibitörüdür4,5. Oral bir multikinaz inhibitörü olan sorafenib, çoklu büyüme faktörü yollarını hedefleyerek karaciğer kanserinde antiproliferatif ve anti-anjiyojenik etkiler gösterir. Tarihsel olarak sorafenib, ileri evre veya rezeke edilemeyen karaciğer kanseri olan hastalar için FDA onaylı ilk birinci basamak sistemik tedaviydi6. Ancak, ileri evre hepatosellüler karsinom (HCC) için mevcut birinci basamak tedavi yelpazesi önemli ölçüde genişlemiştir. Önerilen seçenekler arasında artık immün kontrol noktası inhibitörü kombinasyonu olan atezolizumab artı bevacizumab, lenvatinib ve dual immünoterapi kombinasyonu olan durvalumab artı tremelimumab gibi tedaviler yer almaktadır. Bu ilerlemelere rağmen sorafenib, özellikle immünoterapi kombinasyonlarının kolayca erişilebilir olmadığı veya kontrendike olduğu bölgelerde önemli bir birinci basamak seçeneği olmaya devam etmektedir. Karaciğer kanserinde yaygın kullanımı nedeniyle, ilaca bağlı advers olaylar bir endişe kaynağı olmuştur7. 2006'dan 2023'e kadar olan FDA Advers Olay Raporlama Sistemi (FAERS) veri tabanı analizinde, sorafenib'in advers olaylarının temel olarak sindirim sistemi, cilt ve deri altı dokularının yanı sıra enfeksiyon ve yaralanma gibi spesifik olmayan fiziksel rahatsızlıkları kapsadığı görülmüştür7. İleri evre karaciğer kanseri olan bazı hastalar sorafenib tedavisinden fayda görebilse de, çoğu hasta sonunda direnç geliştirir veya tedavi başarısızlığı yaşar, bu da kötü bir prognoza yol açar8,9,10. Kullanımına rağmen sorafenib, HCC hastalarının yalnızca yaklaşık %30'una fayda sağlamaktadır; dahası, yanıt veren hastalar genellikle 6 ay içinde direnç geliştirmektedir11. Sorafenib direnci ile ilişkili moleküler yolaklar arasında hücre dışı sinyal düzenleyici kinaz (ERK)/fosforile ERK (p-ERK), protein kinaz B (Akt), fosfoinositid 3-kinaz (PI3K)/AKT/memeli rapamisin hedefi (mTOR), hipoksiyle indüklenebilir faktör 1α (HIF-1α)/HIF-2α ve otofaji ile ilgili yolaklar yer almakta olup, bu araştırmada özellikle ERK/p-ERK vurgulanmış ve seçilmiştir11. Gemcitabine, vücuda girerek DNA sentezi üzerinde farklı inhibitör etkileri olan diflorositidin difosfat ve diflorositidin trifosfat üreten bir sitidin analoğudur12. Hepatobiliyer malignitelerde gemcitabine, kombinasyon kemoterapisinin bir bileşeni olarak değerlendirilmiştir. Ancak, gemcitabine'in klinik olarak daha yüksek ilaç direnci gösterdiği rapor edilmiş olup bu durum gemcitabine'in etkinliğini sınırlamaktadır12,13. Bu nedenle, optimal ilaç rejimini etkili ve verimli bir şekilde belirlemek son derece zordur. Son çalışmalar, yeni bir tümör kök hücre benzerliği biyobelirteç öngörüsüne dayanarak, gemcitabine ile sorafenib kombinasyonunun artırılmış terapötik etkiye sahip olabileceğini göstermiştir14. Ancak, bildiğimiz kadarıyla, hiçbir çalışma bu kombinasyonu karaciğer kanserinde özellikle HepG2 hücreleri ve bir hepatosellüler karsinom non-obez diyabetik/şiddetli kombine immün yetmezlik (NOD/SCID) fare ksenogreft modeli kullanarak incelememiştir. Dolayısıyla, sorafenib ve gemcitabine'in karaciğer kanserindeki additive etkilerini doğrudan doğrulayan deneysel kanıtlar halen eksiktir.
Bu makalede açıklanan prosedürler yaygın olarak kullanılmaktadır ancak kariyerinin başındaki araştırmacıların tekrarlayabileceği şekilde ayrıntılı, görsel ve adım adım bir formatta nadiren sunulmaktadır. Sorafenib ve gemcitabine kombinasyonunun karaciğer kanseri hücre proliferasyonunu ve tümör büyümesini eklemeli olarak inhibe edeceğini ve bu etkinin ERK/p-ERK yolunun aşağı regülasyonu ve vasküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF) aracılı anjiyogenezin azalmasıyla ilişkili olacağını hipotez ettik. Bu çalışma, sorafenib ile kombine edilen gemcitabine'in HepG2 karaciğer kanseri hücre hattının proliferasyonu üzerindeki inhibisyon etkisini in vitro ve in vivo olarak ve mekanizmasını öncül olarak araştırmayı amaçlamaktadır (Ek Şekil 1). Bu çalışmanın özgünlüğü üç noktada yatmaktadır: (1) sorafenib-gemcitabine kombinasyonunu, yaygın olarak kullanılan HepG2 hücre hattı ve buna karşılık gelen NOD/SCID fare modeli kullanarak özellikle karaciğer kanserinde test eden ilk çalışmadır; (2) potansiyel bir mekanizma olarak yeterince çalışılmamış olan ERK/p-ERK yolunu incelemektedir; ve (3) bu kombinasyonun karaciğer kanserindeki eklemeli etkisi için hesaplamalı öngörüler yerine doğrudan deneysel kanıtlar sunmaktadır. Bu özellikler, bu çalışmayı diğer tümör tiplerinde veya farklı deneysel modeller kullanılarak yürütülen, özellikle sorafenib bazlı rejimler bağlamındaki önceki kombinasyon tedavisi raporlarından ayırmaktadır.
Protokol
Etik onay, Zhejiang University-Laboratory Animal Welfare and Ethics Review tarafından sağlanmıştır (Onay No. ZJU20250049).
Hayvanlar ve gruplandırma
Lisanslı bir ticari tedarikçiden (Lisans No. SCXK (Shanghai) 2013-0006) satın alınan, 4–5 haftalık, 18–20 g ağırlığındaki toplam 40 dişi NOD/SCID fare, spesifik patojenle arındırılmış (SPF) sınıfı hayvan odalarında barındırılmıştır. Tüm hayvan protokolleri standart kılavuzlara uygun olarak yürütülmüştür. Deney boyunca hayvanların serbestçe beslenip içmelerine izin verilmiş, iyi kontrol edilen bir SPF odasında gruplar halinde (kafes başına 5 fare), oda sıcaklığı 22 ± 2 °C, nem %50%–60% ve 12/12 saatlik bir ışık/karanlık döngüsü ile barındurulmuşlardır. Hayvanlara ad libitum yem ve su sağlanmış ve vücut ağırlıkları her 2 haftada bir izlenmiştir. Farelerin sürekli ağrı, kaşeksi, tümör ülserleri göstermesi, tümör boyutunun maksimum 2 cm'ye ulaşması veya diğer geri dönüşü olmayan sağlık sorunlarının oluşması durumunda, Hayvan Etik Kurulu tarafından onaylanan insani sonlandırma kriterlerine uygun olarak, vücut ağırlığına göre ≥150 mg/kg dozunda %0,45 pentobarbital sodyumun intraperitonal enjeksiyonu ile ötanazi uygulanmış; ardından solunum ve kalp atışının durması, kornea refleksinin kaybı teyit edilmiş veya gerekirse ikincil bir fiziksel yöntem uygulanmıştır. Örneklem büyüklüğü (grup başına n = 10), 1,2'lik bir etki büyüklüğü (pilot deneylerden türetilen), α = 0,05 ve β = 0,20 (%80 güç) varsayılarak yapılan bir güç analizine ve %20'lik bir yıpranma payına göre belirlenmiştir. Tümör implantasyon prosedürleri, tedaviye önceden atanmadan önce gerçekleştirilmiştir (ksenogreft oluşturma için aşağıya bakınız).
