Bu protokol, standart analizler (ALP aktivitesi, RANKL immünofloresansı [osteojenik] ve DMP-1 immünofloresansı [odontojenik]) ve çalışmalar arası karşılaştırılabilirliği sağlamak için normalizasyon stratejileri kullanarak, nanomalzeme iskeleler üzerinde kültüre edilen insan dental kök hücrelerinin proliferasyon kapasitesinin ve osteojenik ile odontojenik farklılaşmasının değerlendirilmesi için standartlaştırılmış ve tekrarlanabilir bir iş akışı sunmaktadır.
Yöntem makalesi
Nanomalzeme İskeleler Üzerinde İnsan Dental Pulpa Kök Hücresi Diferansiyasyonu ve Proliferasyonunun Değerlendirilmesi İçin Standartlaştırılmış Bir In Vitro Protokolü
Bu makalede
Özet
Özet
Osteojenik ve odontojenik diferansiyasyonun yanı sıra kök hücre proliferasyonunun güvenilir bir şekilde değerlendirilmesi, iskele tabanlı rejeneratif stratejilerin biyolojik performansının belirlenmesinde temeldir. Ancak, deneysel protokollerdeki, analiz seçimlerindeki ve veri yorumlamadaki değişkenlikler genellikle tekrarlanabilirliği ve çalışmalar arası karşılaştırmayı kısıtlamaktadır. Bu makalede açıklanan protokol, biyomalzeme iskeleler üzerinde kültüre edilen kök hücrelerin osteojenik ve odontojenik diferansiyasyonunun yanı sıra proliferatif kapasitelerinin in vitro değerlendirmesi için standartlaştırılmış ve tekrarlanabilir bir iş akışı sunmaktadır. Osteojenik farklılaşma, alkali fosfataz (ALP) enzimatik aktivitesi ve Nükleer Faktör κB Ligand Reseptör Aktivatörü (RANKL) immünofloresansı ile değerlendirilirken; odontojenik farklılaşma DMP-1 (dentin matriks proteini-1) immünofloresansı ile değerlendirilmektedir; her iki protein son noktası, standartlaştırılmış H-skor metodolojisi kullanılarak nicelendirilmektedir. Hücre ekim yoğunluğu, indüksiyon zaman çizelgeleri, analiz koşulları, normalizasyon stratejileri (proteinle normalize edilmiş ALP aktivitesi, hücreyle normalize edilmiş 3-(4,5-dimetiltiyazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolyum bromür (MTT) viyabilitesi ve immünofloresan H-skoru dahil) ve veri analizi yaklaşımları gibi kritik deneysel parametreler, teknik değişkenliği en aza indirmek için sorun giderme kılavuzuyla birlikte detaylandırılmıştır. Metodoloji, birden fazla iskele tabanlı deneysel çalışmada standartlaştırılmış bir çerçeve olarak uygulanmış, sağlamlık ve tekrarlanabilirlik göstermiştir. Bu makale, kapsamlı ve doğrulanmış bir çerçeve sunarak, kök hücre-iskele etkileşimlerinin standartlaştırılmış değerlendirmesini kolaylaştırmayı ve preklinik rejeneratif çalışmalar arasındaki karşılaştırılabilirliği artırmayı amaçlamaktadır.
Giriş
Rejeneratif endodonti, kök hücrelerin, büyüme faktörlerinin ve iskelelerin kullanımı yoluyla dental pulpa vitalitesinin restorasyonuna odaklanarak diş hekimliğinde bir paradigma değişimini temsil etmektedir1,2. Pulpa vitalitesinin korunması, duyusal fonksiyon ve bağışıklık yanıtı için temeldir ve özellikle nekrotik pulpaya sahip immatür dişlerin yönetiminde kök gelişiminin devam etmesini sağlamak için hayati önem taşır2.
İnsan dental pulpa kök hücreleri (DPSCs) ve apikal papilla kök hücreleri (SCAPs); yüksek proliferatif potansiyelleri, kendilerini yenileme kapasiteleri, immünosüpresif özellikleri ve uygun mikroçevresel koşullar altında odontoblast benzeri hücrelere farklılaşma yetenekleri nedeniyle bu prosedürler için birincil adaylardır; bu özellikler onları rejeneratif tıp ve hücre tabanlı terapötik müdahalelerdeki gelecekteki uygulamalar için oldukça uygun adaylar haline getirmektedir3,4,5.
Kalsiyum silikat bazlı simanlar gibi geleneksel olarak formüle edilmiş materyaller araştırılmış olsa da, güncel kanıtlar nanopartikül modifikasyonunun biyomateryal-hücre etkileşimlerini önemli ölçüde etkileyebileceğini göstermektedir6. Nanoyapılı biyomateryaller, daha biyomimetik bir mikroçevre sağlayarak kök hücre adezyonunu ve soy hattına özgü diferansiyasyonu potansiyel olarak artırabilir7. Bununla birlikte, nanopartikül formundaki NeoMTA2 gibi yeni materyallerin biyolojik davranışı, nanohidroksiapatit gibi yerleşik materyallerle karşılaştırıldığında yetersiz düzeyde anlaşılmıştır8. Bu protokol, söz konusu etkileşimleri doğru ve tekrarlanabilir bir şekilde değerlendirmek için standartlaştırılmış bir metodolojik çerçeveye olan ihtiyaca odaklanmaktadır.
Bu standartlaştırılmış çerçeve, özellikle çalışmalar arası karşılaştırılabilirliğin büyük önem taşıdığı, yeni biyomalzemelerin veya nanomalzeme iskelelerin özdeş biyolojik koşullar altında değerlendirildiği çalışmalara uygundur. Canlılık taramasını (MTT), erken osteojenik taahhüdü (ALP aktivitesi) ve protein düzeyindeki farklılaşmayı (immünofloresan H-skoru) tek bir iş akışında birleştirerek, tekli analiz yaklaşımlarına göre avantajlar sunar. Geleneksel alizarin red boyaması veya tek zaman noktalı analizler kullanan araştırmacılar, gözlemci yanlılığını azaltmak ve kantitatif çözünürlüğü artırmak için bu çok parametreli çerçeveyi benimsemekten fayda sağlayabilirler. Bununla birlikte, bu protokol; uygun adaptasyonlar yapılmaksızın üç boyutlu organoid kültürleri, ko-kültür sistemleri veya hayvan kaynaklı kök hücre modelleri için tasarlanmamıştır. Gen ekspresyon profillemesine (örneğin RUNX2, OCN veya DSPP için RT-qPCR) ihtiyaç duyan araştırmacılar, mevcut protokol yalnızca protein ve enzimatik son noktalarına odaklandığı için bu iş akışını moleküler analizlerle tamamlamalıdır.
Dental kök hücrelerin bifonksiyonel diferansiyasyon kapasitesini kapsamlı bir şekilde belirlemek için bu protokol, farklı biyolojik son noktaları yansıtan iki tamamlayıcı immünofloresan belirteç kullanmaktadır. RANKL (nükleer faktör kappa-B ligandı reseptör aktivatörü), osteojenik soy taahhüdünün bir belirteci olarak kullanılır: osteoblast benzeri hücrelerdeki ekspresyonu, SCAP'lerin değerlendirildiği çeşitli çalışmalarla uyumlu olarak, kalsiyum iyonu güdümlü mineralizasyon sinyallemesini ve kemik oluşturan hücre aktivasyonunu yansıtır4,8,9. DMP-1 (dentin matriks proteini-1) ise paralel olarak odontojenik/dentinojenik diferansiyasyonun spesifik bir belirteci olarak kullanılır: odontoblast benzeri hücrelerdeki artışı, dentin matriks oluşumunun indüksiyonunu ve pulpa spesifik sert doku onarımını yansıtır ve hedef hücre popülasyonu DPSC'ler olduğunda özellikle önem taşır10. H-skor metodolojisi kullanılarak aynı deneysel çerçevede hem RANKL hem de DMP-1'in miktarları belirlenerek bu protokol, araştırmacıların osteojenik taahhüdü odontojenik taahhütten ayırmasına olanak tanır; bu durum, ayrı deneysel tasarımlar gerektirmeden kök hücre-iskele etkileşimlerinin mekanistik olarak farklı ancak örtüşen iki sonucunu ortaya koyar.
Protokol
Bu protokol, Ain Shams Üniversitesi Diş Hekimliği Fakültesi Etik Kurulu tarafından FDASU-Rec IM112105 onay numarası ile onaylanmıştır. İnsan dokularını içeren tüm prosedürler Helsinki Deklarasyonu'na uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Diş çekimi ve kök hücre toplama işlemi öncesinde tüm katılımcılardan yazılı bilgilendirilmiş onam alınmıştır.
1. Nanomalzemelerin hazırlanması ve karakterizasyonu
- Nanomalzemeleri spesifik gereksinimlere göre sentezleyin10,11. Nano-NeoMTA2 için, tozu bir gezegenli bilyalı değirmen (bakınız Malzemeler Tablosu) kullanarak 350 rpm'de, 3 dakikalık açma/kapama aralıklarıyla 10 saat boyunca öğütün. Zirkonya öğütme kavanozunda zirkonya öğütme bilyoları (5 mm çap) ile 10:1 bilya-toz ağırlık oranı kullanın. İşleme devam etmeden önce final partikül boyutunu transmisyon elektron mikroskobu (TEM) ile doğrulayın (hedef: <200 nm).
