Yöntem makalesi

Moleküler Patologlar için Integrative Genomics Viewer (IGV) ile Klinik Varyant Yorumlama

DOI:

10.3791/71808

⸱

14 Ağustos 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1University of Pennsylvania, Department of Pathology and Laboratory Medicine, 2University of Michigan, Department of Pathology, 3Genomics Organization for Academic Laboratories (GOAL), 4University of Chicago, Department of Pathology, 5University of Colorado, Department of Pathology, 6University of Pennsylvania, Department of Pathology and Laboratory Medicine, 7Broad Institute of MIT and Harvard, 8University of California San Diego, Department of Medicine, 9Cincinnati Children's Hospital Medical Center, Division of Pathology and Laboratory Medicine

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Integratif genomik görüntüleyici (IGV) yazılımı, klinik varyant belirleme için kullanılan temel verilere yönelik zengin ve sezgisel bir pencere sunar. Burada, gerçek patojenik olaylar ile artefaktlar arasında hızlı bir şekilde ayrım yapmanın nasıl gerçekleştirileceğini gösteren ve sonuç olarak yeni nesil dizileme analizlerinin moleküler onay sürecinde yer alan pratisyenlerin tanısal güvenini pekiştiren beş vaka örneği sunuyoruz.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Integratif genomik görüntüleyici (IGV), kompleks sekanslama verilerinin görselleştirilmesine ve yorumlanmasına olanak tanıyan, klinik genomikteleçil bir araçtır. Klinik bilginin, sekanslama sonuçlarının görsel değerlendirmesiyle birleştirilmesi; moleküler patologların ve diğer uzmanların vakaları değerlendirmek ve sonuçlandırmak için kullandıkları temel yöntemdir. Çeşitli yazılım araçları yardımcı olabilir, ancak bu araçların temel verilerle olan ilişkisinin anlaşılması ve sistematik olarak uygulanması gerekir. Bu çalışma, yeni nesil sekanslama (NGS) veri dosyası türleri (örneğin, FASTQ, BAM, VCF) hakkında, formatları ve amaçlarına dair tartışmalarla birlikte temel arka plan bilgileri içermektedir. Ardından, IGV'nin bu dosyalardan gelen nüansları ortaya çıkaran özelliklerini açıklıyoruz. Okuyucunun, insan referans genomuna göre klinik olarak ilgili çeşitli varyant türlerini gözden geçirmek için IGV yazılımını kullanarak klinik NGS sekanslama verileriyle etkileşime gireceği, klinik vinyetlere dayalı bir dizi küratörlü pratik vaka kullanıyoruz. Bu klinik vinyetler, genomik verilerin yorumlanmasındaki bazı karmaşıklık örneklerini ve rutin bir iş akışının parçası olarak IGV kullanımının, rutin biyoinformatik yazılım algoritması varyant çağrılarının ötesinde, varyantlar için nasıl ek yorumlayıcı bilgiler sağlayabileceğini tanımlamak amacıyla küratörlüğü yapılmıştır. IGV içindeki araçlar kullanılarak yapılan genomik varyantların görsel incelemesi, genomik varyantların yorumlanmasını etkileyebilecek ince bağlamsal ipuçlarını (yani, varyant alel frekansı, zincir yanlılığı, dokuya özgü bağlam) ortaya çıkarabilir. Bu çalışma somatik varyantların tespiti ve yorumlanması için IGV kullanımına odaklanmış olsa da, sunulan uygulamalar kompleks varyantların analizi ve mozaisizmin tespiti dahil olmak üzere germline ortamında kullanım için de genişletilebilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Onkolojik bakım, tanı, prognoz ve tedavi seçimini bilgilendirmek için yeni nesil dizileme (NGS) teknolojilerinin kullanımıyla son yıllarda dönüşüme uğramıştır1. NGS testleri, birçok tümör tipinde şu amaçlar için standart bakım haline gelmiştir: 1) moleküler olarak tanımlanmış bir tümör tanısı koymak, 2) tedavi kararları için tümör tipinden bağımsız biyobelirteç sonuçlarını kullanmak ve 3) belirli tümör tipleri için risk stratifikasyonunu belirlemek2,3. NGS ve diğer biyobelirteç testlerinden elde edilen doğru ve zamanında sonuçlar, onkolojide hasta bakımı ve planlamasının kritik bir bileşeni haline gelmiştir.

NGS testleri tipik olarak, kurumların bu tür testleri geliştirmek ve sürdürmek için yeterli uzmanlığa ve kaynağa sahip olduğu durumlarda, büyük referans laboratuvarlarında veya hastane tabanlı/akademik laboratuvarlarda gerçekleştirilir. Genomics Organization for Academic Laboratories (GOAL) organizasyonu, akademik bilgi ve reaktif maliyetlerinin paylaşımına odaklanan iş birlikçi bir ağ olarak tasarlanmıştır4. GOAL konsorsiyumunun önemli bir çabası, klinik çalışmaların incelenmesi ve raporlanması için kritik bileşenlere yönelik eğitim oturumlarını kapsamaktadır. Bunlar, pratik öğretici oturumlar şeklinde geliştirilmiştir ve genomik tıptaki temel ve gelişmiş özelliklerini göstermek amacıyla integratif genom görüntüleyici (IGV) üzerine etkileşimli bir çalıştayı içermektedir.

Çoğu NGS verisinin grafiksel bir kullanıcı arayüzü olmadan çok geniş ve yönetilmesi zor olduğu göz önüne alındığında, IGV, kullanıcıların NGS verilerini ve diğer büyük veri setlerini kolayca incelemelerine olanak sağlamak için tasarlanmış bir veri görselleştirme aracıdır5. IGV başlangıçta klinik varyant analizi için tasarlanmamıştır. Ancak, biyoinformatik deneyim seviyeleri ne olursa olsun tüm moleküler profesyoneller için kullanım kolaylığı sağlaması nedeniyle, karmaşık veri inceleme iş akışının bir parçası olarak birçok laboratuvar tarafından yaygın olarak benimsenmiştir6. Bu çalışma, bu bilgileri daha geniş genomik laboratuvar profesyonelleri topluluğuna yaymak için bir mekanizma olarak hazırlanmıştır.

Klinik iş akışının bir parçası olarak IGV kullanımına yönelik klinik ihtiyaçlar arasında; sekanslama hatalarının tespit edilmesi, genomik varyant belirleme süreçlerindeki karmaşıklıkların yönetilmesi ve ek görselleştirmenin uygun veri yorumlamasına yardımcı olabileceği diğer tekrarlayan değişikliklerin değerlendirilmesi yer almaktadır7. IGV kullanımı, bir NGS çalışmasından elde edilen standart biyoinformatik dosyaları gerektirir8. IGV yazılımının temel özellikleri, sekanslama verilerinin görselleştirilmesine olanak tanır ve klinik varyant yorumlaması için bir dizi tercih ve seçeneğin yapılandırılmasını gerektirir (Ek Dosya 1).