Tümör implantasyonu ve tümör tutunmasının onaylanmasının ardından fareler, NOD/SCID fare transplant tümör modelini oluşturmak amacıyla rastgele sayı tablosu yöntemi kullanılarak kontrol grubu, sorafenib grubu, gemcitabine grubu ve sorafenib ile gemcitabine kombinasyon grubu olmak üzere 4 gruba rastgele ayrılmıştır ve her grupta 10 fare (kafes başına 5 fare) yer almıştır. Modelleme sürecindeki tümör dokularının NOD/SCID farelerde genel durumun kötüleşmesine ve hatta ölüme neden olabileceği ve istatistiksel analizlerin genellikle etkili bir örneklem büyüklüğü gerektirdiği göz önünde bulundurularak, her gruba en az 10 fare dahil edilmiştir. Rastgele gruplandırma bağımsız teknisyenler tarafından gerçekleştirilmiş ve kafesler etiketlenmiştir; ilaç uygulaması veya tümör ölçümü sırasında körleme uygulanmamıştır, bu durum önemli bir kısıtlamadır. Geri kalan doku örneklemesi, biyokimyasal ve patolojik değerlendirmelerin tamamı körleme yöntemiyle laboratuvar personeli tarafından yürütülmüştür. Veriler ayrıca, istatistikler tamamlanana ve veriler körlemeden çıkarılana kadar yalnızca kodlanmış dosyalara erişimi olan istatistikçiler tarafından körleme şeklinde analiz edilmiştir. Tüm hayvanlar final analizine dahil edilmiştir. Sistemik emilimi ve tutarlı biyoyararlanımı sağlamak için her iki ilaç için de intraperitoneal yol seçilmiştir; günde bir kez dozlama, bu rejimle sürdürülen plazma konsantrasyonlarını gösteren önceki farmakokinetik çalışmalara dayandırılmıştır. Araç kontrol grubuna intraperitoneal olarak 0.2 mL steril normal salin enjekte edilmiştir. Sorafenib grubuna intraperitoneal olarak 0.2 mL 40 mg/kg sorafenib enjekte edilmiştir. Gemcitabine grubuna intraperitoneal olarak 0.2 mL 100 mg/kg gemcitabine enjekte edilmiştir. Kombinasyon tedavi grubu: 40 mg/kg sorafenib ve 100 mg/kg gemcitabine'den 0.2 mL'şer intraperitoneal olarak uygulanmıştır. Her gruba 20 gün boyunca günde bir kez uygulama yapılmıştır. Tüm hayvanlar final analizine dahil edilmiş ve çalışmadan herhangi bir fare çıkarılmamıştır. 20 günlük tedavi süresi boyunca hiçbir grupta mortalite gözlemlenmemiştir. Takvim ve dozlar, hepatobilyer kanser modellerindeki yayınlanmış çalışmalara göre seçilmiştir. Gemcitabine'in günlük intraperitoneal uygulamasının toksisiteye neden olabileceği unutulmamalıdır. Transplant tümörlerin uzunluğu ve genişliği günlük olarak ölçülmüş ve transplant tümörlerin hacmi hesaplanmıştır. 20 gün sonra hayvanlar derin anestezi altında servikal dislokasyonla ötanize edilmiş ve transplant tümör dokuları formalinde fikse edilmiştir. Vücut ağırlığı çalışma boyunca her 2 günde bir ölçülmüştür. Fareler; piloereksiyon, kambur duruş, azalmış mobilite, diyare ve letarji dahil olmak üzere klinik toksisite belirtileri açısından günlük olarak izlenmiştir. Bununla birlikte, serum biyokimyası (örneğin, alanin aminotransferaz, aspartat aminotransferaz ve kreatinin) ve ana organların histopatolojik incelemesi yapılmamıştır. Bu nedenle, subklinik toksisite dışlanamaz.
İlaçlar ve reaktifler
Sorafenib, %10 dimetil sülfoksit (DMSO) içinde çözülmüş ve -20 °C'de saklanmıştır. Kullanımdan önce solüsyon çözdürülmüş ve hücre büyümesi üzerinde herhangi bir etkisi olmayan %0,5'ten düşük nihai DMSO konsantrasyonuna seyrelştirilmiştir. Gemcitabine ticari bir kaynaktan temin edilmiştir. Radyoimmünopresipitasyon analizi (RIPA) liz tamponu, tiazolil mavisi, gliseraldehit-3-fosfat dehidrogenaz (GAPDH), ERK, p-ERK ve VEGF'e karşı primer antikorlar, sekonder antikorlar, Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) yüksek glikozlu besiyeri, fetal sığır serumu ve HepG2 hücre hattı ticari kaynaklardan temin edilmiştir.
Sorafenib ve gemcitabine sitotoksik ajanlardır. Tüm ilaç hazırlama ve uygulama prosedürleri, uygun kişisel koruyucu ekipman (laboratuvar önlüğü, nitril eldivenler ve koruyucu gözlükler) giyilmiş halde, belirlenmiş bir biyogüvenlik kabininde gerçekleştirilmelidir. Bu protokolde kullanılan DMSO, metanol, ksilen ve diğer organik çözücüler tehlikelidir ve solunmayı veya ciltle teması önlemek için bir çeker ocak içerisinde kullanılmalıdır. Tüm reaktifler için malzeme güvenlik veri sayfaları (MSDS) kullanım öncesinde incelenmelidir.
Hücre Kültürü
HepG2 hücre hattı canlandırılmış ve 10 mL DMEM yüksek glukoz besiyeri (10% fetal bovine serum, 100 U/mL penisilin-streptomisin ve 4 mmol/L glutamin ile desteklenmiş) içeren hücre kültürü şişelerine ekilmiştir. Hücreler, %5 CO₂ içeren nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 °C'de inkübe edilmiştir. Kültür besiyeri her 2 günde bir değiştirilmiş ve logaritmik büyümeyi sürdürmek için hücreler her 4 günde bir pasajlanmıştır. HepG2 hücre hattı ticari bir kaynaktan temin edilmiştir; ancak, bu çalışmada bağımsız hücre hattı doğrulaması (örneğin, kısa tandem tekrar profilleme) ve mikoplazma testi yapılmamıştır.
Proliferasyon inhibisyon oranının belirlenmesi için MTT yöntemi
Sorafenibin ve gemcitabinin HepG2 hücre hattı üzerindeki proliferasyon inhibisyon oranı, 3-(4,5-dimetiltiyazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolyum bromür (MTT) yöntemi kullanılarak belirlenmiştir. Logaritmik büyüme evresindeki hücreler %0,25'lik tripsin ile 2 dakika boyunca sindirilmiş ve sindirim işlemi, eşit hacimde komple besiyeri eklenerek sonlandırılmıştır. 1000'de santrifüj işleminden sonra × g hücreler 10 dakika boyunca komple medyumda süspanse edildi. Hücre yoğunluğu 1'e ayarlandı × 105 hücre/mL ve 200 µL hücre süspansiyonu, 96 kuyucuklu bir plakanın her bir kuyucuğuna ekilmiştir. Bu ekim yoğunluğu, 5 arası hücre yoğunluklarının denendiği ön optimizasyon deneylerine dayanarak seçilmiştir × 103 5'e × 104 kuyu başına 2 hücre test edildi. 2'nin yoğunluğu × 104 kuyu başına hücre sayısı, 96 saat boyunca lineer absorbans artışı sağladı ve evriltme mikroskobu altındaki görsel inceleme ile doğrulandığı üzere, bitiş noktasında konfluens %80'in altında tutuldu. MTT ölçümlerinin lineer aralıkta kaldığından emin olmak için, her bir zaman noktasında araç ile işlem görmüş kontrol kuyucuklarıyla pilot deneyler gerçekleştirildi. Besin tükenmesini ve metabolik yan ürünlerin birikimini önlemek için besiyeri her 48 saatte bir yenilendi. Konfluens, bir evriltme mikroskobu kullanılarak günlük olarak izlendi. 96. saatte, kontrol kuyucukları yaklaşık %75-80 konfluense ulaştı ve herhangi bir belirgin besin tükenmesi belirtisi gözlemlenmedi. Hücre tutunmasının ardından besiyeri atıldı ve ilaç içeren besiyeri eklendi. İşlem görmemiş kontrol grubuna (araç kontrolü için) ilaç içermeyen besiyeri eklendi. in vivo deneyler). Deney; işlem görmemiş kontrol grubu, sorafenib grubu, gemcitabine grubu ve kombinasyon tedavi grubu olmak üzere bölünmüştür. Sorafenib dozları 1.5 µmol/L, 3 µmol/L, 4.5 µmol/Lve 6 µmol/Lve gemcitabine dozları şunlardı 5 µmol/L, 10 µmol/L, 15 µmol/Lve 20 µmol/LSorafenib'in gemcitabine ile kombine edilen dozları şöyledir: 1.5 µmol/L + 5 µmol/L, 3 µmol/L + 10 µmol/L, 4.5 µmol/L + 15 µmol/Lve 6 µmol/L + 20 µmol/LHer gruptaki hücreler 24 sa, 48 sa, 72 sa ve 96 sa boyunca kültüre edilmiştir. Kültürleme işleminin ardından, 20 µL her bir kuyucuğa 5 mg/mL MTT eklendi ve hücreler bir hücre inkübatöründe 4 saat boyunca inkübe edildi. Süpernatan dikkatlice uzaklaştırıldı ve ardından 150 µL Her bir kuyucuğa DMSO eklendi ve formazanın tamamen çözünmesi için plaka 10 dakika boyunca çalkalandı; ardından her kuyucuğun optik yoğunluk (OD) değeri, çok fonksiyonlu bir mikroplaka okuyucu kullanılarak 490 nm'de ölçüldü. Deney üç kez tekrarlandı ve her grupta beş tekrarlı kuyucuk yer aldı. Veriler ortalama olarak sunuldu ± Üç biyolojik replikanın standart sapması (SD). Hücre büyüme inhibisyon oranı (%) = (1 - OD deney grubu /OD işlem görmemiş grup）× %100. İki ilaç arasındaki etkileşim, şunlara göre değerlendirilmiştir: qşu formülle hesaplanan p-değeri: Soru (veya Sorgu) = EAB / (EA + EB - EA × EB). Burada EA ve EB, A ve B ilaçlarının tek başına kullanıldığındaki inhibisyon oranları, EAB ise iki ilacın birlikte kullanıldığı durumdaki inhibisyon oranıdır. Şöyle olduğunda q 1,15'ten büyükse, iki ilaç arasında sinerjistik bir etki olduğunu gösterir; 0,85–1,15 arası additif bir etkiyi gösterir ve q 0,85'ten küçük olması antagonistik bir etkiyi gösterir. Lütfen çevirmemi istediğiniz kaynak metni paylaşın.-değeri yöntemi basit bir tarama aracıdır ve daha titiz sinerji analizlerinin yerini tutmaz. Yalnızca birkaç sabit oranlı doz çifti test edilmiş olup bu durum sinerji iddiasının güvenilirliğini sınırlamaktadır. Bu nedenle, terimi "sinerji" bu çalışmada ... anlamına gelmektedir q > belirli doz çiftlerinde ve zaman noktalarında 1,15 değerine, tüm doz-yanıt matrisi boyunca doğrulanmış bir additif etkileşime değil.