UYARI: NeoMTA2 tozu solunduğunda solunum yolu irritasyonuna neden olabilir. Tüm kuru öğütme adımlarını, N95 respiratör, emniyet gözlükleri ve nitril eldiven giyerek onaylı bir çeker ocak içinde gerçekleştirin. - Islak kimyasal çöktürme yöntemi kullanarak nanohidroksiapatit hazırlayın8,11,12: 10Ca(NO₃)₂ + 6(NH₄)₃PO₄ + 8NH₄OH → Ca₁₀(PO₄)₆(OH)₂ + 20NH₄NO₃ + 6H₂O. Her ikisi de deiyonize su içerisinde olmak üzere 1 L 0.5 M kalsiyum nitrat çözeltisi ve 0.6 L 0.3 M amonyum fosfat çözeltisi hazırlayın. Kalsiyum nitrat çözeltisini, 400 rpm'de sürekli karıştırma altında yaklaşık 2–3 mL/dak hızla amonyum fosfat çözeltisine damlatın ve amonyum hidroksidin damla damla eklenmesiyle pH 10–12 değerini koruyarak 70 °C'ye ısıtın8.
UYARI: Amonyum hidroksit korozif özelliktedir ve toksik amonyak buharları salar. Yalnızca kimyasal çeker ocak içerisinde kullanın. Aside dayanıklı eldivenler, sıçrama gözlükleri ve laboratuvar önlüğü giyin. Cilt temasını derhal su ile ≥15 dak boyunca yıkayın. - Elde edilen apatit çökeleğini bir otoklavda 140 °C ve 0.3 MPa'da 2–3 saat boyunca hidrotermal işleme tabi tutun10. Saflaştırılmış çökeleği -50 °C'de, ≤0.05 mbar vakum altında 48 saat boyunca dondurarak kurutun8.
- Bioaktif cam 45S5 nanopartiküllerini sol-jel yöntemini kullanarak aşağıdaki şekilde hazırlayın.
- Öncül çözeltiyi, 40 mL tetraetil ortosilikatı (TEOS), asit katalizörü olarak 10 mL 2 M nitrik asit (HNO₃) ile oda sıcaklığında 300 rpm'de sürekli karıştırma altında bir polipropilen beherde karıştırarak hazırlayın.
- 30 dakika sonra, hedef molar kompozisyona ulaşmak için kalsiyum nitrat tetrahidrat (Ca(NO₃)₂·4H₂O) ve sodyum nitrat (NaNO₃) ekleyin: %45 mol SiO₂, %24.5 mol CaO, %24.5 mol Na₂O ve %6 mol P₂O₅. Fosfor öncülü olarak trietil fosfat (TEP) ekleyin.
- Oda sıcaklığında 24 saat boyunca karıştırın. Jeli kapalı bir kapta 60 °C'de 24 saat boyunca olgunlaştırın. 120 °C'de 24 saat boyunca kurutun. Bir kül fırınında 650 °C'de 3 saat boyunca kalsine edin (rampa hızı: 2 °C/dak). Öğütün ve faz kompozisyonunu TEM ve X-ışını kırınımı (XRD) ile doğrulayın4,9.
UYARI: TEOS ve etanol yanıcıdır. HNO₃ korozif özelliktedir. Tüm prosedürleri tutuşturma kaynaklarından uzakta, bir çeker ocak içinde gerçekleştirin.
- Partikül boyutunu ve kristalliği doğrulamak için hazırlanan tüm nanopartikülleri yüksek çözünürlüklü TEM ve XRD kullanarak karakterize edin8. Kolloidal stabiliteyi doğrulamak için dinamik ışık saçılması (DLS) kullanarak ortalama partikül boyutunu, polidispersite indeksini (PDI) ve zeta potansiyelini kaydedin. Ortalama partikül boyutu <200 nm ve zeta potansiyeli <−15 mV veya >+15 mV olan partileri kabul edin.
2. Kök hücre toplama ve kültürü
- Yazılı bilgilendirilmiş onam alındıktan sonra10, yeni çekilmiş gömülü mandibular üçüncü molar dişlerden DPSC'ler veya SCAP'ler toplayın. Çekilen dişleri çekimden sonraki 2 saat içinde işleyin ve 4 °C'de steril fosfat tamponlu salin (PBS) içinde taşıyın.
NOT: Donör uygunluk kriterleri; 18–35 yaş arası sistemik olarak sağlıklı yetişkinler, sigara içmeyenler, önceki 3 ay içinde antibiyotik kullanımı öyküsü olmayanlar, periodontal hastalığı olmayanlar ve radyografik olarak periapikal patoloji kanıtı bulunmayanları kapsar. - Enzim sindirme yöntemini kullanarak hücreleri izole edin9. Diş dokusunu 1–2 mm'lik parçalar halinde kıyın ve serumsuz Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) içinde 3 mg/mL konsantrasyonda kollajenaz tip I çözeltisi ile 37 °C'de, bir sallama platformu üzerinde 60 rpm'lik sürekli ajitasyonla 1 saat boyunca sindirin8. Tam kültür ortamı ile nötralize edin ve 70 µm'lik bir hücre süzgecinden geçirin.
DİKKAT: Kollajenaz tip I endotoksinler içerebilir. Yalnızca endotoksin testi yapılmış, doku kültürü sınıfı kollajenaz kullanın. Eldiven giyin ve solumaktan kaçının. - Tek hücre süspansiyonunu; DMEM, %10 fetal bovine serum (FBS) ve %1 penisilin/streptomisin içeren tam kültür ortamı ile 75 cm2 flasklara 1 × 104 hücre/cm2 başlangıç yoğunluğunda ekimleyin (Malzeme Tablosu)8.
- Flaskları %5 CO₂ atmosferinde 37 °C'de inkübe edin8. Büyümeyi ve kontaminasyonu her gün ters faz kontrast mikroskobu kullanarak izleyin10. Kültür ortamını her 48–72 saatte bir değiştirin. Kontaminasyon belirtileri (bulanıklık, renk değişimi, düzensiz hücre morfolojisi) gösteren flaskları imha edin.
- Yaklaşık %70–80 konfluens seviyesine ulaşıldığında, üçüncü pasajdan sonra hücreleri toplayın8. Pasajlama için ortamı aspire edin, PBS ile durulayın ve 37 °C'de 3–5 dakika boyunca %0,25 tripsin-EDTA kullanarak hücreleri ayırın. Tam kültür ortamı ile nötralize edin, 300 x g hızda 5 dakika santrifüjleyin ve 1 × 104 hücre/cm2 yoğunlukta yeniden ekimleyin. Fenotipik stabiliteyi korumak için yalnızca 3. pasaj ile 6. pasaj arasındaki hücreleri kullanın.
3. Kök hücre karakterizasyonu
- İzole edilen hücrelerin immünofenotipini akış sitometrisi kullanarak değerlendirin8,10. Hücreleri üçüncü pasajda karakterize edin. Boyanmamış bir negatif kontrol ve kullanılan her florokrom için tekli boyanmış kompanzasyon kontrolleri ekleyin.
- Hücre sayısını PBS içerisinde 106/mL olacak şekilde ayarlayın. 800 x g hızda 10 dk santrifüjleyin ve peleti iki kez PBS ile yıkayın8,10.
- Hücreleri, mezenkimal markerlar (CD44, CD73) ve hematopoetik markerlar (CD45) için anti-insan antikorları ile üretici tarafından önerilen dilüsyonlarda (genellikle %1 sığır serum albümini (BSA) içeren PBS içerisinde 1:100 (Malzeme Tablosu)) boyayın8,10. Karanlıkta 4 °C'de 45 dk inkübe edin. PBS ile iki kez yıkayın ve analiz için 300 µL PBS içerisinde yeniden süspande edin.
- İmmünofenotipi değerlendirmek için (hematopoetik dışlama markerı olarak CD45 ile birlikte CD44 ve CD73 ekspresyonu) akış sitometrisi analiz yazılımı (Malzeme Tablosu) kullanarak hücreleri analiz edin. Sırasıyla şu kapılama (gating) stratejilerini uygulayın: (a) saçılım kapılaması (FSC-A vs. SSC-A); (b) dublet dışlaması (FSC-H vs. FSC-A); (c) boyanmamış kontrollere göre ayarlanan florokroma özgü kapılar. Her bir marker için pozitif hücre yüzdesini, kapılama stratejisi ile birlikte raporlayın.
4. Güvenli materyal konsantrasyonunun belirlenmesi (yarı maksimal etkili konsantrasyon, EC₅₀)
- İstatistiksel analiz yazılımı (GraphPad Prism 9) kullanarak EC₅₀ değerini belirleyin. Doz-yanıt verilerini doğrusal olmayan regresyon sigmoidal eğrisine uydurun (dört parametreli lojistik model: Y = Bottom + (Top − Bottom) / (1 + 10^((LogEC₅₀ − X) × HillSlope))). EC₅₀ değerini %95 güven aralığı ile birlikte µg/mL cinsinden raporlayın8.