Kısa okuma sekanslama iş akışı; FASTQ, ikili hizalama haritası (BAM) ve varyant çağırma formatı (VCF) dosya standartları ile karakterize edilir. NGS, milyonlarca kısa okumayı paralel olarak üreterek yüksek verimlilik sağlar. Bu strateji veri üretimini büyük ölçüde hızlandırsa da, her bir okuma orijinal DNA veya RNA'nın yalnızca bir fragmanıdır. Okumalar, adaptör dizileri aracılığıyla bir NGS akış hücresindeki belirli bir konuma tutunur. Optik işlemeden elde edilen sekans ve baz kalitesi bilgileri FASTQ dosyalarına kaydedilir. Bu ham okumalar, nükleotid dizileri ile birlikte baz başına kalite skorlarını içerir. Bu nedenle, ham okumaların işlenmesindeki ilk adımlardan biri, her bir okumayı bir referans genoma hizalamaktır8. Her okumaya referans genomda hizalanma olasılığının en yüksek olduğu belirli bir konum atandığından, aynı konuma karşılık gelen okumalar her lokusta "üst üste biner" ve bu veriler, sekans hizalama haritalama (SAM) spesifikasyonlarına (https://samtools.github.io/hts-specs/SAMv1.pdf adresinden erişilebilir; son doğrulama tarihi: 30/09/2025) uygun olarak bir BAM dosyasında saklanır (Şekil 1A). Bu bilgiler, IGV gibi bir genom tarayıcısı ile görsel olarak incelenebilir. Şekil 1B'de gösterildiği gibi, okumaların birbirleriyle veya referans dizinin kendisiyle karşılaştırılması, nükleotid dizileri arasındaki farkları veya tutarsızlıkları ortaya çıkarabilir. Tüm genom boyunca yalnızca bu "varyant" konumların özetleri bir VCF dosyasında derlenir; bu dosya, BAM dosyasına göre boyut olarak çok daha küçük olabilir ancak varyant incelemesi için gereken yararlı bilgilerin çoğunu hala içerebilir. Bu nedenle VCF dosyası, varyant çağırma hatlarının genellikle nihai çıktısıdır (Şekil 1C). Sonuç olarak, FASTQ dosyaları ham okuma ve kalite verilerini içerirken, BAM dosyası bu okumaların genoma ne kadar güvenle haritalandığına dair bilgi sağlar ve VCF, referans dizi ile örnek dizi arasındaki farkları temsil ederek potansiyel raporlama için incelenebilecek çok daha yönetilebilir miktarda veri sunar.

Bu çalışmadaki altı klinik vaka, moleküler laboratuvarlarda somatik varyant tespiti ile ilişkili yaygın analitik senaryoların yanı sıra, temel verilerin doğru anlaşılmasını ve yorumlanmasını zorlaştıran problemleri örneklendirmektedir. Genel olarak bu vakalar, giderek daha karmaşık hale gelen yorumlama senaryolarını ve IGV'deki gelişmiş özelliklerin kullanımının kapsamlı genomik özellikleri nasıl daha iyi tanımlayabileceğini göstermek için seçilmiştir. Bu çalışma somatik varyant yorumlamaya odaklansa da, bu özellikler germline değişikliklerin görselleştirilmesi ve yorumlanmasında IGV'nin kullanımı için de geçerlidir6. Şunu belirtmek gerekir ki, bu makalede kullanılan terimler sentez yoluyla dizileme kimyasına ve uygun olduğu yerlerde, diğer platformlar için benzer terimlere/kavramlara dayanmaktadır.

Her bir klinik vaka, çok kısa bir klinik bağlamla başlar ve bunu varyantın veya varyantların nasıl araştırılacağı ile hangi varyantın (varsa) gerçek, hangisinin (varsa) bir artefakt olduğunun nasıl çözüleceğine dair talimatlar izler. Sekanslama verilerinin detaylarıyla birlikte klinik bağlam, bu soruyu yanıtlamak için önemlidir.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada sunulan veriler, simüle edilmiş ve gerçek hasta NGS verilerinin bir karışımıdır. Bununla birlikte, tüm hasta verileri, etiket kaldırma ve tek lokus okuma çıkarma yöntemlerinin bir kombinasyonu ile anonimleştirilmiştir. Bu protokol, tüm yazarların kurumlarındaki insan araştırmaları etik kurulu için geçerli olan kılavuzlara uygundur.

1. Integrative Genomics Viewer'ın (IGV) en güncel sürümünün indirilmesi

NOT: IGV, insan genomu da dahil olmak üzere çeşitli genomları görselleştirmek için ücretsiz olarak indirilebilen bir programdır (https://igv.org/doc/desktop/#DownloadPage/). IGV; transkriptlerin, özelliklerin ve izlerin yeni versiyonlarını içerecek şekilde periyodik olarak güncellenmekte olup, genellikle listenin en üstünde en güncel versiyon yer almaktadır.

  1. Yukarıdaki tek düzen kaynak belirleyici (URL) üzerinden erişilebilen ve 'IGV for Windows, Java Included' olarak adlandırılan dosyayı masaüstüne indirin; bu işlem, kuruma bağlı olarak yönetici kimlik bilgileri gerektirebilir.
  2. IGV bünyesinde barındırılan ve raporlarda çağrılması planlanan insan genom sürümünü (örneğin, hg19 veya hg38) seçin.
    NOT: Bu çalışmada IGV 2.19.7 kullanılmıştır. Bu protokolde, Java dahil olan Windows sürümü indirilmiştir. IGV, 8Gb RAM şeklindeki varsayılan bellek tahsisiyle çalıştırılmıştır. IGV tercihler sekmesinde ve IGV'deki diğer bölümlerde önerilen ayarlar Ek Dosya 1'de belirtilmiştir.

2. Klinik vakaları anlama ve gerekli dosyaları indirme

  1. GitHub deposuna gidin: Tüm dosyalar https://github.com/Eitan177/Demo_IGV GitHub deposundan indirilebilir.
    NOT: GitHub deposunda her vinyet için bir oturum dosyası bulunmaktadır ve bu oturum dosyasının yüklenmesi, dosyaların ayrı ayrı yüklenmesi ve ilgili lokusa gidilmesi gereksinimini ortadan kaldırır; çünkü oturum dosyası bu adımları otomatik olarak halleder.
  2. Dosya menüsü aracılığıyla bir oturum dosyasını yükleyin. File > Open Session seçeneğine tıklayın ve uygun oturum dosyasını seçin.

3. Kapsama izinin ayarlanması

NOT: IGV'de ana pencere bir "kapsam izi" (coverage track) içerir. Bazı durumlarda, belirli kanser varyantlarını içeren okumaların küçük bir kısmı bile klinik olarak anlamlı olabilir. Bu nedenle, analiz edilen genom bölgelerinde çok yüksek okuma derinliğine ulaşmak kritik öneme sahiptir. Okumaların yalnızca %2'si belirli bir varyantı içeriyorsa, varyantı güvenilir bir şekilde belirlemek için yüzlerce veya binlerce okuma derinliği gerekebilir; "derin sekanslama" terimi buradan gelmektedir.

  1. Kapsama izinin (coverage track) mevcut olduğundan emin olun: Üst menüden View > Preferences seçeneğine tıklayın ve Alignments sekmesini seçin. Sekmenin üst kısmında, 'Show coverage track' etiketli bir kutucuk bulunmaktadır. Bunun işaretli olduğundan emin olun.
  2. Klinik olarak anlamlı düşük seviyeli varyant eşiğinden emin olun: Adım 3.1'de detaylandırıldığı gibi Alignments sekmesine gidin ve Coverage allele-fraction etiketli kutucuk görünene kadar aşağı kaydırın. Kutudaki sayıyı 0.01 olarak ayarlayın ve Save düğmesine basın (Save düğmesine basıldığında tercih penceresi kapanmalıdır).