ERK ve p-ERK protein ekspresyonunun Western blot analizi
Hücre kültürü ve deneysel gruplandırma yukarıda açıklandığı şekilde gerçekleştirilmiştir. Western Blot yöntemiyle ERK ve p-ERK tespiti için sorafenib dozu 3 µmol/L; gemcitabine dozu 10 µmol/L ve kombinasyon dozu 3 µmol/L + 10 µmol/L olarak uygulanmıştır. 72 saatlik tedavinin ardından hücreler RIPA liziz tamponu ile lizize edilmiş ve her deneysel gruptan toplam protein ekstraksiyonu yapılmıştır. Protein konsantrasyonu bikarboninik asit (BCA) yöntemi ile belirlenmiştir. Eşit miktarda protein (hat başına 30 µg), %10 sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) ile 120 V'da 90 dakika boyunca yüklenmiş ve ayrıştırılmıştır. Proteinler, 4 °C'de 300 mA ile 90 dakika boyunca poliviniliden diflorür (PVDF) membranlara (0,45 µm gözenek boyutu) aktarılmıştır. %0,1 Tween-20 içeren Tris tamponlu salin (TBST) içindeki %5 yağsız süt ile oda sıcaklığında 1 saat boyunca bloklama yapıldıktan sonra, membranlar primer antikorlarla 4 °C'de hafif çalkalama ile gece boyunca inkübe edilmiştir. TBST ile üç kez yıkamanın ardından (her biri 10 dk), membranlar oda sıcaklığında 1 saat boyunca sekonder antikorlarla inkübe edilmiştir. Protein bantları, geliştirilmiş kemilüminesans (ECL) substratı kullanılarak görselleştirilmiş ve dijital jel görüntüleme sistemi ile görüntülenmiştir. Doygunluğu önlemek için her antikor için pozlama süreleri optimize edilmiştir. Densitometrik kantifikasyon, jel analiz aracı kullanılarak ImageJ yazılımı ile gerçekleştirilmiştir. Tüm hedef protein bant yoğunlukları, yükleme kontrolü olarak GAPDH'ye normalize edilmiş ve p-ERK ekspresyonu ayrıca toplam ERK ekspresyonuna normalize edilmiştir. %5 yağsız süt dışında ek bloklama adımı uygulanmamıştır. Kantifikasyon sonuçları, 1,0 olarak belirlenen kontrol grubuna göre kat değişimi (fold change) olarak sunulmuştur. Her deney bağımsız olarak üç kez tekrarlanmıştır. Temsili immünoblotlar gösterilmiştir.
NOD/SCID farelerde HepG2 ksenogreft tümörlerde VEGF ekspresyonunun immünohistokimyasal tespiti
Xenograft oluşturulması için: Logaritmik büyüme fazındaki HepG2 hücreleri tripsinizasyon yoluyla toplandı, steril fosfat tamponlu salin (PBS) ile iki kez yıkandı ve serumsuz DMEM içinde yeniden süspanse edildi. NOD/SCID farelerde bir HepG2 deri altı xenograft modeli oluşturmak için, 0,2 mL serumsuz DMEM (Matrigel olmadan) içindeki toplam 2 × 106 hücre, her bir NOD/SCID faresinin sağ aksiller bölgesine (zengin kan akışına sahip bir alan) 1 mL'lik bir şırınga kullanılarak deri altına enjekte edildi. Tümör tutulumu her 2 günde bir izlendi. Tümör boyutu her iki günde bir ölçüldü ve tümör çapı 0,3–0,5 cm'ye ulaştığında (enjeksiyondan yaklaşık 7–10 gün sonrası, tedavi başlangıç noktası olarak tanımlanmıştır), fareler deney için rastgele 4 gruba ayrıldı. Deri altı xenograftın uzunluğu (L) ve genişliği (W) dijital kumpaslar kullanılarak her gün ölçüldü ve tümör hacmi (V), V = (L × W2) / 2 formülüne göre hesaplandı. Tüm ölçümler, grup tahsislemesine kör olan bir araştırmacı tarafından gerçekleştirildi. 20 gün sonra hayvanlar derin anestezi altında servikal dislokasyonla ötaniyaziye tabi tutuldu ve xenograft dokusu, oda sıcaklığında 24 saat boyunca %10 nötr tamponlu formalin içinde fikse edildi, ardından parafinle gömüldü. Doku kesitleri (5 µm kalınlığında) döner mikrotom kullanılarak kesildi ve poli-L-lizin kaplı cam lamlara monte edildi. İmmünohistokimya için kesitler ksilenle (üç değişim, her biri 5 dk) deparafine edildi ve dereceli bir etanol serisi ( %100, %95, %70, %50; her biri 3 dk) ile yeniden hidrate edildi. Antijen geri kazanımı, kesitlerin bir mikrodalgada 10 mM sodyum sitrat tamponu içinde 15 dk ısıtılması ve ardından oda sıcaklığında 20 dk soğutulmasıyla gerçekleştirildi. Endojen peroksidaz aktivitesi, oda sıcaklığında 10 dk boyunca metanoldeki %3 hidrojen peroksit ile bloke edildi. Non-spesifik bağlanma, oda sıcaklığında 1 saat boyunca PBS içindeki %5 normal keçi serumu ile bloke edildi. Ardından kesitler, nemlendirilmiş bir hazne içinde 4 °C'de gece boyu primer anti-VEGF antikoru (dilüsyon 1 : 200) ile inkübe edildi. PBS ile yıkamanın ardından (üç kez, her biri 5 dk), kesitler oda sıcaklığında 1 saat boyunca horseradish peroxidase (HRP)-konjuge keçi anti-tavşan sekonder antikoru (1 : 500) ile inkübe edildi. Sinyal, 3,3′-diaminobenzidin (DAB) substratı kullanılarak tespit edildi. Kesitler 30 saniye boyunca hematoksilin ile karşı boyandı, dehidrate edildi, şeffaflaştırıldı ve kalıcı montaj medyumu kullanılarak lamellerle kapatıldı. Görüntüleme, parlak alan ayarlarında ×100 büyütmede floresan evirtmiş mikroskop kullanılarak gerçekleştirildi. Temsili görüntüler kalitatif gösterim için sunulmuştur.