- Nanomalzemelerin seri dilüsyonlarını (50, 25, 12.5, 6.25, 3.12 ve 1.56 µg/mL) 1 mL PBS içinde hazırlayın. Stok süspansiyonu 30 s boyunca vorteksleyin, ardından homojen bir süspansiyon sağlamak için sonikasyona tabi tutun (prob sonikatör, 40 W, 4 °C'de 3 döngü boyunca 30 s açık/10 s kapalı). Biyogüvenlik kabininde UV ışığı altında 30 dk boyunca UV sterilizasyonu yapın.
- Kök hücreleri, çeşitli konsantrasyonlar ile 96 kuyucuklu plakalarda 1 × 104 hücre/kuyucuk yoğunluğunda 72 saat boyunca kültüre edin ve 4.1 adımında açıklanan dört parametreli lojistik modeli kullanarak EC₅₀'yi hesaplamak için Trypan blue ile canlı hücreleri sayın.
- Deneyleri, konsantrasyon başına en az üç biyolojik tekrarlı olarak üç paralel (n = 3 bağımsız kuyucuk) şeklinde gerçekleştirin. EC₅₀ değerlerini ortalama ± SD olarak raporlayın ve tekrarlar arasındaki varyasyon katsayısını (CV%) hesaplayın (kabul edilebilir CV <15%).
5. Osteojenik ve odontojenik farklılaşmanın değerlendirilmesi
NOT: Bu bölüm, aynı hücre hazırlığından alınan paralel immünofloresan analizleri kullanarak iki tamamlayıcı diferansiyasyon yolunu değerlendirir. RANKL (adım 5.5) osteojenik marker olarak; DMP-1 (adım 5.6) ise odontojenik marker olarak görev yapar. Her ikisi de aynı H-skoru metodolojisi (adım 5.8) ile nicelendirilir. Her iki analizi, eş zamanlı olarak hazırlanan ayrı lamlar üzerinde gerçekleştirin.
- Kök hücreleri, altı kuyucuklu plaklara kuyucuk başına 4,5 × 105 hücre yoğunluğunda ekiniz. Diferansiyasyonu başlatmadan önce hücrelerin tam kültür ortamında 24 sa boyunca tutunmasına izin veriniz.
- Numuneleri dört gruba ayırınız: negatif kontrol (yalnızca DMEM), pozitif kontrol (osteojenik/odontojenik diferansiyasyon ortamı) ve deney grupları (EC₅₀'den türetilmiş güvenli konsantrasyonlarda nanomalzemeler).
- DMEM'e %10 FBS, %1 penisilin/streptomisin, 10 mM β-gliserofosfat, 50 µg/mL askorbik asit (L-askorbat-2-fosfat) ve 100 nM dekzametazon ekleyerek osteojenik diferansiyasyon ortamı hazırlayınız. Ortamı her 48 saatte bir değiştiriniz. 37 °C ve %5 CO₂ ortamında 72 saat inkübe ediniz.
- ALP aktivitesinin ölçümü
- Hücreleri 24 kuyucuklu kültür plaklarına kuyucuk başına 1 × 104 hücre olacak şekilde ekiniz ve %5 CO₂ içeren nemlendirilmiş bir atmosferde 37 °C'de 72 saat inkübe ediniz.
- Kültür ortamını aspire ediniz, kuyucukları PBS ile durulayınız ve her kuyucuğa 200 µL lizis tamponu (PBS içinde %0,1 Triton X-100) ekleyip 4 °C'de 10 dakika boyunca hafifçe sallayarak inkübe ederek hücreleri liziz ediniz.
- Lizatı toplayınız ve 4 °C'de 5 dakika boyunca 500 x g hızda santrifüjleyiniz; tüm sonraki ALP ölçümleri için süpernatantı kullanınız. Her test numunesinden 50 µL ve p-nitrofenol standartlarından 100 µL'yi 96 kuyucuklu bir mikrotitrasyon plağına aktarınız. Katalitik reaksiyonu başlatmak için AMP substrat tamponu (Malzeme Tablosu) ekleyiniz.
- 37 °C'de 30 dakikalık ikincil inkübasyonun ardından, her kuyucuğa 50 µL 0,5 M NaOH ekleyerek reaksiyonu durdurunuz. Absorbansı anında 405 nm'de bir absorbans mikroplaka okuyucu (Malzeme Tablosu) kullanarak ölçünüz.
- Absorbansa karşı p-nitrofenol konsantrasyonu için bir standart eğri oluşturunuz ve ALP aktivitesini U/L cinsinden hesaplayınız.
- Aynı hücre lizatının toplam protein içeriğini bir Bradford veya BCA protein analizi kullanarak belirleyiniz. ALP aktivitesini toplam protein içeriğine normalize ediniz ve nihai sonuçları U/mg protein olarak raporlayınız.
- Osteojenik belirteç (RANKL)
- RANKL protein ekspresyonunu immünofloresan yöntemle değerlendiriniz. Öncelikle, izotip ve yalnızca ikincil antikor kontrollerini hazırlayınız: (a) primer antikoru aynı konsantrasyonda izotip-eşleşmiş tavşan IgG ile değiştiriniz ve (b) ayrı kuyucuklarda primer antikoru tamamen çıkarınız.
- Hücreleri PBS içinde taze hazırlanmış %4 formaldehit ile oda sıcaklığında 15 dakika sabitleyiniz. Üç kez PBS ile yıkayınız (her biri 5 dakika).
- PBS içinde %0,1 Triton X-100 ile 10 dakika permeabilize ediniz, ardından non-spesifik bağlanmayı azaltmak için PBS içinde %5 normal keçi serumu ile oda sıcaklığında 1 saat bloke ediniz. Yıkama yapmadan, bloklama tamponunda (Malzeme Tablosu) 1:200 dilüsyonda Tavşan Anti-RANKL primer antikorunu doğrudan ekleyiniz ve 4 °C'de gece boyunca inkübe ediniz.
- Üç kez PBS ile yıkayınız, ardından bloklama tamponunda (Malzeme Tablosu) 1:500 dilüsyonda Keçi Anti-Tavşan IgG florofor-konjuge ikincil antikor ile oda sıcaklığında karanlıkta 1 saat inkübe ediniz8. İkincil antikor inkübasyonundan sonra, üç kez PBS ile yıkayınız (her biri 5 dakika) ve montaj için doğrudan adım 5.7'ye geçiniz.
UYARI: Formaldehit (%4 çözelti) toksik bir sabitleyicidir ve muhtemel bir kanserojendir. Sadece sertifikalı bir kimyasal çeker ocak içerisinde hazırlayınız ve kullanınız. Nitril eldiven, koruyucu gözlük ve laboratuvar önlüğü giyiniz. Atıkları kurumsal yönergelere göre imha ediniz.
NOT. Hücre kimliği, immünofloresan skorlamadan önce faz kontrast mikroskopisi ve morfolojik kriterlerle doğrulanır (bkz. adım 5.10).
- Odontojenik belirteç (DMP-1)
NOT: Odontojenik taahhüdü değerlendirmek için DMP-1 (dentin matriks proteini-1) protein ekspresyonunu, adım 5.5 ile paralel olarak immünofloresan yöntemle değerlendiriniz.- Aynı hücre hazırlığından alınan ayrı bir lam örtü camı seti kullanarak; izotip ve yalnızca ikincil antikor kontrolleri dahil olmak üzere, adım 5.5'te açıklanan tüm sabitleme, permeabilizasyon ve bloklama adımlarını tekrarlayınız.
- Bloklamadan sonra yıkama yapmadan, bloklama tamponunda 1:200 dilüsyonda bir anti-DMP-1 primer antikoru (bkz. Malzeme Tablosu) doğrudan ekleyiniz ve 4 °C'de gece boyunca inkübe ediniz. Üç kez PBS ile yıkayınız, ardından bloklama tamponunda 1:500 dilüsyonda uygun florofor-konjuge ikincil antikor (RANKL için kullanılandan spektral olarak farklı bir florokrom kullanınız; bkz. Malzeme Tablosu) ile oda sıcaklığında karanlıkta 1 saat inkübe ediniz.
- Odontoblast benzeri diferansiyasyonun bir göstergesi olarak DMP-1 ekspresyonunu değerlendirmek için 10x büyütmede floresan görüntüler elde ediniz10. İkincil antikor inkübasyonundan sonra, üç kez PBS ile yıkayınız (her biri 5 dakika) ve montaj için doğrudan adım 5.7'ye geçiniz.
- Lamları antifade montaj medyumu (bkz. Malzeme Tablosu) ile kapatınız ve oda sıcaklığında gece boyunca sabitlenmeye bırakınız. RANKL ve DMP-1 boyalı lamları ayrı ayrı kapatınız ve görüntülemeden önce net bir şekilde etiketleyiniz (örneğin, "RANKL Grup 1" ve "DMP-1 Grup 1").
- Lamları hemen floresan mikroskopisi ile inceleyiniz veya ışık korumalı olarak 4 °C'de saklayınız. Boyama yoğunluğunu standartlaştırılmış dört aşamalı bir skorlama sistemi kullanarak değerlendirerek protein ekspresyonunu nicelendiriniz: 0 (boyanma yok), 1+ (zayıf), 2+ (orta) ve 3+ (güçlü).