4. Soft-clipped okumaların ayarlanması

NOT: Bu ayar; gen düzenlemeleri, kopya sayısı değişiklikleri veya birleşik insersiyon-delesyon olayları gibi daha büyük yapısal varyantların saptanması için çok değerlidir. EGFR amplifikasyonları ve delesyonlarına odaklananlar gibi gelişmiş örnekler, soft-clipped okumaların, standart varyant belirleme yöntemleriyle gözden kaçabilecek yapısal varyantların varlığını nasıl doğrulayabileceğini göstermektedir.

  1. Yumuşak kırpmaları (soft-clips) etkinleştirin: Üst menüden View > Preferences seçeneğine tıklayın ve Alignments sekmesini seçin. Show soft-clipped bases kutusuna kadar aşağı kaydırın ve kenarları referansla temiz bir şekilde eşleşmeyen ve "kırpılan" kısmi hizalanmış okumaları ortaya çıkarmak için bu kutucuğun işaretli olduğundan emin olun (Supplementary File 1).

5. Klinik vakalar

  1. Vinyet #1: Gerçek bir durumu ayırt edin KRAS (Kirsten rat sarkom virüsü onkogen homologu) patojenik varyantının bir sekanslama artifaktından ayrımı.
    NOT: Vaka A, histolojik değerlendirmede yaklaşık %80 tümör tahmin edilen, yeni tanı konmuş akciğer adenokarsinomu ile başvuran 65 yaşında bir erkek hastayı kapsamaktadır. NGS profillemesi sonucunda bir KRAS NM_004985.5 c.34G>T küçük hücreli dışı akciğer kanserinde (KHDAK) bilinen bir sürücü mutasyon olan (p.G12C) varyantı. Ortaya çıkan yanlış anlamlı varyant KRAS c.34G>T (p.G12C), akciğer adenokarsinomlarının yaklaşık %13'ünde görülür ve hedefli tedaviler için uygunluk sağlar9Vaka B, bilinen bir sarkomu olan 54 yaşında bir kadın hastayı içermektedir (tahmini %50 tümör ve %50 normal doku). Özdeş KRAS c.34G>Bu örnekte T (p.G12C) varyantı tespit edilmiştir. Ancak, KRAS c.34G>Sarkomda T (p.G12C) nadiren bildirilmektedir; varlığı, olası bir sekanslama artifaktı şüphesini doğurur. 
    1. IGV iş akışı (Oturum dosyası KRAS.xml)             
      1. Verileri yükleyin: Genom açılır menüsünden Hg19'u seçin, kras2A_fixed_backbone_2A_new_final_sorted.bam bam dosyasını yükleyin ve odaklanmak için chr12:25,398,281–25,403,833 bölgesine gidin. KRAS gen bölgesi. İndeks dosyasının (bam dosyasıyla aynı isme sahip ancak .bai ile biten dosya), bam dosyasıyla aynı dizinde olması gerektiğini unutmayın.  
      2. Kapsam ve VAF'yi inceleyin: Ekzon 2'deki kodon 12'yi gözden geçirin (NM_004985.5)) ve o konumdaki ok derinliğini görüntülemek için kapsam izindeki varyant konumuna tıklayın. %35-40 VAF ile, heterozigot, klonal bir sürücü mutasyonla yüksek düzeyde tutarlı olan bir G→T sübstitüsyonuna (transversiyon olayı) dikkat edin (Şekil 2A), özellikle yaklaşık %80 tümör hücre oranı bağlamında.   
      3. StrandBias'ı kontrol edin: Zincire göre renk kodlaması yapın (bkz. Ek Dosya 1, Adım 4), akciğer örneğinde yaklaşık 50:50 oranında ileri (kırmızı): geri (mavi) dağılımını ortaya çıkarmak için.  
      4. Sarkom örneği olan B vakası için 5.1.1.1–5.1.1.3 adımlarını tekrarlayın: kras2B_fixed_backbone_2B_new_final_sorted.bam bam dosyasını yükleyin ve şunları not edin: <%1 VAF ve neredeyse tamamen ileri zincir desteği, bir PCR/hizalama artefaktına işaret etmektedir (Şekil 2B).
  2. Vinyet #2: Çok nükleotidli varyant (MNV) yanlış sınıflandırmasını giderin.
    NOT: Metastatik melanom tanısı olan 50 yaşında bir kadın hastaya NGS tabanlı tümör profillemesi uygulanır. Analiz sonucunda potansiyel bir BRAF (B-Raf proto-onkogen, serin/treonin kinaz) c.1798_1799delinsAA mutasyonu. While BRAF NM_004333.6: c.1799T>A (p.V600E), çeşitli solid tümörlerde daha yaygındır, BRAF c.1798_1799delinsAA (p.V600K), UV ışığının C üzerinden indükleyebildiği etkiler nedeniyle melanoma için nispeten spesifiktir > dipirimidinlerdeki T geçişleri10HGVS kurallarına göre, ... içindeki iki tek nükleotid varyantı (SNV) cis tek bir MNV olarak adlandırılmalıdır. Birçok durumda, bir biyoinformatik hattı bu kompleks varyantı yanlışlıkla yan yana iki SNV olarak tanımlayabilir cis konumunda: BRAF c.1798G>A ve BRAF c.1799T>A. Teknik (yani varyant belirleyici ile ilgili) ve biyolojik (cis karşı Lütfen çevrilecek kaynak metni sağlayın. (ayrım) hususları nedeniyle, klinik inceleme sırasında verilerin görselleştirilmediği takdirde, mutasyonun raporlama aşamasında hatalı bildirilme riski bulunmaktadır.      
    1. IGV iş akışı (Oturum dosyası BRAF.xml)           
      1. Verileri yükleyin: Genom açılır menüsünden Hg38'yi seçin, kras2B_fixed_backbone_2B_new_final_sorted.bam bam dosyasını yükleyin ve chr7:140.453.136–140.753.336 bölgesine gidin. İndeks dosyasının (bam dosyasıyla aynı isimde ancak .bai ile biten dosya), bam dosyasıyla aynı dizinde olması gerektiğini unutmayın.
      2. ...’nın 600. kodonuna yakınlaşın BRAFGri yerine yeşil ve mavi olan komşu kapsama izi pozisyonlarına dayanarak, p.V600K ile uyumlu bir GT→AA dinükleotid değişimini kaydedin. 
      3. İki bireysel SNV'nin (tek nükleotit varyasyonu) birbirleriyle bağlantılı olup olmadığını belirlemek için tarama yapın cis veya Lütfen çevirilecek kaynak metni sağlayın. Metni gönderdiğinizde, belirttiğiniz akademik standartlara ve bilimsel terminolojiye uygun olarak profesyonel Türkçe çevirisini gerçekleştireceğim.Her iki SNV'nin de aynı okumalara eşlendiğine ve şunlarda bulunduğuna dikkat edin: cis.  
      4. Zinciri ve kapsamı inceleyin: Yaklaşık olarak eşit ileri/ters destek göstermek için okumaları renklerle kodlayın (bkz. Ek Dosya 1, Adım 4) ve klonal bir sürücü ile tutarlı olan %50'yi aşan bir VAF. 0,01'lik bir kapsama izleği eşiği (bkz. Ek Dosya 1(kurulum için 3. Adım), (mevcutsa) kısmi alt klonların görünür kalmasını sağlar (Şekil 2C).  
      5. Bağlamı ve MNV nomenklatürünü dikkate alın: İki nükleotid değişimi birbirine komşudur. Uzman konsensüsü uyarınca, aynı sekans okumasında eşleşen ve aralarında 50 bp mesafe bulunan SNV'leri tek bir değişim olarak tanımlayın. "kompleks" veya "delins" varyant11. 
  3. Vinyet #3: Bir [nesneyi/durumu] inceleyin KİT bir gastrointestinal stromal tümörde (GIST) (KIT proto-onkogen, reseptör tirozin kinaz) ekzon 9 insersiyonu
    NOT: Gastrointestinal stromal tümörü olan 58 yaşındaki erkek bir hastaya rezeksiyon uygulanmış ve NGS testi istenmiştir. Sonuçlar, şu bölgede olası bir varyant olduğunu göstermektedir: KİT. KİT mutasyonlar, vakaların yaklaşık %75'inde görülen ve hedeflenebilir olan, GIST'lerde sık rastlanan bir etkendir. Ekzon 11 aktive edici mutasyonların ardından, KİT Ekzon 9 aktive edici mutasyonlar tanımlanan en yaygın sürücülerdir; ancak ekzon 9 mutasyonlu GIST'ler ile ekzon 11 mutasyonlu GIST'ler, tirozin kinaz inhibitörü duyarlılığı açısından farklı davranışlar sergilerler12. 
    1. IGV iş akışı (Oturum dosyası KIT.xml)
      1. Verileri yükleyin: Hg19 genomunu seçin ve KITdupmod2.bam BAM dosyasını yükleyin; indeks dosyasının (BAM dosyasıyla aynı isme sahip ancak .bai uzantılı olan dosya) aynı dizinde olduğundan emin olun. Genomun ekzon 9'unun bir kısmına karşılık gelen chr4:55,592,144-55,592,257 bölgesine gidin. KİT gen
      2. Görünümü sıkıştırın: Hizalama kanalına sağ tıklayın ve seçin Ezilmiş görünümü sıkıştırmak için (Şekil 3A).
      3. Eklemeyi bulun: 55.592.178 ve 55.592.179 pozisyonları arasında yer alan, kapsama izinin hemen üzerindeki ok başı şeklindeki ekleme işaretini belirleyerek kısa bir eklemeyi (Şekil 3B,C).
      4. Ek ile etkileşime girin: Görünümü genişletmek için ok işaretine tıklayın ve boşluğu dolduran bazlara sahip okumalardan birine tıklayarak ayrıntıları bir açılır pencerede görüntüleyin. Eklenen dizinin bir duplikasyon olup olmadığını belirlemek için eklenen diziyi referans diziyle karşılaştırın (Şekil 3D,E).