Kontamine olmuş tüm uçlar, tüpler ve hücre kültürü atıkları biyo-tehlikeli atık olarak toplandı ve bertaraf edilmeden önce otoklavlandı. İlaç içeren çözeltiler, DMSO, ksilen ve metanol dahil olmak üzere kimyasal atıklar, ayrıştırılmış ve etiketlenmiş atık konteynerlerinde toplandı ve tehlikeli kimyasal atıklara yönelik yerel kurumsal düzenlemeler uyarınca bertaraf edildi.
İstatistiksel analiz
İstatistiksel analizler için SPSS 19.0 yazılımı kullanılmıştır. Deneysel veriler, in vitro deneyler için üç bağımsız biyolojik tekrardan elde edilen ortalama ± SD olarak ve in vivo deneyler için grup başına n = 10 fareden elde edilen ortalama ± standart sapma (SD) olarak ifade edilmiştir. İki grup arasındaki karşılaştırmalar için iki kuyruklu bağımsız t-testleri kullanılmıştır. Birden fazla grup arasındaki karşılaştırmalar için tek yönlü varyans analizi (ANOVA) ve ardından Tukey post hoc testi kullanılmıştır. p < 0.05, p < 0.01 ve p < 0.001 değerleri rapor edilmiştir.
Sonuçlar
Sorafenib ve gemcitabine'in HepG2 hücre proliferasyonu üzerindeki inhibitör etkisi
Tablo 1'de gösterildiği üzere, Sorafenib ve gemcitabine HepG2 hücre proliferasyonunu doz bağımlı olarak inhibe etmiştir. Kombinasyon tedavisi, tüm zaman noktalarında monoterapiden anlamlı derecede daha yüksek inhibisyon oranları göstermiştir. MTT, hücre sayısı ile korelasyon gösteren ancak proliferasyonu veya sitotoksisiteyi doğrudan ölçmeyen metabolik aktiviteyi ölçer. Bu nedenle, "proliferasyonun inhibisyonu" terimi, MTT dönüşümündeki bir azalma olarak yorumlanmalıdır. Özellikle, 3 µmol/L sorafenib ve 10 µmol/L gemcitabine kombinasyonu en belirgin inhibitör etkiyi sağlamış ve karaciğer kanserine karşı etkili bir tedavi rejimi olarak potansiyelini ortaya koymuştur. Daha ileri araştırmalar, sorafenib ve gemcitabinin HepG2 hücreleri üzerinde additif bir etkisi olduğunu göstermiştir. Tablo 2, iki ilaç arasındaki potansiyel sinerjik etkileşimleri belirten q-değerlerini sunmaktadır. Özellikle, 3 µmol/L sorafenib artı 10 µmol/L gemcitabine kombinasyonu, birden fazla zaman noktasında 1.15'in üzerinde q-değerleri göstermiştir; bu durum, nedensellik bu verilerle kanıtlanmamış olsa da, azalmış p-ERK ekspresyonu ile gözlemlenen anti-proliferatif etki arasında bir ilişki olduğunu düşündürmektedir. Bu bulgular, terapötik potansiyele ilişkin sonuçlar çıkarılmadan önce ek karaciğer kanseri modellerinde daha fazla araştırma yapılmasının gerekli olduğunu göstermektedir. Sinerji tüm doz çiftlerinde gözlemlenmemiş; aksine, tek bir spesifik konsantrasyon kombinasyonu ile sınırlı kalmıştır.
Şekil 1, sorafenib grubu ve kombinasyon tedavi grubundaki hücre proliferasyonu inhibisyon oranının 72. saatte zirveye ulaştığını göstermektedir. Kombinasyon tedavisi, özellikle 3 µmol/L sorafenib ve 10 µmol/L gemcitabine dozajında, tekli ajan tedavilerine kıyasla belirgin şekilde daha yüksek bir inhibisyon oranıyla sonuçlanmıştır.
Sorafenib ve gemcitabine'in ERK ve p-ERK ekspresyonu üzerindeki etkisi
Şekil 2A, tüm gruplarda ERK protein ekspresyonunda anlamlı bir değişiklik olmadığını göstermektedir. Ancak, p-ERK ekspresyonu sorafenib grubunda ve kombinasyon tedavi grubunda anlamlı derecede azalmış olup, en büyük azalma kombinasyon grubunda gözlemlenmiştir. Bu veriler, azalmış p-ERK seviyeleri ile kombinasyon tedavisi arasında bir ilişki olduğunu kanıtlamaktadır; ancak azalmış p-ERK'nin anti-proliferatif etkiyi doğrudan aracılık ettiğini ortaya koymamaktadır. Densitometrik kantifikasyon, p-ERK'nin toplam ERK ve GAPDH'ye normalizasyonu, biyolojik replika bilgileri ve istatistiksel karşılaştırmalar yapılmamıştır. Bu nedenle, sunulan immunoblotlar yalnızca temsilidir ve kalitatif niteliktedir.
Sorafenib ve gemcitabine'in NOD/SCID farelerde nakledilmiş karaciğer kanserindeki subkütan kseno greftlerin hacmi üzerindeki etkisi
Tedavi öncesinde gruplar arasında deri altı ksenogreftlerin hacmi açısından anlamlı bir fark yoktu (p = 0,367). Tedavi sonrası tümör hacmi, kontrol grubuna kıyasla anlamlı düzeyde azalmış olup kombinasyon tedavi grubundakiler, sorafenib ve gemcitabine gruplarındakilere göre anlamlı derecede daha küçüktür (p < 0,001), şurada gösterildiği gibi Şekil 2B. Gözlemlenen farklılıkların, ilaca bağlı morbidite veya sistemik maruziyetteki farklılıklar tarafından etkilenmediğini doğrulamak için herhangi bir toksisite veya farmakokinetik veri toplanmadığından, bu sonuçlar ihtiyatla yorumlanmalıdır.
Sorafenib ve gemcitabine'in NOD/SCID farelerde transplantasyonla oluşturulmuş karaciğer kanserinde VEGF ekspresyonu üzerindeki etkisi
Şekil 2C, tümör dokularındaki VEGF ekspresyonunun immünohistokimyasal analizini göstermektedir. Sorafenib ve kombinasyon grupları, kalitatif immünohistokimya ile azaltılmış kahverengi-sarı immün boyanma ve daha zayıf VEGF ekspresyonu sergilemiştir. Endotelyal hücre belirteçleri veya mikrodamar yoğunluğu analizleri yapılmadığından, bu bulgu azalmış anjiyojenik potansiyele işaret etmektedir ancak anjiyojenezi doğrudan kanıtlamamaktadır. Gemcitabine ve kontrol grupları kalitatif olarak daha güçlü VEGF ekspresyonu göstermiştir. Bu kalitatif VEGF bulguları yalnızca korelatif olup hipotez oluşturmaya yöneliktir. Kantitatif analiz veya doğrudan vasküler belirteçler olmadan, anjiyogenez veya anjiyogenezdeki sinerji hakkında herhangi bir sonuç çıkarılamaz.
VERİLERİN BULUNABİLİRLİĞİ
Bu çalışma sırasında oluşturulan ve analiz edilen ham veriler ek materyallerde (Ek Dosya 1)) yer almaktadır.