- Tüm deney gruplarında aynı mikroskop ayarlarını (pozlama süresi, lazer gücü ve kazanç) kullanarak görüntüler elde ediniz. Gruplar arası belirteç içi tutarlılığı sağlamak için her bir belirteç (RANKL ve DMP-1) için bağımsız olarak aynı ayarları uygulayınız.
- Kuyucuk başına rastgele seçilmiş en az beş yüksek güç alanını (x20 objektif) skorlayınız. Skorlamayı iki bağımsız kör gözlemciye yaptırınız ve Cohen's kappa katsayısını raporlayınız (kabul edilebilir kappa ≥ 0,7).
- H-skorunu şu formül kullanarak hesaplayınız: H-skoru = Σ(i × Pi), burada i = boyama yoğunluğu (1, 2 veya 3) ve Pi = her yoğunluk seviyesindeki hücrelerin yüzdesi (%0–100).
NOT: H-skoru 0 ile 300 arasında değişir10. - Kuyucuklar arasındaki hücre yoğunluğu farklarını hesaba katmak için, H-skoru verilerini, immünofloresan görüntülemeden önce faz kontrast mikroskopisi altında her alandaki tüm görünür hücrelerin manuel sayımıyla belirlenen alan başına toplam hücre sayısına normalize ediniz.
- İki diferansiyasyon yolu arasında doğrudan karşılaştırma yapabilmek için RANKL (osteojenik son nokta) ve DMP-1 (odontojenik son nokta) için H-skorlarını ayrı ayrı hesaplayınız ve raporlayınız.
6. Proliferasyon ve viyabilite değerlendirmesi
- Canlı hücreleri canlı olmayanlardan ayırt etmek için hemositometre ve Trypan blue boyaması kullanarak hücre sayımı yapın. Kültürün mL başına düşen toplam canlı hücre sayısını hesaplayın. İstatistiksel güvenilirlik için örnek başına en az 100 hücreyi sayın.
- Mitokondriyal metabolik aktiviteyi ölçmek için MTT analizi gerçekleştirin8,10.
- Final konsantrasyonu 0,5 mg/mL olacak şekilde MTT çözeltisi ekleyin (Materyaller Tablosu) hücrelere ekleyin ve 4 saat boyunca şurada inkübe edin 37 °CÇözeltiyi uzaklaştırın, bir çözücü ajan ekleyin (örneğin, SDS-HCl; bakınız Materyaller Tablosu), ve bir spektrofotometre kullanarak 570 nm'de optik yoğunluğu ölçün (Referans dalga boyu: 630–650 nm).
- Hücre canlılığını şu şekilde hesaplayın: Canlılık (%) = (İşlem görmüş hücrelerin absorbansı / İşlem görmemiş kontrol hücrelerinin absorbansı) × 100. Değerler >%100, negatif kontrole kıyasla proliferatif stimülasyonu belirtir. Arka plan düzeltmesi için boş bir kuyucuk ekleyin.
- Paralel bir Trypan mavisi sayımı kullanarak sonuçları hücre sayısına göre normalize edin. Tüm analizleri üç tekrar şeklinde gerçekleştirin (n = grup başına 3 kuyucuk, ≥3 biyolojik replika).
DİKKAT: SDS-HCl çözündürme tamponu koroziftir. Uygun KKD ile kullanın. Formazan içeren atıkları kurumsal düzenlemelere uygun olarak bertaraf edin.
Sonuçlar
Burada sunulan tüm sonuçlar, aynı araştırma grubu tarafından ortak bir kurumsal etik onay (FDASU-Rec IM112105) kapsamında yürütülen tamamlayıcı çalışmalardan4,8,9,10 uyarlanmıştır.
Nanomalzeme karakterizasyonu ve kök hücre izolasyonu
Standardize edilmiş iş akışı, başlangıçta iskale özelliklerinin ve kök hücre fenotiplerinin ölçülebilir onayını sağlar. Sentezin ardından, hazırlanan nanomalzemeler, partikül boyutunu ve kristalliği doğrulamak için yüksek çözünürlüklü TEM ve XRD kullanılarak valide edilir (Şekil 1A,B). Eş zamanlı olarak, enzim sindirimi yoluyla izole edilen DPSC'ler veya SCAP'ler, tam kültür ortamında güçlü tutunma ve proliferasyon gösterir. Akış sitometrisi analizi, pasaj 3'teki toplanan hücrelerin immünofenotipini valide ederek mezenkimal belirteçlerin (CD44, CD43) yüksek ekspresyonunu ortaya koyar ve CD45'in yokluğu ile hematopoetik olmayan kökenlerini doğrular (Şekil 1C).
Güvenli materyal konsantrasyonunun ve proliferasyonun belirlenmesi
Nanomalzemelerin seri dilüsyonlarında (50–1.56 µg/mL) 72 saat boyunca, canlı hücre sayımlarının dört parametreli lojistik regresyonu güvenilir bir EC değeri sağlar₅₀ değer (adım 4.1'de açıklanan doğrusal olmayan sigmoidal doz-yanıt modeli). Değerler negatif kontrol grubuna (işlem görmemiş hücreler %100 olarak belirlenmiştir) göre normalize edildiğinden, %100'ü aşan MTT canlılık değerleri, işlem görmemiş kontrole kıyasla proliferatif stimülasyona işaret eder. Örneğin, Nano-NeoMTA2 için elde edilen ~%196'lık bir değer, mitochondrial aktivitenin biyoaktif stimülasyonunu yansıtır; bunun yerine >%100 mutlak hücre sağkalımı9.
Bu standart protokolün uygulandığı çeşitli çalışmalarda, dört parametreli lojistik model (adım 4.1) kullanılarak 7,9 µg/mL (Nano-NeoMTA2, SCAPs)8 ve 9,92 µg/mL (Nano-NeoMTA2, DPSCs)10 EC₅₀ değerleri belirlenmiş olup, bu protokolde açıklanan diferansiyasyon analizlerinde kullanım için güvenli çalışma konsantrasyonları onaylanmıştır. Bu değerler, temsili doğrulama metrikleri olarak Tablo 1'e dahil edilmiştir.
Osteojenik ve odontojenik diferansiyasyonun kantifikasyonu (çift belirteç değerlendirmesi)
Çift immunofloresans yaklaşımı, aynı hücre preparatından iki farklı ve tamamlayıcı sonuç ölçümü sağlar. Osteojenik değerlendirme için, RANKL H-skorları dört grubun tamamını istatistiksel olarak anlamlı şekilde birbirinden ayırmıştır: Nano-NeoMTA2 ile kültüre edilen hücreler, artmış osteoblast benzeri aktivasyonla uyumlu olarak, negatif kontrole göre önemli ölçüde daha yüksek RANKL ekspresyonu göstermiştir (Şekil 2A, Tablo 1)8,9. Odontojenik değerlendirme için, DMP-1 H-skorları, Nano-NeoMTA2 ile kültüre edilen DPSC'lerde güçlü bir odontoblast benzeri diferansiyasyon ortaya koymuştur; H-skorlarının nanohidroksiapatit ve negatif kontrol gruplarındakinden anlamlı derecede yüksek olması, tercihen dentinojenik taahhüdü doğrulamıştır (Şekil 3A, Tablo 1)10. Hücre kimliği, skorlama öncesinde faz kontrast mikroskopisi ve karakteristik morfolojik kriterler (iğ şeklinde veya poligonal morfoloji) ile doğrulanmıştır.
ALP aktivitesi, hem osteojenik hem de odontojenik farklılaşmanın erken enzimatik bir belirteci olarak, tüm gruplar arasında 405 nm'de spektrofotometrik olarak ayırt edilmiştir (Tablo 1). Spektrofotometrik MTT analizi, EC₅₀'den türetilen güvenli konsantrasyonlardaki tüm nanomalzemelerin, sunulan temsili değerlerle uyumlu olarak, negatif kontrole kıyasla yüksek hücre canlılığını koruduğunu doğrulamıştır (Tablo 1).
Optimal olmayan ve başarısız deneysel sonuçlar
Optimal olmayan sonuçlar Tablo 2'de özetlenmiştir. MTT analizindeki düşük hücre canlılığı, genellikle nanomalzeme konsantrasyonunun EC₅₀ eşiğini aştığını veya UV sterilizasyonunun yetersiz olduğunu gösterir. Tutarsız ALP absorbansı (CV > 20%), genellikle düzensiz ekim yoğunluğuna veya lizis tamponunun eksik homojenizasyonuna işaret eder. RANKL veya DMP-1 için zayıf veya mevcut olmayan immunofloresans sinyali, çoğunlukla antikor inaktivasyonu, yetersiz permeabilizasyon veya aşırı fiksasyondan kaynaklanır; taze %4 formaldehit ve tek kullanımlık antikor alikotları bu sorunu çözer. RANKL ve DMP-1 kanalları arasındaki çapraz reaktivite, skorlama öncesinde yalnızca sekonder antikor içeren kontrol görüntüleri incelenerek dışlanmalıdır.