      5. Kapsanmaya bakın: Destekleyici okuma sayısını görüntülemek için ekleme ok ucunun hemen yanındaki kapsama izine tıklayın; bu sayı, yaklaşık varyant alel frekansını (VAF) belirlemek için toplam okuma sayısı ile karşılaştırılabilir; bu örnekte VAF ~%28'dir.
      6. Zincir yanlılığını kontrol edin: Okumaları okuma zincirine göre sıralayın ve yumuşak kırpılmış (soft-clipped) bazları görüntüleyin (bakın Ek Dosya 1, bölüm 3) ters okumalarda (reverse reads) insersiyona komşu olan bir ilgi bölgesini (region of interest) göstermek içinŞekil 3F).
  4. Vinyet #4: Birini araştırın EGFR Küçük hücreli dışı akciğer kanserinde (KHDAK) Ekzon 19 delesyonu (epidermal büyüme faktörü reseptörü).
    NOT: Yeni teşhis edilmiş KKHPS'li 70 yaşında bir kadın hasta, kitlenin cerrahi rezeksiyonuna tabi tutulur. Yeterli tümör saflığına sahip bir doku kesiti üzerinde NGS istenir ve sonuçlar, şurada olası bir varyant olduğunu gösterir: EGFRBirçok EGFR mutasyonlar tirozin kinaz inhibitörlerine duyarlıdır ve bu varyant, hastanın tedavisi ve prognozu üzerinde etkili olabilir13.
    1. IGV iş akışı (Oturum dosyası EGFR.xml)
      1. Yükle veri: Hg19 genomunu seçin, EGFRE746_A750delmod.bam bam dosyasını yükleyin, indeks dosyasının (bam dosyasıyla aynı isimde olan ancak .bai ile biten dosya) aynı dizinde olduğundan emin olun ve ekzon 19'un bir kısmına karşılık gelen chr7:55.242.420-55.242.513 bölgesine gidin EGFR gen
      2. Kapsama izini (coverage track) kullanarak delesyonu araştırın: Okumaların uçlarında konumlanmamış, düşük kapsamlamaya sahip küçük bir bölgeyi belirlemek için kapsama izini inceleyin (Şekil 4A,B). Kapsama izinin incelenmesi, ekzon 19'un küçük bir bölümünde daha düşük kapsama olduğunu göstermektedir.
      3. Okumaları kullanarak delesyonu inceleyin: Hizalama görünümünü genişleterek, okuma içerisinde siyah bir çizgiyle temsil edilen hizalama boşluğuna sahip okumaları gösterin (Şekil 4C,D).
      4. Genomik bağlamı göz önünde bulundurun: Delesyonun gerçekleştiği ve hemen çevresindeki referans nükleotid dizisini inceleyin. Homopolimer veya tekrarlayan bölgelerdeki delesyonlar, özellikle düşük varyant alel frekansında mevcut olduklarında bir sekanslama artefaktını temsil edebileceğinden, delesyon çağrısını referans dizisindeki konum bağlamında değerlendirin. Bkz. Küçük bir delesyonun görüntülenmesi bir kısmı Ek Dosya 2 iş akışının ayrıntılı bir açıklaması için.
  5. Vinyet #5: Araştır EGFR glioblastoma hastasındaki değişimler.
    NOT: 77 yaşında, ... olan kadın hasta İzositrat Dehidrogenaz yabanı tip glioblastoma, yeni nesil dizileme (NGS) testine tabi tutulur. Hastanın sonuçları, potansiyel bir EGFR kopya sayısı artışı ve potansiyel EGFRvIII yeniden düzenleme (ekzon 2-7 delesyonu). Her iki EGFR amplifikasyon ve EGFRvIII değişikliklerin glioblastomada prognostik ve terapötik önemi vardır. Ayrıca, bu iki değişiklik sıklıkla birlikte görülür; bu da düşük seviyelerde tespit edildiğinde, birinin varlığının diğerinin geçerliliğini destekleyebileceği anlamına gelir.
    1. IGV iş akışı (Oturum dosyası copynumber.xml):
      1. Verileri yükleyin: Hg38 genomunu seçin, segment dosyasını (proband.seg) ve karşılaştırıcı örnekleri yükleyin, c1.seg-c9.seg dosyalarını IGV penceresine sürükleyip bırakarak ekleyin. Chr7'ye gidin.
        NOT: CNVKit tarafından oluşturulan segmentasyon dosyaları indirilmeye hazır olarak sunulmuştur. Kopya sayısı kantifikasyonu oluşturmak için CNVKit'in kullanımına ilişkin tam iş akışı bu çalışmanın kapsamı dışındadır. Ancak kısaca, normal, euploid örneklerden oluşan önceden hazırlanmış bir havuz referans ile CNVKit versiyon 0.9.9 (https://github.com/etal/cnvkit adresinden indirilebilir) kullanılmıştır. Girdi, genom boyunca dağılmış 9.144 CNV iskelet prob konumunu içeren bir bed dosyasından oluşmaktadır. Burada dikkate alınması gereken önemli bir husus, kopya sayısı hattı girdilerinin ve parametrelerinin detaylarının, örneklerin bir çalışmadaki tüm örnekler için aynı olan bir kurulum kullanılarak işlenmesi gerçeğinden daha az önemli olduğudur. Bu durum, sistemik yanlılığın tanımlanmasını kolaylaştırır.
      2. Isı haritasını değerlendirin: İlgilenilen örnekle (bu örneğe karşılık gelen, şu şekilde etiketlenmiş ısı haritası satırını bulun, etiketli) diğerleri arasındaki göreli renk yoğunluğunu karşılaştırın proband) ve diğer örnekler (c1-9), gerçek kopya sayısı değişikliklerini artefaktlardan ayırt etmek için kullanılır.
        NOT: Bir lokusun tüm örnekler genelinde dikey görsel karşılaştırması, her bir örnekteki belirli bir lokusta, arka plana göre anomalilerin (satırlar arası renk farklılıklarına dayalı kalitatif farkların, kantitatif farkların değil) belirlenmesinin yoludur. Şuraya bakın: Şekil 5 ve Kopya sayısı değişikliklerinin görüntülenmesi kesiti Ek Dosya 2 ayrıntılı adımlar için.
  6. Vinyet #6: İncele EGFRvIII glioblastoma tanılı bir hastada.
    NOT: Aynı hastada ayrıca bir ... olduğuna dair kanıtlar bulunmaktadır EGFRvIII yeniden düzenlenme (ekzon 2-7 delesyonu). Her iki EGFR amplifikasyon ve EGFRvIII değişimlerin glioblastomada prognostik ve terapötik önemi vardır. Ayrıca, bu iki değişim sıklıkla birlikte görülür; bu da düşük seviyelerde tespit edildiklerinde, birinin varlığının diğerinin geçerliliğini destekleyebileceği anlamına gelir.
    1. IGV iş akışı (Oturum dosyası egfr_vIII.xml):
      1. Verileri yükleyin: Hg19 genomunu seçin, hastanın bam dosyasını, proband.bam'i yükleyin ve indeks dosyasının (bam dosyasıyla aynı isimde olup .bai uzantısıyla biten dosya) aynı dizinde olduğundan emin olun ve şuraya gidin: EGFR gen
      2. Kırılma noktalarını görselleştirin EGFRvIIIAday kırılma noktalarını tek tek incelemek için görünümü ayarlayın (ekzon 2'nin üst tarafı ve ekzon 7'nin alt tarafı için EGFRvIII), ve 'baz göre sorting' (sort-by-base) işlemini gerçekleştirin  (veya kısayolu kullanın Ctrl-s Windows/Linux üzerinde veya Cmd-s (Mac'te) kırılma noktalarında, soft-clip uygulanmış okumaların yığılmalarını görselleştirmek için.
      3. BLAT okumaları hizala: Yumuşak kırpılmış (soft-clipped) bir dizinin üzerine sağ tıklayın ve seçin BLAT dizisi (IGV, UCSC'den gelen varsayılanları kullanır; BLAT varsayılan parametreleri için bkz. https://ucsc.crg.eu/FAQ/FAQblat.html). İlk satıra tıklayın ve şunu gözlemleyin: Blat izleme IGV iz bölümünün altında görünen.
        NOT: Ekzon 1/intron 1 birleşim noktasına ve intron 6/ekzon 7 birleşim noktasına hizalanan tek bir okuma bile, şunun için yeterli kanıt olabilir: EGFRvIII, başka bir örnekten kaynaklanan çapraz kontaminasyon ihtimali bu okuma için bir neden olarak elendiği sürece. Bakınız Şekil 6 ve Yapısal yeniden düzenlemenin görüntülenmesi kesiti Ek Dosya 2 ayrıntılı adımlar için.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Şunu belirtmek gerekir ki, bu çalışma klinik raporlama için IGV'de varyant incelemesinin inceliklerini açıklamaya odaklanmaktadır. Nihai klinik raporlama, her bir laboratuvarın valide edilmiş iş akışına, kalite kriterlerine ve raporlama politikasına bağlı olmalıdır. Bu önemli konunun kapsamlı bir tartışması mevcut çalışmanın kapsamı dışındadır; ancak, American College of Medical Genetics and Genomics ve Association for Molecular Pathology tarafından önerilen standartlar ve kılavuzlar oluşturulmuştur7 ve bunlar klinik laboratuvarlarda düzenli olarak uygulanmaktadır.