Şekil 1: Farklı müdahalelerin HepG2 hücrelerinin proliferasyon inhibisyon oranı üzerindeki etkileri. (A) HepG2 hücrelerinde farklı zaman noktalarında sorafenib'in inhibisyon oranı (%). (B) Farklı zaman noktalarında HepG2 hücrelerinde gemcitabine'in inhibisyon oranı (%). (C) Sorafenib ve gemcitabine kombinasyonunun HepG2 hücreleri üzerindeki inhibisyon oranı (%). (D) sorafenib inhibisyon oranı (%) (3 µmol/L) ve gemcitabine (10 µmol/Lyalnız başına ve kombinasyon halinde, HepG2 hücreleri üzerinde 72 saatlik uygulamadan sonra. *p < 0.05, **p < 0.01 karşı kontrol grubu. Tüm inhibisyon oranı verileri, protokolde açıklandığı şekilde MTT deneyi kullanılarak elde edilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2tedavi edilen gruplarda ERK/p-ERK ekspresyonu, tümör hacmi ve VEGF ekspresyonu. (A) Farklı tedaviler uygulanmış HepG2 hücrelerinde ERK ve p-ERK ekspresyonu; (B) Hacim (mm3tedavi öncesi ve sonrası dört gruptaki tümörlerin (grup başına n = 10) **p < 0.01 karşı tedavi sonrası kontrol grubu. İstatistiksel karşılaştırmalar, uç nokta hacimleri üzerinde tek yönlü ANOVA kullanılarak gerçekleştirilmiştir. (C) Temsili immünohistokimya görüntüleri (ölçek çubuğu = 100 µm(her gruptan n = 10) tümör dokularındaki VEGF ekspresyonu. Bu görüntüler kalitatif gösterim amacıyla sunulmuştur. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Grup (μmol/L) | İşlem süresi (h) | ||||
| 24 | 48 | 72 | 96 | ||
| Sorafenib | 1.5 | 12.41 ± 3.37 | 22.74 ± 4.57 | 29.76 ± 3.48 | 15.77 ± 3.18 |
| 3 | 26.37 ± 6.14 | 33.10 ± 4.39 | 44.71 ± 5.49 | 38.63 ± 5.68 | |
| 4.5 | 34.42 ± 5.26 | 58.91 ± 4.67 | 67.85 ± 5.20 | 54.26 ± 6.07 | |
| 6 | 46.88 ± 6.61 | 67.48 ± 5.70 | 73.57 ± 7.07 | 61.73 ± 6.10 | |
| Gemcitabine | 5 | 3.56 ± 1.41 | 6.17 ± 1.73 | 9.31 ± 1.76 | 11.35 ± 1.95 |
| 10 | 5.89 ± 2.47 | 9.62 ± 2.15 | 14.57 ± 1.94 | 16.58 ± 2.31 | |
| 15 | 14.57 ± 3.38 | 19.53 ± 2.27 | 22.43 ± 2.13 | 24.75 ± 3.25 | |
| 20 | 22.36 ± 4.46 | 28.76 ± 3.92 | 33.18 ± 3.19 | 38.49 ± 4.28 | |
| Sorafenib + Gemcitabine | 1.5 + 5 | 14.13 ± 2.16 | 26.41 ± 3.43 | 37.75 ± 4.75 | 22.04 ± 2.84 |
| 3 + 10 | 38.69 ± 3.94 | 46.26 ± 4.06 | 71.23 ± 6.76 | 62.47 ± 7.20 | |
| 4.5 + 15 | 40.89 ± 4.21 | 74.30 ± 6.98 | 84.82 ± 9.17 | 66.89 ± 7.16 | |
| 6 + 20 | 64.05 ± 6.54 | 80.67 ± 9.79 | 92.22 ± 10.24 | 81.05 ± 9.87 | |
Tablo 1: Sorafenib ve gemcitabine'in HepG2 hücreleri üzerindeki inhibisyon oranı (%). Veriler, üç bağımsız deneyden elde edilen ortalama ± SD olarak sunulmuştur.
| Grup（μmol/L） | İşlem süresi (sa) | ||||
| 24 | 48 | 72 | 96 | ||
| Sorafenib+Gemcitabine | 1.5 + 5 | 0.91 | 0.96 | 1.04 | 0.87 |
| 3 + 10 | 1.26 | 1.17 | 1.35 | 1.28 | |
| 4.5 + 15 | 0.93 | 1.11 | 1.13 | 1.02 | |
| 6 + 20 | 1.09 | 1.05 | 1.12 | 1.06 | |
Tablo 2: q-değeri ile sorafenib ve gemcitabine'in HepG2 hücreleri üzerindeki sinerjik etkisinin gösterimi. q > 1.15 sinerjiye; 0.85–1.15 additiviteye; q < 0.85 ise antagonizmaya işaret eder. Veriler üç bağımsız deneyden elde edilmiştir.
Ek Şekil 1: Çalışma iki ana aşamada yürütülmüştür: HepG2 hücre hattı kullanılarak yapılan in vitro deneyler ve NOD/SCID fare zenograft modeli kullanılarak yapılan in vivo deneyler. In vitro aşamada, HepG2 hücreleri çeşitli konsantrasyonlarda sorafenib, gemcitabine veya bunların kombinasyonu ile işleme tabi tutulmuştur. Hücre proliferasyonu MTT testi kullanılarak değerlendirilmiş; ERK ve p-ERK ekspresyonu ise Western blotting ile analiz edilmiştir. In vivo aşamada, HepG2 hücrelerinin NOD/SCID farelerine deri altına enjekte edilmesiyle bir zenograft modeli oluşturulmuştur. Fareler dört tedavi grubuna ayrılmış ve günlük intraperitonal enjeksiyonlar uygulanmıştır. Tedavi süresi boyunca tümör hacmi ölçülmüştür. Ötenazi sonrası tümör dokuları toplanmış ve VEGF için immünohistokimyasal boyamaya tabi tutulmuştur. Tüm veriler SPSS 19.0 yazılımı kullanılarak istatistiksel olarak analiz edilmiştir.Lütfen bu dosyayı indirmek için buraya tıklayın.
Ek Dosya 1: Raw data.rar.Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Tartışma
Karaciğer kanseri; sinsi başlangıcı, hızlı ilerlemesi ve etkili tedavi seçeneklerinin azlığı nedeniyle yüksek bir mortalite oranına sahiptir3,15. İleri evre karaciğer kanseri genellikle kemoterapi ve radyasyon direncine sahiptir ve cerrahi rezeksiyon ile karaciğer naklini içeren mevcut seçenekler yetersiz kalmaktadır15,16. Farklı etki mekanizmalarına sahip iki veya daha fazla kemoterapi ilacının kombinasyonu iyi geliştirilmiştir ve etkinliği önemli ölçüde artırdığına inanılmaktadır; bu, hastalığın tedavisi için alternatif bir strateji olabilir15,16. Karaciğer kanseri araştırmaları için hedefe yönelik ilaçlar arasında monoklonal antikorlar (anti-VEGF ve anti-EGFR), tirozin kinaz inhibitörleri ve mTOR inhibitörleri yer almakta olup, temel zorluk, genel sağkalım ve yaşam kalitesi iyileştirmeleri sağlamak için mevcut ilaçların optimal entegrasyonudur17. Etkin ve düşük toksisiteye sahip ilaç kombinasyonları araştırılırsa, karaciğer kanseri tedavisindeki mevcut sınırlamaların aşılmasına yardımcı olabilir. Gemcitabine'e karşı kemoresistans sergileyen güncel bir hücre modeli, gemcitabine/sorafenib'e (EGFR inhibitörleri) yeniden duyarlı hale getirilebileceğini öne sürmüştür14. Bu bulgu, keşfedilmemiş bilimsel bir konu olduğu için bizim için büyük ilgi taşımaktadır. Fraksiyonel faktöriyel bir tasarım; AKT/mTOR yolunu baskılayarak ve apoptozu indükleyerek kolanjiyokarsinom (CCA) proliferasyonunu ve tümör büyümesini önemli ölçüde inhibe eden gemcitabine (1.4 mmol/L), sorafenib (0.03 mmol/L) ve S-1 (0.185 mmol/L) şeklinde optimal üçlü ilaç kombinasyonunu belirlemiştir18. Awasthi ve arkadaşları, sorafenibin pankreatik duktal adenokarsinom (PDAC) hücrelerinde mitogen-aktive protein kinaz (MEK), ERK1/2, 70 kDa ribozomal protein S6 kinaz (p70S6K) ve 4E-bağlayıcı protein 1'in (4EBP-1) fosforilasyonunun yanı sıra hücre proliferasyonunu da inhibe ettiğini göstermiştir; gemcitabine ile kombine edildiğinde, çeşitli hücrelerde additif anti-proliferatif ve pro-apoptotik etkiler sergilemiş ve böylece tümör taşıyan hayvanların sağkalım süresini önemli ölçüde uzatmıştır19. Gemcitabine ve sorafenib ile yapılan kombine tedavi, epitel-mezenkimal geçiş sürecini inhibe etmekte, ek olarak küçük hücreli dışı akciğer kanseri (NSCLC) hücrelerinin proliferasyonunu, migrasyonunu ve invazyonunu baskılamakta, hücre döngüsü durmasını ve apoptozu indüklemektedir20. Ancak, bildiğimiz kadarıyla bu çalışma, bu kombinasyonu özellikle HepG2 tabanlı bir in vitro ve hepatoselüler karsinom subkütan ksenogreft modelinde test eden ilk çalışmadır.