Şekil 1: Nanomalzemelerin standart karakterizasyonu ve kök hücre fenotipinin doğrulanması. (A) Nanopartiküllerin kristal fazını ve yapısal bütünlüğünü doğrulayan XRD spektrumları. (B) Sentezlenen biyomalzemelerin nano ölçekteki partikül boyutunu, morfolojisini ve homojen dağılımını gösteren temsili TEM görüntüleri; NeoMTA2 ve hidroksiapatit karşılaştırması. (a) NeoMTA2 ve (b) hidroksiapatit için düşük büyütmeli görünümler, (c) NeoMTA2 ve (d) hidroksiapatit için ise yüksek büyütmeli detaylar gösterilmiştir. Ölçek çubukları sol alt köşede belirtilmiştir. (C) Kök hücre karakterizasyonu için akış sitometrik kapılama protokolü. Temsili çok parametreli nokta grafikleri, CD44, CD73 (orijinal grafiklerde CD43 PE olarak etiketlenmiştir) ve CD45 için boyanmış hücreleri göstermektedir. CD44+ ve CD73+ alt popülasyonları, CD45 ekspresyonuna göre kapılanmıştır. Panel A ve C, Zaki ve ark.8 (CC BY-NC-SA) ve Panel B, Habib ve ark.10 (CC BY-NC) çalışmalarından uyarlanmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: RANKL immünofloresansı yoluyla osteojenik diferansiyasyonun kantitatif ve yarı-kantitatif değerlendirmesi. (A) 2D iskele mikroçevresi içindeki kritik osteojenik protein belirteçleri RANKL'nin ekspresyonunu yakalayan temsili yüksek çözünürlüklü immünofloresans mikrografları; (a) Negatif kontrol hücreleri zayıf, membranöz RANKL ekspresyonuyla küçük koloniler oluştururken, (b) pozitif kontrol hücreleri yoğun, homojen ekspresyona sahip artmış sayıda osteoblast benzeri koloni göstermektedir. (c) NHAP, (d) NHAP/kitosan ve (e) biyoaktif cam nanoparçacıkları ile tedavi edilen kök hücreler, hem membranda hem de çekirdekte yoğun, homojen RANKL lokalizasyonu ile karakterize büyük, birleşmiş osteoblast benzeri kolonilerle gelişmiş diferansiyasyon sergilemektedir; şuradan uyarlanmıştır: Elshahat et al.4. (B) Farklı çalışmalar genelindeki RANKL ekspresyonunun H-skoru kantifikasyonunu temsil eden sütun grafikleri. İmmünofloresans verilerinin normalleştirilmesi için H-skoru metodolojisinin uygulanması. Görsel boyama yoğunluğunun (0–3 arası derecelendirilmiş) pozitif boyanmış hücrelerin yüzdesiyle matematiksel olarak entegre edilmesiyle H-skoru, kalitatif mikroskobiyi sağlam, yarı-kantitatif bir metriğe dönüştürerek subjektif gözlemci yanlılığını önemli ölçüde azaltır. (a) Nano-NeoMTA2 (7.9 µg/mL) ve biyoaktif cam nanoparçacıklarının (NBG; 500 µg/mL), osteojenik ortam pozitif kontrolü (OM-PC) ve DMEM negatif kontrolüne (DMEM-NC) karşı karşılaştırılması. NBG en yüksek ekspresyon profilini tetiklemiştir (p < 0.001). Abdelaziz et al. 9'dan uyarlanmıştır (CC BY-NC-ND 4.0). (b) Nanohidroksiapatit (NHAP; 10µg/mL), NHAP/Kitosan kompoziti (10 µg/mL) ve NBG'nin (500 µg/mL) kontrollere göre değerlendirilmesi; NHAP/Kitosan en yüksek H-skorlarını sergilemektedir. Elshahat et al.4 (CC BY 4.0)'dan uyarlanmıştır. (c) Nano-NeoMTA2'nin (7.9 µg/mL), NHAP (10 µg/mL) ve kontrollere karşı değerlendirilmesi, Nano-NeoMTA'da önemli ölçüde yükselmiş RANKL ekspresyonunu kanıtlamaktadır; şuradan uyarlanmıştır: Zaki et al.8. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Temsili İmmünofloresan Görüntüler ve H-Skoru Analizi. (A) Deneysel gruplarda Dentin Matris Proteini (DMP-1) ekspresyonunun immünofloresan mikroskopi ile değerlendirilmesi; Yeşil floresan, poliklonal anti-DMP-1 antikorları için pozitif boyanmayı belirtir. (a) Negatif Kontrol: Farklılaşmamış ortamdaki (UM) insan dental pulpa kök hücreleri (hDPSCs), sönük ve uniform DMP-1 ekspresyonu (+) gösteren küçük hücre agregaları sergilemektedir. (b) Pozitif Kontrol: Odontojenik ortamdaki (OM) hDPSCs, yoğun ve homojen DMP-1 sinyalleri (++) ile işaretlenmiş koloni genişlemesi göstermektedir. (c) Nanohidroksiapatait (10 μg/mL) ve (d) Nano-NeoMTA2 (9.92 μg/mL): Farklılaşmış hDPSCs, membran ve çekirdeklere lokalize, güçlü ve homojen DMP-1 ekspresyonu sergileyen odontoblast benzeri hücrelerden oluşan büyük, birleşmiş koloniler oluşturmaktadır. Büyütme: ×10. Sarı daireler odontoblast benzeri kolonileri; sarı oklar yoğun DMP-1 ekspresyonunu belirtmektedir. (B) Çalışma grupları genelinde Dentin Matris Proteini ekspresyonunun H-skoru kantifikasyonunu temsil eden sütun grafiği. Değerlendirme grupları arasında oldukça anlamlı bir fark gözlemlenmiş olup, en yüksek H-skoru Nano-NeoMTA2 kohortunda (169.33 ± 4.04), ardından nanohidroksiapatait (140.33 ± 2.52) ve negatif kontrolde (15.33 ± 1.53) görülmüştür. A ve B panelleri Habib ve ark.10 (CC BY-NC) çalışmasından uyarlanmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Analiz / Parametre | Nanomalzeme / Hücre Tipi | Temsili Değer (Ortalama ± SD) | Normalizasyon | Kaynak |
| Hücre Canlılığı (MTT Analizi) | ||||
| MTT Canlılığı | Nano-NeoMTA2 (7.9 µg/mL) / SCAPs | ~196% (OD = 1.56 ± 0.24) | İşlem görmemiş kontrole göre normalize edilmiştir (DMEM-NC = 100%) | Abdelaziz et al.⁹ |
| MTT Canlılığı | Chitosan-nHA (10 µg/mL) / SCAPs | ~99.97% | İşlem görmemiş kontrole göre normalize edilmiştir (DMEM-NC = 100%) | Elshahat et al.⁴ |
| MTT Canlılığı — Pozitif Kontrol | OM-PC / SCAPs | 113.46% (OD = 0.93 ± 0.03) | İşlem görmemiş kontrole göre normalize edilmiştir (DMEM-NC = 100%) | Abdelaziz et al.⁹ |
| MTT Canlılığı — Negatif Kontrol | DMEM-NC / SCAPs | 100% (OD = 0.82 ± 0.02) — Referans baz çizgisi | DMEM-NC, tüm gruplar için %100 referans olarak tanımlanmıştır | Abdelaziz et al.⁹ |
| Alkalen Fosfataz (ALP) Aktivitesi | ||||
| ALP Aktivitesi | Bioactive Glass Nanoparticles (500 µg/mL) / SCAPs | 69.86 ± 0.98 U/L | Toplam protein içeriğine normalize edilmiştir (U/mg protein, Bradford/BCA analizi) | Abdelaziz et al.⁹ |
| ALP Aktivitesi — Pozitif Kontrol | OM-PC / SCAPs | 77.68 ± 1.28 U/L | Toplam protein içeriğine normalize edilmiştir (U/mg protein, Bradford/BCA analizi) | Abdelaziz et al.⁹ |
| ALP Aktivitesi — Negatif Kontrol | DMEM-NC / SCAPs | 55.81 ± 1.6 U/L | Toplam protein içeriğine normalize edilmiştir (U/mg protein, Bradford/BCA analizi) | Abdelaziz et al.⁹ |
| Güvenli Malzeme Konsantrasyonu (EC₅₀) | ||||
| EC₅₀ (SCAPs) | Nano-NeoMTA2 / SCAPs | 7.9 µg/mL | Dört parametreli lojistik model (doğrusal olmayan sigmoidal doz-yanıt, GraphPad Prism 9) | Zaki et al.⁸ |
| EC₅₀ (DPSCs) | Nano-NeoMTA2 / DPSCs | 9.92 µg/mL | Dört parametreli lojistik model (doğrusal olmayan sigmoidal doz-yanıt, GraphPad Prism 9) | Habib et al.10 |
| H-Skoru — RANKL Protein Ekspresyonu (Osteojenik Markör) | ||||
| H-Skoru (RANKL) Osteojenik markör | Nano-NeoMTA2 (7.9 µg/mL) / SCAPs | 164 ± 4 (ölçek 0–300) | Alan başına toplam görünür hücre sayısı (faz kontrast mikroskopisi) | Zaki et al.⁸ |
| H-Skoru (RANKL) Osteojenik markör | nHA (10 µg/mL) / SCAPs | 68 ± 3 (ölçek 0–300) | Alan başına toplam görünür hücre sayısı (faz kontrast mikroskopisi) | Zaki et al.⁸ |