Klinik Olgu #1 yorumlaması:

Yüksek VAF, dengeli zincir dağılımı ve bilinen insidansı göz önüne alındığında KRAS c.34G>T (akciğer kanserinde (p.G12C)Şekil 2A), A durumundaki varyant hedefli tedaviye olanak sağlayabilir ve bu nedenle klinik olarak raporlanması kritik öneme sahiptir. Aynı durum için olumlu bir çağrıya rağmen KRAS c.34 G>ikinci (sarkom) vakadaki T varyantı (Şekil 2B), yanlış pozitif bir çağrıya dair birden fazla uyarı işareti mevcuttur: (1) bildirilen varyant alel fraksiyonu (VAF) ~%1'dir; bu değer, düşük tümör hücreselliğine (%20) sahip olduğu tahmin edilen bir örnekte bile bir sürücü olayın beklenen değerinin çok altındadır ve (2) bu varyantı destekleyen okumalar, neredeyse sadece ileri okuma dizisinde (forward-strand) görülerek zincir yanlılığı göstermektedir. Bu kanser türü için biyolojik makuliyetin olmamasıyla birlikte, kanıtlar B vakasındaki bulgunun bir artefakt olduğunu göstermektedir.

Klinik Olgu #2 yorumlaması:

Bu vinyet, klinisyenlerin farkında olması gereken birden fazla farklı hatayı örneklemektedir. İlk olarak, varyant belirleyiciler, yan yana bulunan genetik varyantları uygun veya uygun olmayan şekilde ya iki SNV ya da tek bir MNV olarak tanımlayabilir (Şekil 2C). Bu durum, somatik varyant belirleyicilerdeki haplotip duyarlı varyant belirleme algoritmasının uygulanmasındaki farklılıklardan kaynaklanmaktadır. Yalnızca yakın zamanda yayınlanmış birkaç varyant belirleyici bu özelliği içermektedir14,15. İkinci olarak, bu tür teknik ve nomenklatüre dayalı varyasyonlar, farklı biyoinformatik boru hatları kullanan sekanslama merkezleri tarafından harici veri tabanlarına aktarılmaktadır. Bu nedenle, tek bir genetik varyant olarak listelenmesi gereken durumlar için birden fazla farklı kayıt içerebilirler. Veri tabanı fazlama (phasing) işlemi periyodik olarak gerçekleşmediği sürece, bu durum klinik yorumlama aşamasında çeşitli istenmeyen etkilere yol açabilir. Hep birlikte değerlendirildiğinde, bu olası hata kaynakları birleşerek hatalı bir hasta raporuna neden olabilir. Bu karmaşık senaryo, IGV gibi yüksek kaliteli yazılımlar kullanılarak varyant görselleştirmenin önemini vurgulamaktadır.