Bu çalışma, çok hedefli bir kinaz inhibitörü olan sorafenib ile bir sitidin analoğu olan gemcitabine kombinasyonunun karaciğer kanseri üzerindeki etkilerini hem in vitro hem de in vivo olarak inceleyerek bu boşluğu doldurmayı amaçlamıştır. Bu çalışmada, sorafenib ve gemcitabine tek başlarına HepG2 hücrelerinin proliferasyonu üzerinde inhibitör etkilere sahip olmuş ve iki ilacın kombinasyonunun inhibitör etkisi, tek bir ilacınkinden anlamlı derecede daha güçlü çıkarak additive bir etki göstermiştir. Ancak, MTT tek başına sitostatik (büyüme durması) ve sitotoksik (hücre ölümü) etkileri ayırt edemez ve antiproliferatif mekanizmalara dair doğrudan kanıt sunmaz. Bunlar arasında, sorafenib 3 µmol/L + gemcitabine 10 µmol/L kombinasyon grubunun q- değeri her zaman noktasında 1,15'ten büyük çıkarak sinerjik bir etki göstermiştir. Sorafenib ve gemcitabine tek başına veya kombinasyon halinde HepG2 hücrelerinde ERK ekspresyonunu anlamlı şekilde değiştirmemiş, ancak sorafenib tek başına ve kombinasyon halinde p-ERK ekspresyonunu anlamlı şekilde inhibe etmiştir. İki ilacın kombinasyonu, HepG2 hücrelerinde ERK fosforilasyonunu additive olarak inhibe etmiştir. Bu veriler, nedensellik kurulmamış olsa da, azalmış p-ERK ile kombinasyonun antiproliferatif etkisi arasında bir ilişki olduğunu göstermektedir. Sinerji, test edilen tüm koşullarda kombinasyonun genel bir özelliği değil, yalnızca belirli bir konsantrasyon oranında gözlemlenmiştir. NOD/SCID fare karaciğer kanseri ksenograft modelinden elde edilen immünohistokimyasal sonuçlar, sorafenib ve gemcitabine kombinasyonunun VEGF ekspresyonunu anlamlı derecede azaltabileceğini ve tümör hacmini küçültebileceğini göstermiştir. Ancak, toksisite veya vücut ağırlığı verileri sistematik olarak toplanmadığı için, azalmış tümör hacminin kısmen spesifik antitümör etkilerden ziyade ilaç kaynaklı morbiditeye bağlanabilme olasılığı dışlanamaz. Sorafenib ve gemcitabine kombinasyonu, immünohistokimya ile gösterildiği üzere, tümör dokularında azalmış VEGF ekspresyonu ile de ilişkilendirilmiştir. Bu gözlem potansiyel bir anti-anjiyojenik etkiyi düşündürmektedir, ancak azalmış vaskülarizasyona dair doğrudan kanıtlar (örneğin, mikrodamar yoğunluğu analizi) eksiktir. Bu nedenle, VEGF downregülasyonunun gözlemlenen antiproliferatif etkiye katkısı korelatif kalmaktadır. Bu sinerjik etki, kombinasyon tedavisinin, sıklıkla ilaç direnci ve tedavi başarısızlığı ile sonuçlanan tek ajanlı tedavilerin sınırlamalarını aşabileceğini göstermektedir. Sorafenib ve gemcitabine için optimal kombinasyon dozunun belirlenmesi, bu tedavi rejiminin klinik uygulamasına yönelik kritik bir adımdır.
Sorafenib ve gemcitabine'in eklemeli etkisinin altında yatan moleküler mekanizmalar, kombinasyon tedavi grubunda p-ERK ekspresyonundaki belirgin azalmanın işaret ettiği üzere, ERK yolunun inhibisyonu ile ilişkili olabilir. ERK yolunun hücre proliferasyonu, sağkalımı ve anjiyogenezde kritik bir rol oynadığı bilinmektedir ve bu durum onu kanser tedavisi için temel bir hedef haline getirmektedir. Sonuçlar, kombinasyon tedavisinin ERK yolunu tekli ajan tedavilerinden daha etkili bir şekilde bozabileceğini göstermektedir; bu durum, monoterapiye kıyasla p-ERK ekspresyonundaki daha büyük bir azalma ile korelasyon göstermektedir. Bir NOD/SCID fare modelindeki in vivo çalışmalar, kombinasyon tedavisinin potansiyel terapötik faydalarını daha da desteklemektedir. Kombinasyon tedavi grubunda tümör hacminde belirgin bir azalma ve VEGF ekspresyonunda düşüş gözlemledik. VEGF, HCC'de anjiyogenezin temel bir itici gücüdür ve inhibisyonu tümör büyümesinin ve metastazın azalmasıyla ilişkilidir. Kombinasyon tedavisine yanıt olarak VEGF'nin aşağı regülasyonu, bu rejimin anjiyojenik süreçleri modüle edebileceği hipoteziyle tutarlıdır; ancak, anti-anjiyojenik aktiviteye dair doğrudan kanıtlar bu çalışmada değerlendirilmemiştir. Azalmış p-ERK ekspresyonu ile kombinasyonun anti-proliferatif etkisi arasında gözlemlenen ilişki düşündürücü olsa da nedensel bir mekanizma kurmamaktadır. Western blot analizi yalnızca uzun süreli ilaç maruziyeti sonrası tek bir zaman noktasında gerçekleştirildiği için, ERK fosforilasyonundaki erken ve dinamik değişimleri yakalayamamaktadır. Ayrıca, densitometrik kantifikasyonun, replika düzeyindeki istatistiklerin ve toplam ERK ile yükleme kontrollerine normalizasyonun eksikliği, yorumlanabilirliği sınırlamaktadır. Bu nedenle, azalmış p-ERK kombinasyon tedavisi ile korelasyon gösterse de, ERK yolu inhibisyonunun eklemeli etkiyi doğrudan yönetip yönetmediği mevcut verilerle kanıtlanmamıştır. Bu mekanistik içgörü, HCC'deki direnci kırmak için paralel veya kompansatuar yolları hedefleyen yeni stratejilerle tutarlıdır.