| H-Skoru (RANKL) Pozitif Kontrol | OM-PC / SCAPs | 84 ± 1 (ölçek 0–300) | Alan başına toplam görünür hücre sayısı (faz kontrast mikroskopisi) | Zaki et al.⁸ |
| H-Skoru (RANKL) Negatif Kontrol | DMEM-NC / SCAPs | 18 ± 1 (ölçek 0–300) | Alan başına toplam görünür hücre sayısı (faz kontrast mikroskopisi) | Zaki et al.⁸ |
| H-Skoru — DMP-1 Protein Ekspresyonu (Odontojenik Markör) | ||||
| H-Skoru (DMP-1) Odontojenik markör | Nano-NeoMTA2 (9.92 µg/mL) / DPSCs | 169.33 ± 4.04 (ölçek 0–300) | Alan başına toplam görünür hücre sayısı (faz kontrast mikroskopisi) | Habib et al.10 |
| H-Skoru (DMP-1) Odontojenik markör | nHA (10 µg/mL) / DPSCs | 140.33 ± 2.52 (ölçek 0–300) | Alan başına toplam görünür hücre sayısı (faz kontrast mikroskopisi) | Habib et al.10 |
| H-Skoru (DMP-1) Negatif Kontrol | DMEM-NC / DPSCs | 15.33 ± 1.53 (ölçek 0–300) | Alan başına toplam görünür hücre sayısı (faz kontrast mikroskopisi) | Habib et al.10 |
| H-skoru (DMP-1) Odontojenik markör [Pozitif Kontrol -OM-PC] | OM-PC / DPSCs | ~103 H-skoru (ölçek 0–300) | Alan başına toplam hücre sayısı (faz kontrast mikroskopisi) | Habib et al. Eur Endod J, 202610 |
| H-skoru = Σ(i × Pi): i = boyama yoğunluğu (1, 2 veya 3); Pi = her yoğunluk seviyesindeki hücrelerin yüzdesi (0–100%); aralık 0–300. MTT canlılığı, %100 referans olarak belirlenen DMEM-NC'ye göre ifade edilmiştir. ALP aktivitesi, p-nitrofenil fosfatın enzimatik defosforilasyonundan kaynaklanan U/L olarak ifade edilmiş; ayrıca toplam protein içeriğine (U/mg protein) normalize edilmiştir. OM-PC = osteojenik/odontojenik indüksiyon medyumu (pozitif kontrol). DMEM-NC = Dulbecco’s Modified Eagle Medium (negatif kontrol). | ||||
Tablo 1: Standardize edilmiş in vitro değerlendirme iş akışından temsili sonuçlar.Standardize protokol kullanılarak gerçekleştirilen hücre proliferasyonu, alkali fosfataz aktivitesi ve immünofloresan analizlerini gösteren, daha önce yayınlanmış çalışmalardan elde edilen temsili kantitatif sonuçlar.
| Gözlemlenen sorun | Potansiyel neden | Önerilen çözüm |
| MTT analizinde düşük hücre canlılığı (OD < işlem görmemiş kontrol) | Nanomalzeme konsantrasyonunun EC₅₀ değerini aşması, yetersiz UV sterilizasyonu veya yetersiz nanoparçacık dispersiyonu. | EC₅₀ belirlemesini tekrarlayın (Bölüm 4). UV sterilizasyon süresini 30 dk'ya çıkarın. Kullanımdan hemen önce prob sonikasyonla (40 W, 30 sn açık/kapalı, 4 °C'de 3 döngü) homojen nanoparçacık süspansiyonunu doğrulayın. |
| Tekrarlar arasında MTT canlılığı CV >15% | Pipetleme hatası, dengesiz hücre ekimi veya değişken MTT inkübasyon süresi/sıcaklığı. | Tüm eklemeler için kalibre edilmiş çok kanallı bir pipet kullanın. Plakaya ekimden önce hemositometre ile ekim yoğunluğunu onaylayın. Nemlendirilmiş bir CO₂ inkübatöründe 37 °C'de kesin olarak 4 sa. inkübasyon sağlayın. Arka plan düzeltmesi için boş bir kuyu ekleyin. |
| Tutarsız ALP absorbans okumaları (kuyuklar arasında CV >20%) | Dengesiz hücre ekim yoğunluğu, eksik hücre lizisi veya substrat eklemesi sırasında pipetleme tutarsızlığı. | 24 kuyulu plakalarda kuyuk başına 1 × 10⁴ hücre kuralına kesin olarak uyun. Lizis tamponunu kullanmadan önce iyice vorteksleyin. Tutarlı lizis inkübasyonu sağlayın (10 dk, 4 °C, hafif sallama). Hücresiz boş bir kuyu ile arka plan absorbansını kontrol edin. |
| Zayıf veya mevcut olmayan RANKL immünofloresans sinyali (adım 5.4a) | Uygunsuz saklama nedeniyle antikor inaktivasyonu, epitop erişilebilirliğini azaltan aşırı fiksasyon veya yetersiz permeabilizasyon. | Kullanımdan hemen önce taze %4 formaldehit hazırlayın. Bloklamadan önce %0,1 Triton X-100 permeabilizasyonu ekleyin (10 dk, RT). Birincil antikor dilüsyonunu titre edin (1:200 ile başlayın). Pozitif kontrol doku kesiti ekleyin. Tekrarlanan dondurma-çözme döngülerini önlemek için antikor stoklarını alikotlayın. |
| Zayıf veya mevcut olmayan DMP-1 immünofloresans sinyali (adım 5.4b) | Dondurma-çözme döngüleri nedeniyle antikor inaktivasyonu, suboptimal birincil antikor dilüsyonu veya uyumsuz ikincil antikor konakçı türü. | Dondurma-çözme döngülerini önlemek için anti-DMP-1 antikorunu alikotlayın. 1:200'den başlayarak dilüsyonu titre edin. Birincil (DMP-1) ve ikincil antikor arasındaki konakçı türü uyumluluğunu onaylayın. DMP-1 için pozitif kontrol olarak bir dentin doku kesiti ekleyin. |
| RANKL ve DMP-1 floresans kanalları arasında çapraz reaktivite | Her iki ikincil antikor için aynı florokrom kullanıldığında emisyon spektrumlarındaki spektral örtüşme veya floresans mikroskobunda yetersiz kanal ayrımı. | RANKL ve DMP-1 için spektral olarak farklı ikincil antikor florokromları kullanın (örneğin, bir belirteç için Alexa Fluor 488, diğeri için Alexa Fluor 594). Puanlamadan önce her kanal için yalnızca ikincil antikor içeren kontrol görüntülerini bağımsız olarak inceleyin. Ardışık kazanım modunu kullanarak RANKL ve DMP-1 görüntülerini ayrı ayrı edinin. |
| İmmünofloresans boyamasında yüksek spesifik olmayan arka plan | Yetersiz protein bloklama, çok yüksek ikincil antikor konsantrasyonu veya inkübasyonlar arasında yetersiz yıkama adımları. | Bloklama inkübasyonunu RT'de 2 sa.ye uzatın. İkincil antikor dilüsyonunu 1:1000'e artırın. Özgüllüğü yalnızca ikincil antikor içeren kontrolle (birincil antikor yok) doğrulayın. Tüm PBS yıkamalarının tamamlandığından emin olun (her biri 3 × 5 dk). |
| H-skoru gözlemciler arası değişkenlik (Cohen's kappa <0,7, adım 5.6) | Gözlemciler arasında dört aşamalı boyama yoğunluğu ölçeğinin (0, 1+, 2+, 3+) tutarsız uygulanması veya puanlama oturumlarından önce yetersiz kalibrasyon. | Resmi puanlamadan önce temsili eğitim görüntülerini kullanarak ortak bir kalibrasyon oturumu gerçekleştirin. Tüm gözlemciler için aynı görüntü görüntüleme ayarlarını (parlaklık, kontrast) kullanın. Kuyu başına en az beş yüksek büyütmeli alan puanlayın ve sapmayı izlemek için her 10 alandan sonra kappa değerini hesaplayın. |
| EC₅₀ eğrisi yakınsamıyor veya uyum zayıf (adım 4.1) | Yetersiz veri noktaları, dar konsantrasyon aralığı veya ekimden önce homojen süspansiyonun sağlanamaması. | Seri dilüsyon aralığını 50–1,56 µg/mL arasını kapsayan en az 6 konsantrasyon içerecek şekilde genişletin. Her dilüsyon adımından hemen önce prob sonikasyonunun yapıldığından emin olun. En az 3 bağımsız biyolojik tekrarla tekrarlayın. Tekrarlar arasında CV <15% olduğunu doğrulayın. |
Tablo 2: Kritik parametreler ve sorun giderme kılavuzu. Protokol sırasında karşılaşılan yaygın teknik sorunlar, bunların potansiyel nedenleri ve deneysel tekrarlanabilirliği ile veri kalitesini artırmak için önerilen çözümler. Kısaltmalar: CV = varyasyon katsayısı; RT = oda sıcaklığı.