Klinik Vaka #3 yorumlaması:

GIST'lerde ekzon 9 duplikasyonları ile KIT'in konstitütif aktivasyonunun bilinen mekanizması ve duplikasyon için çoklu okuma desteği göz önüne alındığında, bu KIT c.1504_1509dup (p.A502_Y503dup) varyantının gerçek olduğu ve bir artefakt olmadığı sonucuna varabiliriz (Şekil 3). KIT mutasyonları GIST'lerde sık görülen sürücülerdir ve vakaların yaklaşık %90'unda ortaya çıkarlar. Ekzon 11 aktive edici mutasyonlar en yaygın olanları olsa da, ekzon 9 mutasyonlu GIST'ler tirozin kinaz inhibitör duyarlılığı açısından farklı davranış sergilediklerinden ve bu durum terapötik yaklaşımı değiştirdiğinden, burada varyantın doğru karakterizasyonu kritiktir. KIT mutasyonlarının GIST'lerdeki klinik önemi göz önüne alındığında, bu varyant nihai rapora dahil edilmelidir.

Klinik Olgu #4 yorumlaması:

Kapsama izi, stereotipik kısa delesyon görünümü, ok desteği ve NSCLC'deki EGFR ekzon 19 delesyonlarının konstitütif aktivasyonunun bilinen mekanizması göz önüne alındığında, bu EGFR c.2235_2249del (p.E746_A750del) varyantının gerçek olduğu ve bir artefakt olmadığı sonucuna varabiliriz (Şekil 4). Bu iyi bilinen ekzon 19 delesyonu da dahil olmak üzere birçok EGFR mutasyonu, tirozin kinaz inhibitörlerine karşı oldukça duyarlıdır. NSCLC'lerde EGFR mutasyonlarının klinik önemi nedeniyle, bu varyant nihai rapora dahil edilmelidir.

Klinik Olgu #5 ve Olgu #6 yorumlaması:

Isı haritası görünümleri EGFR amplifikasyonunu doğrulamaktadır ve BLAT ile değerlendirilen ekzon 1 ve 8 arasındaki kırılma noktası birleşimi, bu hastadaki her iki bulguyu da teyit etmektedir (Şekil 5 ve Şekil 6). EGFR amplifikasyonu genellikle daha agresif hastalığın prognostik bir faktörü olarak kabul edilir ve EGFRvIII gen yeniden düzenlemesi GBM'ye özgü bir biyobelirteçtir ve potansiyel olarak hedeflenebilir16,17.

Seçilen iş akışları, altı oturum dosyası (her bir vinyet için bir adet), hizalama dosyası kullanan her bir vinyet için beş çift bam ve bai dosyası ve hizalama dosyaları yerine segment dosyaları kullanan beşinci vinyet için 10 seg dosyası içeren GitHub deposunun (https://github.com/Eitan177/Demo_IGV, 6/9/2026 tarihinde güncellenmiş) ana dalına kaydedilen dosyalar kullanılarak yeniden oluşturulabilir.

figure-results-1
Şekil 1: NGS dosya standartları ve dizileme iş akışı. (A) Bir akış hücresinde üretilen kısa okumalar optik ölçümlerle takip edilir ve hem sekans verilerini hem de baz başına kalite skorlarını içeren FASTQ formatında saklanır. Bu okumalar daha sonra sıralanır ve bir referans genoma hizalanır ; böylece her okumanın eşleştiği lokusta "yığıldığı" bir BAM dosyası elde edilir. (B) Referans ile okumalar arasındaki farklılıklar (örneğin, nokta mutasyonları, küçük indel'ler) varyant belirleme algoritmaları tarafından tanımlanır. (C) Son olarak, tespit edilen bu varyantlar; konumlarını, referans/alternatif bazları ve diğer açıklama verilerini özetleyen bir VCF dosyasında derlenir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: KRAS c.34G>T (p.G12C) ve BRAF c.1798_1799delinsAA (p.V600K)'nin IGV tabanlı görselleştirmesi. (A) IGV'de gerçek bir varyantın (KRAS c.34G>T (p.G12C)) görselleştirilmesi; yüksek okuma derinliği (binlerce okuma) ve okumaların ~%35–40'ının G→T değişikliği taşıdığını göstermektedir. İleri (kırmızı) ve geri (mavi) okumalar dengelidir, bu da gerçek bir heterozigot mutasyona işaret eder. (B) İlgisiz dokuda şüphelenilen artefakt; minimum okuma desteğine (%1 VAF) sahip bir varyant göstermektedir. Varyant okumalarının çoğu ileri zincirde (kırmızı) görünmektedir, bu da zincir yanlılığını (strand bias) belirtir. (C) IGV'de görülen karmaşık bir varyant olan BRAF c.1798_1799delinsAA (p.V600K), cis konumda iki bazlı bir sübstitüyonu (GT→AA) ortaya koymaktadır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: Küçük bir insersiyonun görselleştirilmesi. (A) IGV'de KIT ekson 9'un "Sıkıştırılmış" (Squished) görünümü, ilgi duyulan bölgenin belirlenmesine yardımcı olur. (B) İnsersiyon çubuğunun ve yumuşak kırpılmış (soft clipped) bazların görselleştirilmesiyle belirlenen ilgi alanı (kırmızı kutu). (C) İnsersiyonun görselleştirilmesine olanak sağlamak için IGV'de "Genişletilmiş" (Expanded) görünümün ayarlanması. (D) İnsersiyon çubuğuna (kırmızı kutu) tıklandığında eklenen dizi görüntülenir. (E) Eklenen dizi, yinelenen bazları belirlemek için referans dizi ile karşılaştırılır. (F) Okumaların okuma-zincirine (read-strand) göre sıralanması, yumuşak kırpılmış bazların ters okumalardaki insersiyona karşılık geldiğini gösterir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-4
Şekil 4: Küçük bir delesyonun görselleştirilmesi. (A) Çok sayıda okumada mevcut olan delesyonu gösteren EGFR ekzon 19'un "sıkıştırılmış" görünümü. (B) Delesyonun içindeki ve bitişiğindeki pozisyonlardaki okuma sayısını incelemek için kapsama izinin kullanılması. (C) Silinen baz sayısını belirleyen, delesyonu gösteren "genişletilmiş" görünüm. (D) Referans dizi ile karşılaştırma (kırmızı kutu), silinen bazları belirler. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-5
Şekil 5: Bir kopya sayısı artışının görselleştirilmesi. (A) Bir seg dosyasında altı sütun bulunur: örnek kimliği, kromozom, başlangıç, bitiş, segmentteki markörler ve segment ortalaması. (B) seg dosyalarının doğrudan IGV'ye yüklenmesi, kolay görselleştirme sağlar. (C) Verilerin genom genelinde bir görünümle görselleştirilmesi. Her örnek, renklerin değerleri belirttiği bir veri satırı olarak görünecektir; kırmızı >0 ve mavi <0 içindir ve daha yoğun renkler 0'dan daha uzak değerleri yansıtır. İlgilenilen örnek ve aynı çalışmadan rastgele seçilen dokuz örneğin açılmasıyla, on satırlı çok örnekli bir ısı haritası sonucu oluşur. İlgilenilen örnek, altta kırmızı kutu ile vurgulanmıştır. (D) Görünüm EGFR lokusuna daraltıldığında, alttaki ilgilenilen örnekte kırmızı bir çubuk, rastgele örnekler için ise beyaz veya mavi çubuklar görülür. İlgilenilen örnek ile diğer satırlardaki rastgele örnekler arasındaki bu renk farkı, ilgilenilen örnekteki amplifikasyon çağrısının bu lokustaki arka planın veya gürültünün üzerinde olduğunu kanıtlar. (E) chr7'ye zoom out yapıldığında, örneğimizdeki EGFR içeren lokus ile rastgele örneklerdeki durum arasında bir kontrast fark edilir. EGFR amplifikasyonu, en alttaki örnekte kırmızı bir şerit olarak görünür. (F) Görünüm MET lokusuna daraltıldığında, MET amplifikasyonu ilgilenilen örneğin yanı sıra dokuz rastgele örnekte de değişen derecelerde tekrarlanır, bu da bu amplifikasyon çağrısının bir artefakt olduğunu gösterir. Bu durum, EGFR lokusundaki gerçek bir kopya sayısı çağrısı ile bir artefakt arasındaki görünüm farkını vurgular. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-6
Şekil 6: Bir EGFRvIII gen yeniden düzenlemesinin görselleştirilmesi. Bu vaka üzerinde çalışmadan önce, yumuşak kırpılmış (soft-clipped) bazların görselleştirme ayarlarının yapıldığından emin olun (ek ayrıntılar için Ek Dosya 1'e bakın). (A) İlk aday eklem bölgesine gidin ve hizalama izinin (alignment track) görünümünü "Squished" olarak ayarlayın. (B) Lokus boyunca ilerleyin ve hizalama izinin üst kısmında benzer şekilde yumuşak kırpılmış okumaların bir birikimi (pileup) görünene kadar "control-s" bazla sıralama kısayolunu yinelemeli olarak uygulayın. Birikimdeki benzer şekilde yumuşak kırpılmış okumaların (kırmızı kutu) miktarı ne kadar fazlaysa, yapısal yeniden düzenleme güveni o kadar yüksektir. (C) BLAT aracı, yumuşak kırpılmış bazların dizisini çeker ve bu dizinin genomda nerede bulunduğunu, hedef veri tabanındaki belirli bir diziyle ne kadar yakından hizalandığını ölçen sayısal bir skorla birlikte belirler. Belirli bir satırın seçilmesi, o konuma yönlendirecektir. (D) "control-s" bazla sıralama fonksiyonunun tekrar kullanılması, bu kez okumaların karşı tarafında bir yumuşak kırpma birikimini gösterir. hg38 referansına göre örnekte ek baz bulunmadığını doğrulamak için, ardışık yumuşak kırpılmış bazlara sahip bir okumaya sağ tıklayın ve yumuşak kırpma bazlarını tekrar BLAT ile tarayın. Ortaya çıkan tablo, eklemin ilk kırılma noktasını, başlangıçta görselleştirilen lokusu, yani ekzon 1-intron 1 eklemini gösterir. (E) Üst satırın seçilmesi ilk kırılma noktasına geri döndürür. BLAT referans hizalamasının eklemindeki bazlar, sorgu olarak kullanılan yumuşak kırpılmış bazlarla aynıdır; bu da yumuşak kırpılmış okumaların tüm dizisinin referans dizi hizalamasında yer aldığını gösterir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 1: Önerilen IGV kurulumu.Lütfen bu dosyayı indirmek için buraya tıklayın.