Bu çalışma, sorafenib ve gemcitabine'in karaciğer kanseri üzerindeki potansiyel ek etkilerine dair değerli bilgiler sunsa da, çalışmanın bazı kısıtlılıkları kabul edilmelidir. İlk olarak, bu çalışmadaki örneklem büyüklüğü nispeten küçüktür ve bu durum bulguların genellenebilirliğini sınırlayabilir. Kombinasyon tedavisinin daha çeşitli bir hasta popülasyonundaki etkinliğini ve güvenliğini doğrulamak için daha geniş bir kohort çalışması gerekli olacaktır. İkinci olarak, bu çalışmada, karaciğer kanseri araştırmaları için iyi bilinen bir model olan ancak hastalardaki karaciğer kanserinin heterojenliğini tam olarak yansıtmayabilecek HepG2 hücre hattı kullanılmıştır. Farklı karaciğer kanseri alt tipleri ve genetik arka planlar, kombinasyon tedavisine potansiyel olarak farklı yanıtlar verebilir. Bu nedenle, burada bildirilen bulgular tüm karaciğer kanseri türlerine genellenemeyebilir ve daha geniş sonuçlar çıkarılmadan önce ek hücre hatları (örneğin, Huh7 [insan hepatosellüler karsinom hücre hattı] ve PLC/PRF/5 [insan hepatosellüler karsinom hücre hattı, ayrıca Alexander hücreleri olarak bilinir] veya hasta kaynaklı zenograftlar) kullanılarak doğrulama yapılması gereklidir. Üçüncü olarak, in vivo deneyler, bağışıklık sistemi olmayan bir NOD/SCID fare modeli kullanılarak yürütülmüştür; dolayısıyla bu model, insan karaciğer kanserindeki karmaşık tümör-immün mikroçevreyi tam olarak temsil etmemektedir. Gelecekteki çalışmalar, tedavinin immünolojik yönlerini daha iyi anlamak için immün-kompetan fare modellerini veya insanlaştırılmış sistemleri dahil etmelidir. Dördüncü olarak, bu çalışmada sorafenib–gemcitabine kombinasyonunun toksisitesi veya güvenlik profili değerlendirilmemiştir. NOD/SCID farelerde vücut ağırlığı değişiklikleri, organ toksisitesi (örneğin, karaciğer, böbrek fonksiyon testleri) veya advers olaylara ilişkin veri toplanmamıştır. Bu nedenle, mevcut verilerden bu kombinasyonun güvenliği veya tolere edilebilirliği hakkında herhangi bir sonuç çıkarılamaz. Beşinci olarak, anti-anjiyojenik iddia öncül niteliktedir ve aşırı yorumlanmamalıdır. VEGF ekspresyonu kalitatif olarak azalmış olsa da, herhangi bir kantitatif immünohistokimya (IHC) analizi (örneğin, H-skoru, pozitif alan yüzdesi, boyama yoğunluğu veya tümör başına çoklu alanlarda kör dijital görüntü analizi) yapılmamıştır. Ayrıca, Cluster of Differentiation 31 (CD31) veya endomusin gibi endotel markerları kullanılarak mikrovasküler yoğunluk değerlendirilmemiş ve fonksiyonel vasküler assayler uygulanmamıştır. Bu nedenle, mevcut VEGF verileri azalan anjiyojenezi doğrudan kanıtlamamakta; yalnızca VEGF protein seviyelerinde korelatif bir azalma göstermektedir. Altıncı olarak, istatistiksel analizin birkaç kısıtlılığı bulunmaktadır. Tümör hacmi aynı farelerde 20 gün boyunca tekrarlanan ölçümlerle belirlenmiş ancak zamansal korelasyonu hesaba katan tekrarlanan ölçümler ANOVA'sı veya karma etkiler modeli yerine, yalnızca son nokta hacimleri üzerinde tek yönlü ANOVA kullanılmıştır. Normallik ve varyans homojenliği resmi olarak test edilmemiştir. Dahası, bu çalışma azalmış p-ERK ekspresyonu ile sorafenib ve gemcitabine'in ek anti-proliferatif etkisi arasında bir ilişki belirlemiş olsa da, bu verilerden nedensellik çıkarılamaz. Western blot analizinin ek kısıtlılıkları şunlardır: (i) ERK fosforilasyonu erken ve geçici bir sinyalizasyon olayıyken, yalnızca tek bir geç zaman noktası (72 h) incelenmiştir; (ii) temsili blotlar, densitometrik kantifikasyon veya bağımsız biyolojik tekrarlar arasında istatistiksel analiz yapılmadan sunulmuştur; (iii) p-ERK, total ERK'ye normalize edilmemiş ve total ERK, bir yükleme kontrolüne tutarlı ve kantitatif bir şekilde normalize edilmemiştir. Sonuç olarak, bu veriler öncelikle kalitatif ve hipotez üretici niteliktedir. Kesin mekanistik doğrulama, p-ERK seviyelerinin geri yüklenmesinin kombinasyonun anti-proliferatif etkisini azaltıp azaltmadığını test etmek için kurtarma deneyleri (örneğin, mutant MEK aracılığıyla ERK'nin konstitütif aktivasyonu veya ERK aktivatörlerinin kullanımı) gerektirecektir. Temel bir kısıtlılık, derin moleküler doğrulamanın eksikliğidir. p-VEGFR, p-AKT veya apoptotik markerlar incelenmemiştir. ERK yolak verileri kalitatif olup nedensellik kurmamaktadır. Herhangi bir mekanistik sonuç çıkarılmadan önce, altta yatan mekanizmayı aydınlatmak için özel olarak tasarlanmış ileri çalışmalara ihtiyaç vardır. Benzer şekilde, ERK'nin siRNA aracılı susturulması veya yukarı akış regülatörlerini (örneğin, MEK inhibitörleri) hedefleyen farmakolojik inhibitörler, gözlemlenen etkinin gerçekten ERK'ye bağımlı olup olmadığını belirlemeye yardımcı olabilir. Bu doğrulama deneyleri bu başlangıç çalışmasının kapsamı dışındaydı ancak gelecekteki araştırmalar için kritik bir yönü temsil etmektedir. PI3K/AKT veya ilgili aşağı akış faktörleri gibi tümör proliferasyonu ve sağkalımında rol oynayan diğer temel yolaklar araştırılmamıştır ve gözlemlenen etkilere katkıda bulunmuş olabilirler. Bu çalışmadaki VEGF ekspresyonuna ilişkin bulgular öncül niteliktedir ve hipotez üreticidir. Azalmış VEGF immünboyaması, anjiyojenik yolakların potansiyel modülasyonu için önemli bir ipucu sağlamakta ancak anti-anjiyojenik bir mekanizmanın kesin kanıtı değildir. Okuyucuları, özellikle kantifikasyon veya destekleyici vasküler markerlar olmadan, tek başına VEGF IHC'nin anti-anjiyojenik bir mekanizmayı kanıtlayamayacağı konusunda açıkça uyarıyoruz. Endotel hücre markerlarının ve vasküler fonksiyonun analiz edilmemiş olması, bu çalışmanın ana kısıtlılıklarından biridir. Bu nedenle, kombinasyon tedavisinin etki mekanizmasını tam olarak anlamak için diğer kinazların ve anjiyojenik faktörlerin potansiyel rolleri de dahil olmak üzere, ilgili sinyalizasyon yolaklarının daha kapsamlı bir analizine ihtiyaç vardır.
Burada açıklanan prosedürler HepG2 hücreleri ve NOD/SCID fareleri için optimize edilmiştir. Tekrarlanabilirlik, farklı hücre hatları veya fare suşlarına göre değişiklik gösterebilir. Tekrarlanabilirliği etkileyen temel faktörler şunlardır: (1) hücre pasaj sayısı (pasaj 20'nin altındakileri kullanın); (2) MTT inkübasyon süresi (tam olarak 4 h olarak standartlaştırın); (3) antikor lot numaraları (her deney için kaydedin); ve (4) kumpas operatör eğitimi (süreç boyunca aynı körleme operatörü kullanın). Kombinasyonları test etmeden önce kullanıcıların, kurulumlarını doğrulamak için pozitif kontrol deneyleri (örneğin, tek başına 6 µmol/L sorafenib) yapmalarını öneririz.
Bu çalışma, Western blotting yöntemiyle sorafenib ve gemcitabine kombinasyon tedavisinin HepG2 hücrelerinde p-ERK ekspresyonunu önemli ölçüde azalttığını göstermiş ve bunun ERK sinyal yolağının modülasyonuna işaret ettiğini ortaya koymuştur; ancak, bu veriler kalitatif olup nedensel bir ilişki kurmamaktadır. p-ERK, ERK yolak aktivasyonunun fonksiyonel bir markörü olarak yaygın şekilde kullanılmaktadır ve downregülasyonu genellikle yolak aktivitesinin azaldığının bir göstergesi olarak yorumlanır(11). Alt hedef genlerin (c-Fos, c-Myc gibi) transkripsiyonel değişikliklerini RT-PCR ile daha detaylı olarak tespit etmemiş olsak da, p-ERK'da gözlenen azalma, doğrudan mekanistik bir kanıttan ziyade ERK yolağının dahil olduğuna dair korelatif bir destek sağlamaktadır. Gelecekteki çalışmalar, transkriptom analizi veya hedefli qPCR aracılığıyla ERK alt ağının düzenleyici detaylarını daha fazla ortaya çıkararak kombinasyon tedavisinin mekanizmasına dair anlayışı geliştirebilir. Ek olarak, bu çalışma kombinasyon tedavisinin kısa vadeli etkilerine odaklanmıştır. Yanıtın kalıcılığını, potansiyel direnç gelişimini ve tedaviyle ilişkili gecikmiş toksisiteleri değerlendirmek için uzun vadeli çalışmalar gereklidir. Son olarak, bu araştırma, tedavi etkilerini potansiyel olarak artırabilecek immünoterapi veya diğer hedefe yönelik tedaviler gibi yeni gelişen stratejilerle sorafenib ve gemcitabine kombinasyonunun potansiyelini incelememiştir. Gelecekteki araştırmalar, karaciğer kanseri için daha etkili tedavi rejimleri geliştirmek amacıyla çoklu ilaç kombinasyonlarını araştırmalıdır. Özetle, bu çalışma karaciğer kanserinde sorafenib ve gemcitabine'in gelecek vadeden bir additive etkisini öne sürse de, bu bulgular çalışmanın kısıtlılıkları çerçevesinde yorumlanmalıdır. Bu sonuçları doğrulamak ve elde edilen bilgileri karaciğer kanserli hastalarda daha iyi klinik sonuçlara ve potansiyel yan etkilerin analizine dönüştürmek için daha fazla araştırmaya ihtiyaç vardır.