Tartışma
Bu protokoldeki kritik adımlar arasında doğru EC₅₀ tayini, homojen nanomalzeme süspansiyonu ve biyolojik assay çıktılarının normalizasyonu yer almaktadır. Non-lineer regresyon (dört parametreli lojistik model) yoluyla yapılan EC₅₀ hesaplaması, lineer interpolasyona göre daha kesin bir doz-yanıt tahmini sağlar ve yeterli veri noktası mevcut olduğunda tercih edilmelidir13,14. Hücre maruziyeti hemen öncesinde prob sonikasyonu ile homojen bir nanoparçacık süspansiyonu sağlanması kritiktir; yetersiz dağılmış süspansiyonlar güvenilmez doz-yanıt eğrileri oluşturur ve EC₅₀ tahminlerini yanıltır. NeoMTA2 gibi yeni malzemeler için, dökme parçacık boyutu yüzey reaktivitesini ve ardından gelen biyobiyaktiviteyi önemli ölçüde değiştirdiğinden, nanölçekte öğütme temel bir ilk adımdır13,14. Güvenli olması beklenen konsantrasyonlarda düşük hücre canlılığı gözlemlenirse, araştırmacılar EC₅₀ assay'ini tekrarlamadan önce UV sterilizasyon protokolünü doğrulamalı, öğütme ve dağıtma prosedürlerini yeniden incelemelidir10.
Bu protokolün temel taşı, farklı ancak örtüşen farklılaşma yollarını yansıtan iki tamamlayıcı immünofloresan belirtecin kullanılmasıdır. Osteoblast benzeri hücrelerde RANKL artışı, kalsiyum iyonu güdümlü osteojenik sinyallemeyi yansıtır ve osteojenik hücrelerin sayısıyla orantılıdır8,9; DMP-1 ekspresyonu ise odontoblast benzeri farklılaşmanın ve dentinojenik aktivitenin spesifik bir göstergesi olarak hizmet eder, bu da hedef hücre popülasyonu DPSC'ler olduğunda onu özellikle anlamlı kılar10. Her iki belirtecin H-skor metodolojisi kullanılarak nicelleştirilmesiyle bu protokol, araştırmacıların tek bir standart analiz sistemi içinde osteojenik ve odontojenik soy taahhüdünü ayırt etmelerine olanak tanır; bu, kemik oluşturucu ve dentin oluşturucu taahhüdü ayırt edemeyen tek belirteçli yaklaşımlara göre bir ilerlemedir. Çalışmalar arası karşılaştırılabilirliği korumak için bu protokolü kullanan tüm yayınlarda hem RANKL hem de DMP-1 H-skorları bildirilmelidir. Araştırmacılar, kanal örtüşmesini önlemek için iki sekonder antikor için spektral olarak farklı florokromlar kullanmalı ve skorlama öncesinde yalnızca sekonder antikor içeren kontrol görüntülerini incelemelidir.
Bu protokolün alternatif biyomalzemelere veya hücre modellerine uyarlanması sırasında çeşitli metodolojik modifikasyonlar gerekebilir. Çok opak veya renkli iskeleler için, 570 nm'deki MTT absorbansına yönelik girişimler, iskele malzemelerinden kaynaklanan optik girişimlere karşı daha az duyarlı olan CellTiter-Glo (lüminesans) veya PrestoBlue (rezazurin indirgenmesi) gibi alternatif bir canlılık analizini gerektirebilir. DPSC'ler yerine SCAP'ler kullanan araştırmacılar, SCAP'lerin daha yüksek osteojenik taahhütlerini yansıtan daha güçlü bir RANKL ekspresyonu gösterme eğiliminde olduğunu, DPSC'lerin ise daha güçlü odontojenik/dentinojenik soy yanlılıklarını yansıtan daha belirgin bir DMP-1 ekspresyonu sergilediğini not etmelidir. Pasaj sayısı kritik bir değişkendir: pasaj 6'yı geçmiş hücreler, azalmış diferansiyasyon kapasitesi ve değişmiş yüzey markörü ekspresyonu sergileyebilecekleri için tercih edilmemelidir.
Bu metodolojik çerçevenin kısıtlamaları arasında, genellikle 14–21 gün gerektiren geç evre mineralizasyon olaylarını yakalayamayabilecek kısa süreli bir değerlendirme penceresi (72 h) yer almaktadır. In vivo doğrulamanın eksikliği, önemli bir translasyonel boşluğu temsil etmektedir. H-skoru kullanımı potansiyel gözlemci değişkenliği oluşturmaktadır; Bölüm 5.10'da bildirilen gözlemciler arası güvenilirlik (Cohen's kappa), yayınlanan tüm sonuçlara dahil edilmelidir.
Bu çerçeve, mevcut tek uç noktalı yaklaşımlara kıyasla çeşitli avantajlar sunmaktadır. Geleneksel osteojenik analizler sıklıkla yalnızca alizarin red boyamasına veya tek bir zaman noktasındaki ALP aktivitesine dayanır. MTT canlılık taraması, ALP aktivitesi kantifikasyonu ve tek bir iş akışı içinde çift RANKL + DMP-1 immünofloresan H-skorlamasının entegrasyonu, aynı deneysel koşullar altında farklı iskele türleri arasında doğrudan istatistiksel karşılaştırmaya olanak tanıyan çok parametreli bir çıktı sağlar. Açıklanan normalizasyon stratejileri (protein mg başına ifade edilen ALP aktivitesi, tedavi edilmemiş kontrole göre yüzde olarak MTT sonuçları ve alan başına toplam hücre sayısına göre normalize edilen H-skoru), kuyucuklar arası değişkenlikten kaynaklanan karıştırıcı faktörleri ortadan kaldırır4,8.
Gelecekteki çalışmalar, biyomalzemelerin inflamatuar markerlar, anjiyojenik yanıtlar veya alternatif kök hücre modelleri üzerindeki etkilerini değerlendirmek için bu metodolojiyi uygulayabilir. Analiz dizisi, 3D iskele formatlarına da uyarlanabilirdir. Nihayetinde, bu standartlaştırılmış çerçevenin bağımsız laboratuvarlar genelinde benimsenmesi, preklinik rejeneratif diş hekimliği araştırmalarında iskele performansının anlamlı meta-analitik karşılaştırmalarını kolaylaştıracaktır15.
Açıklamalar
Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 24 kuyucuklu kültür plakaları | Corning | 3527 | ALP analizleri için kullanılır |
| 96 kuyucuklu plakalar | Corning | 3596 | ALP absorbans okumaları ve MTT analizleri için kullanılır |
| ALP analiz kiti | Abcam | ab83369 (veya eşdeğeri) | Alkalin fosfataz aktivitesini ölçmek için kullanılır |
| ALP substrat tamponu (2-amino-2-metil-1-propanol) | Sigma-Aldrich | N/A | ALP katalitik reaksiyonunu başlatmak için kullanılır |
| Amonyum hidroksit (NH4OH) | N/A | N/A | Nanohidroksiapatit sentezi sırasında pH ayarı için kullanılır. KOROZİF |
| Anti-DMP-1 primer antikor | N/A | N/A | Odontojenik belirteç; bloklama tamponunda 1:200 dilüsyon; 4 °C'de gece boyunca |
| Anti-human CD44 antikoru (CD44-FITC) | Beckman Coulter | N/A | Akış sitometrisi için kullanılır; mezenkimal kök hücre pozitif belirteci |
| Anti-human CD45 antikoru (CD45-PC5) | Beckman Coulter | N/A | Akış sitometrisi için kullanılır; hematopoetik soy negatif belirteci |
| Anti-human CD73 antikoru (CD73-PE) | Beckman Coulter | N/A | Akış sitometrisi için kullanılır; mezenkimal kök hücre pozitif belirteci |
| Otoklav (hidrotermal reaktör) | Tuttnauer | N/A | Nanohidroksiapatitin 140 °C, 0.3 MPa'da hidrotermal işlemi için kullanılır |
| BCA Protein Analiz Kiti | Thermo Fisher Scientific | 23225 (veya eşdeğeri) | ALP aktivitesinin normalizasyonu için toplam protein konsantrasyonunu belirlemek amacıyla kullanılır |
| CO2 inkübatörü | Thermo Fisher Scientific | N/A | Tüm hücre kültürü adımları için 37 °C ve %5 CO2 değerine ayarlanmıştır |
| Kollagenaz Tip I | Sigma-Aldrich | C0130 | Kök hücre izolasyonu sırasında diş dokularının enzimatik sindirimi için kullanılır |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Gibco (Thermo Fisher Scientific) | 11965-092 | Bazal kültür ortamı; ayrıca negatif kontrol grubu olarak kullanılır |
| Fetal sığır serumu (FBS) | Gibco (Thermo Fisher Scientific) | 10270-106 | Tam kültür ortamı için takviye; diferansiyasyon ortamı için MSC-kalifiye FBS kullanılır |
| Akış sitometresi (Navios) | Beckman Coulter | Navios | Kök hücre immünofenotiplemesi için kullanılır |
| Akış sitometrisi analiz yazılımı (Navios) | Beckman Coulter | N/A | Akış sitometrisi panellerinin gating ve veri analizi için kullanılır |