Ek Dosya 2: Yoğunlaştırılmış iş akışları.Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Klinik raporlama için doğru varyant incelemesi, karmaşık biyoinformatik algoritmalara ve IGV kullanılarak karmaşık varyantların görsel incelemesinin sürece dahil edilmesine bağlıdır5,6. Bu çalışma, IGV'de basit ve karmaşık genomik değişimleri görselleştirmek için önerilen ayarların kısa bir kaynağını derlemek amacıyla tasarlanmıştır (Ek Dosya 1). Bu çalışma, yaygın somatik değişimlere ve bunların IGV'de nasıl inceleneceğine odaklanmaktadır.

Protokol, tespit edilen bulgunun gerçek mi yoksa bir artefakt mı olduğunu belirlemeye özel dikkat göstererek, basit bir sübstitüsyon mutasyonunun (Şekil 2A) ve kompleks bir sübstitüsyon mutasyonunun (Şekil 2C) değerlendirilmesiyle başlar. Ardından, bu değişikliklerin IGV'de nasıl göründüğünü vurgulayan basit bir insersiyona (Şekil 3) ve basit bir delesyona (Şekil 4) geçer. Son olarak, kopya sayısı değişiklikleri (Şekil 5) ve yapısal yeniden düzenlemeler (Şekil 6) dahil olmak üzere kompleks genomik değişiklikleri ele alır. Bu özelliklerin her biri için temel adımları vurgulayan yoğunlaştırılmış iş akışları Ek Dosya 2'de özetlenmiştir. Bu çalışma, okuyucunun farklı genomik değişikliklerin IGV'de nasıl göründüğüne aşina olmasını amaçlamaktadır5.

Şunu belirtmek gerekir ki, IGV varyantları bağımsız olarak tespit etmek için kullanılan bir pipeline aracı değildir. Bu makalenin kapsamı dışında olmakla birlikte; varyant alel fraksiyonu ve kapsama derinliği için assay validasyon kısıtlamalarına dayalı olarak raporlanabilir varyantların belirlenmesi, belirli koşullar altında varyantlar için ortogonal onay gerekip gerekmediği, biyoinformatik yazılım versiyonlamasıyla ilgili karmaşıklıklar ve görsel yorumlamadaki gözlemciler arası varyasyon gibi konuların araştırma laboratuvarları için güçlü bir şekilde önerildiği ve klinik laboratuvarlar için zorunlu olduğu laboratuvar politikaları ve prosedürlerinde ele alınmalıdır1,7.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm yazarlar, herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan etmektedir.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