Sonuç olarak bu çalışma, sorafenib ve gemcitabine kombinasyonunun anti-proliferatif aktivite sergilediğine ve HepG2 hücrelerinde ve bir NOD/SCID fare ksenograft modelinde VEGF ekspresyonunun azalmasıyla ilişkili olduğuna dair ön kanıtlar sunmaktadır. Ancak, VEGF verileri kalitatif olup doğrudan anti-anjiyojenik etkileri kanıtlamamaktadır; bu nedenle, anti-anjiyojenik aktiviteye dair her türlü iddia bu aşamada kanıtlanmamış durumdadır. Veriler, p-ERK ekspresyonunun azalması ile kombinasyonun anti-proliferatif etkisi arasında bir ilişki olduğunu gösterse de, nedensel mekanizmalar henüz ortaya konulmamıştır. Burada belirtilen Western blot sınırlamaları göz önüne alındığında, ERK yolağının bu kombinasyondaki mekanistik rolü şu aşamada spekülatif kalmaktadır. Sorafenib ve gemcitabine kombinasyonu, ERK yolağı inhibisyonunun gözlemlenen sinerjinin temel bir mediyatörü olup olmadığını belirlemek için yolak kurtarma (pathway rescue) deneylerini ve ek karaciğer kanseri modellerinde test edilmeyi içeren daha ileri araştırmaları hak etmektedir. Sorafenib artı gemcitabine kullanımının klinik ilgisi, gelecekteki preklinik ve klinik çalışmalarda, özellikle sorafenib-dirençli tümörler bağlamında veya sorafenibin klinik bir seçenek olmaya devam ettiği durumlarda, modern standartlara göre değerlendirilmelidir.
Açıklamalar
Yazarların beyan edilecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.
Teşekkürler
Yazarların herhangi bir teşekkürü yoktur.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Dijital jel görüntüleme sistemi | Bio-Rad Laboratories, Inc., ABD | 1708280 | |
| yüksek glukozlu DMEM medyumu | HyClone, ABD | SH30243.01 | |
| ERK tavşan monoklonal antikoru | Santa Cruz, ABD | sc-94 | |
| Fetal sığır serumu | Zhejiang Tianhang Biotechnology Co., Ltd., Çin | 11011-8611/11011-8615 | |
| Floresan ters mikroskop | Olympus, Japonya | IX73 | |
| GAPDH tavşan poliklonal antikoru | Santa Cruz, ABD | sc-25778 | |
| Gemcitabin | Eli Lilly and Company | 95058-81-4 | |
| Keçi anti-tavşan ikincil antikoru | Shanghai Shenggong Biological Engineering Co., Ltd., Çin | D111018 | |
| ImageJ yazılımı | National Institutes of Health, Bethesda, MD, ABD | Sürüm 1.8.0_112 | |
| Mikroplaka okuyucu | Thermo Fisher Scientific Inc., ABD | MK3 | |
| p-ERK tavşan monoklonal antikoru | Santa Cruz, ABD | 9106 | |
| Soğutmalı santrifüj | Changsha Xiangyi Centrifuge Co., Ltd. | DL-5M | |
| RIPA liziz tamponu | Biyuntian Biological Technology Research Institute, Çin | P0013B | |
| Rotary mikrotom | Leica, Almanya | CM3050 | |
| Sorafenib | Bayer Şirketi, Almanya | 284461-73-0 | |
| Tiyazolil Mavi (MTT) | Sigma, ABD | M5655 | |
| Üç gazlı inkübatör | Thermo Fisher Scientific Inc., ABD | 51026402 | |
| VEGF tavşan monoklonal antikoru | BioLegend, USA | B199116 |
Kaynaklar
- Fujii T, Kuzuya T, Kondo N, Funasaka K, Ohno E, Hirooka Y, et al. Altered intestinal Streptococcus anginosus and 5α-reductase gene levels in patients with hepatocellular carcinoma and elevated Bacteroides stercoris in atezolizumab/bevacizumab non-responders. J Med Microbiol. 2024;73(9):001878.
- Gay MD, Drda JC, Chen W, Huang Y, Yassin AA, Duka T, et al. Implicating the cholecystokinin B receptor in liver stem cell oncogenesis. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2024;326(3):G291-g309.
- Diao X, Guo C, Jin Y, Li B, Gao X, Du X, et al. Cancer situation in China: an analysis based on the global epidemiological data released in 2024. Cancer Commun (Lond). 2025;45(2):178-97.
- Yokota S, Yonezawa T, Momoi Y, Maeda S. Sorafenib inhibits tumor cell growth and angiogenesis in canine transitional cell carcinoma. J Vet Med Sci. 2022;84(5):666-74.
- Nassar-Reis JP, Umeta PF, Stefano JT, Longatto-Filho A, Carrilho FJ, Alves VAF, et al. P53 and VEGF are promising biomarkers for sorafenib efficacy in an experimental model of NASH-related HCC. J Mol Histol. 2023;54(5):473-88.
- Taha AM, Aboulwafa MM, Zedan H, Helmy OM. Ramucirumab combination with sorafenib enhances the inhibitory effect of sorafenib on HepG2 cancer cells. Sci Rep. 2022;12(1):17889.
- Ning L, Tian Y, Chen D, Han J, Xie G, Sun J. Sorafenib safety evaluation: Real-world analysis of adverse events from the FAERS database. Heliyon. 2024;10(18):e37348.
- Vij P, Hussain MS, Satapathy SK, Cobos E, Tripathi MK. The emerging role of long noncoding RNAs in sorafenib resistance within hepatocellular carcinoma. Cancers (Basel). 2024;16(23):3904.
- Lu X, Chen Z, Mi W, Zheng J, Liu Y. MARK1 suppress malignant progression of hepatocellular carcinoma and improves sorafenib resistance through negatively regulating POTEE. Open Med (Wars). 2024;19(1):20241060.
- Lee HJ, Lee JS, So H, Yoon JK, Choi JY, Lee HW, et al. Comparison between nivolumab and regorafenib as second-line systemic therapies after sorafenib failure in patients with hepatocellular carcinoma. Yonsei Med J. 2024;65(7):371-9.
- Tang W, Chen Z, Zhang W, Cheng Y, Zhang B, Wu F, et al. The mechanisms of sorafenib resistance in hepatocellular carcinoma: theoretical basis and therapeutic aspects. Signal Transduct Target Ther. 2020;5(1):87.
- Lin Q, Guan S, Peng M, Yu H. A mesoporous silica-based nano-drug co-delivery system with gemcitabine for targeted therapy of pancreatic cancer. J Coll Physicians Surg Pak. 2024;34(12):1456-63.
- Tang J, Liu Z, Xie G, Wang C, Jiang Y. POU4F1 enhances lung cancer gemcitabine resistance by regulating METTL3-dependent TWF1 mRNA N6 adenosine methylation. 3 Biotech. 2025;15(1):7.
- Cheng J, Zhu T, Liu S, Zhou J, Wang X, Liu G. Prediction of synergistic gemcitabine-based combination treatment through a novel tumor stemness biomarker NANOG in pancreatic cancer. RSC Med Chem. 2024;15(11):3853-61.
- Man S, Luo C, Yan M, Zhao G, Ma L, Gao W. Treatment for liver cancer: From sorafenib to natural products. Eur J Med Chem. 2021;224:113690.
- Llovet JM, Pinyol R, Kelley RK, El-Khoueiry A, Reeves HL, Wang XW, et al. Molecular pathogenesis and systemic therapies for hepatocellular carcinoma. Nat Cancer. 2022;3(4):386-401.
- Bronte F, Bronte G, Cusenza S, Fiorentino E, Rolfo C, Cicero G, et al. Targeted therapies in hepatocellular carcinoma. Curr Med Chem. 2014;21(8):966-74.
- Li H, Zhang Z, Zhou Z, Ding X, Zhou G. Optimal combination of gemcitabine, sorafenib, and S-1 shows increased efficacy in treating cholangiocarcinoma in vitro and in vivo. Anticancer Drugs. 2016;27(7):600-8.
- Awasthi N, Zhang C, Hinz S, Schwarz MA, Schwarz RE. Enhancing sorafenib-mediated sensitization to gemcitabine in experimental pancreatic cancer through EMAP II. J Exp Clin Cancer Res. 2013;32(1):12.
- Jiang S, Wang R, Zhang X, Wu F, Li S, Yuan Y. Combination treatment of gemcitabine and sorafenib exerts a synergistic inhibitory effect on non-small cell lung cancer in vitro and in vivo via the epithelial-to-mesenchymal transition process. Oncol Lett. 2020;20(1):346-56.