| Floresans mikroskobu | Labomed / NY Microscope Company | 9126000 | İmmünofloresans görüntüleme ve H-skoru hesaplaması için kullanılır |
| Dondurarak kurutucu (liyofilizatör) | Labconco | N/A | Nanomalzeme çökeleklerini −50 °C'de kurutmak için kullanılır |
| Keçi anti-tavşan IgG sekonder antikor (Alexa Fluor 488) | Invitrogen | A-11034 | Floresan sekonder antikor; 1:500 dilüsyon; oda sıcaklığında 1 sa |
| Keçi anti-tavşan IgG sekonder antikor (Alexa Fluor 594) | Invitrogen (veya eşdeğeri) | A-11012 (veya eşdeğeri) | Multiplex boyama yapıldığında DMP-1 immünofloresansı için kullanılan spektral olarak farklı sekonder antikor |
| GraphPad Prism yazılımı | GraphPad Software | Version 9 | EC50 hesaplaması ve istatistiksel analiz için kullanılır |
| Hemositometre | Neubauer | N/A | Manuel hücre sayımı ve H-skoru normalizasyonu için toplam hücre sayımı için kullanılır |
| Ters faz-kontrast mikroskobu | Olympus | N/A | Hücre büyümesinin ve morfolojisinin günlük izlemi için kullanılır |
| Kapatma medyumu, antifade (ProLong Gold) | Invitrogen | P36930 | İmmünofloresan boyama sonrası lam kapatma için kullanılır |
| MTT reaktifi | Invitrogen | M6494 | Hücre metabolik aktivitesini değerlendirmek için kullanılır; 0.5 mg/mL, 37 °C'de 4 sa |
| Nanohidroksiapatit (NHAP) | Nanogate, Cairo, Egypt | N/A | Islak çöktürme ile sentezlenmiş veya ticari olarak temin edilmiş; 10 µg/mL konsantrasyonda kullanılır |
| NeoMTA2 tozu | NuSmile Ltd. / Avalon Biomed | N/A | Planeter bilyalı değirmen ile Nano-NeoMTA2 hazırlama için başlangıç malzemesi |
| Normal keçi serumu | N/A | N/A | Primer antikor uygulamasından önce bloklama için kullanılır (%5 PBS içinde) |
| Osteojenik/odontojenik diferansiyasyon ortamı | Gibco (Thermo Fisher Scientific) | N/A | Pozitif kontrol ortamı; DMEM, FBS, askorbat, beta-gliserofosfat ve dekzametazon içerir |
| Paraformaldehit (%4) | Sigma-Aldrich | P6148 | İmmünofloresans öncesi hücre fiksasyonu için kullanılır. TOKSİK — çeker ocakta kullanınız |
| PBS (fosfat tamponlu salin, pH 7.4) | Gibco (Thermo Fisher Scientific) | 10010-023 | Hücre yıkama, antikor dilüsyonu ve nanomalzeme süspansiyonu için kullanılır |
| Penisilin-streptomisin çözeltisi | Gibco (Thermo Fisher Scientific) | 15140-122 | Antibiyotik takviyesi; tam kültür ortamında %1 oranında kullanılır |
| Planeter bilyalı değirmen | Retsch (veya eşdeğeri) | PM 400 | NeoMTA2 tozunun nanoboyuta getirilmesi için kullanılır; 350 rpm, 10 sa |
| p-Nitrofenol standartları | Sigma-Aldrich | N/A | ALP aktivitesi standart eğrisini oluşturmak için kullanılır |
| Tavşan anti-RANKL primer antikor | Abcam | ab9957 | Osteojenik belirteç; 1:200 dilüsyon; 4 °C'de gece boyunca |
| Tavşan IgG izotip kontrol antikoru | N/A | İmmünofloresans için negatif kontrol; primer antikor ile eşleşen konsantrasyon | |
| SDS-HCl solubilizasyon çözeltisi | Sigma-Aldrich | N/A | MTT formazan kristallerini çözmek için kullanılır. KOROZİF |
| Altı kuyucuklu doku kültürü plakaları | Corning | 3516 | Diferansiyasyon analizleri için kullanılır |
| Sodyum hidroksit (NaOH), 0.5 M | Sigma-Aldrich (veya eşdeğeri) | N/A | Absorbans ölçümü öncesinde ALP reaksiyonunu sonlandırmak için kullanılır; KOROZİF |
| Sonikatör (prob / ultrasonik banyo) | Branson Ultrasonics | N/A | Biyolojik analizler öncesinde nanoparçacık dispersiyonu için kullanılır |
| T-75 kültür flaskları | Corning | 430641 | Kök hücre ekspansiyonu için kullanılır |
| TEOS (tetraetil ortosilikat) | N/A | N/A | 45S5 biyoaktif cam sol-gel sentezi için silika öncüsü. YANICI |
| Transmisyon elektron mikroskobu | JEOL Ltd. | JEM-2100 | Nanomalzeme boyut ve morfoloji karakterizasyonu için kullanılır |
| Triton X-100 (%0.1 PBS içinde) | N/A | N/A | İmmünofloresans öncesi hücre permeabilizasyonu için kullanılır |
| Trypan blue çözeltisi (%0.4) | Sigma-Aldrich | T8154 | Hücre canlılığı değerlendirmesi için kullanılır |
| X-ışını difraktometresi (X'PERT-PRO) | PANalytical | X'PERT-PRO | Nanoparçacıkların kristalografik analizi için kullanılır |
Kaynaklar
- Sui B et al. Dental pulp stem cells: from discovery to clinical application. J Endod. 2020;46(9 Suppl):S46-S55. doi:10.1016/j.joen.2020.06.027.
- Zhang W, Yelick PC. Vital pulp therapy: current progress of dental pulp regeneration and revascularization. Int J Dent. 2010;2010:856087. doi:10.1155/2010/856087.
- Zhang W et al. The performance of human dental pulp stem cells on different three-dimensional scaffold materials. Biomaterials. 2006;27(33):5658-68. doi:10.1016/j.biomaterials.2006.07.013.
- Elshahat S, Elgendy AA, Elsewify T. Osteogenic differentiation and proliferation of apical papilla stem cells using chitosan-coated nanohydroxyapatite and bioactive glass nanoparticles. Eur J Dent. 2024;18(2):665-71. doi:10.1055/s-0043-1777044.
- Huang M, Dissanayaka WL, Yiu CKY. Exploring the potential of stem cells from the apical papilla (SCAPs) in regenerative medicine: advantages, applications, challenges and opportunities. Stem Cell Res Ther. 2025;16(1):626. doi:10.1186/S13287-025-04705-8.
- Tran N, Webster TJ. Nanotechnology for bone materials. Wiley Interdiscip Rev Nanomed Nanobiotechnol. 2009;1(3):336-51. doi:10.1002/wnan.23.
- Ding F, Guo S, Pan G. Emerging biomimetic materials with micro/nanostructure-dependent biological effects. Rev Mater Res. 2025;1(2):100040. doi:10.1016/j.revmat.2025.100040.
- Zaki NT, El-Helbawy M, Mahran AH, Elsewefy T. Effect of Neo-MTA and hydroxyapatite nanoparticles on proliferation and osteogenic differentiation of apical papilla stem cells (SCAPs) (in vitro study). J Pharm Negat Results. 2023;14. doi:10.47750/pnr.2023.14.02.344.
- Abdelaziz H, Mahran AH, Elsewify T. Osteogenic differentiation and proliferation of apical papilla stem cells using nanoparticles of Neo MTA and bioactive glass. Saudi Dent J. 2024;36(1):134-39. doi:10.1016/j.sdentj.2023.10.018.
- Habib N, Elgendy A, Elsewify T, Yehia T. The effect of Nano-NeoMTA2 and nanohydroxyapatite on the human dental pulp stem cells odontogenic differentiation and proliferation. Eur Endod J. 2026;11(4):158-65. doi:10.65717/eej.2026.25165.
- Ferraz MP, Monteiro FJ, Manuel CM. Hydroxyapatite nanoparticles: a review of preparation methodologies. J Appl Biomater Biomech. 2004;2(2):74-80.
- Xu F, Li Y, Wang X, Wang J, Yang A. Preparation and characterization of nano-hydroxyapatite/poly(vinyl alcohol) hydrogel biocomposite. J Mater Sci. 2004;39:5669-72. doi:10.1023/B:JMSC.0000040074.64787.b3.
- Tanomaru-Filho M et al. Biocompatibility and mineralized nodule formation of Neo MTA Plus and an experimental tricalcium silicate cement containing tantalum oxide. Int Endod J. 2017;50(Suppl 2):e31-e39. doi:10.1111/iej.12780.
- Rodríguez-Lozano FJ et al. Biomineralization potential and biological properties of a new tantalum oxide (Ta2O5)-containing calcium silicate cement. Clin Oral Investig. 2022;26(2):1427-41. doi:10.1007/s00784-021-04117-x.
- Okajcekova T et al. A comparative in vitro analysis of the osteogenic potential of human dental pulp stem cells using various differentiation conditions. Int J Mol Sci. 2020;21(7). doi:10.3390/ijms21072280.