IGV yazılımının tüm geliştiricilerine ve IGV geliştirmesini halihazırda finanse eden NIH hibe desteğine ( U24CA258406) minnettarız. Bu çalışmanın geliştirilmesi için herhangi bir finansman alınmamıştır.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
BLATBLAT Genom Aramasıhttps://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlatBağımsız BLAT web sayfası. BLAT API, IGV içerisinde mevcuttur, ek bir kuruluma gerek yoktur
CNVKitGitHubhttps://github.com/etal/cnvkitCNVKit'in ücretsiz indirilebildiği genel GitHub deposu. CNVKit'in indirilmesi/çalıştırılmasına yönelik talimatlar da burada mevcuttur.
Vinyet #5 için karşılaştırıcı segment dosyası #1GitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/c1.segKopya Sayısı Dosyaları
Vinyet #5 için karşılaştırıcı segment dosyası #2GitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/c2.segKopya Sayısı Dosyaları
Vinyet #5 için karşılaştırıcı segment dosyası #3GitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/c4.segKopya Sayısı Dosyaları
Vinyet #5 için karşılaştırıcı segment dosyası #4GitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/c5.segKopya Sayısı Dosyaları
Vinyet #5 için karşılaştırıcı segment dosyası #5GitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/c6.segKopya Sayısı Dosyaları
Vinyet #5 için karşılaştırıcı segment dosyası #6GitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/c7.segKopya Sayısı Dosyaları
Vinyet #5 için karşılaştırıcı segment dosyası #7GitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/c8.segKopya Sayısı Dosyaları
Vinyet #5 için karşılaştırıcı segment dosyası #8GitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/c9.segKopya Sayısı Dosyaları
Vinyet #5 için karşılaştırıcı segment dosyasıGitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/c3.segKopya Sayısı Dosyaları
İnsan Genom Dizisiİnsan Genom Dizisihttps://hgdownload.soe.ucsc.edu/goldenPath/hg38/bigZips/latest/hg38.fa.gzHg38 insan genom sürümünü içeren indirilebilir fasta dosyası.  Bu, IGV içerisinde mevcuttur, ek bir indirmeye gerek yoktur
İnsan Genom Dizisiİnsan Genom Dizisihttps://hgdownload.soe.ucsc.edu/goldenPath/hg19/bigZips/latest/hg19.fa.gzHg19 insan genom sürümünü içeren indirilebilir fasta dosyası. Bu, IGV içerisinde mevcuttur, ek bir indirmeye gerek yoktur
IGV Yazılım paketiIGV Yazılımıhttps://data.broadinstitute.org/igv/projects/downloads/2.19/IGV_Win_2.19.7-WithJava-installer.exeJava (JDK 21) ile birlikte IGV yazılım versiyon 2.19.7, ücretsiz indirilebilir. Buradaki bağlantı Windows içindir; ancak Linux ve Mac için bağlantılar da mevcuttur.
Vinyet #5 vakası için segment dosyasıGitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/proband.segKopya Sayısı Dosyaları
Eğitim GitHub DeposuGitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/tree/mainAltı vinyeti yeniden oluşturmak için gerekli tüm dosyaların bulunduğu genel GitHub deposu
Vinyet #1GitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/KRAS.xmlOturum Dosyaları
Vinyet #1 Vaka A bai indeksiGitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/kras2A_fixed_backbone_
2A_new_final_sorted.bam.bai		Hizalama Dosyaları
Vinyet #1 Vaka A bam hizalama dosyasıGitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/kras2A_fixed_backbone_
2A_new_final_sorted.bam		Hizalama Dosyaları
Vinyet #1 Vaka B bai indeksiGitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/kras2B_fixed_backbone_
2B_new_final_sorted.bam.bai		Hizalama Dosyaları
Vinyet #1 Vaka B bam hizalama dosyasıGitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/kras2B_fixed_backbone_
2B_new_final_sorted.bam		Hizalama Dosyaları
Vinyet #2GitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/BRAF.xmlOturum Dosyaları
Vinyet #2  bai indeksiGitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/fig2C_braf_v600k_2bp_
backbone_2CD_new_final_sorted.bam.bai		Hizalama Dosyaları
Vinyet #2  bam hizalama dosyasıGitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/fig2C_braf_v600k_2bp_
backbone_2CD_new_final_sorted.bam		Hizalama Dosyaları
Vinyet #3GitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/KIT.xmlOturum Dosyaları
Vinyet #3 bai indeks dosyasıGitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/KITdupmod2.baiHizalama Dosyaları
Vinyet #3 bam hizalama dosyasıGitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/KITdupmod2.bamHizalama Dosyaları
Vinyet #4GitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/EGFR.xmlOturum Dosyaları
Vinyet #4 hizalama dosyasıGitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/EGFRE746_A750delmod.bamHizalama Dosyaları
Vinyet #4 bai indeksiGitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/EGFRE746_A750delmod.baiHizalama Dosyaları
Vinyet #5GitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/copynumber.xmlOturum Dosyaları
Vinyet #6GitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/egfr_vIII.xmlOturum Dosyaları
Vinyet #6 bai indeksiGitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/proband.baiHizalama Dosyaları
Vinyet #6 bam hizalama dosyasıGitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/proband.bamHizalama Dosyaları

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tjota MY, Segal JP, Wang P. Clinical utility and benefits of comprehensive genomic profiling in cancer. J Appl Lab Med. 2024;9(1):76-91.
  2. Freedman AN, et al. Use of next-generation sequencing tests to guide cancer treatment: results from a nationally representative survey of oncologists in the United States. JCO Precis Oncol. 2018;2:PO.18.00169.
  3. Ghoreyshi N, et al. Next-generation sequencing in cancer diagnosis and treatment: clinical applications and future directions. Discov Oncol. 2025;16:578.
  4. Aisner DL, et al. The Genomics Organization for Academic Laboratories (GOAL): A vision for a genomics future for academic pathology. Acad Pathol. 2023;10(3):100090.
  5. Robinson JT, Thorvaldsdóttir H, Wenger AM, Zehir A, Mesirov JP. Variant review with the Integrative Genomics Viewer (IGV). Cancer Res. 2017;77(21):e31-e34.
  6. Thorvaldsdóttir H, Robinson JT, Mesirov JP. Integrative Genomics Viewer (IGV): high-performance genomics data visualization and exploration. Brief Bioinform. 2013;14(2):178-192.
  7. Richards S, et al. Standards and guidelines for the interpretation of sequence variants: a joint consensus recommendation of the American College of Medical Genetics and Genomics and the Association for Molecular Pathology. Genet Med. 2015;17(5):405-424.
  8. Larson NB, Oberg AL, Adjei AA, Wang L. A clinician's guide to bioinformatics for next-generation sequencing. J Thorac Oncol. 2023;18(2):143-157.
  9. Jänne PA, et al. Adagrasib in non-small-cell lung cancer harboring a KRAS G12C mutation. N Engl J Med. 2022;387(2):120-131.
  10. Vandenberg BN, et al. Contributions of replicative and translesion DNA polymerases to mutagenic bypass of canonical and atypical UV photoproducts. Nat Commun. 2023;14(1):2576.
  11. Dunn T, Narayanasamy S. vcfdist: accurately benchmarking phased small variant calls in human genomes. Nat Commun. 2023;14(1):8149.
  12. Trent JC. Toward personalized, targeted therapy of gastrointestinal stromal tumor. Gastrointest Cancer Res. 2008;2(5):256-257.
  13. Xu CW, et al. Molecular characteristics and clinical outcomes of EGFR Exon 19 C-helix deletion in non-small cell lung cancer and response to EGFR TKIs. Transl Oncol. 2020;13(9):100791.
  14. Guille A, et al. A benchmarking study of individual somatic variant callers and voting-based ensembles for whole-exome sequencing. Brief Bioinform. 2024;26(1):bbae697.
  15. Cooke DP, Wedge DC, Lunter G. A unified haplotype-based method for accurate and comprehensive variant calling. Nat Biotechnol. 2021;39(7):885-892.
  16. Ezzati S, Salib S, Balasubramaniam M, Aboud O. Epidermal Growth Factor Receptor inhibitors in glioblastoma: current status and future possibilities. Int J Mol Sci. 2024;25(4):2316.
  17. Vivanco I, et al. Differential sensitivity of glioma- versus lung cancer-specific EGFR mutations to EGFR kinase inhibitors. Cancer Discov. 2012;2(5):458-471.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Yeni Nesil DizilemeDizileme Verisi G rselle tirmeGenomik Varyant TespitiSomatik Varyant AnaliziVCF Dosya FormatBAM Dosya FormatVaryant Allel Frekans
Video yakında

İlgili makaleler